Tipificacion antigénica y secuenciación genética de cepas del virus

Resumen: V-003
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Tipificacion antigénica y secuenciación genética de cepas del virus de la rabia
paresiante en la provincia de Corrientes (Argentina). Estado de avance.
Miranda, Amaury O.
Facultad de Ciencias Veterinarias. UNNE.
Sgto. Cabral 2139 (3400) Corrientes.
Telefax: 03783-425753 interno 161.
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La rabia es una zoonosis transmitida al hombre por la inoculación del virus rábico contenido en la saliva de un animal
infectado, principalmente por mordedura. Esta enfermedad tiene una letalidad del 100% si la persona expuesta no es tratada.
En los países en desarrollo, la rabia es un problema de Salud Pública, principalmente por la transmisión por perros,
gatos y murciélagos en áreas urbanas, y por animales silvestres en áreas rurales.
Se considera a los murciélagos hematófagos (Desmodus rotundus, quiróptero mamífero) como la principal fuente
natural de infección y reservorio del agente etiológico, virus de la Familia Rhabdoviridae, Género Lyssavirus, el que se aloja en
la grasa interescapular o grasa café, la que ha sido incriminada como tejido reservorio para el virus rábico, donde permanece
latente durante la hibernación a bajas temperaturas (fundamentalmente en murciélagos no hematófagos), y se ha sugerido que
éste órgano androgénico sirve como un mecanismo de sobrevivencia para el virus durante los períodos interepidémicos.
Características de los murciélagos: Ecología y Mastozoología.
Sub-Reino: Metazoos. Tipo: Vertebrados. Clase: Mamíferos. Sub-Clase: Placentarios. Orden: Quirópteros, el que comprende 19
Familias, unos 189 Géneros y aproximadamente 2.000 especies, muchas aún sin clasificar.
Son mamíferos voladores de hábitos nocturnos o crepusculares, se alimentan de insectos (insectívoros), otros de frutas
(frugívoros), algunos de peces (ictiófagos), otros de sangre (hematófagos).
Los Quirópteros beben agua con frecuencia, por la gran superficie de evaporación de sus alas, y por ello prefieren como
hábitat sitios sombríos, húmedos como grutas, cavernas, los huecos de los árboles, pozos aljibe abandonados, taperas, etc. En
reposo se coloca cabeza abajo asido con las uñas de sus patas, lo que no significa esfuerzo alguno; unas especies son migratorias
e hibernan, pero esto no acontece con los vampiros que son activos durante todo el año.
Es común o frecuente que las hembras tengan una sola cría por vez y la gestación se prolonga entre los cinco y siete
meses. Poseen ojos muy pequeños y de visión débil, con el agravante de que su desplazamiento se realiza normalmente en plena
oscuridad, no obstante su vuelo es elegante, con velocidad y bien orientado, permitiéndole capturar pequeños insectos en vuelo,
ello merced a que emite sonidos ultrasónicos orientadores de sus movimientos (50.000 a 100.000 vibraciones por segundo),
que el oído humano no registra, pero ellos lo perciben perfectamente. El cri-cri
ultrasónico dura 1-2 milésimas de segundo y necesita de la biaudición,
orientación llamada ecolación, la que no funciona cuando el animal aterriza.
Incorrectamente se suele decir que poseen un sistema de radar, lo correcto es
decir de sonar (ondas sonoras) que lo orientan en plena oscuridad.
El vampiro es de tamaño mediano entre los murciélagos, de unos 45 g en estado
adulto (Figura 1), pelo de color pardo a castaño, fino y largo y no posee cola.
Poseen pequeña prominencia en la nariz y su dentadura es la que tiene menor
número de dientes (20),
Figura 1: Desmodus rotundus
en cambio otros tienen 32, y
particularmente un par de incisivos superiores.
Durante la noche pueden andar unas cinco horas y según algunos
Autores su radio d e acción puede ser de unos 6 a 10 km y para otros de 15 a
20 km. La herida que produce el Desmodus es indolora y permite que fluya la
Sangre merced a enzimas que tiene en su saliva que actúan como anticoagulante
y disminuye el dolor, lo que le permite regresar sobre el mismo animal durante
varios días para alimentarse e ingerir sangre casi en la misma cantidad a la de
su peso (unos 30 g por noche), la lesión es relativamente pequeña, de aproximadamente 13 mm de largo por 6 mm de ancho y unos 5 mm de profundidad que Figura 2: Cabeza de Desmodus
produce solamente con los incisivos superiores con los que imprime un leve golpe a modo de sacabocado.
Posiblemente los vampiros son los murciélagos más longevos, pudiendo vivir 14-15 años y más y constituyen colonias
con tan pocos integrantes como 10 y tan numerosas como 300.
Cuando los Desmodus están infectados con el virus de la rabia, y por ende padecen ésta enfermedad, se vuelven muy
agresivos y las luchas se intensifican con las consecuentes mordeduras entre ellos que favorecen la propagación.
Resumen: V-003
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Los murciélagos enfermos de rabia, presentan dificultad para
volar, se
los puede observar durante el día posados sobre el piso con dificultad para
desplazarse (Figura 3), con parálisis de los músculos alares e incontinencia
de orina, dicho estado suele ser corto de unos 5 días y de ordinario termina
con la muerte. La rabia bovina (Paresiante o Desmodina), es una
enfermedad que adquiere características de enfermedad Enzoótica en el
NOA y NEA, involucrando a las provincias de Formosa, Chaco,
Corrientes, Misiones, Salta, Jujuy, Tucumán, Santiago del Estero,
Catamarca y Norte de Santa Fe, región de preferencia como hábitat del
murciélago
reservorio-vector
hematófago
Desmodus
rotundus
(vulgarmente vampiro).
Figura 3: Desmodus rotundus de día sobre piso
Durante casi siete años (desde el primer caso, febrero/97) hasta el último registro correspondiente al mes de
septiembre/2003, se diagnostica para Corrientes casos de rabia todos los años.
Las dimensiones del virión, cuya característica morfológica responde a la forma clásica de bala o proyectil, son 180 nm
de longitud por 75 nm de diámetro. El virus está envuelto por una bicapa lipídica (membrana o envoltura), cuya composición es
semejante a la de la membrana neuronal. En la membrana está insertada la glicoproteína denominada G. Hacia el interior esta la
proteína de matriz o M, la nucleocápside constituida por tres proteínas (N, P y L) y el ácido nucleíco que es un RNA de cadena
sencilla y de polaridad negativa.
La información genética del virus esta contenida en 11.932 nucleótidos determinados en la cepa PV del virus de la
rabia. La posición de los genes en el RNA de cadena negativa es N, P, M, G y L en sentido 3´a 5´
La caracterización genética de los diferentes aislamientos de campo del virus permite la identificación de variantes
virales asociadas con brotes diferentes o provenientes de diferentes reservorios domésticos y silvestres. Por otra parte, también
hay que tener en consideración que brotes definidos solamente a través de los datos de la vigilancia epidemiológica pueden estar
viciados hacia especies animales encontradas más comúnmente alrededor de los asentamientos humanos haciendo aparecer
como responsable del brote a especies que en esa zona determinada sólo cumplen un rol menor en el ciclo de transmisión de la
enfermedad.
En conjunto, los datos proporcionados por el análisis de secuencia de nucleótidos, y la descripción epidemiológica de la
rabia humana y animal son de interés para la vigilancia epidemiológica de la enfermedad, por ello se dispuso realizar la
caracterización genética de los aislamientos de virus rábico recuperados en el período 1997-2003 lo que permitirá señalar la
circulación de las diversas variantes y sus reservorios, información que es de utilidad para el control y prevención de la rabia
humana y animal.
OBJETIVOS
Generales:
- Caracterizar genéticamente los aislamientos de virus rábico recuperado en la provincia de Corrientes (Argentina), entre
los años 1997-2003.
Específicos:
Estudiar en el tiempo y en el espacio los casos de rabia en la región.
- Identificar las variantes antigénicas virales circulantes en la provincia de Corrientes (Argentina), y sus reservorios.
- Identificar las especies silvestres que mantienen los ciclos endémicos de transmisión de la rabia.
- Establecer un mapa nosológico para la región en base a la tipificación de cepas.
MATERIALES Y METODOS
Se procesaron en total 1.232 muestras de encéfalo de diferentes especies durante los años 1997-2003, en los que se
diagnosticó rabia en la provincia de Corrientes. Las especies corresponden a bovinos, equinos, caninos, felinos, porcinos,
caprinos, ovinos, roedores silvestres y sinantrópicos, murciélagos y humanos.
Recepcionada la muestra o extraída la misma en el laboratorio, se procede a su procesamiento de rutina para su
diagnóstico, para lo cual se realizó la prueba de los anticuerpos fluorescentes (AF) o también denominada inmunofluorescencia
directa (IFD) e inoculación intracerebral en ratones destetados (IR), cepa CF1 Romanelli, origen Charles River (U.S.A.), los que
se disponen en el Bioterio desde el año 1960, provistos por el Instituto de Energía Atómica, endocriados por consanguinidad en
sistema intensivo, cuya taxonomía responde a la Clase Mamífera, Familia Muridae, Género Mus, Especie musculus.
De las muestras que resultaron positivas mediante la Prueba de los AF e IR, el 20% tomadas al azar, se procesaron a
través de la prueba del índice de neutralización del virus en ratones (SNr) para determinar que se trate de virus rábico.
Confirmado, se confrontó con anticuerpos monoclonales (Ac Mc) y finalmente mediante transcripción reversa (RT), reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y secuencia génica a los efectos de establecer con precisión y dirimir a qué variante antigénica
corresponde, las 66 muestras positivas.
Resumen: V-003
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
RESULTADOS
De acuerdo a un orden cronológico, se describen los resultado de las muestras procesadas como rutina mediante AF
seguida de la PB, SNr. Ac Mc, RT-PCR, secuenciación.
Se procesaron en total 1.232 muestras de encéfalo de diferentes especies durante los años 1997-2003, procedentes de la
provincia de Corrientes y correspondientes a las siguientes especies: bovinos, equinos, caninos, felinos, porcinos, caprinos,
ovinos, roedores silvestres y sinantrópicos, murciélagos y humanos, registrándose 66 positivos a los AF e igual número
mediante la PB correspondientes a bovinos y equinos. Cuadro 1.
Cuadro 1: Diagnóstico de rutina de rabia mediante AF y PB en 1.232 muestras procedentes de la provincia de Corrientes en el
período 1997-2003
Año
Muestras
Resultado
(=n)
AF+
AFPB+
PB 1997
164
8
156
8
156
1998
171
2
169
2
169
1999
177
5
172
5
172
2000
187
30
157
30
157
2001
179
11
168
11
168
2002
175
4
171
4
171
2003
179
6
173
6
173
Totales
1.232
66
1.166
66
1.166
Las 66 muestras de bovinos y equinos que resultaron positivas fueron procesadas mediante RT-PCR y se establece la
secuencia genética para determinar la variante antigénica y poder comparar con los resultados obtenidos mediante los Ac Ms.
DETERMINACION: RT-PCR Rabia
Figura 4: Prueba de Primers
1
2
3
4
5
6
7
1.200-1.400 pb
8
9
10
Figura 5: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1400 pb
11
1
2
3
15
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13 14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2 8
En la figura 4, se registra las corridas en gel correspondientes a diferentes Primers usados para establecer el
de mejor calidad, y corresponde a 10G-304 (CDC), visible en la calle 5, identifica en 1.200-1.400 pb.
En la figura 5, la calle 21 resulta negativo, como las calles 9, 20 y 21 de la figura 6 los que se repiten para
su confirmación.
1
2
3
4 5 6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27
Figura 6: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1.200-1.400 pb
Resumen: V-003
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
1
2
3
4
5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1.200 pb
21 22 23 24 25 26 27 28
1.200 pb
Figura 7: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1.200-1.400 pb
En el gel de la figura 7, las calles 1 y 21 detectan positivo débil, se repiten, confirmándose en nueva corrida como
positivos. Se logra de ésta forma el resultado positivo RT-PCR en las 66 muestras que en principio lo fueron a los AF y PB.
Análisis Filogenético.
El alineamiento de las secuencias obtenidas se realiza mediante la utilización del programa "Clustal W”, mientras que el
análisis filogenético se realiza por programas como Phylip, MEGA. Las secuencias obtenidas se compararan con secuencias de
variantes de rabia hasta el momento conocidas en las Américas y en el resto del mundo. Se determina el grado de correlación,
análisis de ROC y se emplea el programa Statistix for Windows . Se realiza un estudio retrospectivo sobre la distribución
espacial y temporal de los diagnósticos de rabia en el NE desde el año 1997 al 2003. El análisis espacial se realiza teniendo en
cuenta los cuadrantes en que se subdivide la región y los indicadores se referirán a muertos / población promedio del cuadrante
y el tipo de virus (cepa) actuante. Se observa si existe alguna tendencia a formar conglomerados de acuerdo a la ubicación
geográfica (componente básico para un programa de control). Otras variables a ser relacionadas son el tipo de explotación y
densidad ganadera.
División del análisis temporal:
a) Construcción del canal endémico: para ello se utiliza la serie histórica hallando la mediana mensual, el primero y el tercer
cuartil. Como instrumento de suma utilidad para el seguimiento del programa oficial de control, el que permitirá cuantificar en
forma objetiva el número mínimo de casos necesarios para emitir un diagnóstico de epidemia.
b) Análisis de series cronológicas: la variación de la frecuencia de presentación de una enfermedad a través del tiempo se
explica porque ella está generalmente influenciada por diversos factores que se presentan con cierta regularidad, e intentará
descubrir cuál es la tendencia secular de la enfermedad y la probable existencia de variaciones cíclicas y estacionales.
Inicialmente se utiliza el modelo clásico que asume que las variaciones aleatorias de corto plazo en los puntos del tiempo
estudiados se neutralizan entre sí promediando cero (Lapin, 1973). Para ello se utiliza el programa Statistix 7.0.
BIBLIOGRAFIA:
- Cisterna, D. y col. Antigenic and molecular characterization of rabies virus in Argentina. www.Elsevier.com/locate/virusres
- Miranda, A.O., Brunel, C.M. (1991).Tres casos de Rabia en "Coatí" (Nasua sp.). Diagnósticados en la provincia de Formosa
(Argentina). Revista Veterinaria. Facultad de Ciencias Veterinarias de Corrientes. UNNE. Vol. III, Nº2: 8-84.
- Miranda, A.O. y Brunel, C. (1992). Inmunización Antirrábica en Humanos con Vacuna obtenida en cerebro de Rata Lactante.
Parte 1: Respuesta Inmune empleando distinta frecuencia de dosificación". Ciencia Pet's. Vol. 8-Nº 44: 286-291.
- Miranda, A. O.; Acosta, R. S. (2001). Diagnóstico de rabia mediante el uso de los anticuerpos fluorescentes en impresión
corneal de un humano de la ciudad de Corrientes (Argentina). Anuario en C. D. del III Congreso Argentino de Zoonosis. II
Congreso Latinoamericano de Zoonosis. 7 al 10/08/01. Bs. Aires. Argentina.
- Miranda, A. O.; Acosta, R. S. (2001). Persistente epidemia de rabia bovina (Paresiante) en la provincia de Corrientes
(Argentina). Anuario en C. D. del III Congreso Argentino de Zoonosis. II Congreso Latinoamericano de Zoonosis. 7 al
10/08/01. Bs. Aires. Argentina.
- Smith J. (1995). Molecular epidemiology of rabies in the United States. Seminars in Virology. Vol 6: 387-400.
Consta a la fecha de 108 citas por tratarse de tema de tesis, la que podrá consultarse y/o requerirse al publicarse como final que
incluya discusión y conclusión