Clases 2

CAPTURA Y GESTIÓN
DE IMÁGENES
INSTRUMENTOS DE CAPTURA
 DIBUJO A MANO ALZADA
 INSTRUMENTOS DE DIBUJO: RETÍCULA, CÁMARA CLARA
 ESCÁNER
 CÁMARA FOTOGRÁFICA ANALÓGICA
 CÁMARA DE VIDEO ANALÓGICA
 CÁMARAS DIGITALES
DIBUJO EN MICROSCOPÍA
 Muy útil para reproducir el original, realizar medidas o reconstrucciones
seriadas
 OCULAR CUADRICULADO (largo y poco preciso), PROYECCIÓN sobre la
mesa o superposición de la imagen y el lápiz mediante CÁMARA CLARA o
tubo de dibujo
Retículo en cruz, escala doble de medidas y retícula
ESCÁNER
 Exploración de la imagen por un haz luminoso
 Luz reflejada se dirige a un CCD (dispositivo de carga acoplada o adyacente)
 Captura toda la imagen de una vez y la transforma en señales eléctricas
 Conversión en formato digital en un DAC (conversor analógico-digital)
 Transmisión de la información al ordenador
 Se obtiene un archivo de alta resolución
DISPOSITIVOS DE CAPTURA DE IMÁGENES
 CÁMARA FOTOGRÁFICA ANALÓGICA: captura la imagen en soporte analógico
(película fotográfica) que hay que procesar antes de visualizarlo
 CÁMARA DE VIDEO
 CÁMARA FOTOGRÁFICA DIGITAL
DISPOSITIVOS DE CAPTURA DE IMÁGENES
 CÁMARA FOTOGRÁFICA ANALÓGICA
 CÁMARA DE VIDEO: Trabaja en tiempo real. CCD, como en el escáner, requiere
dispositivo digitalizador en el ordenador, para generar archivo gráfico a
expensas de la imagen captada del microscopio
 CÁMARA FOTOGRÁFICA DIGITAL
Tarjeta digitalizadora
DISPOSITIVOS DE CAPTURA DE IMÁGENES
 CÁMARA FOTOGRÁFICA ANALÓGICA
 CÁMARA DE VIDEO
 CÁMARA FOTOGRÁFICA DIGITAL: Directamente digitaliza la imagen capturada
del microscopio, pudiendo transferirla a un sistema de almacenamiento en el
ordenador
Cámara fotográfica digital
SISTEMA DE ILUMINACIÓN
 CAMPO CLARO: imágenes normales, contraste de fases positivo y polarización
sin compensadores
 CAMPO OSCURO: contraste de fases negativo, polarizadores cruzados y baja
fluorescencia. Potente, SIN burbujas en medio de montaje de la preparación
 Necesario buen contraste de la preparación, control mediante uso de FILTROS
DIGITALIZACIÓN
 Mediante dispositivo de conversión de datos analógicos en digitales
 Captura de distintas señales de video (RGB): da imagen en color (píxeles)
 ESPACIAL: descripción de puntos por coordenadas numéricas (px/área)
 INTENSIDAD LUMINOSA: nivel de gris de cada punto (imágenes en B/N)
 Cada píxel tiene asignado un valor tonal:
 Blanco, Negro (1, 0)
 Diferentes niveles de gris
 Color: tres valores de intensidad (R, G, B) por píxel
PROFUNDIDAD DE BITS
Cantidad de bits usados para definir cada píxel:



Imagen bitonal: píxeles de 1 bit cada uno (0 negro y 1 blanco)
Imagen a escala de grises:
2 bits: 22, 0 0 (negro), 0 1, 1 0 (grises), 1 1 (blanco)
8 bits: 28 = 256 tonos de gris por píxel
Imagen en color: de 8 a 24 bits, (8 rojo x 8 azul x 8 verde)
224 = 16,7 millones de colores
RESOLUCIÓN
300 ppp
100 ppp
50 ppp
DIMENSIONES DE PIXEL: Alto x ancho x dpi (puntos por pulgada)
Ejemplo: documento A4 (210 x 297 mm) escaneado a 300 dpi:
1 pulgada = 25.4 mm
Dimensiones en pulgadas: 8.27 x 11.69
8.27 x 300 = 2481 píxeles; 11.69 x 300 = 3507 píxeles
2481 x 3507 píxeles
TAMAÑO DE ARCHIVO:
Dimensiones de píxel x profundidad de bits
8
Documento A4 a 8 bits (256 colores): 2481 x 3507 x 8 = 8700867 bytes
8
1 Kilobyte (KB) = 1.024 bytes
1 Megabyte (MB) = 1.024 KB
1 Gigabyte (GB) = 1.024 MB
1 Terabyte (TB) = 1.024 GB
TIPOS DE ARCHIVOS DE IMAGEN
FORMATO
GRÁFICO
COMPRESIÓN
TAMAÑO EN
DISCO
COLORES
BMP
NO
12.099 kb
256
GIF
SI
14.397 kb
256
JPEG
SI
5794 kb
16 Millones
TIF
NO
12.098 kb
256
Se facilitan los tamaños y resoluciones obtenidas al capturar una imagen
original de 5526 x 2241 píxeles (76,75 x 31,13 cm), guardada en cada uno
de los formatos descritos
RELACIÓN COMPRESIÓN/CALIDAD Y TAMAÑO
(ARCHIVOS JPEG)
Compresión 10
Tamaño 15 Kb
Compresión 40
Tamaño 15 Kb
Compresión 80
Tamaño 8 Kb
Compresión 90
Tamaño 3 Kb
ARCHIVO
GRÁFICO
http://www.serif.com/free-photo-editing-software/
AJUSTES CON LOS PROGRAMAS DE RETOQUE
Brillo, contraste, intensidad
Proporción de color
AJUSTES CON LOS PROGRAMAS DE RETOQUE
Recorte
Giro o volteo
AJUSTES CON LOS PROGRAMAS DE RETOQUE
Inversión
Inserción texto
AJUSTES CON LOS PROGRAMAS DE RETOQUE
Selección
Pintura
AJUSTES CON LOS PROGRAMAS DE RETOQUE
ANÁLISIS DE IMAGEN
Micrómetro ocular
7 divisiones
M. objetivo
M. ocular
En este esquema observado a 500 aumentos, siete divisiones del micrómetro
ocular corresponden a dos divisiones del micrómetro objetivo, es decir 20 m;
por lo que el valor de una división del ocular será de 20/7=2.857 m.
Valor micrométrico (m) = nº divisiones M. Obj./ nº divisiones M. Oc.
TUTORIAL MEDIDAS
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/reticlecalibration/index.html
MORFOMETRÍA Y ESTEREOLOGÍA
 Estudio de las medidas y volúmenes de los componentes de un tejido. Se
utilizan principios estadísticos de muestreo y aplicación de variables.
Interpretación tridimensional de imágenes bidimensionales
 Se usan oculares con retículo, para ir ciñendo los recuentos y mediciones a
los campos que integran cada retícula
 Los recuentos se pueden realizar por TÉCNICAS MICROMÉTRICO OCULARES
sobre retícula o bien mediante análisis de imagen automáticos que evalúan
niveles de gris, forma y tamaño
MICROSCOPIO
NIKON ECLIPSE
E800 CON
SISTEMA DE
CÁMARA DIGITAL
Teclado
Ordenador
conectado
a la cámara
Cámara
digital
DXM1200
Alojamiento de
lámpara para epiiluminación
Microscopio
Nikon E800
PASOS EN EL ANÁLISIS DE IMAGEN
Imagen capturada
Imagen previamente almacenada
DIGITALIZACIÓN
ARCHIVO GRÁFICO
PROCESAMIENTO
SEGMENTACIÓN
IMAGEN BINARIA
REALIZACIÓN DE MEDIDAS
PROCESAMIENTO
Operaciones geométricas y espaciales
(traslaciones, giros, zoom)
Edición
(Selección zonas de interés)
PROCESAMIENTO
Inversión (negativo)
Dilatación y erosión
(Individualizar objetos)
SEGMENTACIÓN
Umbrales (rango o
niveles de grises)
Regiones homogéneas
(bordes o texturas)
IMAGEN BINARIA
Criterios múltiples
(separación colores 1os)
UMBRALES
SEPARACIÓN DE
COLORES PRIMARIOS
Azul
Rojo
Verde
REALIZACIÓN DE MEDIDAS
MORFOLOGÍA
Nº de objetos
Área
Longitud
Perímetro
Diámetro
Distancias
DENSITOMETRÍA (sobre niveles de grises)
Densidad óptica (aporta datos cuantitativos
sobre componentes celulares)
Datos susceptibles de representar
o analizar estadísticamente
REALIZACIÓN DE MEDIDAS Y DATOS ESTADÍSTICOS
http://rsbweb.nih.gov/ij/
http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/3d-viewer/index.html
http://webscreen.ophth.uiowa.edu/bij/vr.htm
http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html
RECONSTRUCCIÓN
FOTOGRÁFICA EN
MICROSCOPÍA ÓPTICA
SOBRE GRANDES SUPERFICIES
1. Captura de secuencia de imágenes parcialmente solapadas:
2. Composición y agrupamiento de las imágenes
EN DOS DIMENSIONES (SUPERFICIE)
EN TRES DIMENSIONES
1. Captura de secuencia de imágenes a diferentes profundidades de
micrométrico, tratando de recoger todo el área de interés
2. Mediante programa de retoque fotográfico, recorte de las zonas
enfocadas de cada imagen
3. Composición y agrupamiento de los fragmentos resultantes en un nuevo
archivo
RECONSTRUCCIÓN 3D EN
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
 Toma de series de microfotografías digitales de la estructura a reconstruir
 Trazado manual de los contornos de la estructura en cada microfotografía
 Mediante aplicaciones informáticas, trazado de una textura sobre las
superficies, dando el aspecto 3D
Unión neuromuscular (músculo en rojo). Detalle de una terminación axónica (verde) en
cuyo interior aparecen numerosas mitocondrias (amarillo) y vesículas sinápticas
(blanco). Cerca del terminal se observan dos axosomas (marrón) también con vesículas
RECONSTRUCCIÓN 3D EN
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:
TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA
TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA
 Obtención de imágenes y modelos tridimensionales (TOMOGRAMAS) de estructuras
celulares, aplicando determinados algoritmos y aplicaciones informáticas
 No produce artefactos al trabajar sobre material vitrificado (-140ºC), no fijado
 Existen dos procedimientos de congelación:
 INMERSIÓN de la rejilla en etano líquido, dentro de N líquido
 CRIOSUSTITUCIÓN: Transferencia al medio de sustitución (acetona) para reemplazar
agua por el mismo (2-3 días a -90º C). Posterior inclusión en resina
Rejilla
Recipiente con
etano líquido
Recipiente con
N líquido
ETAPAS EN LA TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA
 Al CRIO-ME, escoger una sección apropiada para realizar el análisis
 Capturar series de microfotografías digitales entre +60º y -60º
ETAPAS EN LA TOMOGRAFÍA ELECTRÓNICA
 Al MEAV, escoger una sección apropiada para realizar el análisis
 Capturar series de microfotografías digitales entre +60º y -60º
 Obtención del tomograma mediante una aplicación informática
ETAPAS EN LA TOMOGRAFÍA ELECTRÓNICA




Al MEAV, escoger una sección apropiada para realizar el análisis
Capturar series de microfotografías digitales entre +60º y -60º
Obtención del tomograma mediante una aplicación informática
Modelado del tomograma mediante la misma aplicación (coloreado
manual sobre cada microfotografía)
ETAPAS EN LA TOMOGRAFÍA ELECTRÓNICA




Al MEAV, escoger una sección apropiada para realizar el análisis
Capturar series de microfotografías digitales entre +60º y -60º
Obtención del tomograma mediante una aplicación informática
Modelado del tomograma mediante la misma aplicación (coloreado
manual sobre cada microfotografía)
 Disección y análisis
En verde y rojo, cisternas cis y trans; azul: RE; amarillo:
compartimentos entre el RE y Golgi
Tomografía ME de una sección de 250 nm de riñón de rata, obtenida por criosustutución y
congelación a alto vacío. Una de las imágenes de 3.2 nm del tomograma, con los contornos
dibujados por el ordenador
TÉCNICAS
ESPECIALIZADAS EN
DETECCIÓN Y
ANÁLISIS
INMUNOCITOQUÍMICA
INMUNOCITOQUÍMICA EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
PREINCLUSIÓN:
 Observación del material inmunoteñido al MO y su posible TRANSFERENCIA
AL ME, seleccionando determinadas zonas
 Orientación sobre la topografía celular
POSTINCLUSIÓN:
 Utilización de partículas de oro coloidal de distintos tamaños, unidas a un
AC secundario, que se visualizan al ME
 Mucho más fácil penetración de los anticuerpos en cortes ultrafinos
 Posible pérdida de antigenicidad tisular por acción del osmio,
deshidratación o polimerización de las resinas (elevada temperatura)
 Utilización de otros tipos de resinas (Lowicryl) que pueden ser penetradas
por los diversos reactivos
TRANSFERENCIA
ÓPTICO-ELECTRÓNICO
 Perfusión (paraformaldehído y poco glutaraldehído), postfijación y
crioprotección, “golpe de frío” en N líquido y corte en vibratomo
 Osmificación, deshidratación con alcoholes e inclusión en plano
sobre porta sin gelatinar. Cuidado en el manejo de los cortes, por su
fragilidad
 Cubrir con cubre de plástico (transparencia) y polimerizar 48 h a
60ºC
 Identificación de las estructuras al MO. Fotografiar. Tallado de la
zona a la lupa, con ayuda de una cuchilla
 Reinclusión de la pieza obtenida en una cápsula de resina
 Obtención de semifinos, para volver a localizar al MO la estructura.
Fotografiar
 Reinclusión del semifino en una cápsula de resina
 Obtención de semifinos, donde se volverá a observar la estructura,
ahora al ME
TRANFERENCIA ÓPTICO-ELECTRÓNICO
POSTINCLUSIÓN
Método inmunocitoquímico indirecto con oro coloidal:
• Fijación, sección en bloques, osmificación, deshidratación e inclusión
• Ultramicrotomía y confección de rejillas. Todos los lavados, a través
•
•
•
de
microfiltro
Las rejillas se depositan sobre una gota de cada solución, con la cara que
tiene los cortes en contacto con ella
Emplear el AC secundario unido a oro coloidal y lavar
CONTRASTE con acetato de uranilo y citrato de plomo
Doble marcaje con inmunooro coloidal para dos anticuerpos primarios:
• Como el anterior, hasta incubar en mezcla de los dos anticuerpos primarios
•
(distinta especie y no reacción cruzada)
Incubar en mezcla de AC secundarios complementarios de los primarios,
marcados con partículas de oro de 10 y 20 nm
Doble marcaje con proteína A-oro coloidal:
• Incubar en AC 1º, luego en proteína A-oro coloidal y repetir el proceso con el
segundo AC 1º y la segunda proteína A-oro coloidal
PROTEÍNA AORO COLOIDAL
PROTEÍNA A
ORO COLOIDAL
AC
AG
Partículas de oro coloidal de
10 y 18 nm de diámetro
Localización de glutamato
deshidrogenasa (18 nm) y
ornitina trans-carbaminasa
(10 nm) en fracción
mitocondrial aislada de
hígado de rata
Localización de proteínaA-oro coloidal
Inmunomarcaje contra TH en
fibras nerviosas del cerebro
COLOCALIZACIÓN
DOBLES MARCAJES (COLOCALIZACIONES)
Con AC secundarios, sucesivamente, marcados con distintos fluorocromos
• Observar al microscopio de fluorescencia, usando los filtros de excitación
correspondientes a cada fluorocromo
• Comparar las dos imágenes para analizar posible coexistencia de los dos
fluorocromos
Con técnicas de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa
• Incubar con los dos anticuerpos
• Incubar con AC secundario unido al fluorocromo correspondiente a uno de
los AC primarios
• Incubar con 2ª y 3ª capa (conjugada con PAP) y revelar
nNOS
nNOS
CGRP
NPY
nNOS - CGRP
nNOS - NPY
LECTINAS
 Glicoproteínas obtenidas en vegetales, capaces de unirse específicamente a
monosacáridos de la membrana, de forma parecida a la de AG-AC
 Se pueden detectar con ellas cambios funcionales celulares, antes de que se
manifiesten como alteraciones morfológicas (transformaciones neoplásicas)
 La lectina se puede marcar mediante fluorocromos, enzimas u oro coloidal
 Incubación en lectina biotinada, luego en avidina-peroxidasa y revelado con
DAB
 Pueden combinarse para doble marcaje con técnicas inmunocitoquímicas,
realizando los dos protocolos uno a continuación de otro
LECTINAS
Pericardio embrión de ratón
Sinaptosomas-oro coloidal
MICRODISECCIÓN
MEDIANTE CAPTURA
POR LÁSER (LCM)
 Frotis o extensión celular, cortes histológicos, etc. sobre porta, cubiertos
por lámina termoplástica
 Localización al microscopio de la zona a aislar
 Microdisección de la zona por láser infrarrojo, que activa la película
adhiriéndola al tejido, sin impactar directamente sobre éste
 Catapultado por presión fotónica de la muestra a un recipiente
 Determinación de contenido en ADN y/o proteínas, expresión de genes,
identificación de antígenos, etc