Replicación del DNA
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Replicación del DNA Replicación cromosoma circular E.coli Replicación cromosoma circular E.coli OriC E. coli Secuencia rica en T-A Mutantes termocondicionales control 40oC dnaB, dnaC H3 T dnaA 30oC wt b a 30oC t 1) 2) 3) 4) Nucleasa + DNA Ori pp dna A + DNA Ori pp dnaB + DNA Ori pp dnaC + DNA Ori 1 2 3 245 1 Conclusión: Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación 4 Secuencia del origen de replicación bacteriano Región de los treceámeros (tres repeticiones de 13 nucleótidos), 70% AT 4 Nonámeros o cajas dnaA Proteína DnaA • Monómero 52kDa • Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas dnaA • Estequiometria de 20 subunidades de DnaA por oriC • Une ATP y lo hidroliza a ADP en forma dependiente de DNA • Complejo DnaA-ATP mayor afinidad por el DNA • Una vez abiertos los treceámeros DnaA se sienta en las cadenas sencillas Reconocimiento del oriC DnaA reconoce el origen, lo activa y lo protege DnaB • Monómeros de 50kDa que forman un homohexámero • Actividad de helicasa • Dominios para : Unión a DNA de cadena doble Unión a DNA cadena sencilla Interacción con la proteína DnaC Hidrólisis de ATP Dna C • Dna C homohexámero que permite la llegada de DnaB • ATPasa: al hidrolizar ATP pierde afinidad por DnaB La helicasa rodea una de las hebras del DNA dúplex y se desplaza rompiendo puentes de hidrógeno, logrando la apertura de la doble hélice por exclusión estérica. Una hebra es retenida en el interior del anillo y la otra es excluida. DnaB -DnaC SSB Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias Reconocimiento y activación del oriC Resumen La replicación del DNA requiere un cebador • Dna G. Primasa • RNA polimerasa • Sintetiza cebador de ≈ 12nt • Primasa reconoce a DnaB DNA Pol I • A. Kornberg • primera polimerasa descrita • Péptido de 103 kDa • Dependiente de molde de • DNA • Dirección de la síntesis 5´-3´ • Requiere extremo 3 ´OH Actividades de la DNA polimerasa I • Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables” por lo tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa • La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA DNA polimerasas bacterianas Enzima gen Polimerización Actividad 5´-3’ exonucleasa3´-5´ Actividad exonucleasa 5´-3´ Función principal I polA + + + Reparación II polB + + - Reinicio de la replicación, reparación III polC + + - Replicasa Subunidades de la DNApolimerasa III de E.coli sub # por holoenzima Mr Función dnaE α 2 132,000 Subunidad catalítica dnaQ ε 2 27,000 Proofreading holE θ 2 10,000 Acoplador dnaX τ 2 71,000 Dimerización dnaX γ 1 52,000 holA δ 1 35,000 holB δ´ 1 33,000 holC χ 1 15,000 holD ψ 1 12,000 dnaN β 4 37,000 Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Complejo γ ó complejo τ Procesividad Núcleo de la polimerasa DNA polimerasa III • Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde • La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10 • Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega muchos. • Distributividad. Se refiere a la síntesis que avanza agregando pocos nucleótidos por evento de unión Formación de la holoenzima Procesividad de la DNApolimerasa III L a procesividad de la DNApolII aumenta de 50nts a más de 50,000nts gracias a las subunidad β La replicación es semidiscontinua Fragmentos de Okazaki 1200-2000 nt Interrupción de la replicación de la cadena retrasada El molde de la cadena retrasada se debe doblar para parecer que va en la misma dirección que la cadena adelantada RNasa H ayuda a remoción del cebador pero no es eficiente eliminando desoxinucleótidos (el último del cebador) DNA polimerasa I ayuda a remover el cebador, actividad exonucleasa 5´-3´ Actividad de polimerasa reemplaza los nucleótidos eliminados ≈17 DNA ligasa cataliza la formación de enlace fosfodiéster DNA ligasa Topoisomerasas Topoisomerasas I Topoisomerasa I Topoisomerasa III Topoisomerasas II Topoisomerasa II (DNA Girasa) Topoisomerasa IV Toposiomerasas I • Topoisomerasas II Girasa • Topoisomerasas II Topo IV Decatenasa Termino de la replicación Síntesis del DNA • Semiconservativa • Dependiente cebador de RNA • Semidiscontinua • Bidireccional Inicio de la replicación en eucariotes Inicio de la replicación en eucariotes Polimerasas de eucariotes DNA polymerases undertake replication or repair DNA polymerase Function Structure α High fidelity replicases Nuclear replication Polimerasa-primasa 350kDa tetramer δ Nuclear replication Cadena discontinua 250kDa tetramer ε Nuclear replication Cadena continua 350kDa tetramer γ Mitochondrial replication 200kDa dimer β High fidelity repair Base excision repair 39kDa monomer ζ Low fidelity repair Thymine dimer bypass Heteromer η Base damage repair Monomer ι Requiered in meiosis Monomer κ Deletion and base substitution monomer Cdt1 Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA Proteína 29kDa Incrementa procesividad de la DNApol delta ≈ 40 Forma un trímero alrededor del DNA Pol ε Polδ Terminación en eucariotes El dilema de los cromosomas lineales Terminación en eucariotes Telomeros Terminación en eucariotes Telomerasa Terminación en eucariotes Telomerasa
