Guia electroforesis

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
SECCION DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA
SEGUNDO SEMESTRE – 2007-II
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Introducción
La electroforesis de proteínas se basa en la migración de proteínas a través de un
campo eléctrico. Esta técnica es útil como un método analítico, ya que las proteínas
pueden ser separadas y visualizadas, sean analizadas en su conformación nativa
como denaturada. La electroforesis permite determinar el peso molecular de una
proteína o si está formada por varias subunidades. Estas características pueden
determinarse dependiendo del tipo de electroforesis que se realice.
La electroforesis de proteínas es llevada a cabo generalmente en un gel de
poliacrilamida el cual actúa como un tamiz molecular.
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
El gel SDS-PAGE está compuesto principalmente por los reactivos Acrilamida y bisacrilamida y SDS. Las acrilamidas son agentes que forman polímeros en forma de
una red, dejando poros a través de los cuales pasarán las proteínas. El tamaño del
poro depende de la concentración de estas acrilamidas. Para manipularlo se debe
utilizar mascarilla y guantes ya que es neurotóxica al contacto y por vía respiratoria.
El SDS es un detergente que posee carga negativa e interactúa fuertemente con las
proteínas, favoreciendo su desnaturalización.
La proteína desnaturalizada en
presencia de SDS es así recubierta por una carga negativa uniforme (1.5 g de SDS
por g de proteína, una molécula de SDS para dos aminoácidos aproximadamente).
De esta manera las propiedades eléctricas de cualquier proteína se hacen uniformes
y la migración de la proteína en el campo eléctrico no depende de su secuencia
particular de aminoácidos si no de su tamaño.
Eliminadas otras variables, el factor de migración (Rf) de la proteína será función
únicamente de su peso molecular (PM). Al graficar el logaritmo del peso molecular
versus la distancia recorrida se observará una recta.
La preparación de los geles de poliacrilamida para SDS-PAGE se realiza con el equipo
Mini Protean II de Bio-Rad. Dependiendo del tamaño de las muestras que queramos
separar se utilizara un gel separador con diferente concentación de acrilamida.
Rango efectivo de separación de proteínas en geles de
poliacrilamida
Rango de tamaños
% acrilamida-bisacrilamida
separables (kDa)
en el gel separador
36-205
5
24-205
7.5
14-205
10
14-66*
12.5
14-45*
15
* las proteínas más grandes no se mueven
significativamente en el gel
Componentes para la preparación de Geles de Poliacrilamida
DENATURANTE
NO - DENATURANTE
Reactivo
Agua
Acrilamida:Bisacrilamida
(30:0.8 p/v)
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
Tris-HCl 1.0 M pH 6.8
SDS 10%
TEMED
APS (10%)
Gel
concentrador
(5%) (ml)
(2geles)
Gel separador
(12.5%) (ml)
(2geles)
Gel
concentrador
(5%) (ml)
(2geles)
Gel
separador
(12.5%) (ml)
(2geles)
3.4
0.83
3.3
4
3.45
0.83
3.4
4
---0.63
0.05
0.005
0.05
2.5
---0.1
0.006
0.1
---0.63
---0.005
0.05
2.5
------0.006
0.1
Objetivos
1. Conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE.
2. Observar el perfil de proteínas de las diferentes fracciones obtenidas durante la
purificación de la Pirazinamidasa por cromatografía de intercambio iónico.
Materiales y Reactivos
- Azul brillante de Coomassie (tinción del gel)
- Buffers: Tris-HCl 1.5M pH 8.8 (gel separador) /Tris-HCl 0.5M pH 6.8 (gel
apilamiento)
- Buffer de Corrida electroforética (Trizma base 0.025M, SDS 0.1%, Glicina 0.2M)
- Buffer Tris-HCL 75mM pH 7.5
- Buffer de muestra 2X- No denaturante (20% glicerol, 0.2% Azul de bromofenol
- Buffer de muestra 2X- Denaturante (20% glicerol, 0.2% Azul de bromofenol, 4%
SDS y 0.2% B-mercaptoetanol).
- Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%
- Persulfato de amonio (APS) 10%
- N,N,N´,N´- tetramethyl etilen diamina (TEMED)
- Solución de Acrilamida:bisacrilamida (30:0.8)
- Cámara electroforética y Fuente de poder
- Micropipetas
-
Guantes, mandil, regla, calculadora, papel milimetrado
Preparación del gel SDS-PAGE
El gel está compuesto por dos fases (ver figura adjunta): 1) Gel de apilamiento, el
cual presenta menor concentración de acrilamida y por lo tanto poros de mayor
tamaño. 2) Gel de separación, de mayor concentración y poros de menor tamaño.
Para la polimerización (gelificación) del gel, se mezclan las acrilamidas, el buffer Tris,
el persulfato de Amonio y el TEMED, en cantidades adecuadas. El persulfato de
amonio (APS) dona los radicales necesarios para la polimerizacion de la acrilamidabis-acrilamida, reacción que es acelerada por el TEMED. Esta reacción se inhibe a pH
ácido.
Tratamiento de la muestras para geles denaturantes
1. Tomar 100 uL de la fracción de purificación y colocar en un tubo de
microcentrífuga
2. Agregar 200 uL de Etanol absoluto helado.
3. Dejar en hielo por 10 minutos
4. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
5. Lavar el precipitado con 200ul buffer Tris HCl pH 7.5.
6. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos, descartar el sobrenadante y volver a
centrifugar por 5 segundos para eliminar el resto de buffer.
7. Resuspender el precipitado en 20 ul de buffer Tris HCl pH 7.5
8. Tomar 10 uL de la muestra y mezclar con 10 uL del Buffer de carga de la muestra
2X (Denaturante y No denaturante) , colocar en las tapas parafilm.
9. Hervir la muestra por 5 minutos, transcurrido el tiempo centrifugar durante 5
segundos.
10.Sembrar 10 uL en los pocillos del gel de poliacrilamida.
11.
12.Hacer la electroforesis a 85 Voltios.
13.Detener la corrida cuando el frente de corrida haya llegado ala parte interior del
gel.
14.Colorear con Azul de Coomassie R-250 por espacio de 20 minutos.
15. Desteñir los geles con agua caliente.
16. Analizar el gel y discuir los resultados.
Tratamiento de la muestras para geles No-Denaturantes
El procedimiento para preparar los geles no denaturantes y para el tratamiento de
las muestras a correr es el mismo, con la diferencia que el Buffer de carga para el gel
NO-denaturante no tiene β-mercaptoetanol, ni DTT (Ditiotreitol), así como los buffers
utilizados no tienen SDS.
Las muestras tampoco se hierven para evitar su
denaturación.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función del β-mercaptoetanol?
2. ¿Cuál es el propósito de hervir la muestra antes de la corrida en los geles SDSPAGE?
3. Usted analiza una mezcla de proteínas: la proteína A es dimérica con subunidades
de 25 kDa y 55 kDa, y la otra proteína B es dimérica con subunidades idénticas
de 35 kDa. Haga un gráfico de los perfiles de corrida que espera encontrar si
hace una corrida en gel SDS-PAGE y una corrida en gel PAGE no denaturante.
4. Analice los geles que se han obtenido en la práctica. Se observa diferencia entre
los geles denaturante y no denaturante? Qué diferencias observa entre los
perfiles de proteínas obtenidos en el extracto crudo y en las fracciones obtenidas
durante la purificación? Cómo ha resultado la purificación de la Pirazinamidasa?
Discuta los resultados.
5. Grafique en papel milimetrado el peso molecular (MW) de las proteínas del
Estándar vs el factor de migración (Rf). Utilizando su gráfico, determine el peso
molecular de la enzima Pirazinamidasa.