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III.-Capítulo 3
Transformación genética
Díaz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.;
Franzone, Pascual M.; Ríos, Raúl D.
1 Introducción
El mejoramiento genético vegetal se originó hace aproximadamente 10.000 años,
cuando el hombre se hizo agricultor y comenzó la domesticación de las plantas. En el siglo XX, con la incorporación de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biología
floral de las especies, los avances de la
genética y de la estadística experimental,
entre otros, se desarrollaron los métodos de
mejoramiento actualmente utilizados. El
mejoramiento genético se basa en la existencia de variabilidad genética para los caracteres que se desea mejorar y la reproducción sexual para la incorporación de los
mismos. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad esté restringido por
barreras de cruzabilidad. El reciente desarrollo de métodos no sexuales para transferir
genes, como la transformación genética,
permite superar esta limitación, abriendo
nuevas perspectivas en el mejoramiento de
las plantas.
La ingeniería genética o transformación
genética, técnica conocida como del ADN
recombinante, permite introducir en plantas
genes provenientes no sólo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto
de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar
que la transformación de plantas es una tecnología que aporta variabilidad genética conocida sin alterar el fondo genético. Este último aspecto es de gran importancia ya que
la creación de cultivares es un proceso
acumulativo; es decir que se desea incorporar características favorables sin perder las
mejoras logradas anteriormente. El
germoplasma transgénico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento,
el cual dependerá de la especie y del tipo de
cultivar a obtener.
En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresión de un transgen (gen
introducido) en células vegetales y al año siguiente se obtuvieron las primeras plantas
transgénicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicación de esta
tecnología a unas 120 especies. Las plantas
transgénicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos métodos, los que han
sido modificados para cada especie en particular, aumentándose de esta forma la eficacia de los mismos.
Entre sus aplicaciones se encuentran la
obtención de plantas con resistencia a virus,
insectos, hongos y bacterias, tolerancia a
herbicidas y a estreses abióticos y modificación de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a través del uso de
transgenes es posible modificar la expresión
de genes presentes en el genoma de la planta. La transformación genética también constituye una herramienta útil para estudios
básicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y función de genes
específicos, aspecto particularmente relevante en la era genómica (ver VII.-1).
2 Requerimientos para la obtención de
plantas transgénicas
Para todas las técnicas de transformación
desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias
regulatorias y codificante clonadas en un
vector de transformación) y de una metodología eficiente para la transferencia al
genoma vegetal. Una vez introducido el gen
de interés en la célula, se induce el desarrollo
de plantas mediante distintas técnicas de
cultivo de tejidos. Se procede luego al análisis molecular de las plantas regeneradas in
vitro para identificar aquellas que porten y
expresen el o los transgenes en los niveles
deseados. Finalmente, a través de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgénicos
y su descendencia.
Por lo tanto, los elementos básicos que
se requieren en trabajos de transformación
genética en plantas son:
1. Un sistema de cultivo de tejidos que
permita regenerar plantas completas y fértiles.
2. Vectores apropiados, que permitan el
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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clonado del gen de interés y/o su transferencia al tejido blanco de transformación.
3. Un protocolo de transformación (sistema de transferencia de genes y de selección
del material transformado).
4. Herramientas de análisis para detectar
la presencia del transgen y los productos del
mismo en la planta.
Antes de iniciar la descripción de los ítem
anteriores, resulta importante destacar que
para lograr una planta transgénica deben
ocurrir tres procesos en la misma célula:
a) El transgen debe ser transferido al interior de la célula,
b) El transgen debe integrarse al ADN
celular y
c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la célula transgénica en la que
se verificaron los procesos a y b.
Dado que las células tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada
uno de estos procesos, la puesta a punto
de un protocolo de transformación eficiente requiere maximizar la cantidad de células competentes para todos ellos de manera simultánea.
2.1 Cultivo de tejidos vegetales
Los métodos de transformación más utilizados actualmente se basan en la obtención de células transgénicas y posterior recuperación de plantas completas y fértiles a
partir de las mismas a través del cultivo y selección in vitro. Esto es posible gracias a la
propiedad de totipotencia expresada por las
células vegetales (ver II.-1). En la mayoría de
las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnología con fines de mejoramiento genético
es muy importante conocer la respuesta
morfogenética de distintos genotipos con
adaptación local. En el cultivo in vitro, un prolongado período de subcultivos puede inducir la aparición de variación somaclonal no
deseable, ya que es conveniente introducir
sólo las modificaciones que se desean y en
forma controlada (ver III.-1).
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2.2 Construcción del vector
Para introducir un transgen es necesario
que el mismo sea incorporado previamente
en un vector (por ejemplo un plásmido). Para
ello se digiere el ADN extraído de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas
de restricción. Estas endonucleasas tienen la
capacidad de reconocer en el ADN secuencias específicas compuestas por pocos
nucleótidos y posteriormente producir cortes
en las mismas. Los fragmentos de restricción
así obtenidos pueden ser ligados
enzimáticamente a vectores de clonado,
obteniéndose, de este modo, clones de ADN
recombinante (ver II.-3)
Figura 1: Estructura molecular del transgen
Un transgen está compuesto por una secuencia codificante (región comprendida entre los codones de iniciación y terminación
de la traducción) y por secuencias regulatorias
que determinan el tejido, el momento del
desarrollo y el nivel de expresión del transgen
en la planta. La adecuada expresión de los
transgenes es un aspecto importante en la
obtención del fenotipo deseado en la planta transgénica. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente
no pueden expresarse eficientemente en
células eucariotas. Por ello, para optimizar la
expresión del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por
otras aptas para su expresión en células vegetales. En este contexto, la secuencia más
importante es el promotor, sitio del ADN al
cual se une la enzima ARN-polimerasa para
iniciar el proceso de transcripción (Fig. 1).
Cabe destacar que la expresión génica es controlada por las secuencias regulatorias y no
depende de la secuencia codificante. Por lo
tanto, una secuencia codificante aislada de
un gen A, puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B, se expresará de
acuerdo con el patrón de expresión de dicho
promotor. Asimismo, en la elección del pro-
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
motor a utilizar en la construcción del
transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrón
de expresión pueden variar al ser utilizados
en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen
aquellos constitutivos, que permiten la expresión del gen en toda la planta en forma
continua, los inducibles que responden a
factores ambientales y finalmente los específicos de tejido que permitirán la transcripción en determinados órganos y tejidos (Tabla 1). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresión de
los genes que regulan, pueden truncarse,
adicionárseles un intrón o unírseles secuen-
nidos en el mismo experimento. La solución
para evitar los «efectos de posición» es dirigir la secuencia de interés a sitios específicos
del genoma vegetal, elegidos por su patrón
de expresión adecuado y estable. Esto se
puede lograr usando sistemas de recombinación heteróloga sitio-específicos o mediante reemplazo génico por recombinación
homóloga.
2.3 Métodos de transformación
La pared celular impide la entrada del ADN
en la célula, constituyendo un obstáculo que
todos los métodos de transformación
genética tienen que superar de algún modo.
Estos métodos pueden dividirTabla 1: Promotores usados en transformación genética de plantas
se en:
Constitutivos
Promotores
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium)
35 S (virus del mosaico del coliflor)
Ubi (ubiquitina de maíz)
Act 1 (actina de arroz)
TA 29 (tapete de la antera de tabaco)
faseolina (cotiledones de poroto)
Específicos de tejido TobRB 7 (raíz de tabaco)
patatina (tubérculo de papa)
glutenina (endosperma de trigo)
subunidad pequeña de Rubisco inducible por luz
alcohol deshidrogenasa-1 inducible por
Inducibles
anaerobiosis
proteína de shock térmico inducible por calor
cias de otros promotores. Al momento de
elegir el promotor debe tenerse en cuenta
también la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en
monocotiledóneas, como el 35S; por otra
parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maíz es
uno de los más efectivos en gramíneas. Además, es necesario que el transgen disponga
de una región no traducida en el extremo 3’
del mismo, que incluya la señal de corte y
poliadenilación (terminador), necesaria para
el correcto procesamiento del transcripto
correspondiente.
Por otra parte el nivel y patrón de expresión del gen también puede estar afectado
por la posición del mismo en el genoma de
la planta transformada (efecto de posición).
Esto puede deberse a la presencia de otras
secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrón de metilación,
etc. La cantidad de proteína producida por
el transgen comúnmente varía más de 100
veces entre individuos transformantes obte-
a) Transformación mediada por Agrobacterium, vector
biológico que participa del proceso de transferencia.
b) Métodos de transformación genética directa, también llamados físicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN
en la célula.
2.3.1 Transformación mediada por
Agrobacterium
Las especies del género Agrobacterium
son bacterias Gram-negativas aeróbicas obligadas que viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saprofítico
o parasítico. El género comprende cuatro
especies fitopatogénicas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A.
rhizogenes). Ambas especies son capaces de
infectar una amplia variedad de especies de
dicotiledóneas y tienen como blanco de infección a las heridas, atacando células individuales y provocando su proliferación. A.
tumefaciens causa tumores, enfermedad
que se conoce como «agalla de la corona» y
A. rhizogenes induce la proliferación de raíces dando lugar a la enfermedad denominada «raíz en cabellera». La capacidad
patogénica de estas bacterias esta asociada
a la presencia de megaplásmidos (150-200
kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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«tumor-inducing»
o inductor de tumores) o Ri (por
«root-inducing» o
inductor de raíces),
presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostró
que durante la patogénesis un fragmento de estos
plásmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA
T-DNA
(por
«transfer-DNA»), es transferido a la célula están involucrados genes cromosómicos (chv
vegetal, donde se integra al ADN A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce
cromosómico de la planta y cuya expresión el procesado y la transferencia del T-DNA,
causa proliferación de células de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia)
través de la síntesis y alteración de la respues- que son inducidos por azúcares y compuesta a hormonas vegetales. El T-DNA contiene tos fenólicos, como la acetosiringona, produgenes que se expresan eficientemente en la cidos por células vegetales heridas. Se conocélula vegetal infectada y producen síntesis ce con mucho detalle la etapa de la
de hormonas vegetales (llamados oncogenes patogénesis que ocurre en la bacteria (ver
porque son los responsables de la prolifera- revisión de Gelvin, 2000). La región de virución anormal del tejido) y genes que provo- lencia (de alrededor de 30 Kb) está organizacan la síntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) o
y nitrógeno para la bacteria).
A. tumefaciens es el caso más estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la
y utilizado en la transformación de plantas. transformación (vir C, vir E). El ingreso de
El T-DNA está delimitado por dos repeticio- Agrobacterium en la era genómica permitines directas imperfectas de 25 pares de ba- rá avanzar en el conocimiento de la
ses (bp) que lo flanquean, llamadas bordes interacción de esta bacteria con las plantas.
El desarrollo de la patogénesis de planderecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son
los únicos elementos en cis necesarios para tas por Agrobacterium representa una situadirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier ción única en la naturaleza: la transferencia
fragmento de ADN ubicado entre estos bor- de un elemento genético (T-DNA) de un ordes puede ser transferido a la célula vegetal. ganismo procariota a un organismo eucariota
Contrariamente a lo que sucede con otros superior, con su subsiguiente integración y
tipos de secuencias móviles de ADN, el T-DNA expresión en el genoma hospedador. Este
no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniería genética natural es
transferencia. El T-DNA es una región relati- aprovechado para la transferencia de genes
vamente grande (ca. 20 Kb) que contiene de interés a las plantas, para lo cual, los
genes con secuencias regulatorias (promoto- oncogenes y genes de síntesis de opinas, son
res y señales de poliadenilación) típicamente reemplazados por un marcador seleccionable
y el gen a transferir (Fig. 2). El método llamaeucarióticas.
Desde la década de 1950-60 se sabe que do «del explante» (Horsch y col., 1984) conlos tumores de la agalla de la corona se desa- siste en inocular un explante con A.
rrollan si hay A. tumefaciens patogénicas en tumefaciens, dejar la bacteria en contacto
presencia de heridas. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo, en
de esta bacteria es que usa la respuesta de la él se produce la transferencia del T-DNA que
planta a las heridas (cicatrización y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el
como quimioatractivo y activador del proce- o los transgenes de interés. Posteriormente
so de patogénesis. Luego de la adhesión de se transfieren los explantes a un medio de
la bacteria a la célula vegetal, etapa en la que cultivo que contiene un antibiótico que ac-
112
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
túa como bacteriostático y el agente selectivo correspondiente al gen marcador
seleccionable utilizado. Una vez completado
el protocolo de cultivo y selección in vitro se
recuperan las plantas transgénicas (Fig. 3).
Análisis por hibridación del T-DNA en plantas transgénicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN
cromosómico y se hereda en forma estable.
Los plásmidos Ti sin oncogenes se denominan «desarmados», son de gran tamaño
y resulta difícil introducir genes en su T-DNA
usando técnicas habituales de ADN
recombinante. Por esta razón se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores
cointegrados, que deben formar estructuras
cointegradas para replicarse en A.
tumefaciens y los vectores binarios, que son
capaces de replicarse en forma autónoma en
esta bacteria. En los vectores cointegrados,
la inserción del ADN que contiene los
transgenes dentro del T-DNA de un plásmido
Ti desarmado se logra por recombinación
homóloga. Sobre la base de la capacidad de
los genes de virulencia de actuar en trans,
movilizando el T-DNA presente en otro
plásmido, se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no
oncogénico en un plásmido pequeño, con un
origen de replicación de amplio espectro de
hospedantes, características que permiten su
fácil manipulación genética usando E. coli
como huésped. La introducción de este
plásmido a una cepa de Agrobacterium que
contenga un plásmido llamado «helper» de
virulencia (con la región vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del
T-DNA a las células vegetales. Si bien ambos
tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformación, se aprecia una
notable preferencia por el uso de vectores
binarios.
La integración del T-DNA en el ADN
cromosómico de la planta se produce al azar,
por recombinación ilegítima, preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participación de proteínas
de la bacteria y de la planta. Este sistema de
transformación permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen características tanto de cromosomas artificiales de
bacterias (BACs) como de vectores binarios.
El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamaño y posteriormente transferirlos al genoma vegetal vía
A. tumefaciens. Esta tecnología es de gran
utilidad para el clonado posicional de genes.
Más de 600 especies vegetales son
hospedantes naturales de A. tumefaciens.
Estas pertenecen en su mayoría a dicotiledóneas y gimnospermas y más raramente a
monocotiledóneas. Para muchas de ellas se
han puesto a punto protocolos de transformación genética basados en este vector. El
interés en el desarrollo de este tipo de tecnología hizo que se expandiera el rango de
hospedantes de A. tumefaciens a especies
que no son susceptibles en condiciones naturales a este patógeno. Esto fue posible
debido al amplio conocimiento que se tiene
de esta patogénesis. Así, se ha puesto énfasis en la utilización de A. tumefaciens como
vector de transformación en gramíneas y se
han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maíz, cebada, trigo
y gramíneas forrajeras). Cabe notar que su
aplicación es actualmente una rutina en arroz
y maíz.
La transformación con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la
producción de raíces con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos
secundarios como productos farmacéuticos,
aditivos alimentarios y cosméticos, y por otra
parte representa una valiosa herramienta
para la estimulación de la rizogénesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leñosas.
La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformación mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que además de tener muy buen
conocimiento de la respuesta al cultivo in
vitro de la especie a transformar, hay que
considerar aspectos tales como el genotipo
vegetal, la cepa bacteriana, el tejido blanco
de transformación, la inducción de los genes
de virulencia y el control del estrés durante
todo el proceso.
2.3.2 Transformación directa o por
métodos físicos
La primer metodología de transformación
genética de plantas desarrollada fue la de A.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
113
Figura 3: Comparación de técnicas de transformación
directa e indirecta
tumefaciens. Inicialmente esta tecnología no
resultó de utilidad para abordar la transformación de especies de gran importancia económica como los cereales, debido a que no
son hospedantes naturales de esta bacteria.
Este hecho condujo al desarrollo de los métodos físicos de transformación. En ellos el
transgen es introducido en la célula vegetal
mediante distintas técnicas que se detallan
a continuación.
- Transformación de protoplastos
La introducción y expresión de ADN forá-
114
neo en protoplastos fue el primer
método de transferencia directa claramente demostrado en plantas y
esto se debió a que se disponía,
para algunas especies, de procedimientos eficientes para la regeneración a partir de protoplastos. Se
basa en el hecho de que la pared
celular es la principal barrera para la
introducción de ADN en las células
vegetales por lo que ésta es
temporariamente removida. Los
protoplastos pueden ser aislados en
forma mecánica o por un proceso
enzimático que digiere la pared. Así
se obtiene una suspensión conteniendo millones de células individuales lo que favorece la transformación
de células aisladas.
Los protoplastos pueden ser
transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporación,
microinyección o liposomas. La
transformación de protoplastos
mediada por PEG es el método más
comúnmente usado. Tanto el PEG
como la electroporación producen
poros en la membrana plasmática
por alteración de la polaridad de la
misma y por ellos penetra el ADN
foráneo. En el último caso se someten los protoplastos a un campo
eléctrico. Ambas técnicas permiten
el tratamiento de un gran número
de protoplastos al mismo tiempo.
La microinyección es un método difícil y laborioso que consiste en la introducción de ADN dentro de
protoplastos individuales mediante
el uso de capilares de inyección y
micro-manipulador y aunque con
esta metodología es necesario manipular las
células individualmente, es posible lograr un
alto grado de integración del ADN foráneo.
Cabe notar que el cultivo de protoplastos
es la metodología más sofisticada de cultivo
in vitro de plantas por lo cual representa
gran complejidad experimental y no está disponible más que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologías
alternativas de transformación directa como
la electroporación de tejidos, el uso de fibras
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
de carburo de silicio para facilitar la entrada corporar de manera permanente la informadel ADN en las células en cultivo y el bombar- ción genética transferida. A pesar de la desdeo con microproyectiles o micropartículas.
ventaja que representa el bajo número de
- Bombardeo de micropartículas
transformantes producido por un solo epiEs un proceso por el cual micropartículas sodio de bombardeo, la versatilidad de la
cubiertas con ADN son aceleradas por un gas aceleración de partículas para introducir
comprimido e introducidas en células vege- transgenes ha superado muchas de las batales. Esta técnica se ha ido perfeccionando rreras asociadas a otros métodos de transy actualmente es la más difundida entre los formación, como son el rango de huéspedes
métodos de transformación directa. Inicial- de Agrobacterium y las dificultades inherenmente, la fuerza impulsora de las partículas tes al cultivo y regeneración de protoplastos.
estaba dada por pólvora, pero
luego fue reemplazada por el Tabla 2: Comparación entre métodos de transformación del genoma
sistema de helio comprimido nuclear
Método biolístico
Agrobacterium
que brinda una mejor regulación de la fuerza, distribución
Especies a transformar
- dicotiledóneas y algunas
- sin limitaciones
monocotiledóneas
de microproyectiles y mayor
Eficiencia de transformación
- alta
- baja
reproducibilidad entre bombar- Tipo de integración en el - aleatoria en regiones con
- aleatoria
transcripción
genoma vegetal
deos. Se utilizan micropro- bajo número de copias
- multicopia en tandem
yectiles de oro o tungsteno
independientes
- precisa
- imprecisa
(químicamente inertes) cuyos
Construcción de vectores
- compleja
- simple
tamaños van desde 0,5 a 3 Dependencia del genotipo
- mayor
- menor
vegetal
mm, que al ser disparados a
grandes velocidades pueden
La biolística ha demostrado ser la mejor opatravesar pared y membranas de la célula ción para la producción de plantas
vegetal bombardeada sin causarle daños le- transgénicas de soja, sorgo, papaya, espárratales (Klein y col., 1987). Para el bombardeo go, caña de azúcar y trigo.
se puede emplear cualquier tipo de explante
vegetal, desde células o protoplastos hasta 2.3.3 Transformación directa vs. indirecta
plántulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El
Con el transcurso de las investigaciones
explante es generalmente sometido a un tra- se ha logrado optimizar los protocolos de
tamiento osmótico pre y posbom-bardeo, transformación para muchas especies vegeque produce plasmó-lisis celular, evitando tales; igualmente, en la actualidad, ambas
que el impacto y la penetración de las partí- vías de transformación presentan ventajas y
culas dañen las células (Fig. 3). Los vectores desventajas que las hacen más o menos conplasmídicos que se usan en este tipo de pro- venientes para los distintos fines. En la Tacedimiento sólo requieren un origen de bla 2 se presenta una comparación entre la
replicación que permita un alto número de transformación del genoma nuclear mediacopias de los mismos en E. coli, aspecto que da por A. tumefaciens y el método biolístico
facilita en la práctica la preparación del ADN como representante de los métodos de
necesario en grandes cantidades para la transformación directa.
transformación genética por este método.
Uno de los procesos necesarios para obEsta técnica, sin embargo, tiene manifies- tener plantas transgénicas es la integración
tas limitaciones. Algunas especies oponen del transgen al ADN cromosómico. Con reuna resistencia natural a la penetración de lación a este proceso existen diferencias enlas partículas, dada por cutículas endurecidas, tre ambos métodos. A. tumefaciens posee
paredes celulares lignificadas o superficies un mecanismo natural muy eficiente para
vellosas. Sin embargo, la principal limitación transferir, al núcleo celular, el T-DNA que condel método continúa siendo la baja relación tiene el transgen y producir una integración
entre el total de células sometidas al bom- aleatoria en regiones cromosómicas con acbardeo y el número de células que logran in- tividad transcripcional. Generalmente, los
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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patrones de inserción de transgenes son más
sencillos en comparación a los producidos por
el método biolístico. Así, el número de copias que se incorpora es bajo y cuando hay
más de una copia, suelen distribuirse en loci
independientes, lo que facilita la posterior
eliminación de las copias no deseadas por
segregación. Por otra parte, el mecanismo
involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA, acompañado de proteínas que lo protejen de la acción de nucleasas. Por el contrario, en el método biolístico el ADN transferido no está
asociado a proteínas, por lo que al ser parcialmente degradado, sólo parte del mismo
llega al núcleo donde se produce, con baja
eficiencia, la integración al azar en el ADN
cromosómico. En este método es común que
se produzcan inserciones de varias copias del
transgen en un mismo sitio del genoma con
distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este último aspecto es
considerado como una desventaja ya que
tanto desde el punto de vista de la percepción pública como el de la optimización de la
expresión de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el
desarrollo de productos comerciales. Así, el
fenómeno de silenciamiento de transgenes
(pérdida de su expresión), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia
de varias copias del transgen. Por otra parte,
cuando se utiliza el método biolístico, el segmento de ADN plasmídico que se integra al
ADN cromosómico no está definido, como
en el caso de T-DNA, sino que es de longitud
variable.
La construcción de vectores es mucho
más sencilla en el caso del método
biolístico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigación, en los cuales muchas
veces se requiere utilizar un número considerable de vectores diferentes.
Es conveniente destacar que en ambos
métodos la integración del transgen en el
genoma se produce al azar. Como consecuencia de ello, diferentes plantas
transgénicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. Así, la expre-
116
sión fenotípica de un transgen será diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen, por lo cual, para clarificar la situación se considera a cada una de ellas
como eventos de transformación distintos.
La aplicación de cualquiera de estos métodos de transformación al mejoramiento
vegetal depende, en gran medida, de la disponibilidad de genotipos con muy buena
respuesta al cultivo in vitro. Finalmente,
cabe mencionar que en el caso de A.
tumefaciens, debido a que se trata de una
interacción biológica entre una planta y una
bacteria, la dependencia del genotipo es
mucho más acentuada, ya que influyen también en la eficiencia de transformación, tanto el genotipo de la planta como el de la
bacteria.
2.3.4 Genes de selección e informadores
En el proceso de obtención de plantas
transgénicas, los genes marcadores
seleccionables (Tabla 3), generalmente de
origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia, sea para poner a punto un protocolo de
transformación o como acompañantes de
genes de interés que se desean introducir. El
gen marcador seleccionable otorga a las células transgénicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las células no
transgénicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces, si el gen marcador codifica para una proteína que confiere resistencia a agentes fitotóxicos como
antibióticos o herbicidas, las células que lo
expresen podrán crecer y desarrollarse en
medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las células no
transgénicas no lo harán (selección negativa). En otros casos, la ventaja estará dada
por la posibilidad de utilizar diferencialmente
un sustrato. Así, el gen man A de E. coli permite a las células vegetales que lo expresan
utilizar la manosa como fuente de carbono,
lo cual no es posible para las células no
transgénicas (selección positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados, por lo que
es importante evaluar este aspecto cuando
se elige el gen de selección a utilizar, así como
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
Tabla 3: Genes marcadores utilizados comúnmente en transformación de
plantas
Marcadores
Seleccionables (Agente selectivo)
npt II (kanamicina, paromomicina, G418)
hph (higromicina)
pat o bar p
( hosphinotricina, bialaphos)
CP 4 (glifosato)
man A (manosa 6 fosfato)
2.4 Técnicas de detección
del transgen y sus
productos
Visualizables (Fenotipos asociados)
Luego de la selección in
vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas
por métodos moleculares
para identificar aquellas
que porten y expresen los transgenes en los
niveles deseados. Para ello se emplean técnicas como:
- Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR): con el uso de «primers» homólogos a
la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta técnica permite hacer un «screening» rápido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones, un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los «primers» utilizados
pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. Para
maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de ‘annealing’
o apareamiento de primers altas (más de 60
°C) y «primers» relativamente largos (más de
20 nucleótidos). Una variación de esta técnica, PCR en tiempo real, resulta de utilidad
para evaluar el número de copias del
transgen incorporadas al genoma de la célula vegetal.
gus A (color azul índigo)
luciferasa (luminiscencia)
gfp (fluorescencia verde)
el agente selectivo y las concentraciones del
mismo.
En la puesta a punto de las metodologías
de transferencia de genes son asimismo de
gran utilidad los genes marcadores
visualizables o informadores que posibilitan
la observación directa de las células que los
expresan (Tabla 3). Estos genes codifican para
proteínas que no están presentes en las células vegetales y producen un fenotipo característico de fácil y rápida observación. Así, el
gen gus A proveniente de E. coli codifica para
la enzima ß-glucuronidasa. Esta proteína
puede ser detectada cualitativamente por
tinción histoquímica, en presencia de un
sustrato específico, por la producción de un
precipitado azul-índigo de fácil visualización.
Este marcador también puede ser detectado cuantitativamente usando técnicas fluorométricas. Como ejemplo de la aplicación de
estos métodos de detección podemos mencionar el estudio de la expresión de un promotor en una especie vegetal. Para ello se
puede construir un vector con la secuencia
codificante de gus A y con una secuencia de
terminación de transcripción, y estudiar en
plantas transgénicas el patrón de expresión
espacio-temporal del promotor (en qué tipo
de células y cuándo se expresa) por tinción
histoquímica y su nivel de expresión por
fluorometría.
Recientemente, el gen de la proteína
fluorescente verde, gfp («green fluorescent
protein»), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in
vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con
luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen células que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente. Al ser éste un
ensayo no destructivo, es decir que permite
conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para
visualizar diferentes etapas del proceso de
transformación.
- Hibridación southern o «Southern
blotting»: es una de las herramientas
moleculares más poderosas para caracterizar
las plantas transgénicas. Además de indicar
la presencia o no de la secuencia de interés,
da información acerca de la integración de la
misma en el genoma de la célula huésped
(número de copias integradas y número de
loci en los cuales se produjo la integración).
En la Fig. 4 se representa el análisis de un
caso hipotético de transformación mediante Agrobacterium, aunque éste es aplicable
también a plantas obtenidas por métodos
directos. El esquema 4-a representa parte del
vector que contiene el gen de interés y el gen
marcador. Si se utiliza como sonda el T-DNA
completo y la digestión del ADN genómico
se realiza con enzimas de restricción que no
cortan dentro del T-DNA, el número de bandas del patrón representa el número de si-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
117
Hind III
BI
Eco RI
Sal I
Gen Marcador
1 2 3
4 5
c) 1 2 3 4 5
Ausente dentro del
T -DNA
Sonda:
T-DNA (frag.Hind III)
2 3
T-DNA (frag.Hind III)
> 2 kb
4
5
Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre
el marcador y el transgen
Sonda:
Transgen
Frag: tamaño
cantidad
d) 1 2 3
4 5
Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre
el marcador y el transgen
> 5 kb
e) 1
BD
3 kb
Sitio de corte:
Frag: tamaño
Hind III
Gen de Interés
2 kb
b)
Sal I
> 3 kb
Igual que en d)
Gen marcador
> 2 kb
f)
1
2 3
4
5
Dos sitios (Sal I) dentro del
transgen
Fragmento (Sal I) del transgen
1 kb
Uno
Figura 4: Patrones de Hidridación de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002)
tios de inserción. El tamaño de las bandas
será mayor que el T-DNA ya que se están utilizando enzimas que cortan por fuera de éste.
Plantas transgénicas obtenidas en forma independiente tendrán patrones de hibridación diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte único dentro del
T-DNA, utilizando la sonda antes mencionada, ésta dará dos señales de hibridación para
118
cada sitio de inserción independiente del TDNA (4-c). La aparición de un número impar
de bandas indica que en un mismo sitio se
insertaron múltiples copias, ocurrieron
rearreglos o se produjo el truncado del TDNA. Si se digiere la muestra con una enzima
de restricción que posee un sitio único de
corte entre el gen marcador y el gen de interés y utilizando como sonda el gen marca-
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
dor, se obtendrá una sola banda por cada
inserción independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de interés (4-e) aparecerá un patrón que tendrá el mismo número de bandas que el anterior. La ausencia
de una banda es indicativo de la inserción de
una copia truncada de uno de los genes por
lo que se pierde el sitio de corte. La aparición
de una banda del tamaño del T-DNA puede
indicar la presencia de repeticiones en
tandem. Para estimar el número de copias
del transgen en un locus transgénico, se deben utilizar enzimas de restricción con sitios
flanqueantes del transgen y como sonda, el
transgen. Se observará una sola banda del
tamaño del transgen; sin embargo, la intensidad de la señal variará entre las distintas
plantas analizadas de acuerdo con el número de copias del mismo (4-f). Para realizar la
comparación es necesario utilizar simultáneamente estándares conteniendo un número
conocido de copias del transgen. Esta determinación no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestión de las muestras y a la degradación que sufre el ADN.
En lo que respecta a la cuantificación, esta
técnica ha sido reemplazada en gran medida, en los últimos años, por la PCR en tiempo real o «real time PCR», antes mencionada, dado que esta última resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos
cantidad de material vegetal para realizar el
análisis.
- Análisis de ARN: Las técnicas de RTPCR (transcripción reversa seguida de PCR)
con la hidridación de ARN o «Northern
blotting» pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de interés
presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern
blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra
es de fácil preparación. Por otra parte, la hibridación del ARN utiliza como sonda el
transgen, ofrece información sobre el tamaño del transcripto y permite su cuantificación.
- ELISA y «Western blotting»: aquellas
plantas que poseen la secuencia de interés y
la expresan como transcripto, pueden ser
analizadas con estas técnicas inmunológicas
a fin de determinar la presencia de la proteína codificada por el transgen.
La actividad de la proteína debe ser medida, sea por ensayos bioquímicos o por
bioensayos, a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. Además, es conveniente confirmar la estabilidad
meiótica de los transgenes estudiando su
transmisión sexual a la generación siguiente.
Estas técnicas se encuentran descriptas
detalladamente en la sección II.3 y su aplicación para el análisis de plantas transgénicas
en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan
(2002).
Finalmente, el comportamiento de los
individuos transgénicos se estudia en laboratorio, invernáculo y campo. Cabe aclarar que
para realizar experimentos de invernáculo y
de campo es necesario contar con autorización de la Comisión Nacional Asesora de
Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) (ver
IX.-3).
3 Aporte de la transformación genética a
la variabilidad genética
Como ya se mencionó, la transformación
genética permite introducir variabilidad
genética novedosa en las diferentes especies
vegetales. Analizando con más detalle este
concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras. Así, este puede consistir en:
a) La expresión de secuencias codificantes
no existentes en la especie (ejemplo: proteínas insecticidas de origen bacteriano).
b)La expresión de nuevas formas alélicas
de genes que ya están presentes en el
genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en
soja).
c) La expresión de secuencias codificantes
presentes en el genoma pero bajo el control
de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrón de expresión (ejemplo: proteínas relacionadas a la patogénesis).
d)La inhibición de la expresión de genes
residentes en el genoma .
Para lograr la inhibición de la expresión
génica se pueden usar diferentes técnicas:
cosupresión, antisentido y la denominada
interferencia del ARN. Todas ellas se basan
en un proceso denominado silenciamiento
génico post-transcripcional. Este involucra la
degradación del ARN mensajero producido
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
119
por un gen determinado. La cosupresión
consiste en la obtención de plantas
transgénicas que expresan un transgen homólogo del gen residente que se desea silenciar. La técnica del ARN antisentido
involucra la síntesis de moléculas de ARN que
son complementarias al ARNm producido
por la transcripción del gen que se quiere silenciar. El transgen consta de la secuencia
codificante del gen cuya expresión se desea
alterar pero con la orientación invertida,
cuando esta secuencia se transcribe genera
ARN que hibrida con el ARNm formando una
hebra doble que bloquea la traducción. Como
resultado de este mecanismo las células
transformadas producirán poco o ningún
producto proteico. Esta técnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates
(FlavrSavrä) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura
de la pared celular, la polygalacturonidasa, se
expresa en un 10% del nivel normal. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresión
génica que es actualmente muy estudiado y
es la metodología más eficiente, y por ello la
más utilizada, para silenciar genes en plantas. La técnica se basa en la construcción de
transgenes cuyo producto final es un ARN.
Este contiene parte de la secuencia
transcripta del gen a silenciar en forma de
repetición invertida. Como consecuencia de
esta estructura , cuando este tipo de
transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el
mecanismo de degradación dependiente de
la secuencia antes mencionado (Agrawal et
al., 2003). El uso de una secuencia espaciadora
entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias. Este tipo de construcciones se denominan ARN «hairpin».
Además, se observó que el uso de un intrón
como secuencia espaciadora, produce un
silenciamiento más eficiente en la planta. Esta
metodología es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genómica funcional
para poner en evidencia la función de genes
clonados mediante su inactivación. Otra posibilidad es utilizarla para la obtención de
plantas transgénicas mejoradas mediante la
inactivación de genes endógenos cuya expre-
120
sión es indeseada (Kusaba, 2004). Una interesante aplicación de interés agronómico de
esta tecnología fue la obtención de plantas
transgénicas de café que no contienen
cafeína.
4 Obtención de plantas transplastómicas
Las células vegetales contienen tres
genomas: el nuclear, el plastídico y el
mitocondrial. Los métodos presentados en
las secciones precedentes tienen como blanco de transformación al genoma nuclear. Sin
embargo, en los últimos años la obtención
de plantas transplastómicas ha recibido notable atención (Maliga, 2002). Así, el genoma
de los plástidos (plastoma) se ha convertido
en un blanco atractivo para la ingeniería
genética ya que esta tecnología ofrece una
serie de ventajas sobre la transformación del
genoma nuclear:
1. Se pueden obtener altos niveles de
expresión de los transgenes y elevados niveles de acumulación de las proteínas codificadas por ellos (hasta el 47% de las proteínas
solubles totales). Cabe notar que el nivel de
acumulación observado a partir de transgenes
nucleares es generalmente inferior al 1%.
2. Es posible expresar un transgen
‘operón’ con varias secuencias codificantes
bajo el control de un mismo promotor.
3. No se observa efecto de posición debido a que la integración del transgen está
dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto
hace que no sea necesario obtener una gran
población de transformantes, a diferencia de
lo que actualmente ocurre con las plantas
transgénicas nucleares.
4. No se observa silenciamiento de
transgenes.
5. Para las especies que tienen transmisión materna de los plástidos (la mayoría).
Se minimiza la dispersión de los transgenes
por el polen debido a la ausencia de transmisión de los plástidos por el mismo.
6. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema genético de los
plástidos, se ha demostrado que estas
organelas pueden procesar proteínas
eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formación de puentes disulfuro
gracias a la presencia de proteínas
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
chaperonas
endógenos.
y
sistemas
enzimáticos
Los protocolos existentes para la obtención de plantas transplastómicas se basan en
la transferencia de genes por el método
biolístico, un eficiente proceso de cultivo y
selección in vitro, y la utilización de vectores
con secuencias homólogas al genoma del
cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en
la transformación del genoma nuclear, la integración dirigida de los transgenes en el
plastoma se realiza mediante recombinación
homóloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de interés flanqueados
por secuencias con alta homología al ADN
plastídico. La homología entre el ADN del
vector y del ADN del cloroplasto determina
la potencialidad del plásmido para ser utilizado en la transformación genética del
plastoma. En este contexto, la existencia de
secuencias altamente conservadas en el
plastoma de varias especies es explotada para
el diseño de vectores universales, potencialmente útiles en la transformación de los
cloroplastos de numerosas especies. La expresión exclusivamente plastídica de los
transgenes queda asegurada a través de la
utilización de promotores específicos del
cloroplasto, cuya transcripción tiene características típicamente procarióticas.
5 Importancia y aplicaciones de las
plantas transgénicas
Las primeras plantas transgénicas experimentales fueron obtenidas a mediados de
los años 80. La disponibilidad de esta tecnología permitió importantes avances en el área
del conocimiento de la biología vegetal. Por
otra parte, se constituyó en una herramienta disponible para el mejoramiento genético
vegetal (ver aspectos para esta aplicación en
Birch, 1997) y el gran esfuerzo realizado en
este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros cultivares transgénicos. Es destacable
la rápida adopción que tuvieron estos productos. Así en el 2002 se cultivaron en el
mundo 58,7 millones de hectáreas con plantas transgénicas. El 99% de este área global
se cultivó en 4 países (USA, Argentina, Canadá y China) mientras que el 1% restante se
distribuyó en 12 países. Esta superficie estuvo ocupada prácticamente por 4 cultivos: soja
(62%), maíz (21%), algodón (12%) y canola
(5%). Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%), resistencia a insectos (17%) o
una combinación de ambos (8%). En la Argentina los eventos con autorización de
comercialización son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato), maíz (resistencia a
lepidópteros, tolerancia a glufosinato de
amonio) y algodón (resistencia a
lepidópteros, tolerancia a glifosato). La
CONABIA (ver en la página de la Secretaría
de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos,
República
Argentina;
http://
www.sagpya.mecon.gov.ar/), ha autorizado
desde el año 1991, 520 solicitudes para liberaciones a campo, en distintas especies y con
diferentes eventos de transformación.
Los cultivos transgénicos actuales corresponden a lo que se denomina «la primera
generación» que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la reducción en el uso de agroquímicos, la conservación de la tierra arable, el agua y la energía, la reducción de la contaminación del
ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. Se considera que ‘la segunda generación’ de cultivos
transgénicos tendrá más beneficios directos
para los consumidores. Estos comprenden el
mejoramiento de la calidad nutricional (proteínas, aceite, vitaminas y minerales), la eliminación de alergenos, la fitoremediación (es
decir la recuperación de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilización de plantas como bioreactores para la
expresión de proteínas recombinantes con
fines tales como la producción de vacunas
comestibles, anticuerpos y otras proteínas de
uso terapéutico o industrial. Esta aplicación
se conoce como «molecular farming» (producción de moléculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la producción en
gran escala de estas proteínas en particular
en lo que respecta a costos, practicidad y seguridad. Sin embargo aún quedan algunos
aspectos que limitan su potencial como
biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final. En los últimos
10 años, se han desarrollado varios sistemas
de expresión basados en plantas y en la ac-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
121
tualidad se producen más de 100 proteínas
recombinantes en diferentes especies vegetales, generándose un estrecho vínculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Un ejemplo destacable es el ‘arroz dorado’, llamado así por la pigmentación amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el
endosperma. ‘La tercera generación’ de cultivos transgénicos se basará en la información producida por los proyectos genómicos
y tendrá por objeto aspectos tales como la
modificación de la arquitectura de la planta,
la manipulación de la floración, el mejoramiento de la eficiencia fotosintética, la manipulación de la heterosis y la apomixis, etc.
6 Perspectivas
La continuidad en el desarrollo de tecnología de transferencia de genes en plantas
es importante tanto para ampliar el rango
de especies a transformar como el de
genotipos dentro de cada especie. En los últimos años se nota un creciente interés en el
control del nivel de expresión de transgenes
así como de su regulación espacial y temporal. La expresión de los genes nucleares
eucarióticos está controlada en varios niveles que involucran la transcripción propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su
traducibilidad, así como la estabilidad, modificación y compartimentalización del producto proteico final. Por otra parte, es necesario
aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresión de transgenes, de modo
de diseñar protocolos de transferencia que
minimicen las posibilidades de silenciamiento
génico. En este contexto, está recibiendo
notable atención el estudio de la
recombinación homóloga como mecanismo
para la transformación del genoma nuclear
(ver revisión de Hanin y Paszkowski, 2003).
Del análisis comparativo de métodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, continúa
el interés en extender el uso de la transformación mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la
bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los métodos de transformación genética actualmente en uso re-
122
quieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en
una clara limitación cuando se desea aplicar
esta tecnología a los materiales usados por
los mejoradores, los que generalmente no
poseen esta característica. Por ello, se está
tratando de reducir y si es posible evitar la
fase de cultivo in vitro durante el proceso de
transformación, lo que permitirá ampliar el
rango de genotipos a los cuales se podrá
aplicar esta moderna tecnología. Así, se desarrolló un método eficiente y reproducible
de transformación in planta para
Arabidopsis thaliana. Este consiste en infiltrar con vacío plantas adultas de esta especie, con una suspensión de A. tumefaciens
de modo que los tejidos y órganos
reproductivos sean invadidos por la bacteria.
Posteriormente se propuso una simplificación
de este método que consiste en reemplazar
el tratamiento de vacío y sumergir la
inflorescencia en una suspensión bacteriana
que incluye un surfactante. Las plantas
transgénicas que se obtienen por
autofecundación de las plantas así transformadas, son hemicigotas y se demostró que
esta metodología produce la transformación
de la gameta femenina.
El logro de determinados objetivos como
puede ser el redireccionamiento de una ruta
metabólica o la modificación de un carácter
complejo de interés agronómico como por
ejemplo la resistencia durable a enfermedades fúngicas, requiere de la integración de
múltiples transgenes y de la expresión coordinada de los mismos en la planta
transgénica. Este tema está recibiendo notable atención (ver revisión de François y col.,
2002).
Los métodos de transformación que hemos descripto se basan en la utilización de
genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia
del marcador no es deseable en plantas
transgénicas que se liberan al ambiente. Hay
un manifiesto rechazo por parte del público
con respecto a la utilización de genes de resistencia antibióticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a
herbicidas puede ser inconveniente. Por otra
parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans-
DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.
genes y con la metodología convencional no
hay más que un número limitado de genes
marcadores disponibles. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtención
de plantas transgénicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido más esfuerzo hasta ahora, plantea la
remoción vía cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido
la planta transgénica. Una posibilidad para
ello es cotransformar, esto implica que el
transgen de interés y el marcador seleccionable estén presentes en vectores distintos
y que posteriormente se separen los genes
por segregación luego de la reproducción
sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias
particulares como cuando no se dispone de
un protocolo eficiente de cotransfor-mación
o cuando no se desea reproducir sexualmente
la planta transgénica. Otra opción dentro de
esta línea es la utilización del sistema de
recombinación sitio-específica de origen viral
Cre/lox. Más recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo
de métodos de transformación que no usen
marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformación a través del uso de genes que promuevan la regeneración.
Finalmente, las plantas transgénicas actualmente cultivadas comercialmente, en su
mayoría resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y
mejores generaciones de productos.
7 Lecturas recomendadas
AGRAWAL, N.; DASARADHI, V.; MOHAMMED, A.;
MALHOTRA, P.; BHATNAGAR, R. y MUKHERJEE, S. 2003
«RNA Interference: Biology, Mechanism , and
Applications». Microbiology and Molecular Biology
Reviews Dec. 2003, p. 657-685.
BIRCH R. 1997. «Plant transformation: Problems and
strategies for practical applications». Annu. Rev.Plant
Physiol. Plant Mol.Biol. 48: 297-326.
FRANÇOIS, I.; BROEKAERT, W.; CAMMUE, B. 2002.
«Different approaches for multi-transgene-stacking in
plants». Plant Science 63: 281-295.
GELVIN S. 2000. «Agrobacterium and plant genes
involved in T-DNA transfer and integration». Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 223-256.
HANIN, M.; PASZKOWSKI, J. 2003. «Plant genome
modification by homologous recombination». Current
Opinion in Plant Biology 6: 157-162.
HORSCH, R.; FRALEY, R.; ROGERS, S.; SANDERS, P.;
LLOYD, A.; HOFFMAN, N. 1984. «Inheritance of functional
foreign genes in plants». Science 223: 496-498.
KLEIN, T.; WOLF, E.; WU, R.; SANFORD, J. 1987.»High
velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into
living cells». Nature 327: 70-73.
KUSABA, M. 2004. «RNA interference in crop plants»
Current Opinion in Biotechnology 15: 1-5.
MALIGA, P. 2002. «Engineering the plastid genome of
higher plants». Current Opinion in Plant Biology 5: 164172.
PUCHTA, H. 2003. «Marker-free transgenic plants». Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134.
REGISTER J. 1997. Approaches to evaluating the transgenic
status of transformed plants. TiBTech, 15:141-6.
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