vacuna de subunidad actinobacillus pleuropneumoniae.

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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k
ES 2 075 325
kInt. Cl. : A61K 39/102
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 91200849.7
kFecha de presentación : 11.04.91
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 453 024
kFecha de publicación de la solicitud: 23.10.91
T3
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k
54 Tı́tulo: Subunidad de vacuna contra el actinobacillus pleuropneumoniae.
k
73 Titular/es: Akzo Nobel N.V.
k
72 Inventor/es:
k
74 Agente: Ungrı́a Goiburu, Bernardo
30 Prioridad: 20.04.90 EP 90200989
Velperweg 76
NL-6824 BM Arnhem, NL
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.10.95
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.10.95
Aviso:
k
k
Van den Bosch, Johannes Franciscus
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 075 325 T3
DESCRIPCION
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La invención se refiere a una composición de vacuna para la protección de cerdos frente a Actinobacillus pleuropneumoniae (App) y también a un método para protección de cerdos por administración de
la citada vacuna.
La pleuroneumonı́a porcina, una grave enfermedad respiratoria en cerdos, está extendida por todo el
mundo y origina cuantiosas pérdidas económicas a la industria porcina debido a muertes por afección
peraguda, tratamiento de cerdos con enfermedad aguda y retrasos en la comercialización de los cerdos
infectados crónicamente. Se ha identificado el Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae)
como agente etiológico de esta enfermedad. Se transmite principalmente por contacto directo entre animales, y la infección resultante da lugar a un curso de enfermedad que varı́a desde peragudo a crónico.
La enfermedad es principalmente una infección del tracto respiratorio que tiene los sı́ntomas de fiebre
alta, molestias respiratorias fuertes, tos y anorexia. El comienzo de la enfermedad es rápido y la morbilidad y mortalidad son elevadas. Como patologı́a, tiene interés el desarrollo y distribución de lesiones
pneumónicas en los pulmones.
Se comprende que se haya intentado controlar estas infecciones de A. pleuropneumoniae entre los
cerdos por programas de vacunación.
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Con este fin, se han vacunado cerdos con bacterinas, bacterias de A. pleuropneumoniae inactivadas.
Nielsen, R.; Nord. Vet. Med. 36: 221-234 (1984), Inzana y col.; Inf. Imm. 56:1880-1889 (1988), Higgins,
R.; Can. Vet, Journ. 26:86-89 (1985).
Una desventaja de esta vacuna está en las reacciones secundarias graves concomitantes. Además, la
vacunación con bacterina da lugar en primer lugar a anticuerpos provocados frente a (lipo)polisacáridos
que son solo especı́ficos para un cierto serotipo de A. pleuropneumoniae y por tanto no son protectores
frente a otros serotipos de A. pleuropneumoniae. Además, las bacterinas de A. pleuropneumoniae solamente proporcionan una protección menor frente a la infección de campo.
También se ha descrito la utilización de extractos capsulares para la protección de cerdos frente a A.
pleuropneumoniae (Fenwick y col; Inf. Imm. 53: 298-304 (1986), Fenwick y col.; Am. J. Vet. Res. 47:
1888-1891 (1986). Sin embargo, la inmunización de cerdos y ratones con estos extractos solo proporcionan una inmunidad parcial. Además, las vacunas basadas en la cápsula solo proporcionan una protección
homóloga, es decir, los cerdos vacunados con una vacuna de cápsula derivada de A. pleuropneumoniae
de un serotipo especı́fico no quedan protegidos frente al ataque de A. pleuropneumoniae de serotipo diferente.
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Las vacunas de A. pleuropneumoniae vivos atenuados adolecen asimismo de una serie de desventajas
entre las que se incluyen el riesgo de inoculación de animales con patógenos atenuados inadecuadamente
y la posibilidad de que las bacterias atenuadas puedan revertir a un estado patógeno resultante de la
enfermedad de los animales inoculados y la posible propagación de los patógenos a otros animales.
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Por tanto, se deja sentir desde hace mucho tiempo la necesidad de disponer de una vacuna de A.
pleuropneumoniae que sea segura, independiente del serotipo y que induzca una respuesta inmune fuertemente protectora en cerdos.
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Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna de subunidades frente
a la pleuropneumonı́a porcina, esencialmente libre de células de A. pleuropneumoniae, que comprende
sustancialmente una combinación de al menos dos componentes de la subunidad diferentes derivados de
A. pleuropneumoniae, donde la citada vacuna:
- induce una buena protección frente a infección por A. pleuropneumoniae en cerdos
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- y es además independiente del serotipo.
La presente invención proporciona una vacuna de A.pleuropneumoniae que está esencialmente libre
de células de A. ,pleuropneumoniae, que se caracteriza porque la vacuna se deriva de una preparación
de proteı́na de la membrana externa de A. pleuropneumoniae que tiene un componente de proteı́na
antigénica dominante mayor de aproximadamente 42 kD medido por SDS-PAGE, y al menos una toxina
seleccionada del grupo que consiste en
1. una hemolisina (Hly) de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 105 kD en SDS-PAGE, y
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2. una toxina de macrófago (Mat) de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 120 kD en SDSPAGE.
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Según la presente invención, se ha encontrado que la hemolisina y/o la toxina de macrófago de A.
pleuropneumoniae combinadas con una preparación de proteı́na de membrana externa de A. pleuropneumoniae que tiene un componente de proteı́na antigénica dominante mayor de aproximadamente 42 kD
medido por SDS-PAGE (citada también como preparación de OMP de 42 kD) puede aplicarse como vacuna frente a infección de A. pleuropneumoniae en cerdos, caracterizándose por propiedades protectoras
extraordinarias no exhibidas por las vacunas de técnicas anteriores.
Se sabe que la hemolisina induce una cierta protección en cerdos. Sin embargo, las vacunas que comprenden hemolisina y/o toxina de macrófago, y una preparación de OMP de 42 kD inducen una protección
completa y heteróloga frente a un ataque con bacterias de A. pleuropneumoniae virulentas (Ejemplos 3
y 5). La combinación del componente Hly o Mat con la OMP de 42 kD da lugar a un aumento de las
propiedades protectoras de la vacuna que es inesperado.
La hemolisina (Hly) se caracteriza porque
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- es una proteı́na inducible por calcio, aislable de un sobrenadante de cultivo de células de A. pleuromoniae
- tiene un peso molecular de 105 ± 5 kD medido por SDS-PAGE (como se ha señalado aquı́),
- es dependiente del serotipo del que se ha aislado la hemolisina, y tiene una actividad hemolı́tica
hacia eritrocitos, que es
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- sensible al calor, y
- sensible a tratamiento con proteinasa K.
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La actividad hemolı́tica de hemolisina puede establecerse según el ensayo expuesto en el Ejemplo 2.1.
La actividad hemolı́tica de hemolisina es inestable y decae durante el almacenamiento además de
decrecer el peso molecular de la proteı́na de 105 kD que, sin embargo, no da lugar a inactivación de las
propiedades inmunizantes.
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Por tanto, la citada hemolisina privada de actividad hemolı́tica o fragmentos antigénicos de hemolisina que aún tienen propiedades inmunizantes pueden incorporarse también a una vacuna de la presente
invención.
De los serotipos 1-12, solamente los tipos 1, 5a. 5b, 9, 10 y 11 producen una hemolisina con actividad
hemolı́tica. (Ejemplo 2,1), produciendo los demás serotipos proteı́nas nohemolı́ticas equivalentes de 105
kD que están relacionadas serológicamente con la hemolisina de proteı́na de 105 kD con propiedades hemolı́ticas (Ejemplo 2.3). Estos equivalentes inmunológicos o fragmentos de los mismos se citan también
aquı́ como hemolisina.
Se sabe además que el antisuero provocado frente a hemolisina derivado de un serotipo hemolı́tico
de A.pleuropneumoniae neutraliza cruzadamente la actividad hemolı́tica de la hemolisina derivada de los
otros serotipos de A. pleuropneumoniae hemolı́ticos (Ejemplo 2.3).
En vista de la estrecha relación inmunológica antes mencionada entre hemolisina derivada de serotipos
diferentes, es de esperar que se puede preparar una vacuna frente a infección de A. pleuropneumoniae que
contenga junto con preparación de OMP de 42 kD una hemolisina que puede estar derivada de cualquiera
de los serotipos o cepas de A. pleuropneumoniae hemolı́ticos de que se dispone.
Una hemolisina que se va a incorporar a una vacuna según la presente invención puede obtenerse
fácilmente por cultivo de células de A. pleuropneumoniae en condiciones que promuevan la expresión de
hemolisina y separando el sobrenadante de las células. La hemolisina se puede purificar posteriormente
por ultrafiltración y precipitación con sulfato amónico seguido de cromatografı́a en tamiz molecular.
Durante el proceso de purificación, se puede hacer el seguimiento de la fracción enriquecida en hemolisina derivada de cepas hemolı́ticas por su actividad hemolı́tica hacia eritrocitos según el ensayo bosquejado
en el Ejemplo 2.1.
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Un miembro de la clase de hemolisinas que se van a incorporar a una vacuna según la invención
se puede aislar de células de A. pleuropneumoniae de serotipo 1 según el procedimiento expuesto a
continuación:
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a. cultivo de la citada bacteria durante 6 horas en caldo Columbia suplementado con 0,01% de NAD,
1% de IsovitaleX y CaCl2 25 mM;
b. concentración del sobrenadante de cultivo libre de células ası́ obtenido sobre un filtro con un valor
de interceptado de 300.000 D;
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c. precipitación del sobrenadante concentrado por adición de sulfato de amonio a una saturación de
55% y subsiguiente centrifugación del precipitado durante 10 minutos a 16.000 x g;
d. separación del precipitado re-disuelto en tampón tris-HCl 10 mM sobre una columna Sephacril
S-200;
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e. recogida del primer pico eluido.
Este procedimiento de aislamiento puede aplicarse para obtener hemolisinas derivadas de otros serotipos de A. pleuropneumoniae (La purificación y caracterización parcial de una hemolisina de serotipo 1
está publicada también por Frey, J. y Nicolet, J., FEMS Microbiol. Letters (1988), 55, 41-46).
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La toxina de macrofago (Mat) se caracteriza porque
- es una proteı́na obtenible de sobrenadante de cultivo de células de A. pleuropneumoniae
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- tiene un peso molecular de 120 ± 10 kD medido por SDS-PAGE (como aquı́ se ha señalado),
- tiene una secuencia de aminoácidos de terminal N:
Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met,
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- es citotóxica para macrófagos alveolares de cerdo, siendo
- sensible al calor, y
- sensible a tratamiento de proteinasa K.
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La actividad citotóxica de Mat puede establecerse por el ensayo descrito en el Ejemmplo 4.1.
La actividad citotóxica de Mat es inestable y decae durante el almacenamiento junto con el decrecimiento del peso molecular de la proteı́na de 120 kD lo que, sin embargo, no es esencial para las propiedades
de inmunización de Mat.
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Por lo tanto, también las citadas proteı́nas desprovistas de su actividad citotóxica de macrofago o
los fragmentos antigénicos de las mismas que aún tienen propiedades inmunizantes pueden incorporarse
asimismo a una vacuna según la invención.
De los serotipos 1-12 de A. pleeuropneumoniae, las cepas de referencia de serotipos 2, 3, 4, 6 y 8
producı́an Mat. Además, se ha demostrado que los anticuerpos provocados frente a Mat derivada de
células de un serotipo especı́fico neutralizan la actividad citotóxica de macrofago de la preparación de
Mat (Ejemplo 4).
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A la vista de la estrecha relación inmunológica entre Mat derivada de diferentes serotipos se deduce
que una vacuna según la invención se puede preparar a partir de los serotipos o cepas de A. pleuropneumoniae disponibles que producen Mat.
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La Mat que se va a incorporar a una vacuna según la presente invención se puede obtener fácilmente
por cultivo de células de A. pleuropneumoniae en condiciones que promueven la expresión de Mat y separando el sobrenadante de las células. La Mat se puede purificar entonces por las etapas de ultrafiltración,
cromatografı́a y concentración por ultrafiltración.
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Durante el proceso de purificación, la fracción enriquecida en Mat puede seguirse por su actividad
citotóxica de macrofago mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 4.1.
Un miembro de las citotoxinas de macrofago que se incorpora a una vacuna según la invención se
caracteriza y se puede obtener por el siguiente procedimiento:
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a. cultivo de bacterias de células de serotipo 2 de A. pleuropneumoniae en caldo Columbia suplementado con 0,01% de NAD a 37◦ C durante aproximadamente 6 horas;
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b. concentración del sobrenadante del cultivo por ultrafiltración utilizando un filtro con un valor de
intercepción del peso molecular de 300.000 D;
c. elución del concentrado sobre una columna CL4B;
d. recogida del primer pico eluido;
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e. filtración de la toxina a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm.
Este procedimiento de aislamiento se puede aplicar también a la obtención de Mat a partir de otras
cepas del mismo o de diferente serotipo.
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El componente no-toxina de una vacuna según la presente invención es una preparación de proteı́na
de membrana externa de células de A. pleuropneumoniae que comprende una proteı́na de 42 ± 5 kD medida por SDS-PAGE (como se ha señalado aquı́) o un fragmento antigénico de la misma como proteı́na
antigénica dominante mayor (preparación de OMP de 42 kD), siendo la OMP de 42 kD
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- modificable por calor
- sensible a tratamiento de proteinasa K
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El antisuero provocado frente a una preparación de OMP de 42 kD derivada de células de serotipo 1
reacciona cruzadamente fuertemente con lisatos de células derivadas de serotipos 1-12 de A. pleuropneumoniae. Como el citado antisuero comprende principalmente anticuerpos que reconocen la OMP de 42
kD en manchas Western, se puede concluir que la OMP de 42 kD es la proteı́na antigénica dominante
mayor en la preparación de OMP purificada (Ejemplo 1.2). Según lo anterior se puede esperar que puede
prepararse una vacuna frente a infección de A. pleuropneumoniae que contenga junto a hemolisina y/o
Mat, una preparación de OMP de 42 kD que puede derivar de cualquier serotipo de A. pleuropneumoniae
disponible.
La citada preparación de OMP de 42 kD se puede obtener por cultivo de bacterias de A. pleuropneumoniae en condiciones de promoción de la expresión de la OMP de 42 kD, sedimentación de la fracción
de membrana celular que sigue a la disrupción de células de A. pleuropneumoniae, por ejemplo, por
ultrasonidos, trituración o prensa francesa, purificación de la citada fracción posteriormente en membranas interna y externa, por ejemplo por sedimentación de gradiente de densidad o por solubilización
diferencial de la membrana interior por detergentes tales como TRITONR X-100 o sarcosilo seguido de
centrifugación, y, si se desea, preparación de una OMP enriquecida después en la OMP de 42 kD.
Un miembro de la clase de preparaciones de proteı́na de membrana externa enriquecidas en la proteı́na
de 42 kD que se incorpora a una vacuna según la invención, se puede aislar de células de A. pleuropneumoniae de serotipo 1 según el procedimiento señalado a continuación:
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a. cultivo de dichas bacterias durante toda la noche en Infusión de Corazón Cerebro suplementada
con NAD al 0,01%;
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b. recuperación de las células bacterianas por centrifugación y nueva suspensión en tampón HEPES
10 mM;
c. disrupción de células bacterianas por tratamiento con ultrasonidos;
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d. separación de los detritus grandes de células por centrifugación y recogida de los fragmentos de
membrana total desde el sobrenadante por centrifugación durante 1 hora a 100.000 x g y nueva
suspensión en tampón HEPES;
e. adición de N-lauroilsarcosinato de sodio (sarcosilo) a una concentración final de 1% (p/v) y agitación
durante 1 hora.
f. recogida de las proteı́nas de membrana externa por centrifugación a 100.000 x g durante 1 hora y
nueva suspensión en H2 O.
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Este procedimiento de aislamiento se puede aplicar para obtener preparaciones de OMP de 42 kD
derivadas de todos los serotipos de A. pleuropneumoniae disponibles.
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Si se desea, se puede purificar la OMP de 42 kD hasta homogeneidad por los métodos conocidos en la
técnica, por ejemplo solubilizando la OMP de 42 kD a partir de la citada preparación de OMP de 42 kD
por extracción con uno o más detergentes seguido de posterior purificación que incluye el intercambio de
iones o la cromatografı́a con tamiz molecular, en condiciones que no afecten las propiedades protectoras
de la OMP de 42 kD.
Una hemolisina, una Mat y una OMP de 42 kD que se van a incorporar a una vacuna según la invención se pueden obtener por sı́ntesis quı́mica, purificación de cultivo de células de A. pleuropneumoniae
o por tecnologı́a de ADN recombinante.
En el último caso, se pueden identificar, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican las
proteı́nas antes mencionadas o fragmentos de las mismas por análisis de selección de un banco de ADN
de A. pleuropneumoniae genómico para clones individuales que comprenden las citadas secuencias, por
ejemplo, utilizando una reacción especı́fica con anticuerpos policlonales y monoclonales provocados frente
a hemolisina, Mat o la OMP de 42 kD. Las secuencias de ácido nucleico se pueden ligar a diversas secuencias de ADN que efectúan la expresión, dando lugar a la llamada molécula de ácido nucleico recombinante
que puede utilizarse para la transformación de un huésped adecuado. Estas moléculas de ADN hı́bridas
pueden derivarse, por ejemplo, de plasmidios o de secuencias de ácido nucleico presentes en virus. La
célula huésped puede ser de origen procariótico, por ejemplo bacterias, o de origen eucariótico tal como
por ejemplo de células de mamı́fero. Las células huésped transformadas se pueden utilizar para producir
la hemolisina o la OMP de 42 kD tras lo cual dichas proteı́nas pueden aislarse y subsiguientemente incorporarse a una vacuna según la presente invención.
En otro modo de realización, se puede preparar una vacuna de vector vivo que comprende microorganismos no-patógenos, por ejemplo, virus o bacterias que contienen los genes que codifican la hemolisina y/o Mat, y la OMP de 42 kD clonados en los mismos o diferentes microorganismos.
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Una vacuna según la presente invención deriva de una hemolisina y/o componente Mat, y un componente de preparación de OMP de 42 kD, derivados ambos de A. pleuropneumoniae. La vacuna puede
comprender los componentes respectivos o fragmentos antigénicos de dichos componentes que tienen aún
propiedades inmunizantes o puede estar en forma de una vacuna de ADN recombinante como se ha
señalado antes.
Fragmentos de polipéptidos inmunoquı́micamente activos adecuados de componentes de proteı́na de
la vacuna de la presente invención que contiene (un) epitope(s) pueden encontrarse siguiendo el método
descrito en la Solicitud de Patente WO 86/06487, Geysen, H.M. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81,
3998-4002, 1984), Geysen, H.M. y col. (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) basado en el conocido
como método de “pep-scan”, en el que se sintetizan una serie de polipéptidos que se solapan parcialmente
que se corresponden con secuencias parciales del polipétido completo que se considera, y se estudia su
reactividad con anticuerpos.
Además, un cierto número de regiones del polipéptido, con la secuencia de aminoácidos establecida,
se pueden designar como epitopes basándose en consideraciones teóricas y el acuerdo estructural con
epitopes conocidos. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de criterios de hidrofilicidad según Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981) y los aspectos de estructura
secundaria según Chou y Fasman (Advances in Enzimology 47, 45-148, 1987).
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Los epitopes de células T que pueden ser necesarios pueden derivarse asimismo sobre bases teóricas utilizando el criterio de anfifilicidad de Berzofsky (Science 235, 1059-62, 1987). Preferiblemente se conjugan
pequeños fragmentos a moléculas portadoras con objeto de elevar su inmunogenicidad. Los portadores
adecuados para este propósito son macromoléculas, tales como los polı́meros naturales (proteı́nas que se
adaptan como llave a cerradura como hemocianina, albúmina, toxinas), polı́meros sintéticos como poliaminoácidos (polilisina, polialanina), o micelas de compuestos anfı́filos como saponinas. Alternativamente,
estos fragmentos pueden proporcionarse como polı́meros de los mismos, preferiblemente polı́meros lineales.
En particular, el componente hemolisina deriva de cepas de A. pleuropneumoniae de serotipo 1, 5a,
5b, 9, 10 ó 11.
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El componente Mat en una vacuna según la invención deriva preferiblemente de células de A. pleuropneumoniae de serotipo 2, 3, 4, 6 u 8.
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La vacuna más preferida según la invención es una vacuna trivalente derivada de la preparación de
OMP de 42 kD, la hemolisina y la Mat de A. pleuroneumoniae.
Se pueden obtener resultados muy favorables con la vacuna trivalente si la OMP de 42 kD deriva de
células de serotipo 1, la hemolisina deriva de células de serotipo 5b y la Mat deriva de células de serotipo
2.
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La vacuna según la presente invención se puede administrar según un esquema de inmunización activa
convencional: administración única o repetida de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La administración de la vacuna
se puede hacer, por ejemplo, por vı́a intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.
15
La concentración de los componentes descritos antes puede variar de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 1 mg por cerdo, por dosis. Un intervalo preferido es de aproximadamente 25 µg a 200 µg
por cerdo.
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Una vacuna según la invención se puede preparar mezclando la hemolisina y/o componente Mat y
componente de preparación de OMP de 42 kD para obtener una composición de actividad inmunizante.
Para administración parenteral, tal como inyección intramuscular, se pueden combinar los citados
componentes con un vehı́culo farmacéuticamente aceptable adecuado, por ejemplo un medio acuoso o
una suspensión acuosa, mezclado frecuentemente con otros constituyentes, por ejemplo, con el fin de aumentar la actividad inmunizante y/o la vida en depósito. Estos constituyentes pueden ser sales, tampones
de pH, estabilizantes, emulsionantes, auxiliares para mejorar la respuesta inmune (emulsiones aceite-enagua por ejemplo de vitamina E, emulsiones agua-en-aceite, compuestos de aluminio, muramil dipéptido,
saponina, polianiones, compuestos anfipáticos o (co)polı́meros de bloque) y conservantes.
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La vacuna se puede combinar también con otros componentes inmunizantes para otras enfermedades
para producir vacunas multivalentes o con otros medicamentos, por ejemplo, antibióticos. Por ejemplo,
se pueden preparar vacunas multivalentes que comprenden adicionalmente material antigénico de uno o
más de los patógenos del cerdo, por ejemplo, virus de pseudorabia, virus de gastroenteritis transmisible,
parvovirus porcino, virus de gripe del cerdo, Mycoplasma hyopneumoniae, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica y Pasteurella multocida.
Ejemplo 1
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1. Purificación y caracterización de preparación de proteı́na de membrana externa (OMP) de 42 kD
enriquecida
Métodos
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Se llevó a cabo la purificación de OMP de la forma descrita por Barenkamp y col. esencialmente (J.
Infect. Dis. 143, 668-676; 1981).
Se cultivó durante toda la noche la cepa de referencia de App serotipo 1 en caldo de Infusión de
Corazón Cerebro suplementado con NAD al 0,01%, se recogieron las bacterias por centrifugación y se
volvieron a suspender en tampón Hepes 10 mM (pH 7,4). Se trataron las células bacterianas por ultrasonidos, mientras se enfriaban en agua con hielo, utilizando un Sonificador Branson (tipo B-12) hasta que
la mayorı́a de las bacterias se desorganizaron y OD660 habı́a disminuido al menos un 90%. Se separaron
los detritus grandes de células por centrifugación a 5.000 x g durante 20 minutos, seguido de centrifugado
a 10.000 x g durante 10 minutos. Se recogieron las membranas del sobrenadante por ultracentrifugado a
100.000 x g durante 1 hora, y se volvieron a suspender en tampón Hepes. Se separó por centrifugación
el material insoluble grande (11.000 x g durante 20 minutos) y filtración de 5 µm. Se añadió Nlaurosilsarcosinato de sodio (sarcosil) al filtrado hasta una concentración final del 1% (p/v). Después de agitar
durante 1 hora, se aglomeraron las OMP insolubles en sarcosil a 100.000 x g durante 1 hora. Se volvieron
a suspender en H2 O y se filtraron por 0,45 µm.
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Las preparaciones de OMP purificadas se analizaron por SDS-PAGE siguiendo el método de Laemmli
(Nature 227, 680-684; 1970).
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Se midió el contenido de proteı́na por un ensayo de FolinCiocalteu modificado (J. Biol. Chem. 73,
627; 1927) utilizando BSA como patrón, se midió el contenido de hidratos de carbono por el ensayo
de fenol-ácido sulfúrico según Dubois y col. (Anal. Chem. 28, 350-356; 1956) utilizando glucosa como
patrón.
Se ensayó por SDS-PAGE la modificabilidad con calor de las OMP por pre-tratamiento de las muestras
en tampón de muestra a varias temperaturas (30◦ C-100◦C) durante 10 minutos, antes de la aplicación al
gel.
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Se ensayó la sensibilidad de las OMP para el tratamiento de Proteinasa K como sigue. Se ajustaron
las muestras a aproximadamente 0,05 mg/ml de proteı́na en tampón Tris-HCL 10 mM (pH 7,5) suplementado con EDTA 5 mM y SDS al 0,5% y conteniendo 100 µg/ml de Proteinasa-K (Boehringer). Después
de la incubación a 37◦ C durante 3 horas con agitación suave y almacenamiento durante toda la noche
a 4◦ C, se analizaron por SDS-PAGE las muestras tratadas con Proteinasa-K y las tratadas en blanco.
Se tiñeron geles con CBB o con plata (Wray y col., Anal.Biochem. 118, 197-203; 1981), o se utilizaron
para manchas Western con un suero de cerdo convaleciente (Anal. Biochem. 120, 46-51; 1982). Los
antisueros de cerdo utilizados eran todos sueros de convaleciente de los cerdos que habı́an sobrevivido
a una infección de campo con serotipo 2 o 9 de App, o de cerdos que habı́an sobrevivido a un ataque
experimental con serotipo 1, 2, 5a ó 9 de App.
Resultados
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La relación proteı́na-hidrato de carbono de la preparación de OMP purificada era 1:0,8. El SDSPAGE con el teñido de CBB de la preparación de OMP purificada reveló una doble banda de 42 kD como
proteı́na mayor, claramente enriquecida al compararla con el total de lisatos bacterianos y preparaciones
de membrana total brutas. La Figura 1 muestra un ejemplo de una exploración de gel de la preparación
de OMP purificada, llevado a cabo con Proteinasa K.
2. Ensayo de antigenicidad de OMP conectado con un Registro de Datos Shimadzu (DR-2). La pureza
de la proteı́na de 42 kD resultó ser de aproximadamente 60% basado en la proteı́na.
El pretratamiento de las OMP purificadas a diversas temperaturas antes del SDS-PAGE reveló que
después de un tratamiento a temperatura de 70◦C o más alta, la proteı́na de 42 kD era la banda mayor. Después de un tratamiento por debajo de 60◦ C, la banda a 42 KD estaba completamente ausente,
mientras que aparecı́a otra banda mayor a aproximadamente 200 kD. Esta banda de 200 kD no estaba
presente después de un pretratamiento a 70◦ C o más alto. Se llega a la conclusión de que la OMP de 42
kD es una proteı́na modificable por calor.
El pretratamiento de OMP purificadas con Proteinasa K antes del SDS-PAGE y subsiguiente teñido
de geles con CBB mostraba que no quedaba ninguna banda después del tratamiento con Proteinasa K,
tampoco la proteı́na de 42 kD mayor, mientras que el tratamiento en blanco no tenı́a efecto sobre el
modelo de proteı́na en los geles. El teñido de los geles con plata mostró que quedaban solo muy pocas
bandas de bajo peso molecular (1220 kD) después del tratamiento con Proteinasa K, mientras que las
muestras tratadas en blanco tenı́an el modelo normal de bandas que incluı́a la banda de 42 kD mayor.
Las manchas Western de los geles con suero de cerdo convaleciente mostraron que no se desarrollaba
ninguna banda después del tratamiento con Proteinasa K, mientras que el modelo normal se desarrolló
después del tratamiento en blanco (Fig. 2). Aparentemente, el suero de cerdo convaleciente no contiene
anticuerpos dirigidos contra las bandas de bajo peso molecular resistentes a Proteinasa K vistas en geles
teñidos con plata. Se llega a la conclusión de que la OMP de 42 kD es sensible a la acción proteolı́tica
de la Proteinasa K.
2. Ensayo de antigenicidad de OMP de 42 kD purificada
Métodos
55
Se vacunaron cobayas subcutáneamente con 20 µg de OMP de 42 kD, purificada como se ha descrito
antes, en una emulsión agua-en-aceite. Cuatro semanas después de la vacunación se recogieron sueros y
se ensayaron en cuanto a manchas Western sobre lisatos bacterianos.
60
(Los lisatos bacterianos se prepararon a partir de las cepas de referencia de App para seroptipos 1-10
como sigue. Se recogieron bacterias de 3 grandes placas de agar de chocolate de 15 cm por cepa, se
supendieron en aproximadamente 10 ml de PBS (0,04 M, pH 7,2) con formalina al 0,3%. Se sometieron
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a lisis bacterias utilizando un tratamiento de ultrasonidos con un Sonificador Branson B-12, el tiempo
necesario para alcanzar una reducción en el OD660 de aproximadamente un 90%. Se centrifugaron las
bacterias y los detritus celulares grandes y el lisato se filtró a través de un filtro de 0,45 µm. se ajustaron
los lisatos a una concentración de proteinas de 1 mg/ml).
5
Resultados
10
Tal como se muestra en la Figura 3, la respuesta a la vacunación estaba principalmente dirigida contra
la banda de 42 kD (doble). Aunque la vacuna se preparó de OMP de 42 kD purificada de la cepa de
referencia de serotipo 1 de App, los anticuerpos reconocı́an una (doble) banda de 42 kD similar en lisatos
de cepas de referencia de App para serotipos de 1 a 10. Se llega a la conclusión de que la OMP de 42 kD
es un antı́geno común reactivo-de cruzamiento, presente en todos los serotipos de App ensayados.
Ejemplo 2
15
1. Actividad hemolı́tica de cepas de App
Métodos
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Se ensayó la actividad hemolı́tica de las cepas esencialmente como han descrito Frey y Nicolet (Infec.
Immun. 56, 2570-2575; 1988). Se hicieron crecer bacterias en caldo Columbia (Difco) suplementado con
1% de IsoVitaleXR (BBL), 0,01% de β-NAD (Sigma) y CaCl2 25 mM (Merck) a 37◦ C durante 4-6 horas
a fase log medio-final. Se centrifugaron células bacterianas a 12.000 x g durante 10 minutos y se hicieron
diluciones en serie del sobrenadante en solución salina tamponada con Tris (TBS; Tris-HCl 10 mM en
NaCl 0,85%, pH 7,5). Se añadieron volúmenes iguales de una suspensión de eritrocitos de caballo al 2%
en TBS a las diluciones de sobrenadante. Se incubaron las mezclas a 37◦ C durante 2 horas con agitación,
seguido de incubación estática durante toda la noche a 4◦C para sedimentación de los eritrocitos. La
absorbancia de los sobrenadantes resultantes se midió a 540 nm (A540 ). En cada ensayo se incluyeron al
menos cuatro controles al 100%, que consistı́an en 1 parte de agua destilada y 1 parte de eritrocitos de
caballo al 2%. Los controles negativos consistı́an en 1 parte de TBS y 1 parte de eritrocitos al 2%. La
actividad hemolı́tica podı́a expresarse como la dilución del sobrenadante de cultivo que da una hemolisis
del 25% respecto a la media del control al 100%. Las muestras se consideraron positivas cuando las
muestras sin diluir mostraban al menos un 25% de hemolisis con respecto a la media del control del
100%. Los controles negativos se utilizaron como control de calidad para la suspensión de eritrocitos, no
sobrepasando una A540 de 0,100.
Resultados
40
En la Tabla 1 se muestran los resultados para las cepas de referencia de App. Empleando el ensayo
descrito en los Métodos, los serotipos de App 1, 5a, 5b, 9, 10 y 11 de App aparecı́an como hemolı́ticos,
mientras que los otros serotipos eran negativos. Al ensayar los aislatos de campo de App, en general los
mismos serotipos eran hemolı́ticos.
TABLA 1
45
Actividad hemolı́tica de cepas de referencia de A. pleuropneumoniae (en cultivo lı́quido)
Serotipo
Cepa de referencia n◦ .
Hemolitica
1
2
3
4
5a
5b
6
7
4074
1536
1421
M62
K17
120
Femφ
WF83
+
+
+
-
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TABLA 1 (Continuación)
Actividad hemolı́tica de cepas de referencia de A. pleuropneumoniae (en cultivo lı́quido)
5
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Serotipo
Cepa de referencia n◦ .
Hemolitica
8
9
10
11
12
405
13261
13039
56153
8329
+
+
+
-
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2. Purificación y caracterización de hemolisina
Métodos
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Para purificación de hemolisina se hizo crecer cepa de referencia serotipo 1 o serotipo 5b de App en
caldo Columbia suplementado con 1% de IsoVitaleXR , 001% de NAD y CaCl2 25 mM a 37◦ C durante
aproximadamente 6 horas. Todas las etapas subsiguientes se levaron a cabo a 4◦ C. Las bacterias se
separaron por centrifugación (30 min. a 16.000 x g) y la filtración se realizó por 0,45 µm utilizando
filtros de membrana de acetato de celulosa (Sartorius). Se concentró el sobrenadante libre de células
por ultrafiltración utilizando sistema MinitanR (Millipore) con un filttro PTMK (interceptación de peso
molecular (MW) 300.000; polisulfona). Se dejó precipitar la hemolisina toda la noche en sulfato amónico
de 55% de saturación, se centrifugó durante 10 minutos a 16.000 x g y se volvió a disolver en tampón
Tris-HCl 10 mM de pH 7,5. Por último, se eluyó la hemolisina sobre una columna SephacrylR S-200 ó
columna CL4B (Pharmacia) utilizando tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) como tampón de elución. El
primer pico eluido contenı́a la hemolisina. Se analizaron las preparaciones de hemolisina purificada con
SDS-PAGE por el método de Laemmli (Nature 227, 680-684; 1970).
35
Se hicieron preparaciones de hemolisina bruta de todos los serotipos por precipitación de sulfato de
amonio de sobrenadantes de cultivo. Todas las preparaciones se almacenaron a -70◦C a menos que se
establezca de otra manera.
40
Se ensayó la sensibilidad al calor por calentamiento de los sobrenadantes del cultivo durante 10 minutos a 60◦ C y subsiguiente ensayo de la actividad hemolı́tica (véase lo anterior). Se ensayó la sensibilidad
a tratamiento de proteinasa K por incubación de sobrenadantes de cultivo con 0,02 mg/ml de proteinasa
K (Boehringer; procedente de T. album) durante 10 minutos a 37◦ C y subsiguiente ensayo de la actividad
hemolı́tica.
45
Se ensayó la sensibilidad a tripsina por incubación del sobrenadante de cultivo en presencia de 0,02
mg/ml de tripsina (Sigma) durante 10 minutos a 37◦C, seguido de adición de 0,03 mg/ml de inhibidor de
tripsina (Sigma) y otra incubación durante 10 minutos a 37◦C. La hemolisina purificada que contenı́a 0,6
mg/ml, se incubó con 0,1 mg/ml de proteinasa K durante 3 horas a 37◦ C y se sometió subsiguientemente
a SDSPAGE. Se ensayó la estabilidad de hemolisina purificada por almacenamiento de preparaciones a
varias temperaturas durante perı́odos diversos y análisis subsiguiente con SDS-PAGE.
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Resultados
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Tanto la hemolisina de la cepa de referencia de serotipo 1 como la de serotipo 5b purificada siguiendo
el procedimiento descrito en los Métodos, mostraban una banda en SDS-PAGE a 105 kD tras teñido
con CBB. En la Figura 4 se muestra una exploración de gel de hemolisina de serotipo 5b purificada.
Aunque el peso molecular (MW) aparente en el SDS-PAGE aparecı́a como aproximadamente 105 kD, la
hemolisina nativa quedaba retenida durante la filtración utilizando un filtro con una interceptación de
peso molecular de 300 kD. Además, del perfil de elución obtenido por filtración con gel se llegaba a la
conclusión de que la hemolisina nativa o agregados de la misma tienen un peso molecular de al menos 10
x 106 D (Figura 5). Utilizando una columna Sephacril(R) S-1000 (Pharmacia) con tiroglobulina bovina
(peso molecular (MW) de aproximadamente 669 kD; Sigma) como proteı́na marcadora, la hemolisina se
eluı́a justo después del volumen hueco mientras que la tiroglobulina era retenida.
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La relación proteı́na-hidrato de carbono de preparaciones de hemolisina purificada era de aproximadamente 10:1.
5
Las preparaciones de hemolisina bruta a partir del sobrenadante de cultivo de las cepas de referencia
enumeradas en la Tabla 1, mostraban todas una banda similar a 105 kD con SDS-PAGE. Según esto,
también las cepas de referencia sin actividad hemolı́tica probadas según el ensayo descrito, mostraban
todas una banda de proteı́nas de 105 kD similar a las cepas hemolı́ticas.
10
La hemolisina purificada tenı́a aún actividad hemolitica, siempre que la purificación se realizara dentro de los 2 a 3 dı́as después del cultivo de las bacterias. La actividad hemolı́tica era estable cuando se
almacenaba la hemolisina a -70◦ C, pero se perdı́a al cabo de unos cuantos dı́as tras almacenamiento a
temperatura de 4◦ C o más alta.
15
Tampoco, según SDS-PAGE, la proteı́na de 105 kD era estable cuando se almacenaba la hemolisina
purificada a temperatura de 4◦ C o más alta. El almacenamiento de hemolisina durante 7 dı́as a temperatura de 4◦ C, a temperatura ambiente o a 37◦C daba lugar a una disminución gradual en el peso molecular
aparente de la banda de proteı́na hasta aproximadamente 65 kD tras el almacenamiento a 37◦ C. Como
ejemplo, la Figura 6 muestra exploraciones en gel de hemolisina purificada mantenida a -20◦C y a 37◦ C.
20
25
La actividad hemolı́tica en sobrenadantes de cultivo de cepas pertenecientes a serotipos hemolı́ticos
(véase Tabla 1) quedaba abolida completamente por calentamiento durante 10 minutos a 60◦C. La actividad hemolı́tica de sobrenadantes de cultivo también era sensible a tratamiento de proteinasa K o tripsina.
La adición de formalina al 0,5% a cultivos y la incubación durante toda la noche a temperatura ambiente
o a 37◦C destruı́a también la actividad hemolı́tica.
3. Ensayo de antigenicidad de hemolisina purificada y reacción cruzada de antisueros
Métodos
30
Se recogieron sueros de cerdos convalecientes que habı́an sobrevivido a una infección experimental con
serotipos 1, 2, 5a o 9 de App, pero que habı́an desarrollado lesiones de pulmón significativas durante la
infección con App.
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Se hicieron aparecer sueros hiperinmunes en conejos por dos inyecciones intramusculares, con un intervalo de 6 semanas, de hemolisina purificada de cepas de referencia de serotipo 1 o serotipo 5b tal como
se ha descrito antes. Los conejos se inmunizaron con dos dosis de 100 µg de hemolisina de serotipo 1
purificada en auxiliar Freund completo y auxiliar Freund incompleto respectivamente. Los conejos se
inmunizaron con dos dosis de 25 µg de hemolisina de serotipo 5b purificado en emulsión de derivado de
tocol. También se provocaron sueros hiperinmunes en conejos frente a hemolisina purificada de serotipo
5b de App, almacenada durante un prolongado perı́odo de tiempo a varias temperaturas: -70◦ C, 4◦C
y temperatura ambiente. Los conejos recibieron 2 dosis intramusculares de 25 µg de hemolisina en una
emulsión agua-en-aceite con un intervalo de 6 semanas. El tiempo de las preparaciones mantenidas a
varias temperaturas era de 75 dı́as en la inyección de cebado y 118 dı́as en la inyección de refuerzo. Todos
los animales eran de calidad SPF o al menos libres de App según el ensayo serológico (Elisa, mancha
Western) con los sueros preinmunes. Los antisueros se recogieron dos semanas después de la inyección de
refuerzo.
Se prepararon lineas de hibridomas que producı́an anticuerpos monoclonales (MAb) por los métodos
convencionales. Se inmunizaron ratones Balb/c con hemolisina purificada de serotipo 1 de App, se fundieron células de bazo con células de mieloma Ag8, y se clonaron células de hibridoma positivas por
dilución limitativa. Se recogieron los MAb desde el sobrenadante de cultivo del hibridoma o desde el
fluido ascı́tico del ratón.
Se llevó a cabo un ensayo ELISA (ensayo inmunosorbente de unión a enzima) por procedimientos
convencionales, utilizando hemolisina de serotipo 1 y serotipo 5b purificada como antı́genos de recubrimiento. Se prediluyeron antisueros a 1:100 antes de hacer las diluciones en serie. Se calcularon los valores
de absorción de fondo a partir de suero pre-inmune diluido a 1:100. Las concentraciones de Elisa se
definı́an como la dilución de suero más alta que daba un valor de absorción de al menos 1,15 veces el
valor de la absorción de fondo.
Las manchas Western de preparaciones de hemolisina bruta y de hemolisina purificada se llevaron a
11
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cabo como se ha descrito antes.
5
Se ensayó, como sigue, la neutralización de actividad hemolı́tica por antisueros. Se prepararon sobrenadantes de cultivo como se ha descrito antes. Se prediluyeron antisueros a 1:25 y se hicieron diluciones
en serie en TBS. Se añadieron volúmenes iguales de sobrenadante de cultivo sin diluir a las diluciones
de antisuero, seguido de incubación durante 30 minutos a 37◦C. Se ensayaron en cuanto a actividad
hemolı́tica como se ha descrito antes. La concentración de neutralización se definı́a como la dilución
de suero que da una hemolisis del 50% respecto al sobrenadante de cultivo diluido 2 veces. Los sueros
pre-inmunes sirvieron de controles negativos en cada ensayo.
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Resultados
15
Tal como se muestra en la Tabla 2, los sueros de cerdos convalecientes que habı́an sobrevivido a
infección con serotipo 1, 5b o 9 de App contenı́an altas concentraciones de anticuerpo según el ensayo
Elisa frente a hemolisina purificada a partir de serotipo 1 y 5b, y neutralizaban la actividad hemolı́tica
de sobrenadantes de cultivo de serotipos 1 y 5b y 9 de App. El suero de cerdo convaleciente de serotipo
2 solo contenı́a concentraciones moderadas de anticuerpo según el ensayo Elisa frente a hemolisina de
serotipos 1 y 5b mientras que la neutralización de actividad hemolı́tica no se podı́a detectar.
20
Los antisueros de conejo hiperinmune que aparecen frente a hemolisina purificada de serotipos 1 y
5b de App mostraban ambos altas concentraciones de anticuerpo en ensayo Elisa frente a hemolisina de
ambos serotipos 1 y 5b, y ambos antisueros presentaban neutralización de hemolisina de serotipo 1, 5b y
9.
25
Cuatro MAb diferentes preparados frente a hemolisina de serotipo 1 de App tenı́an, según ensayo
Elisa, altas concentraciones frente a hemolisina de ambos serotipos 1 y 5b, pero no presentaban neutralización de actividad hemolı́tica. Todos los antisueros de serotipo 1 de App ensayados (suero de cerdo
convaleciente, suero de conejo hiperinmune y MAb) reaccionaban en manchas Western con la banda de
105 kD en hemolisina de serotipo 1 y 5b purificada ası́ como con la banda de 105 kD de preparaciones
de hemolisina bruta de todos los serotipos de App (1-12). Como ejemplo, la Figura 7 muestra la mancha
Western de preparaciones de hemolisina bruta y hemolisina de serotipo 5 b de App purificada con uno
de los MAb.
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Se llega a la conclusión de que 1) la hemolisina lábil de 105 kD es antigénica tanto en infección activa como después de la inmunización con hemolisina purificada; 2) que los anticuerpos anti-hemolisina
muestran reacción cruzada con un antı́geno de 105 kD similar producido por todos los serotipos de App
(1-12), incluyendo las cepas sin actividad hemolı́tica tal como se ensayan en el ensayo descrito; 3) que
los anticuerpos provocados muestran neutralización cruzada de actividad hemolı́tica de varios serotipos,
suponiendo que los anticuerpos sean inducidos por un antı́geno de 105 kD desde un serotipo hemolı́tico.
Obviamente los MAb reconocen epitopes que no están implicados en actividad hemolı́tica.
Tal como se he mostrado antes, el almacenamiento de hemolisina purificada a una temperatura de
4◦C o más alta daba lugar a un decrecimiento del peso molecular aparente según SDSPAGE, de forma
gradual desde 105 kD a 65 kD. Los antisueros cuya lista se da en la Tabla 2 que aparecen frente a
hemolisina de 105 kD reaccionaban aún en manchas Western con preparaciones de hemolisina envejecidas
con decrecimiento del peso molecular (MW) aparente (datos no mostrados). Las propiedades antigénicas
de las preparaciones envejecidas después de la inmunización de conejos se muestran en la Tabla 3. Se
llega a la conclusión de que la hemolisina envejecida con un peso molecular aparente disminuido según
SDS-PAGE da lugar aún a anticuerpos que son reactivos con la hemolisina de 105 kD original de serotipos
1 y 5b de App. Se pudieron observar algunas disminuciones en las concentraciones de anticuerpo, pero
también la inmunización con la preparación de hemolisina envejecida de 65 kD conducı́a a antisueros
con concentraciones muy altas en anticuerpo. Estos antisueros mostraban también neutralización de
actividad hemolı́tica.
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TABLA 2
Reacciones cruzadas de antisueros con preparaciones de hemolisina
5
Antisueroa)
(serotipo)
10
CPS
CPS
CPS
CPS
168 (1)
261H (2)
139 (5a)
191 (9)
Elisab)
1 5b
Manchac)
Neutralizaciónd)
1 5b 9
++
+
++
++
++
+
++
++
+
nt
nt
nt
+ + +
- - + + +
+ + +
HRS 3895 (1)
HRS 4609 (5b)
++
++
++
++
+
nt
+
+
+
+
+
+
MAbs (1)
++
++
+
-
-
-
-
--
-
-
-
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20
PPS
PRS
-
25
30
a) CPS = suero de cerdos convalecientes infectados con el serotipo de App indicado.
HRS = sueros de conejos hiperinmunes frente a hemolisina purificada a partir del serotipo de App
indicado.
MAbs= 4 anticuerpos monoclonales diferentes, preparados frente a hemolisina a partir de serotipo
1 de App.
PPS y PRS = sueros de cerdo y de conejo pre-inmunes, respectivamente.
b) Detección de anticuerpos en Elisa frente a hemolisina purificada a partir de serotipos 1 y 5b;
35
- = concentr. <100, + = 100<concentr.<1000, ++ = concentr.>1000.
40
c) Reacción con banda de 105 kD en preparaciones de hemolisina bruta de todos los serotipos de App
(1-12) y en hemolisina purificada a partir de los serotipos 1 y 5b de App; nt = no ensayado.
d) Neutralización de la actividad hemolı́tica en sobrenadante de cultivo de serotipos 1, 5b y 9.
TABLA 3
Propiedades antigénicas de hemolisina de serotipo 5b de App purificada envejecida
(media de antisueros de 3 conejos para cada preparación)
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a)
60
Antı́geno
almacenado a
Banda(s) prominente(s)
en SDS-PAGE a
Elisaa)
1 5b
-70◦C
4◦ C
temp.ambiente
105 kD
80 y 70 kD
65 kD
6,0 6,9
5,8 6,55
5,4 6,2
10
log de las concentraciones en Elisa frente a hemolisina de 105 kD purificada a partir de serotipos
1 y 5b.
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Ejemplo 3
Protección de cerdos frente a prueba de infección con App por vacunación
5
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Métodos
La prueba de infección de los cerdos con App se llevó a cabo por exposición a aerosol utilizando un
nebulizador ultrasónico DeVilbiss 65 (DeVilbiss Co., Pensilvania, EEUU). El uso de este nebulizador
ha sido recomendado por Sebunya y col. (Can. J. Comp. Med. 47, 48-53; 1983) para estudio de la
patogénesis de App y más especı́ficamente para la evaluación de vacunas.
Las pruebas de infección se realizaron con cepas de referencia de App para serotipos 1 y 5a (Tabla
1). Se hicieron crecer las bacterias durante aproximadamente 6 horas en caldo de Infusión de Corazón
Cerebro suplementado con NAD al 0,01%, o caldo Columbia suplementado con IsoVitalexR al 1% y NAD
al 0,01%, se recogieron por centrifugación y se volvieron a suspender en solución salina a la concentración
deseada. Los recuentos de viables se hicieron sobre placas de agar de chocolate.
Los animales se encerraron en condiciones SPF en recintos con barrera controlados, tras la prueba de
infección a presión negativa.
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Para la prueba de infección, se pulverizó un aerosol de aproximadamente 50 ml de suspensión bacteriana durante 15 minutos. El nebulizador estaba colocado fuera de la habitación de la prueba y su cámara
de aerosol estaba conectada a través de la pared con una tuberı́a perforada a aproximadamente 1,50 m
por encima del suelo. Todos los animales de un experimento, los vacunados y los de control, se sometieron
juntos a la prueba de infección en la misma habitación de la prueba. Los animales se observaron a las
2 semanas de someterlos a la prueba de la infección. Se examinaron postmortem los cerdos muertos, ası́
como los supervivientes a las 2 semanas de la prueba, en cuanto a lesiones patológicas. Se clasificaron
las lesiones pulmonares App tı́picas, pleuropneumonı́a fibrinosa necrosante hemorrágica, utilizando una
escala de 0-4 basada en el porcentaje del pulmón afectado: 0 = sin lesiones; 1 = <25% afectado; 2 =
>25% pero <50% afectado; 3 = >50% pero <75% afectado; 4 = >75% afectado.
Se llevaron a cabo experimentos con cerdos de diversos orı́genes, que se vacunaron a varias edades
con diversas dosis de vacunas y antı́geno, y se sometieron a prueba de infección con bacterias App de
serotipos 1 y 5a. Todas las vacunas se administraron intramuscularmente en el cuello a dosis de 2 ml
cada una. El intervalo de tiempo entre la primera y segunda vacunación fue de 6 semanas, mientras que
los cerdos se sometieron a la prueba de infección a las 2 semanas después de la vacunación. Las dosis
de antı́geno incluidas en la vacuna se calcularon basándose en los contenidos de proteı́na totales de las
preparaciones purificadas.
Los antı́genos consistı́an en preparación purificada de proteı́na de membrana exterior (OMP) de 42 kD
tal como la descrita en el Ejemplo 1.1, hemolisina (Hly) purificada como se ha descrito en el Ejemplo 2.2
ó 2 vacunas comerciales que contenı́an bacterias de App inactivadas de varios serotipos. Estas bacterinas
se administraron siguiendo las instrucciones de los fabricantes. En los Resultados se dan otros detalles
de cada experimento.
45
Resultados
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Del experimento 1 (Tabla 4) se llega a la conclusión de que ambas bacterinas comerciales no inducı́an
protección frente a la infección aunque en ambas bacterinas estaban presentes bacterias inactivadas de
los mismos serotipos que la cepa de la prueba de infección (App1).
En el experimento 2 (Tabla 5) se encontró que, tras la vacunación de los cerdos con la combinación
de hemolisina y preparación de OMP de 42 kD, ambos productos purificados procedentes del serotipo 1
de App, proporcionaban una protección casi completa frente a la infección de App 5a con respecto tanto
a la mortalidad como a lesiones de pulmón por App. La clasificación de la lesión de pulmón media de
0,3 en este caso significa que solamente un cerdo tenı́a un pequeño nódulo de App en el pulmón en la
disección.
En el experimento 3 (Tabla 6) se vacunaron cerdos muy jóvenes con diversas dosis de la combinación
de hemolisina purificada del serotipo 5b de App y preparación de OMP de 42 kD purificada del serotipo
1, y a continuación se les sometió a la prueba de infección con serotipo 1 de App. Comparados con los
animales de control, todos los cerdos vacunados con las diferentes dosis de antı́genos estuvieron completa14
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mente protegidos, tanto con respecto a la mortalidad por la infección de App como a lesiones pulmonares
de App.
5
10
El experimento 4 (Tabla 7) es muy similar al experimento 3, siendo la única diferencia el origen y
estado de los cerdos. En lugar de utilizarse los cerdos SPF del experimento 3 sin anticuerpos maternos
frente a los antı́genos de la vacuna, en el experimento 4 se emplearon cerdos nacidos de madres con alta
concentración de anticuerpos frente a los componentes de la vacuna. En el momento de la vacunación,
a una edad de 5 semanas, los cerdos tenı́an concentraciones de anticuerpo ELISA entre 1:100 y 1:1000
frente a ambos componentes de la vacuna hemolisina y OMP de 42 kD. También en este experimento que
utilizaba cerdos con anticuerpos maternos, la vacunación con la combinación de hemolisina y preparación
de OMP de 42 kD protegı́a frente a la infección con serotipo 1 de App.
15
A partir de estos experimentos de vacunación se llega a la conclusión de que la vacunación de cerdos con
hemolisina y preparación de OMP de 42 kD juntas inducen una completa protección frente a la infección
por App. La protección estaba dirigida no solamente frente al serotipo de App homólogo (antı́genos
purificados a partir del mismo serotipo que el serotipo de App de la prueba de infección) sino también
frente a serotipos de App heterólogos (antı́genos purificados de serotipos de App diferentes procedentes
de los serotipos de App de la infección)
20
TABLA 4
Experimento de vacunación N◦ . 1a)
25
30
35
40
Vacunab)
Antı́geno
(de serotipo)
Dosis de
antı́geno
(µg)
Delsuvac HP
Pleurovac
Control
(bacterina)
(bacterina)
-
Cepac de
ataque
serotipo
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd
pulmonares
medias
App1
App1
App1
1/3
2/3
1/4
2,0
3,3
2,3
a) cerdos SPF; primera vacunación a una edad de 12 semanas; 3 o 4 cerdos por grupo.
b) Delsuvac HP de Mycofarma, Paı́ses Bajos, que contiene bacterias de serotipos 1, 2, 3, 4, 6 y 8 de
APP. Pleurovac de Boxham Veterinary Products Ltd., Irlanda, que contiene bacterias de serotipos
1, 2, 3, 4, 6 y 8 de App.
45
c) Suspensión de la prueba de infección de recuento de viables: 1x109 /ml
d) Clasificación de lesiones de pulmón App sobre una escala de 0-4 basada en el porcentaje afectado
de pulmón: 0 = sin lesiones, 1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = >75%.
50
55
60
15
ES 2 075 325 T3
TABLA 5
Experimento de vacunación N◦ . 2a
¯
5
Vacunab)
10
Antı́geno
(de serotipo)
Dosis de
antı́geno
(µg)
15
Hly(1)/OMP(1)
Control
50/200
-
Cepac de
ataque
serotipo
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd
pulmonares
medias
App5a
App5a
0/3
3/3
0,3
4,0
a) Cerdos sin App comercial; primera vacunación a una edad de 8 semanas; 3 cerdos por grupo
20
b) Formulación de vacuna: emulsión agua-en-aceite
c) Suspensión de la prueba de infección de recuento de viables: 6x106 /ml
25
d) Véase leyenda de la Tabla 4.
TABLA 6
Experimento de vacuna N◦. 3a
¯
30
Vacunab)
35
40
Antı́geno
(de serotipo
Dosis de
antı́geno
µg
Hly(5b)/OMP(1)
HLy(5b)/OMP(1)
HLy(5b)/OMP(1)
Control
50/200
50/50
12,5/50
-
Cepac de
ataque
serotipo
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd
pulmonares
medias
App1
App1
App1
App1
0/3
1/3
1/3e
2/3
0
0,3
0,7
3,0
45
a) cerdos SPF; primera vacunación a una edad de 4 semanas; 3 cerdos por grupo.
b) Formulación de vacuna: emulsión derivada de tocol
50
c) Suspensión de la prueba de infección de recuento de viables: 7,4x108/ml
d) Véase leyenda de la Tabla 4
55
e) En los grupos indicados un animal murió por causas desconocidad, sin sı́ntomas o patologı́a de App.
60
16
ES 2 075 325 T3
TABLA 7
Experimento de vacunación N◦ . 4a
¯
5
Vacunab)
10
15
20
Antı́geno
(de serotipo)
Dosis de
antı́geno (µg)
Hly(5b)/OMP(1)
HLy(5b)/OMP(1)
HLy(5b)/OMP(1)
Control
50/200
50/50
12,5/50
-
Cepac de
ataque
Mortalidad
muertos/total
Lesionesd
pulmonares
medias
App1
App1
App1
App1
0/3
0/3
0/3
1/3
0
0,3
0,7
3,0
a) cerdos comerciales con anticuerpos maternos; primera vacunación a una edad de 5 semanas; 3 cerdos
por grupo
b) Formulación de vacuna: emulsión de derivado de tocol
25
c) Suspensión de prueba de infección de recuento de viables: 7,4x108/ml
d) Véase leyenda de la Tabla 4
Ejemplo 4
30
1. Actividad citotóxica de cepas de App
Métodos
35
40
45
50
Para el ensayo de citotoxicidad, se incubaron sobrenadantes de cultivo de App con macrófagos alveolares de cerdo. Los macrófagos alveolares se aislaron por inundación de pulmones de cerdo con Solución
de Sal Equilibrada de Hank (Flow) suplementada con EDTA 0,01 M y Hepes 20 mM, pH 7,4. Se lavaron
células tres veces en la misma solución sin EDTA, y después de la última centrifugación, se suspendieron
las células en medio RPMI 1640 (Flow) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco) y por
último se ajustaron a una concentración de 2 x 106 /ml. Las placas de cultivo de tejido (24 pocillos;
Costar) con cubreobjetos circulares de vidrio (ø12 mm; Tamson) en cada pocillo se sembraron con 0,5 ml
por pocillo de la suspensión final de células, y se dejaron atacar por macrófagos durante 2 horas a 37◦C
en una atmósfera de CO2 . A continuación se lavaron las placas 3 veces con RPMI 1640 sin suero. Se
dejaron crecer las bacterias en caldo de Columbia (Difco) suplementado con βNAD (Sigma) al 0,01% a
37◦C durante 4-6 horas a una fase de log mitad del final. Se recogieron las bacterias por centrifugación
y se añadió 0,5 ml del sobrenadante por pocillo a la placa de cultivo del tejido con macrófagos. Al cabo
de 2 horas de incubación a 37◦C, los cubreobjetos con macrófagos se lavaron tres veces con RPMI 1640
y se colocaron en posición invertida sobre portaobjetos de vidrio sobre una gota de 20 µl de Azul de
Tripano al 0,05% (Merck) en PBS. Se determinó el porcentaje de células muertas, teñidas de azul por
absorción del Azul de Tripano, por microscopı́a de contraste de fase. Los controles negativos consistı́an
en macrófagos incubados con caldo de Columbia.
Resultados
55
60
Tal como se muestra en la Tabla 8, todas las cepas de referencia de App eran citotóxicas para macrogfagos alveolares, una actividad secretada por las bacterias. Los controles negativos mostraron un 10% o
menos de toxicidad para los macrófagos.
Mientras que la citotoxicidad de cepas hemolı́ticas puede ser atribuida a la hemolisina descrita en el
Ejemplo 2, las cepas no-hemolı́ticas producirı́an otras moléculas tóxicas. En contraste con la actividad
hemolı́tica, la toxicidad de macrófagos se expresaba también cuando crecı́an las bacterias en ausencia de
CaCl2 suplementado.
17
ES 2 075 325 T3
TABLA 8
Toxicidad para macrófagos alveolares de cerdo, actividad hemolı́tica y SDS-PAGE de sobrenadantes de
cultivo de cepas de referencia de App
5
Serotipo
(cepa de
referencia)
Toxicidad
para
macrófagosa
Hemolı́ticab
Presencia en SDS-PAGE
1
2
3
4
5a
5b
6
7
8
9
10
11
12
caldo
75
100
100
85
90
90
90
80
75
70
65
85
55
10
+
+
+
+
+
+
-
105 kD
120 kD
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
±c)
-
10
15
20
25
30
a) Porcentaje de macrófagos muertos determinado como se describe en los Métodos de este Ejemplo.
b) Hemolı́tica tal como se determina en el ensayo descrito en el Ejemplo 2.1.
35
c) Una banda visible algo más alta que la posición de 120 kD, y no reactiva con anticuerpo monoclonal
Int 33-8 (véase Ejemplo 4,3).
2. Purificación y caracterización de toxina de App de macrofago (Mat)
Métodos
40
45
50
55
Para purificar serotipo 2 de App de actividad tóxica de macrofago, se hizo crecer una cepa nohemolı́tica según el Ejemplo 2 en caldo Columbia suplementado con NAD al 0,01% a 37◦C durante
aproximadamente 6 horas. Se realizó una posterior purificación esencialmente de la manera descrita en
el Ejemplo 2.2 para purificación de hemolisina, que incluı́a la separación de bacterias por centrifugación,
concentración del sobrenadante del cultivo por ultrafiltración utilizando un filtra con interceptación de
peso molecular (MW) de 300.000, y elución del concetrado sobre columna de SepharoseR CL4B. El primer
pico eluido contenı́a la actividad tóxica. La toxina se podı́a filtrar a través de un filtro de acetato de
celulosa de 0,45 µm (Sartorius) sin pérdida de actividad o antı́geno.
Se hicieron preparaciones de Mat bruta a partir de todos los serotipos por precipitación con sulfato de
amonio de sobrenadantes de cultivos. Todas las preparaciones se almacenaron a -70◦ C ó -20◦C a menos
que se establezcla de otra manera.
La sensibilidad al calor, la sensibilidad a proteinasa K y la estabilidad de Mat se ensayaron como se
ha descrito en el Ejemplo 2.2 para hemolisina. El SDS-PAGE se llevó a cabo por el método de Laemmli.
Se realizó un análisis de aminoácidos de terminal N sobre una muestra obtenida después de aplicar la
preparación de Mat obtenida como se ha descrito antes a electroforesis y electromanchado.
60
En pocas palabras, se prepararon geles de PAGE con un tampón de gel utilizado en el sistema Laemmli
(Nature 227, supra). Después, las proteı́nas de la electroforesis se aplicaron en ensayo de manchas sobre
PVDF (Immobilon-PR, Agua/Millipore) utilizando CAPS 10 mM pH 9-11/metano1 al 10% como tampón
18
ES 2 075 325 T3
de transferencia. La proteı́an de la mancha se utilizó para análisis secuencial realizado por degradación de
Edman con un secuenciador automático (lı́quido-impulsos, Modelo 477A, Applied Biosystems) conectado
en serie con una HPLC (modelo 120A, Applied Biosystems) para identificación de la liberación gradual
de aminoácidos de PTH.
5
Resultados
10
15
20
La toxina de macrofago (Mat) purificada desde la cepa de referencia de serotipo 2 por el procedimiento
descrito antes, mostraba aún actividad tóxica siempre que la purificación se hubiera llevado a cabo dentro
de los 2 a 3 dı́as a 4◦ C. Ya que la cepa de referencia de serotipo 2 produce una hemolisina inactiva como
se ha descrito en el Ejemplo 2, la banda de 120 kD se considera que representa la Mat.
La evaluación de preparaciones de Mat bruta mostraban una banda de 120 kD similar en SDS-PAGE
en sobrenadantes de serotipos 2, 3, 4, 6 y 8. El sobrenadante del cultivo del serotipo 10 mostraba una
banda en una posición algo más alta que 120 kD (Tabla 8). Una banda de 120 kD similar se veı́a también
en un cierto número de aislatos de campo de serotipo 2 y 5.
La toxicidad de macrofago quedaba totalmente abolida después del tratamiento de preparaciones de
Mat a temperaturas de al menos 60◦C durante 15 minutos, o después del tratamiento con proteinasa-K.
La proteı́na de 120 kD en SDS-PAGE era estable en almacenamiento a -20◦C, pero 3 meses de almacenamiento a 4◦ C daban lugar a una desintegración de la banda de 120 kD en SDS- PAGE.
El análisis de la secuencia se aminoácidos de terminal N de Mat reveló la siguiente secuencia de
aminoácidos:
25
Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met
(?) significa una asignación provisional del aminoácido.
30
3. Antigenicidad de toxina de macrofago (Mat) y reacción cruzada de antisueros
Métodos
35
Se utilizaron cerdos convalencientes como se ha descrito en el Ejemplo 2.3. Se prepararon lı́neas
de células de hibridoma que producı́an anticuerpo monoclonal (MAb) por métodos convencionales; en
análisis de selección, se seleccionaron hibridomas que producı́an MAb que eran reactivo con Mat purificada del serotipo 2 de App pero no reactivo con hemolisina de serotipo 1 o 5b de App purificada en
ensayo Elisa.
40
Se llevó a cabo el ensayo de manchas Western tal como se ha descrito antes. Se ensayó la neutralización de la actividad de Mat por adición de volúmenes iguales de sobrenadante de cultivo de App a
diluciones de antisuero, seguido de incubación durante 30 minutos a 37◦ C, antes del ensayo de toxicidad
tal como se ha descrito en el Ejemplo 4.1.
45
Resultados
50
Los sueros de cerdos convalecientes que habı́an sobrevivido a la infección con serotipo 2, pero no los
sueros de cerdos infectados con serotipos 1, 5a y 9, reconocı́an la banda de 120 kD de preparaciones de
Mat en manchas Western. Los sueros de serotipo 2 de App de convalecientes también neutralizaban la
actividad de Mat.
Int 33-8 de MAb neutralizaba la actividad de Mat y reaccionaba cruzadamente en manchas Western
con una banda de 120 kD en preparaciones de Mat bruta de serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 pero no otros serotipos
(de referencia) (Figura 8)
55
También se veı́a una reacción con una banda de 120 kD en preparaciones de Mat bruta de aislatos de
campo de serotipo 2 y de algunos aislados de campo de serotipo 5.
60
Int 33-4 de MAb reaccionaba en manchas Western solamente con la banda de 120 kD de preparaciones
de serotipo 2 y no con preparaciones de otros serotipos.
Tal como se ha descrito antes, el almacenamiento de Mat purificada a 4◦ C durante 3 meses daba
19
ES 2 075 325 T3
lugar a desintegración de la banda de 120 kD como se veı́a en SDS-PAGE teñido con CBB. Sin embargo,
las manchas Western de estas preparaciones envejecidas mostraban bandas a aproximadamente 70-80 kD
con Int 33-8 de MAb.
5
Ejemplo 5
Protección de cerdos frente a infección de App por vacunación con una vacuna trivalente
Métodos
10
Se llevó a cabo la prueba de infección tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. En un experimento (no.
8) los cerdos se infectaron por vı́a intranasal con 1 ml de un cultivo de 6 horas que contenı́a 106 bacterias
viables. Las cepas utilizadas para la prueba fueron cepa de referencia serotipo 1 de App o aislatos de
campo de App con serotipo 2 ó 9.
15
20
La vacunación se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. Las dosis de antı́geno incluidas
en las vacunas se calcularon sobre la base de contenidos totales de proteı́na de preparaciones purificadas.
Los antı́genos eran proteı́na de membrana exterior (OMP) de 42 kD purificada tal como se ha descrito
en el Ejemplo 1.1, hemolisina (Hly) de 105 kD purificada tal como se ha descrito en el Ejemplo 2.2, y
toxina de macrofago (Mat) de 120 kD purificada como se ha descrito en el Ejemplo 4.2.
En los Resultados se dan más detalles de cada experimento.
Resultados
25
30
35
40
En el experimento 5 (Tabla 9), se ensayó la vacuna bivalente de hemolisina de 105 kD y OMP de 42
kD, utilizada también en el Ejemplo 3, para la protección frente a la prueba de la infección con serotipo
2 de App. Tal como se demuestra, la vacuna inducı́a una cierta protección frente a lesiones pero no
protegı́a por completo frente a la infección con serotipo 2. Según esto, se ha llegado a la conclusión de
que la vacuna tenı́a que contener un componente extra, por ejemplo, la toxina de macrofago de 120 kD
descrita en el Ejemplo 4, para que fuese completamente protectora también frente a serotipo 2 de App.
En el experimento 6 (Tabla 10), se vacunaron cerdos con una vacuna que contenı́a toxina de macrofago
(Mat) de 120 kD purificada de serotipo 2 y OMP de 42 kD purificada del serotipo 1, o una vacuna que
contenı́a Mat de 120 kD purificada del serotipo 2, OMP de 42 kD purificada del serotipo 1, y hemolisina
(Hly) de 105 kD purificada de serotipo 5b. Se encontró que la vacuna bivalente que contenı́a Mat de 120
kD y OMP de 42 kD no protegı́a frente a lesiones tras la prueba del ataque con serotipo 1 de App. Esta
falta de protección era esperada ya que según el Ejemplo 3, la vacuna tenı́a que contener hemolisina de
105 kD para proteger contra serotipo 1 de App y la cepa de serotipo 1 de App utilizada para la prueba
de infección no expresaba Mat de 120 kD.
Sorprendentemente, la adición de Hly de 105 kD de células de serotipo 5b a la vacuna bivalente inducı́a
una protección completa frente a la prueba de infección por serotipo 1 de App.
45
En el experimento 7 (Tabla 11) se ensayaron las mismas vacunas bivalente y trivalente que en el
experimento 6 en cuanto a protección frente a la prueba de infección con serotipo 2 de App. Tal como se
muestra, ambas vacunas protegı́an muy bien frente a infección con serotipo 2 de App, las dos con respecto
a mortalidad y lesiones pulmonares. Según esto, la adición de la Mat de 120 kD a la vacuna bivalente de
Hly de 105 kD/OMP de 42 kD hace a la vacuna también protectora frente a serotipo 2.
50
En el experimento 8 (Tabla 12) se encontró que la misma vacuna trivalente utilizada en el experimento
7, que contenı́a Mat de 120 kD, OMP de 42 kD y Hly de 105 kD, protegı́a también los cerdos frente a
una prueba de infección completamente heteróloga con una cepa de serotipo 9 de App.
55
60
20
ES 2 075 325 T3
TABLA 9
Experimento de vacunación No.5a)
5
Vacunab)
10
Antı́geno
(del serotipo)
Dosis
de antı̀geno (µg)
15
Hly(5b)/OMP(1)
control
50/200
-
Cepac de
infección
(serotipo)
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd)
pulmonares
medias
HV 109 (2)
HV 109 (2)
0/3
0/3
1,7
2,0
a) cerdos SPF; primera vacunación a 12 semanas de edad; 3 cerdos por grupo
20
b) Formulación de vacuna: emulsión de derivado de tocol
c) Suspensión de la prueba de infección de recuento de viables: 1,9 x 108 /ml
d) Véase leyenda de la Tabla 4.
25
TABLA 10
Experimento de vacunación No.6a)
Vacunab)
30
35
40
45
Antı́geno
(del serotipo)
Mat(2)/OMP(1)
Mat(2)/OMP(1)
/Hly(5b)
control
Cepac de
infección
(serotipo)
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd)
pulmonares
medias
50/200
App1
0/3
1,7
50/200/50
-
App1
App1
0/3
0/3
0,0
1,5
Dosis
de antı́geno (µg)
a) cerdos SPF; primera vacunación a 7 semanas de edad; 3 cerdos por grupo
b) Formulación de vacuna: emulsión de derivado de tocol
c) Suspensión de la prueba de infección, recuento de viables: 2,1 x 109 /ml
50
d) Véase leyenda de la Tabla 4.
55
60
21
ES 2 075 325 T3
TABLA 11
Experimento de vacunación No.7a)
5
10
15
20
Vacunab)
Antı́geno
(del serotipo)
Cepac de
infección
(serotipo)
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd)
pulmonares
medias
65/50
H 111(2)
0/2∗
0,0
65/50/50
-
HV 111(2)
HV 111(2)
0/3
2/3
0,3
6 3,3
Dosis
de antı́geno (µg)
Mat(2)/OMP(1)
Mat(2)/OMP(1)
/Hly(5b)
control
a) cerdos SPF; primera vacunación a 12 semanas de edad; 3 cerdos por grupo
excepto∗ donde 1 cerdo murió antes de la prueba
b) Formulación de vacuna: emulsión de derivado de tocol
25
c) Suspensión de la prueba de infección, recuento de viables: 5 x 108 /ml
d) Véase leyenda de la Tabla 4.
TABLA 12
30
Experimento de vacunación No.8a)
Vacunab)
35
Antı́geno
(del serotipo)
Dosis
de antı́geno (µg)
Mat(2)/OMP(1)
/Hly(5b)
control
65/50/50
-
Cepac de
infección
(serotipo)
Mortalidad
(muertos/
total)
Lesionesd)
pulmonares
medias
4915 (9)
4915 (9)
0/8
2/8
0,3
2,3
40
45
a) cerdos SPF; primera vacunación a 5 semanas de edad; 8 cerdos por grupo
50
b) Formulación de vacuna: emulsión de derivado de tocol
c) Prueba de infección intranasal con 106 bacterias viables
d) Véase leyenda de la Tabla 4.
55
Leyendas de las Figuras
Figura 1 Exploración de gel de SDS-PAGE llevado a cabo con preparación de OMP enriquecida con 42
kD.
60
Figura 2 Manchas Western de preparaciones de OMP Proteinasa K con suero de cerdo convaleciente.
Trayectos 1 y 4: OMP bruta; trayectos 2, 3, 5 y 6: OMP purificada;
trayectos 1-3: tratado en blanco; trayectos 4 - 6: tratado con Proteinasa K.
22
ES 2 075 325 T3
Figura 3 Manchas Western de lisatos bacterianos con suero post-vacunación.
Figura 4 Exploración de gel de SDS-PAGE llevado a cabo con hemolisina (B) y proteı́nas marcadoras
(A).
5
Figura 5 Perfil de elución de hemolisina utilizando una columna de SephacrylR S-1000
Figura 6 Exploraciones de gel de proteı́nas marcadoras (A) y hemolisina purificada almacenada a -20◦C
o a 37◦C (B).
10
Figura 7 Manchas Western de preparaciones de hemolisina bruta y hemolisina de serotipo 5b de App
purificada (+) con anticuerpos monoclonales provocados frente a serotipo 1 de App.
Figura 8 Manchas Western de preparaciones de Mat bruta con anticuerpos monoclonales provocados
frente a Mat de serotipo 2 de App.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
23
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REIVINDICACIONES
5
10
1. Método para la preparación de una vacuna para la protección de cerdos frente a infección por
Actinobacillus pleuropneumoniae esencialmente libre de células completas de A. pleuropneumoniae, caracterizado porque se purifica material antigénico de A. pleuropneumoniae derivado de una preparación
de proteı́na de membrana externa de A. pleuropneumoniae que tiene un componente de proteı́na antigénica dominante mayor de aproximadamente 42 kD medido en SDS-PAGE, y al menos una toxina
seleccionada del grupo que consiste en
1) una hemolisina de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 105 kD en SDS-PAGE, y
2) una toxina de macrófago de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 120 kD se purifica, seguido de
mezclado de cantidades inmunológicamente efectivas, con un vehı́culo fisiológicamente aceptable, de:
15
el material antigénico de A. pleuropneumoniae derivado de la citada preparación de proteı́na de membrana externa, y al menos una toxina seleccionada del grupo que consiste en
1. la hemolisina de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 105 kD en SDS-PAGE, y
20
2. la toxina de macrófago de A. pleuropneumoniae de aproximadamente 120 kD en SDS-PAGE.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el preparado de proteı́na de membrana
externa, la hemolisina y la toxina de macrofago, se mezclan con un vehı́culo farmacéuticamente aceptable.
25
3. Método según las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la hemolisina se deriva de células de
serotipo 1, 5a, 5b, 9, 10 ó 11.
4. Método según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la toxina de macrófago se deriva de
serotipo 2, 3, 4, 6 u 8.
30
35
5. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el preparado de proteı́na de membrana
externa de células de serotipo 1, la hemolisina se deriva de células de serotipo 5b y la toxina de macrófago
de células de serotipo 2.
6. Método según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque se mezcla además material antigénico
de otros patógenos porcinos.
7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el material antigénico mezclado adicionalmente de otros patógenos porcinos es virus de pseudorabia o virus de gripe porcina.
40
8. Método según las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se mezcla un auxiliar.
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50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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