ÁNALISIS DEL CONTENIDO DE PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS

LICENCIATURA EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA
Í DE LOS ALIMENTOS
QUÍMICA
Í
DE LOS ALIMENTOS
ÁNALISIS DEL CONTENIDO
DE PROTEÍNAS
EN LOS ALIMENTOS
2016
Dra. Roxana Verdini
[email protected]
Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
La determinación
ó
de la CANTIDAD DE
PROTEÍNA de un alimento no es sencilla y el
valor obtenido en cada caso depende del
MÉTODO utilizado.
Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA
DE UNA DETERMINADA CADENA LATERAL
AMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).
los resultados analíticos se verán
condicionados por la proporción del
aminoácido en cuestión en las proteínas
sometidas al ensayo y necesitarán ser
referidos a alguna proteína estándar.
Otros métodos se basan en la determinación
del
contenido
(Kjeldahl).
de
NITRÓGENO
Ó
TOTAL
Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
Existen
numerosas fuentes de NITRÓGENO
que p
pueden interferir en
NO PROTEICO q
algunos métodos de análisis:
aminoácidos
i á id
libres,
lib
péptidos
é tid
pequeños,
ácidos
nucleicos,
fosfolípidos aminoazúcares,
fosfolípidos,
aminoazúcares porfirina,
porfirina
algunas vitaminas, alcaloides, ácido
úrico, urea, iones amonio, etc.
Otras
fuentes de interferencia pueden ser
los otros macronutrientes presentes en los
alimentos como hidratos de carbono y lípidos.
Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
Los métodos mas comúnmente empleados son:
Kjeldahl
Kjeldahl/Bethelot
Bi
Biuret
t
Lowry
Absorbancia a 280 nm
Fijación de colorantes
Turbidimétrico
Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
Estos métodos se fundamentan en:
determinaciones de nitrógeno
enlaces peptídicos
aminoácidos
i á id aromáticos
áti
absortividad UV de las proteínas
grupos amino libres
propiedades de dispersión de la luz
capacidad de adhesión de colorantes
Método de Kjeldahl
j
Es
un método oficial descrito en múltiples
p
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y
distintas Directivas Comunitarias.
Se basa en los siguientes supuestos:
la
l proporción
ió de
d nitrógeno
it ó
no proteínico
t í i
en un producto alimenticio es demasiado
pequeña para ser significativa,
significativa
una
determinación del contenido de
nitrógeno total (refleja con suficiente
precisión el contenido de proteína del
alimento,
alimento
la
proporción que representa el nitrógeno
en la mayor parte de las proteínas
alimenticias es de 16%.
Método de Kjeldahl
j
FUNDAMENTO

Involucra la conversión del nitrógeno
presente
t
a
sulfato
lf t
d
de
amonio
i
por
DIGESTIÓN, DESTRUCCIÓN OXIDATIVA O
MINERALIZACIÓN con ácido sulfúrico.
sulfúrico
Posteriormente
el sulfato de amonio se
descompone
por
ALCALINIZACIÓN
con
hidróxido de sodio y DESTILACIÓN del
amoníaco liberado captándolo en una solución
ácida.
Finalmente
del amoníaco.
amoníaco
se realiza una VALORACIÓN
Método de Kjeldahl
j

El ácido sulfúrico OXIDA LA MATERIA
ORGÁNICA y se combina con el amonio
formado.

Los elementos
L
l
carbono
b
e hidrógeno
hid ó
se
convierten en dióxido de carbono y agua.
Durante
la digestión se libera el nitrógeno
proteico para formar iones de amonio.
Esta
determinación
incluye
todo
el
nitrógeno reducido presente (-NH2 y =NH),
de modo que los compuestos amoniacales,
urea y aminoácidos libres son también
valorados.
valorados

El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo
para la
l formación
f
ió de
d burbujas.
b b j
Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES
Digestión:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Neutralización y destilación
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
NH3 + H3BO3
2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O
NH4+ + H2 BO3-
Titulación
H2BO3- + H+
H3BO3
Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

En 1883 el investigador danés Johann
Kj ld hl desarrolló
Kjeldahl
d
lló ell proceso básico
bá i
d l
del
conocido método actual de análisis de
proteínas por el método Kjeldahl,
Kjeldahl
más
propiamente,
para
analizar
nitrógeno
g
orgánico.
El
método original fue
algunas
l
modificaciones.
df




sufriendo
Wilforth (1885)
Gunning (1889)
Arnold
Winkler
luego
Método de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA

En el método original la digestión se
efectuaba con una mezcla de ácido sulfúrico y
anhídrido fosfórico y la oxidación se
completaba
p
mediante
la
adición
de
permanganato de potasio.
Las
modificaciones
df
d l método
del
é d que han
h
resultado más útiles emplean:

óxido de mercurio como catalizador
de oxidación (Wilfoth).
 K2SO4 para aumentar
t
ell punto
t de
d
ebullición del ácido sulfúrico (Gunning).
 CuSO4 también como catalizador de
oxidación (Arnold).
Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

Los catalizadores permiten acortar el tiempo
de digestión y actúan como transportadores de
O2 .
Cuando
se usa Hg como catalizador, éste debe
ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.

Otra modificación ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilación propuesta
por Winkler:

originalmente se utilizaba ácido sulfúrico
valorado para captar el amoníaco,
amoníaco

titulando posteriormente
NaOH valorado.
valorado
su
exceso
con
Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA
La
modificación consiste en:

recibir el NH3 sobre una solución de
ácido bórico,

valorarlo directamente con solución
valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.
Ventajas:
la solución de ácido bórico no necesita
ser exactamente medida,
medida eliminando los errores en
la medición del ácido valorado en el colector y por
otra parte sólo se requiere una solución valorada
H2SO4 o HCl.
Método de Kjeldahl
j
ESQUEMÁTICAMENTE
Método de Kjeldahl
j
ESQUEMÁTICAMENTE
Método de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN
Método de Kjeldahl
j
ALGUNOS EQUIPOS
Los
equipos
p
mas modernos vienen con un
sistema
de
EXTRACCIÓN
Ó
Y
NEUTRALIZACIÓN DE GASES:

una unidad “Scrubber” q
que bloquea
q
el
paso y neutraliza las condensaciones
ácidas,

una bomba de recirculación de agua que
proporciona un gran caudal de vacío para
la aspiración de los gases.
Método de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIÓN, SCRUBBER Y BOMBA
Método de Kjeldahl
j
DESTILADORES
Método de Kjeldahl
j
DESTILADORES Y TITULADORES
Método de Kjeldahl
VENTAJAS DEL MÉTODO
Apropiado
productos.
d
para
Alta confiabilidad.
Usado como método
varios
tipos
de
de referencia.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
Interfieren
proteicos.
proteicos
compuestos nitrogenados no
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.
Método de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIÓN
El
contenido porcentual promedio de N en
las proteínas de diversos alimentos es de
16%.
El
factor para convertir N en proteínas
sería entonces 100/16 = 6,25.
Este
factor general de conversión no es sin
embargo exacto, ya que las proteínas de
origen animal contienen generalmente menos
nitrógeno y las de origen vegetal más.
Así,
Así
el factor de conversión para la
proteína del trigo es 5,7 y para la de
productos lácteos es 6,38.
Método de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIÓN
Actualmente
se conoce el contenido de N, y
por lo tanto el factor apropiado,
apropiado de una gran
cantidad de productos agrícolas.
Debido
bd
a lla confusión
f ó que podría
d í derivarse
d
del hecho de utilizar el factor general de
conversión 6,25
6 25 o el específico para la
proteína en estudio

Es necesario aclarar siempre en los
informes el factor de conversión utilizado
para ell cálculo
ál l de
d proteínas.
t í
Método de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIÓN
Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES
Digestión:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Neutralización y destilación
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
NH3 + H3BO3
2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O
NH4+ + H2 BO3-
Titulación
H2BO3- + H+
H3BO3
Método de Kjeldahl
j
CÁLCULOS
%N = V x N x 14 x 100
1000
P
%N = V x N x 0,014 x 100
P
V: mL de ácido
N: normalidad del ácido
P: gramos de muestra
,
equivalente
q
volumétrico del N
0,014:
Método de Kjeldahl
j
Método de Kjeldahl/Berthelot

Este método
E
é d combina
b
l d
la
digestión
ó húmeda
hú d
del método de Kjeldahl con la reacción
colorimétrica de Bethelot.
Bethelot

Al producto de la digestión se le reduce la
acidez,
id
ll
lleva
a volumen
l
fi l y luego
final
l
una
alícuota
se
somete
a
la
reacción
colorimétrica.
colorimétrica

El NH4+ presente en la digestión sulfúrica
reacciona
i
con ell fenol
f
l e hipoclorito
hi
l it de
d sodio
di
en medio alcalino, formándose un complejo de
color azul.
azul

La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.
Método de Kjeldahl
j
Método de Kjeldahl
j
/Berthelot
 La absorbancia del complejo
p j de se lee
a 540 nm.
 Se calibra con solución de sulfato de
amonio.
Por lo tanto lo que se determina por
este
t método
ét d es NITRÓGENO TOTAL.
TOTAL
Otros métodos
m
 Los alimentos son una matriz compleja
p j
por lo que se sugiere que estos métodos
empíricos
p
e indirectos sean calibrados con
el método de Kjeldahl.
 Se espera una buena correlación entre
estos dos tipos de determinaciones de
proteína
í
cuando la
l
relación
l ó
N no
proteico/N proteico es baja y constante.
Son
satisfactorios
para
leche
y
cereales
l
e insatisfactorios
i
ti f t i
para la
l
mayoría de los vegetales y mezclas de
alimentos.
alimentos
Otros métodos
m
Método de absorbancia a 280 nm

El método se basa en la medición de
absorbancia a 280
80 nm.

La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm.,
nm la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina y al grupo
p
indólico del triptofano.
Otros métodos
m
Método de absorbancia a 280 nm

Es un método
E
é d
destructivo.
simple,
l
rápido
á d
y
no

Es
un
método
directo
para
la
determinación
de
proteínas
que
puede
aplicarse
li
en algunos
l
sistemas
i t
alimenticios.
li
ti i

Es necesaria la
proteína estándar.
Generalmente
calibración
con
una
se toma una proteína
p
como la Albúmina Sérica Bovina (BSA), que
es soluble en agua, para construir curvas
patrón
ó
que sirvan de
d
referencia
f
para
cuantificar otras proteínas, que serán más
precisas mientras la proteína en cuestión
se parezca más a la BSA.
Otros métodos
m
Método de absorbancia a 280 nm
La
solución
l ó debe
d b ser clara
l
e incolora,
l
l
la
turbidez puede afectar los resultados.

El contenido de aminoácidos aromáticos
difiere considerablemente entre las distintas
proteínas.
t í
Los
ácidos nucleicos interfieren (anillos de
purina y pirimida), no así el amonio.
Otros métodos
m
Método de Biuret
Comprende
un ensayo colorimétrico de un
paso donde se cuantifica la formación de un
p j estable entre p
proteínas y cobre ((II))
complejo
de configuración desconocida.
El
complejo presenta un color violeta
característico, que se puede observar a
por la
310nm o 540-560nm, el cual se da p
coordinación de un átomo de cobre con cuatro
átomos de nitrógeno.
El
complejo se basa en la desprotonación de
los grupos amida para formar el enlace con el
cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares
d electrones
de
l t
lib
libres
d los
de
l átomos
át
d oxigeno
de
i
y de nitrógeno del péptido.
Otros métodos
m
Método de Biuret
Otros métodos
m
Método de Biuret

Después de la adición del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para desarrollar
una coloración de Biuret estable; es necesario
considerar la posible influencia de aminoácidos
libres que forman buffer en configuración tris
y amoniaco.

El complejo tiene dos máximos a 330 y a
545 nm.

La lectura se hace usualmente a 545 nm,
dado q
que a la longitud
g
de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.
Otros métodos
m
Método de Biuret
Es rápido,
rápido simple y no detecta nitrógeno de
fuentes no proteicas o no peptídicas.
Es necesaria la calibración con una proteína
estándar.
Altas
concentraciones de carbohidratos,
carbohidratos
lípidos pueden causar opalescencia en la solución
f
final.
.
Las sales de amonio también interfieren en la
reacción.
Se ha encontrado poca aplicación en análisis
de alimentos debido a la presencia de
interferentes como azúcares reductores que
p
en medio alcalino
reducen el ion cúprico
produciendo
resultados
insatisfactorios.
Ejemplo: leche.
Otros métodos
m
Método de Lowry
El
método
ét d de
d Lowry
L
combina
bi
l reacción
la
ió de
d
Biuret con la reducción del reactivo de FolinCiocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico)
por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína,
cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen,
1988).
1988)
El
proceso de oxido-reducción se acompaña de
lla formación
f
ió de
d un color
l azull característico.
t í ti
Los
quelatos de cobre en la estructura del
péptido
é tid facilitan
f ilit
l transferencia
la
t
f
i de
d electrones
l t
d
de
los grupos funcionales amino al cromóforo ácido.

Este
E
t método
ét d es útil para determinar
d t
i
pequeñas
ñ
cantidades de proteína en una disolución.
El
desarrollo
d
ll de
d color
l
es dependiente
d
di t del
d l pH,
H
que se debe mantener entre 10 y 10.5.
Otros métodos
m
Método de Lowry
Otros métodos
m
Método de Lowry
Tiene
Biuret.
mayor sensibilidad que el método del
La
respuesta del color varía de acuerdo al
tipo de proteína.
La
L
iintensidad
t
id d del
d l color
l
no es estrictamente
t i t
t
proporcional a la concentración de proteína.
Los
iones potasio, magnesio, EDTA e
hidratos de carbono interfieren en la
reacción.
ió
Es
menos afectado por la turbidez de la
muestra.
Es
afectado p
por la presencia
p
de azúcares
reductores al igual que el método de Biuret.
Otros métodos
m
Métodos de adhesión de colorante

Controlando el pH y la fuerza iónica del medio
los g
grupos
up
funcionales ácidos y básicos de las
fu
proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos
de carga opuesta.
Al
realizarse la unión se presenta coloración o
bien un cambio de ésta.
Comúnmente
se usan colorantes
cuales reaccionan a pH ácido con el
d la
de
l lisina
li i
y ell grupo guanidina
idi
d
de
imidazol de la histidina y un número
amino
am
n tterminales.
rm na .
Pueden
adherirse colorantes
CATIÓNICOS
N
((BRADFORD).
DF D).
sulfonados los
grupo ε-amino
l arginina,
la
i i
ell
limitado de α-
ANIÓNICOS
o
Otros métodos
m
Métodos de adhesión de colorante aniónico
El
COLORANTE ANIÓNICO se une a los
grupos catiónicos de los residuos básicos de
las proteínas (histidina, arginina, lisina) y
forman un complejo insoluble.
El
colorante en exceso permanece soluble y
se
relaciona
inversamente
con
la
concentración de proteínas.
El
método con el colorante NARANJA 12
está descripto en la AOAC para leche fluida,
helados, leche en p
polvo descremada (λ=480
nm).
Algunos
compuestos no proteicos como
almidón o metales pueden unirse al colorante.
Otros métodos
m
Método de Bradford
Se
basa en lla unión
b
ó del
d l colorante
l
Coomassie
Blue G-250 a las proteínas.
Las
proteínas (aminoácidos básicos y
aromáticos) se unen a la forma azul para
f
formar
un complejo
l j proteína-colorante
t í
l
t con un
coeficiente de extinción mayor que el
colorante libre.
libre
Este
método es sensible, simple, rápido,
b
barato
t y pocas sustancias
t
i
i t fi
interfieren
en su
determinación.
Entre
E
llas sustancias que interfieren
f
están
á
los detergentes y las soluciones básicas.
No
interfieren los carbohidratos.
Otros métodos
m
Método de Bradford
Los
aminoácidos que son reconocidos por el
colorante son arginina, fenilalanina, triptofano
y prolina.
El
azul de Coomasie libre se detecta a 470
que la forma unida a p
proteínas a
nm mientras q
595 nm.
Esto
se debe a que el Coomassie se une
preferencialmente
a
los
aminoácidos
mencionados y cambia de un estado
catiónico a uno aniónico.
Otros métodos
m
Método de Bradford
Otros métodos
m
Espectroscopia infrarroja
Se
aprovecha la absorción del grupo amida
del enlace peptídico.

Ventajas:
Es
un método
multicomponentes
No
rápido
rápido,
análisis
destructivo
destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibración
complejo
complejo.
de
Otros métodos
m
Espectroscopia infrarroja reflectante

La muestra se ilumina
l
con seis longitudes
l
d
de onda cercanas a la radiación infrarroja y
se detecta la luz reflejada.
reflejada
Consideración
Es necesaria
la calibración contra un
conjunto de muestras estadísticamente
significativas, analizadas por métodos de
referencia tradicionales.
Ventajas
Rápido,
Rápido análisis de multicomponentes.
multicomponentes
Aplicable a materiales sólidos.
Cuantifica proteína en presencia
agua.
de
Determinación
m
de la secuencia de
aminoácidos
La
L
d t mi
determinación
ió
d
de
l
la
composición
m
i ió
proporciona
proteína.
proteína
una
información
sobre
una
A
veces se necesita identificar la secuencia
de los aminoácidos,
aminoácidos para lo que se cuenta con
dos métodos:

secuenciación
i ió de
d la
l cadena
d
polipeptídica
li
tídi
en
equipos
automatizados
llamados
secuenciadores de proteínas.
proteínas

análisis con espectrometría de masas
d los
de
l
péptidos
é tid
generados
d
y sus masas
moleculares respectivas.
Determinación
m
de la secuencia de
aminoácidos
Por
P
ell tamaño
t m ñ
d
de
l
las
m lé l
moléculas,
se
hidrolizan con proteasas específicas, para
posteriormente secuenciar e identificar más
fácilmente porciones de 10 a 20 aminoácidos
de los p
péptidos
p
generados.
g
La
combinación de proteasas específicas y
los péptidos generados alimentados a bases
de datos que tengan la información de
g
enzimáticas,
permiten
p
ir
digestiones
completando las secuencias.
Se
ensaya el orden posible de los péptidos
al compararlos con bases de datos que tengan
la información de digestiones enzimáticas
provenientes de proteínas cuya secuencia ha
sido ya elucidada.
Determinación
m
de la secuencia de
aminoácidos
Pehr
P h Edman
Edm
d
descubrió
b ió una secuencia
i de
d
reacciones que permiten identificar los Nterminales y que al realizarse repetidamente
permiten identificar la secuencia completa de
los p
polipéptidos
p p
en cuestión.
El
reactivo utilizado por Edman es el
fenilsiotiocianato que reacciona con el amino
terminal para producir el feniltiocarbamilo del
p p
péptido.
El
conocimiento de la secuencia de
proteínas es cada vez más necesario para
identificar la presencia de variantes naturales
a la luz de los nuevos alimentos de origen
transgénico.
Determinación
m
de proteínas
p
por
p
electroforesis
Pueden
P d
realizarse
li
electroforesis
l t f
i
en
condiciones nativas en las que las proteínas
migran
conservando
su
diversidad
y
propiedades físicas, especialmente su punto
isoeléctrico y p
peso molecular.
Es
posible utilizarla en una sola dimensión o
en dos dimensiones (2D).
(2D) Se les denomina 1D
o 2D-PAGE (por sus siglas en inglés,
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).
Una
vez realizadas las separaciones,
generalmente se continúa con una digestión
proteolítica y la separación de los fragmentos
por electroelución o para su análisis por
espectroscopia de masas (MS).
Determinación
m
de proteínas
p
por
p
electroforesis
La
L
PAGE puede
d
ll
llevarse
a cabo
b
en
condiciones denaturalizantes si se utilizan
tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol
y ditiotreitol (DTT) y un detergente
desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de
sodio (SDS).
El
tratamiento con ambas sustancias las
despliega y las cargas negativas conferidas
por los g
p
grupos
p
sulfato del SDS p
permite la
migración de las moléculas hacia el ánodo, de
acuerdo
con
su
peso
molecular
exclusivamente.
l i
t
Determinación
m
de proteínas
p
por
p
electroforesis
Las
L
técnicas
té
i
2D permiten
mit
una segunda
d
separación que discrimina proteínas que en 1D
se traslapan,
traslapan
por ejemplo,
ejemplo
cuando son
especies moleculares múltiples, aun cuando se
trate de p
proteínas p
purificadas.
Para
el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separación por carga eléctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separación
por p
p
peso molecular.
Esta
poderosa técnica se ha convertido en
un sinónimo de Proteómica y el mejor método
para la resolución de mezclas complejas de
proteínas.
Determinación
m
de proteínas
p
por
p
electroforesis
Las
L
técnicas
té
i
2D permiten
mit
una segunda
d
separación que discrimina proteínas que en 1D
se traslapan,
traslapan
por ejemplo,
ejemplo
cuando son
especies moleculares múltiples, aun cuando se
trate de p
proteínas p
purificadas.
Para
el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separación por carga eléctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separación
por p
p
peso molecular.
Esta
poderosa técnica se ha convertido en
un sinónimo de Proteómica y el mejor método
para la resolución de mezclas complejas de
proteínas.