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II.- Capítulo 4
Marcadores Moleculares
Picca, Aurora; Helguera, Marcelo;
Salomón, Nelly; Carrera, Alicia
1 Introducción
entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rápida identificación
y simple análisis y de posible detección en los
estadios tempranos del desarrollo de la planta.
En los análisis genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genéticos:
morfológicos, isoenzimas, proteínas y marcadores basados en ADN.
2 Marcadores morfológicos
Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar
genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado de
éxito en este proceso depende de i) el control genético de la característica, es decir el
número de genes que la codifican y controlan (herencia monogénica o poligénica) y las
relaciones interalélicas (dominancia o
aditividad), ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a través del
parámetro de heredabilidad. Una serie de
técnicas moleculares de gran desarrollo en los
últimos veinte años permiten conocer la información genética que los organismos portan. Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en
forma genérica como marcadores moleculares. Son ampliamente utilizados en
genética humana, vegetal, animal y
microbiana. Permiten evidenciar variaciones
(polimorfismos) en la secuencia del ADN
entre dos individuos, modifiquen éstas o no
su fenotipo. En relación a los vegetales son
de utilidad en estudios evolutivos y de
genética poblacional, manejo de bancos de
germoplasma, identificación, protección legal
de germoplasma, mapeo, selección asistida
por marcadores y clonado de genes.
Para que un carácter sea considerado un
marcador genético debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre los
individuos de la población y un modo de herencia predecible según las leyes de Mendel.
Esta variación puede ser considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios
fenotípicos heredables significativos hasta la
variación de un solo nucleótido. Un marcador ideal debe ser: altamente polimórfico o
variable dentro y entre especies, de herencia
mendeliana no epistática (sin interacción
Son características fenotípicas de fácil
identificación visual tales como forma, color,
tamaño o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes «descriptores», a la hora
de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo,
alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo,
hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan
para inscribir e identificar variedades de trigo
en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentación. Este tipo de marcadores
contribuyó significativamente al desarrollo
teórico del ligamiento genético y a la construcción de las primeras versiones de mapas
genéticos. Un gran número de marcadores
morfológicos ha sido mapeado en tomate y
maíz. En girasol, los primeros híbridos se obtuvieron utilizando el «color de hipocótile»
como marcador ligado al gen ms de
androesterilidad; de este modo las plantas
verdes que eran androestériles se utilizaban
como líneas maternas y las plantas con
antocianas que eran fértiles se eliminaban del
lote de producción al comienzo de su desarrollo.
Las principales limitaciones de los marcadores morfológicos se encuentran en: i) número reducido de marcadores disponibles en
cada población, ii) bajo nivel de polimorfismo,
iii) pueden producir alteraciones fenotípicas
que dificultan el desarrollo de la planta, iv)
varios se hallan bajo control poligénico, v)
dominancia, vi) muchos de ellos se expresan
en estadío de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluación en los programas de mejoramiento. No obstante, los
marcadores morfológicos permanecen como
caracteres útiles en la identificación de materiales dado que representan un conjunto de
genes que pueden ser evaluados con métodos sencillos y a bajo costo.
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3 Isoenzimas
Se definen como diferentes formas
moleculares de una enzima, que poseen una
actividad catalítica común, es decir actúan
sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en
el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos, originando proteínas con la misma actividad biológica pero con
diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan
patrones característicos de migración
electroforética de las formas iso-enzimáticas.
Varios factores determinan el patrón de
bandas o zimograma:
1) Número de genes que las codifican.
La presencia de varios genes codificando para
una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicación génica y subsecuente divergencia a través de mutaciones diferentes
en cada caso.
2) Estados alélicos. El proceso más simple de generación de nuevas formas
enzimáticas es la mutación de un gen estructural; las variantes alélicas se denominan
aloenzimas. Estos marcadores muestran
codominancia
3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos. La enzima funcional puede
estar compuesta por un número variable de
sub-unidades. En las formas más simples o
monoméricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve más compleja,
encontramos enzimas activas compuestas
por dímeros, tetrámeros, etc.. En este caso
el individuo heterocigota presenta bandas
adicionales no presentes en los homocigotas,
que se generan por la combinación de subunidades codificadas por los distintos alelos
o loci. (Fig. 1).
4) Compartimentalización subcelular. Se
encuentran formas enzimáticas localizadas
en citoplasma, cloroplasto o mitocondria,
codificadas todas por genes nucleares pero
con diferentes velocidades de migración.
Las isoenzimas se obtienen por
homogenización del tejido (semilla, raíz, hoja)
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Figura 1: Locus isoenzimático Pgd-3 en girasol. Variantes
alélicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas y
F1 heterocigota
en soluciones «buffer» y se analizan mediante electroforesis en un soporte sólido, generalmente almidón. El gel puede ser cortado
en capas horizontales y cada una se destina
a una solución de revelado específica que
consta de un sustrato, un colorante y
cofactores, disueltos en un buffer apropiado.
La preparación del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo.
Las enzimas se clasifican de acuerdo a su
función y se representan con una sigla de tres
letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol
dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX),
hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP, esterasas
EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y
transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Los
loci en general se representan con las tres
letras señaladas en tipo cursiva y se agrega
un número para designar al locus y una letra
para el alelo, de acuerdo a distancias decrecientes de migración. Por ejemplo: Adh-1a,
Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c.
Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales
para determinar variabilidad y estructura
genética, sistemática y biología evolutiva así
como en descripción de germoplasma e identificación de variedades. Su aplicación en la
construcción de mapas se ha visto limitada
por el número de marcadores isoenzimáticos
disponibles, en general menor a 50 y por su
reducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otro
lado, las formas enzimáticas extraídas de hoja
o raíz (no así las de semilla) presentan variaciones en relación a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo
cual afecta la reproducibilidad de los
zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia
para relacionar mapas obtenidos a partir de
PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia
distintos marcadores de ADN.
4 Proteínas de reserva
El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su
peso seco. Almidón y proteínas son las dos
macromoléculas más importantes. El contenido de proteína varía según la especie y el
manejo de cultivo a campo. Los valores más
altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los
más bajos en maíz y arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas
ya que en éstas los órganos de reserva o
cotiledones son capaces de almacenar hasta
un 40% de su peso seco en proteínas.
Las proteínas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por
Osborne, quién dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la
solubilidad relativa en diferentes solventes:
albúminas solubles en agua, globulinas en
solución salina, prolaminas en alcohol y
glutelinas en ácidos o álcalis. Para el grupo
de las prolaminas se ha asignado un nombre
específico para cada uno de los cereales. De
esta manera en maíz se la denomina zeína,
en cebada hordeína, en avena avenina y en
trigo gliadina. En el caso específico de trigo a
las glutelinas se las conoce con el nombre de
gluteninas.
En la mayoría de los cereales las
prolaminas y glutelinas están codificadas por
varios genes relacionados conformando familias. Durante la evolución de estos genes
se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos móviles
entre otros re-arreglos cromosómicos. Estos
cambios genéticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies,
así como entre variedades de la misma especie. Además, el análisis genético de cruzamientos ha demostrado que la variación en
el patrón de proteínas es debida a la existencia de variantes alélicas en cada locus.
Las glutelinas se analizan en geles
discontinuos de poliacrilamida con dodecil
sulfato de sodio, en medio básico (SDS-PAGE)
utilizando diferentes tamaños de poros (tamiz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento de
las prolaminas se realiza en electroforesis áci-
Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades
de trigo por SDS-PAGE para su correlación con variables
de calidad industrial.
da (A-PAGE), en geles continuos, utilizando
el principio de diferencias en la carga eléctrica. La visualización se realiza en ambos casos
mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue
R250.
En trigo pan, Triticum aestivum, los genes
estructurales para las dos principales proteínas, gluteninas y gliadinas, están confinados
al conjunto de los cromosomas homeólogos
(cromosomas parcialmente homólogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Los
genes para las subunidades de gluteninas de
alto peso molecular (GAPM) están ubicados
en el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y
1D, cercanos al centrómero. Las gluteninas
de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos
de ese mismo grupo de cromosomas, distantes del centrómero.
El patrón electroforético de las gliadinas
muestra cuatro grupos proteicos denominadas a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y w
se encuentran codificadas por genes del
cromosoma 1 de los tres genomas, próximos
al grupo de genes correspondientes a GAPM.
Los genes de las fracciones a y b se ubican en
el brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y
6D.
La localización cromosómica de los genes
de proteínas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides
tales como nulisómicos o tetrasómicos de la
variedad Chinese Spring. La posición relativa
del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre líneas con contenidos contrastantes de proteína y determinando la frecuencia de recombinación en
la progenie. La posición cromosómica de estas proteínas ha sido estable a lo largo de la
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evolución y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeología
cromosómica de la Tribu Triticeae.
5 ADN y marcadores moleculares
Un marcador de ADN es simplemente un
punto de referencia en un cromosoma, que
puede o no corresponder a un gen. Diversas
técnicas de biología molecular se encuentran
disponibles para detectar variabilidad en la
secuencia de ADN. La reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las
hibridizaciones son algunas de las técnicas
que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para más detalles ver II.- 3)
Los marcadores moleculares pueden ser
clasificados en tres grupos:
A) Marcadores basados en la hibridación
del ADN: los más utilizados en plantas son
los RFLP «restriction fragment length
polymorphisms» o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción de ADN.
Este tipo de estudio involucra la detección
de un segmento específico (marcador
molecular) en el ADN de estudio por hibridación con un fragmento marcado
radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). En el proceso, el ADN
en estudio es digerido por medio de una
enzima de restricción. Este tipo de enzimas
corta el ADN en una secuencia determinada
o sitio de restricción. La variabilidad genética
presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN
genómico debidas a duplicaciones, deleciones,
inserciones, etc. que modifican la distancia
entre pares de sitios de restricción y generan
fragmentos polimórficos (de diferentes tamaños). Los fragmentos clivados por la enzima de restricción se separan por su tamaño
mediante electroforesis y se transfieren a una
membrana donde son hibridados con la sonda. En el proceso, la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en
la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. Para visualizar los
polimorfismos se expone la membrana a una
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placa radiográfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles,
codominantes y multialélicos. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos,
difíciles de automatizar, requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas, trabajar con radiactivos, lo que los hace
relativamente caros.
Los minisatélites o VNTR «variable
number of tandem repeats» son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que
contienen de 9 a 100 pares de bases. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas
de detectar los VNTR ya sea por hibridación
o por técnicas de PCR. El ADN genómico es
digerido con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción que
flanquean las repeticiones en tandem, separado electroforéticamente e inmovilizado en
una membrana. Cuando la enzima de restricción corta las secuencias adyacentes a un locus
hipervariable, la longitud de los fragmentos
de restricción producidos en diferentes individuos varía con el número de repeticiones
de minisatélites. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando
sondas diseñadas a partir de las secuencias
de ADN que flanquean las repeticiones o a
partir de las repeticiones mismas. Estos fragmentos pueden ser considerados como un
tipo específico de RFLP. La diferencia básica
entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNRT las sondas están constituidas por secuencias
homólogas a las secuencias repetidas de los
minisatélites, por lo tanto todos los locus
hipervariables son detectados simultáneamente, mientras que en RFLP, las sondas son
homólogas a secuencias únicas del genoma,
detectando así uno o pocos loci cada vez. De
esta manera, en el autoradiograma al contrario del patrón simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos
homocigotas o dos bandas para genotipos
heterocigotas), para minisatélites se obtiene
un perfil complejo de bandas múltiples. Una
ventaja de los VNRT, es que además de explorar el polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción en cada locus
hipervariable, utilizan también el polimorfismo en el número y distribución de estos
loci a lo largo del genoma, posibilitando así
PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia
la visualización simultánea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta técnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatélites también pueden ser detectados mediante la amplificación
por PCR de los segmentos conteniendo diferente número de repeticiones, utilizando
«primers» o cebadores, que flanqueen dichos
segmentos.
hebras del ADN en estudio presenten sitios
de hibridación con el oligonucleótido en
orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificación. La secuencia del
oligonucleótido es aleatoria al igual que los
sitios de hibridación, por lo que la secuencia
amplificada es desconocida. El polimorfismo
que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. 3).
DAF «DNA amplification fingerprinting» y AP-PCR «arbitrary primer PCR»
son técnicas similares a RAPDs. DAF involucra
el uso de primers arbitrarios de longitud tan
corta como 5 pares de bases. Esto reduce la
especificidad del apareamiento con el ADN
molde y resulta en un perfil más complejo de
bandas. La visualización se lleva a cabo por
medio de geles de poliacrilamida teñidos con
plata. AP-PCR utiliza primers ligeramente más
largos que la técnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de amplificación
son marcados radiactivamente y también
pueden ser resueltos por electroforésis en
geles de poliacrilamida
La ventaja de estas técnicas consiste en
B) Marcadores basados en la amplificación del ADN: mediante la reacción de PCR
«polymerase chain reaction» o reacción en
cadena de la polimerasa de ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias de un segmento específico
de ADN en presencia de una polimerasa de
ADN termoestable. Para ello se utilizan dos
oligonucleótidos llamados «cebadores» o
«primers». El segmento de ADN a amplificar
esta compuesto por dos hebras (a y b), la
secuencia de uno de los oligonucleótidos
hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucleótido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a
la hebra b. Para que exista amplificación del
fragmento es imprescindible
que ambos oligonucleótidos
hibriden en secuencias complementarias presentes en
las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridación
de cualquiera de los
oligonucleótidos impide la
amplificación del fragmento.
La necesidad de disponer
de información previa acerca
de la secuencia del ADN a amplificar para diseñar oligonucleótidos, limitó inicialmente
el desarrollo de marcadores
Figura 3: RAPDs en DNA genómico de trigo candeal.
basados en la reacción de
Genotipos parentales K y D y progenie F7.
PCR en plantas. La primera
solución a este problema vino de la mano de que son rápidas y sencillas, de bajo costo de
los RAPDs «random amplified polymorphic implementación, automatizables y no radioDNAs» o fragmentos polimórficos de ADN activas. La desventaja, además de su baja
amplificados aleatoriamente. Esta técnica reproducibilidad, es que es un marcador dose basa en la utilización de un único minante (al observar un fragmento es impooligonucleótido de 10bp que hibrida al azar sible determinar si el mismo se originó de una
con el ADN en estudio. Para que se genere o dos copias de la secuencia amplificada).
un fragmento RAPD es necesario que las dos
La disminución en los costos de secuen-
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ciación y PCR, junto a la creciente información sobre genomas animales y vegetales han
permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes características,
entre ellos los más frecuentemente utilizados
en plantas son: SSR «simple sequence
repeats» o microsatélites y AFLPs
«amplified fragment length polymorphisms».
Los microsatélites (SSR), son regiones
genómicas hipervariables constituidas por
repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia única. La base genética del
polimorfismo detectado en microsatélites se
basa en la variabilidad del número de repeticiones en tandem y consecuentemente del
tamaño del microsatélite amplificado en individuos de una especie. El microsatélite amplificado por PCR es sometido a electroforesis
en geles de alta resolución que permiten detectar diferencias de 2, 3 o 4 nucleótidos que
corresponden al mínimo polimorfismo de longitud en un microsatélite. Por el alto
polimorfismo que presentan por locus
(multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies
autógamas como el trigo. Estos marcadores
son codominantes, genoma-específicos y altamente polimórficos en comparación con los
RFLPs y RAPDs. Su implementación en un laboratorio requiere de mayor infraestructura
y presupuesto que los RAPDs.
C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una
combinación de RFLP y RAPDs. Esta técnica
consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el
ADN genómico es cortado con enzimas de
restricción (generalmente una de corte raro
y otra de corte frecuente). 2) adaptadores
de ADN de doble cadena se adhieren en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando así el molde para la amplificación del ADN.
3) una fracción de los fragmentos obtenidos
es amplificada selectivamente por la acción
de primers específicos que fueron diseñados
para reconocer la secuencia de los
adaptadores ligados en el segundo paso, el
sitio de la enzima de restricción, más una a
tres bases selectivas al azar agregadas en el
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extremo 3’. El uso de bases selectivas al azar
permite la amplificación de sólo un grupo de
fragmentos de restricción (aquellos en que
coincide la secuencia del adaptador + sitio de
restricción + bases selectivas). 4) análisis de la
subpoblación de fragmentos amplificados
mediante su desnaturalización por electroforesis en geles de alta resolución (poliacrilamida) y visualización por autoradiografía o
por tinción con nitrato de plata (Fig. 4). Su
implementación en laboratorio requiere de
una infraestructura y presupuesto similar a los
microsatélites. Estos marcadores presentan
un alto poder de detección de la variabilidad
genética, ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de
sitios de restricción (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). La base
del polimorfismo es la ausencia o presencia
de fragmentos amplificados de un tamaño
determinado y al igual que en los RAPDs, no
es posible distinguir individuos heterocigotas
por lo que se trata de un marcador dominante. Es un marcador mucho más robusto
Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinaciones
de primers para las enzimas de restricción Pst I y Mse I
en las variedades K y D.
PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia
que los RAPDs, ya que en la amplificación se (ARNm transcripto a ADN utilizando la enziutilizan oligonucleótidos más largos, que au- ma transcriptasa reversa). La ventaja de los
mentan significativamente la especificidad de ESTs, al ser derivados de ARNm maduro es
la reacción sin perder las ventajas de la am- que generalmente se ven libres de intrones
plificación de secuencias al azar (no requiere y de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTs
información previa de secuencia de ADN). representan genes funcionales y son por lo
Otra ventaja de los AFLPs es el número de tanto más útiles como marcadores
fragmentos (marcadores) resueltos por moleculares que las secuencias anónimas.
electroforesis que oscila entre 30 - 50 contra
En una variante conocida como CAPs
los 4 – 10 de RAPDs.
«cleavage amplified polymorphic
Para una utilización más eficiente en pro- sequence», los productos de amplificación de
gramas de mejoramiento de marcadores secuencias específicas se digieren con una
RFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de enzima de restricción. Este método permite
transformarlos en marcadores PCR alelo-es- identificar individuos heterocigotas, por lo
pecíficos, que son económicos, robustos y de que se comporta como marcador codomisencilla implementación en cualquier labora- nante. La información para la secuencia de
torio.
los primers utilizados en CAPs puede proveExisten distintas estrategias para la con- nir de un banco de genes o de clones
versión de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPs genómicos o de cDNA. Recientemente meen marcadores PCR alelo-específicos, en ge- diante CAPS ha sido posible seleccionar planneral ligados a un caracter de interés agro- tas de trigo hexaploide portadoras del alelo
nómico. Se conocen como STS «sequence- 2NS, proviente de una translocación de
tagged sites». En estos casos se aisla el frag- Triticum ventricosum que contiene genes de
mento de ADN polimórfico del gel, se clona, resistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5).
se secuencia y se diseñan
oligonucleótidos específicos de
alrededor de 20 pb, para ser utilizados como cebadores. Cuando se parte de un fragmento
RAPD, el marcador derivado mediante este proceso es conocido
como SCAR «región amplificada de secuencia caracterizada». El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronómico Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificación). Calles
superior, por ejemplo un alelo 2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109).
4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas
asociado a la resistencia a un pa- Calles
2AS/2NS.
tógeno y el marcador entonces
se hace evidente con una simple
reacción de PCR. El problema que enfrentan
Existen técnicas de alta resolución que
estas estrategias suele ser el bajo nivel de permiten detectar mutaciones a nivel de un
polimorfismo entre variedades de una espe- solo nucleótido conocidas como SNPs «sincie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las po- gle nucleotide polymorphisms». Entre ellas,
sibilidades de encontrar mutaciones útiles los SSCPs «single-strand conformational
para desarrollar estos marcadores. De todos polymorphism» tienen la capacidad de demodos, existen antecedentes exitosos de tectar cambios de un solo nucleótido en fragdesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe- mentos de más de 1000 pares de bases. La
cíficos en trigo para locus altamente técnica de SSCPs se basa en la movilidad de
polimórficos como pueden ser alelos de las cadenas simples del ADN en geles de
gluteninas.
poliacrilamida no desnaturalizantes, moviliLos ESTs «expressed sequence tags» son dad que depende tanto de su tamaño como
similares a los STSs y sirven para los mismos de su secuencia. Las cadenas simples de ADN
propósitos pero derivan de clones de cDNA tienen tendencia a formar apareamientos
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intramoleculares de bases que resultan en
una conformación dependiente de la secuencia y con una movilidad específica en geles
de acrilamida. Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN, aunque sea de un solo par
de bases, causan modificaciones en la conformación y consecuentemente en la movilidad electroforética. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restricción, separando los distintos fragmentos según su conformación por corrida en un gel.
Posteriormente se realiza una hibridación de
Southern a partir del gel con fragmentos específicos como sondas para la hibridación.
Otra metodología para obtener SSCPs consiste en la amplificación de un fragmento específico por PCR y posterior corrida
electroforética en geles de alta resolución.
De la descripción realizada, se desprende
que los marcadores varían ampliamente en
el grado de complejidad del método, el modo
de herencia, el nivel de polimorfismo y en los
factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen
el análisis de un número elevado de individuos. La tabla 1 resume algunos aspectos
importantes a considerar a la hora de elegir
el tipo de marcador a utilizar.
Tabla 1: Comparación entre algunos sistemas de
marcadores moleculares.
6 Lecturas recomendadas
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methods and nomenclature. Canadian Journal of Plant
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