Aplicación de herramientas para diferenciar distintas especies de

ikerketak
RODAL DE PINUS NIGRA
FOTO: A. CANTERO
Aplicación de herramientas
para diferenciar distintas
especies de pinos
Algunas veces, resulta muy difícil diferenciar distintas especies de pinos en el
monte, sobre todo cuando están mezcladas y se trata de árboles adultos. Para
conseguirlo, se presenta un método basado en técnicas moleculares a partir de su
material genético (ADN), muy útil cuando resulta complicado hacerlo basándose
en la morfología de los individuos.
TEXTO: GUTIÉRREZ I., ARAGONÉS
A., HERNÁNDEZ M., CANTERO
A, ESPINEL S, RITTER E.
(NEIKER-ARKAUTE)
U
na de las tareas a las
que se enfrenta un
técnico forestal es un
certero reconocimiento de
las especies forestales.
Aunque la mayor parte de
las especies presentes en el
46
sustrai.68
País Vasco suele tener
caracteres fácilmente reconocibles, existen otras que
por su rareza o por su similitud con especies semejantes pueden llevar a situaciones de incertidumbre. El
problema se agrava en el
caso de hibridaciones o de
empleos de variedades o
subespecies no tan fáciles de
reconocer.
También surgen problemas cuando en habitats ecológicos similares, especies
diferentes tienden a adoptar
características externas parecidas, sobre todo si se trata
de bosques de gran edad.
Éste puede ser el caso
que aquí se desarrolla. En
un inventario realizado por
un técnico forestal vasco en
el sur de la sierra de Gredos
(Avila) se muestrearon pies
naturales de Pinus sylvestris
y Pinus nigra de varios
siglos de edad, de formas
extrañas y sin los caracteres
morfológicos que ayudan a
clasificarlos (por ejemplo,
corteza anaranjada y acículas (hojas de los pinos) cortas del primero y entrenudos
constantes del segundo).
Entre ellos apareció un
ejemplar de pino muy viejo,
con corteza de color claroanaranjada y acículas de longitud intermedia entre
ambas especies.
Ante la imposibilidad de
determinar visualmente la
especie a la que pertenece
este ejemplar, fue necesario
recurrir a una herramienta
alternativa como son los
marcadores moleculares.
Los marcadores moleculares (fragmentos de ADN)
presentan un gran potencial
para la determinación de la
variación genética inter e
intrapoblacional así como
para su utilización en programas de mejora genética.
El advenimiento de la
técnica AFLP (Polimorfismo en la Longitud de
Fragmentos Amplificados)
ha proporcionado una
nueva clase de marcadores
altamente polimórficos. Su
ventaja sobre otros marcadores es su alta reproducibilidad lo que unido a su
carácter polimórfico les
confiere una enorme capacidad para discernir entre
especies, razas e incluso
individuos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población de muestreo
Se seleccionaron 5 individuos de cada una de las especies de pino: Pinus radiata,
Pinus pinaster, Pinus nigra y
Pinus sylvestris así como
material de la muestra objeto
de estudio. Las muestras se
obtuvieron de distintas zonas
del País Vasco en rodales
monoespecíficos bien caracterizados.
A partir de acículas de
cada árbol, se llevó a cabo la
extracción y purificación del
ADN utilizando para ello un
kit comercial: Dneasy plant
de QIAGEN.
P. nigra
EgaccMagac
P. silvestris
Gredos P. radiata
P. pinaster P. nigra
Egaccmaggt
P. Silvestris Gredos P. radiata P. pinaster
FIGURA 2: IMAGEN DE UN GEL DE AFLP CON DOS COMBINACIONES DE CEBADORES DONDE SE OBSERVA EL POLIMORFISMO
OBTENIDO ENTRE LAS DISTINTAS ESPECIES DE PINO
Marcadores moleculares
A partir del material
genético de cada individuo a
comparar, para el análisis se
han utilizado los AFLPs
(Polimorfismos en la longitud de fragmentos de DNA
amplificados) como marcadores genéticos. Se trata de una
técnica basada en la PCR
(Reacción en cadena de la
polimerasa). El polimorfismo
se detecta como presencia o
ausencia de cada banda o
Combinación de cebadores
EgacaMagac
EgacaMaggt
EgacaMaggc
EgacaMagtg
EgacaMagca
EgacaMagat
EgaccMagac
EgaccMaggt
EgaccMaggc
EgaccMagtg
EgaccMagca
EgaccMagat
fragmento de ADN. Dicha
técnica se ha llevado a cabo
siguiendo la metodología descrita por Vos y co. (1995). El
ADN se corta en sitios determinados utilizando los enzimas de restricción EcoRI y
MseI. A cada fragmento
obtenido se le añaden
secuencias conocidas de
nucleótidos (adaptadores) y
se amplifica cada fragmento
utilizando cebadores complementarios a los adaptadores
Nº Fragmentos polifórmicos
30
13
9
16
11
12
16
12
7
10
7
7
TABLA 1: COMBINACIONES DE CEBADORES AFLP Y POLIMORFISMO OBTENIDO ENTRE LAS DISTINTAS
ESPECIES DE PINUS.
FOTO: NEIKER
con 3-4 nucleótidos adicionales en el extremo 3' terminal,
de modo que se hace una
selección de fragmentos ya
que sería imposible visualizarlos todos.
El análisis AFLP se ha
realizado utilizando el sistema LICOR con cebadores
fluorescentes no radioactivos.
Las amplificaciones se realizan con cebadores que están
marcados con una molécula
IRD800 o IRD700. Los productos amplificados se separan mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida y se
detectan por un láser de baja
energía incorporado a un
escaner. Este sistema genera
una imagen que se transfiere
a un ordenador. En la figura
2 se puede ver el aspecto de
la imagen de un gel de estas
características. Cada banda
que se observa corresponde a
un fragmento amplificado de
ADN.
sustrai
47
Las muestras se obtuvieron de distintas zonas del País Vasco,
en rodales monoespecíficos bien caracterizados.
tificar se trata de un ejemplar de Pinus nigra ya que se
agrupa claramente con los
individuos de esta especie.
Tambien se observa que las
cuatro especies de pino estudiadas se agrupan entre sí lo
que nos indica que la técnica
utilizada es capaz de discriminar entre estas especies a
pesar del número reducido
de muestras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se han analizado 12 combinaciones de cebadores para
la obtención de fragmentos
AFLP. Se han obtenido un
total de 150 fragmentos polimórficos. La cantidad de
fragmentos polimórficos
generados por combinación
de cebadores se puede ver en
la tabla 1. El número medio
de bandas polimórficas obtenido por combinación de
cebadores es de 12,5. El
número máximo de bandas
por combinación de cebadores ha sido de 30 y el número
mínimo 7. Sólo se tuvieron
en cuenta las bandas claras
que variaban entre las poblaciones.
Con los datos obtenidos se
construyó una matriz de presencia/ ausencia de bandas
polimórficas para cada
muestra de pino (1 presencia
de banda, 0 ausencia).
Bibliografía
EJEMPLAR DE PINO RADIATA CON MÁS DE 100 AÑOS DE EDAD.
Esta matriz se transformó en una matriz de similitud utilizando el coeficiente el de "correspondencia
simple" (Sneath y Sokal,
1973). A dicha matriz de
similitud se le aplicó un aná-
FOTO: MARIO MICHEL
lisis cluster con el método
UPGMA generando un dendrograma que se muestra en
la Figura 3.
Tal como se puede apreciar en la Figura 3, podemos
afirmar que el árbol sin iden-
SNEATH, PHA. and SOKAL
RR. (1973). Numerical
Taxonomy. Freeman. San
Francisco. 573 pp.
VOS P., HOGERS R.,
BLEEKER M., REIJANS M., VAN
DE LEE T., HORNES M.,
FRIJTERS A., POT J., PELEMAN
J., KUIPER M., ZABEAU M.
(1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting,
Nucleic Acids Res. 23:44074414.
FIGURA 3: AGRUPACIÓN DE LAS MUESTRAS DE PINO ESTUDIADAS TRAS LA APLICACIÓN DE UN COEFICIENTE DE SIMILITUD Y UN ANÁLISIS CLUSTER (METODO UPGMA) A LAS BANDAS POLIMÓRFICAS OBTENIDAS
AFLPS. (NIGRA=PINUS NIGRA, PIN= PINUS PINASTER, SYL =PINUS SYLVESTRIS, RAD=PINUS RADIATA, GREDOS= ÁRBOL SIN IDENTIFICAR).
MEDIANTE
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sustrai.68