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LABORATORIOS BETERÁ
Producción de suero anti-D químicamente modificado
Lic. Odalys Martín González,1 Lic. Patricia Hernández Díaz2 y Téc. Lourdes Alfonso García3
RESUMEN
El suero hemoclasificador anti-D químicamente modificado es uno de los diagnosticadores de grupo sanguíneo utilizado en la
tipificación sanguínea en bancos de sangre y servicios de transfusiones, además en muchos casos permite la detección de
antígenos débiles.También se utiliza en la evaluación cualitativa de la hemorragia fetomaterna y en la tipificación del antígeno D
eritrocitario como prueba pre-transfusional de cabecera. Este trabajo tuvo como propósito la producción de un suero anti-D que
fuera funcional y empleara la menor cantidad de agente potenciador posible. Se utilizó un proceso de modificación de la molécula
de IgG anti-D por técnicas de reducción y alquilación, además de potenciación del reactivo con albúmina bovina reactiva. Se
obtuvo un suero anti-D químicamente modificado con características similares al anti-D de producción nacional con la utilización
de mucha menor cantidad de reactivo potenciador, lo que abarata su producción.
Palabras clave: Anti-D químicamente modificado-potenciador, anti-D químicamentemodificado-producción.
El suero hemoclasificador anti-D es uno de
los diagnosticadores de grupo sanguíneos utilizados
en la tipificación sanguínea en bancos de sangre y
servicios de transfusiones. La mayoría de los
anticuerpos anti-D son de la clase IgG conocidos
con el término «incompletos» pues frecuentemente
no aglutinan los glóbulos Rho D positivos
suspendidos en medio salino, por lo que necesitan
de agentes potenciadores para llevar a cabo la
reacción de aglutinación.1
El potenciador más utilizado tradicionalmente
es la albúmina sérica bovina2 que constituye entre
20 y 70 % del reactivo, lo que encarece
significativamente su producción. Además en
algunas ocasiones los potenciadores pueden
producir aglutinación de glóbulos rojos sensibilizados
in vivo y dan en el test de Rh falsa positividad .
En presencia de un agente reductor la molécula
de IgG anti-D cambia su conformación molecular
y tiene mayor flexibilidad, por lo que se hace más
asequible a los sitios antigénicos presentes en los
glóbulos rojos. 3,4 Los anticuerpos anti-D
monoclonales reducidos de la clase IgG3 son más
potentes aglutinadores directos que los IgG1.5,6 El
reactivo hemoclasificador anti-D químicamente
modificado además de ser utilizado en la tipificación
1
Aspirante a Investigador.
Maestra en Ciencias. Investigadora Agregada.
3
Técnico en Inmunohematología
2
sanguínea, en muchos casos permite la detección
de antígenos débiles (Du), que se realiza por medio
de las pruebas de antiglobulina indirecta que
consume suero antiglobulínico y mayor tiempo de
incubación. También se utiliza en la evaluación
cualitativa de la hemorragia fetomaterna y en la
tipificación del antígeno D eritrocitario como prueba
pretransfusional de cabecera.1
MÉTODOS
Para la elaboración del reactivo
hemoclasificador anti-D químicamente modificado
se utiliza como materia prima suero de donantes
voluntarios Rho negativos con título superior a
1:1024 y con resultados negativos a las pruebas
enzimáticas, virológicas y microbiológicas. El
proceso de reducción y alquilación del suero se
realiza según la técnica descrita por Romans y
otros, utilizando como agente reductor el
dithiothreitol (DTT) 10 mmol y como agente
alquilante la Iodoacetoamida (IAA) 25 mmol.3
El proceso de diálisis se realiza contra solución
salina 0,9 % a temperatura ambiente por 24 h.
15
Un volumen de muestra se diluye en 3
volúmenes de solución salina 0,9 % y se le añade
de 4 a 6 % de albúmina bovina reactiva 25 %
(ABR 25 %).
El proceso se realiza a temperatura ambiente,
con adición de azida sódica 01 % para su
conservación.
El control de calidad del producto se realiza
según la Guía para el Servicio de Transfusión de
Sangre de Londres.7
Se efectúa la esterilización del producto
mediante filtración en área estéril a través de un
filtro Sartorius empleando membranas clarificantes
y esterilizantes hasta 0,2 micras.
RESULTADOS
En la tabla 1 se muestran los resultados del
control de calidad realizados a los 3 lotes de suero
anti-D químicamente modificado de 1 L cada uno,
donde se muestra la ausencia de isoaglutininas, falsa
aglutinación y de anticuerpos contaminantes; se
corrobora la especificidad anti-D del anticuerpo
presente.
Falsa
Lote Isoaglutininas aglutinación
1
2
3
no
no
no
negativo
negativo
negativo
Anticuerpos
contaminantes
no
no
no
Títulos
1:32
1:32
1:32
Avidez
en tubo
+++ hasta 1:16
+++ hasta 1:16
+++ hasta 1:16
Avidez
en placa
10 s
10 s
10 s
El título de hemoaglutinación frente a eritrocitos
Rho D positivos fue de 1:32 para cada lote, mientras
que la avidez en placa fue de 10 s.
Al enfrentar el suero anti-D químicamente
modificado a eritrocitos Du positivos los resultados
fueron positivos.
El tiempo de incubación fue solo de 2-5 min
para el test en láminas y tubos o microplacas.
Se obtuvo un buen título de hemoaglutinación
con la adición de 4 a 6 % de albúmina bovina.
DISCUSIÓN
El suero hemoclasificador anti-D contiene
anticuerpos anti-D que en la mayoría son de la
clase IgG conocidos con el término de
«incompletos» porque frecuentemente no aglutinan
los glóbulos Rho D positivos suspendidos en medio
salino, por lo que necesitan de agentes
potenciadores para llevar a cabo la reacción de
aglutinación.1
El método que tradicionalmente se utiliza en la
producción de este diagnosticador emplea entre
20 y 70 % de albúmina bovina como potenciador;
sin embargo si en su producción se utiliza un
proceso de reducción y alquilación la molécula de
IgG anti-D cambia su conformación molecular y
tiene mayor flexibilidad, por lo que se hacen más
asequible sus sitios antigénicos3,4 y se reduce de
forma considerable la cantidad de potenciador a
utilizar, en este caso de 4 a 6 % de albúmina bovina.
Esto es significativo porque en algunas
ocasiones los potenciadores pueden producir
aglutinación de glóbulos rojos sensibilizados in vivo
y dan en el test de Rh falsa positividad.
Los parámetros de calidad establecidos para
la producción de este reactivo son similares a los
obtenidos en el caso de la producción de suero que
tradicionalmente se realiza (tabla 1) .
El título de hemoaglutinación frente a eritrocitos
Rho D positivos mediante la prueba de antiglobulina
indirecta del suero reducido y alquilado, después
de la adición de la albúmina bovina de 4 a 6 % se
mantuvo igual al del anti-D sin reducir (1:32 para
cada lote), sin embargo, la avidez en placa mejoró
alrededor de 10 s para cada lote con respecto al
anti-D de producción nacional.
Otra de las ventajas de este suero es que en
los casos en que se enfrentó el suero anti-D
químicamente modificado a eritrocitos Du positivos
a temperatura ambiente los resultados fueron
positivos, esto demostró su propiedad de detección
directa de antígenos débiles (Du).1
El anti-D químicamente modificado se utiliza
mucho en test de lámina y tubos o microplacas y
necesita una incubación de solo 2-5 min a
temperatura ambiente, mientras el anti-D policlonal
IgM usualmente requiere de 15 min a 37 °C,
resultado semejante a lo reportado por Mollison y
otros,1997.1
El anti-D de producción nacional contiene
alrededor de 70 % de albúmina, cantidad muy
16
superior a la que contiene el anti-D químicamente
modificado (4 a 6 %), lo que significa un ahorro
considerable de divisas
SUMMARY
The serum hemoclasificador chemically modified anti-D
is one of the diagnosticians of sanguine group used in
the sanguine typing in banks of blood and services of
transfusions, also in many cases it allows the detection
of weak antigens. It is used in the qualitative evaluation
of the hemorrhage fetomaternal and in the tipificación
of the antigen D eritrocitario like test head pretransfusional. This work had as purpose the production
of a serum anti-D that is functional and that it used the
smallest quantity in agent possible potentiator. We used
a process of modification of the molecule of IgG anti-D
for technical of reduction and alkylation, besides
potentiator of the reagent with bovine albumin
reactivates. A serum anti-D was obtained chemically
modified with characteristic similar to the anti-D of
national production with the use of a lot of smaller
quantity of reagent potentiator, what reduces its
production.
Key words: chemically modified anti-D - potentiator, chemically
modified anti-D - production.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Mollison PL,Engelfriet LP,Contreras M.Blood transfusion
in Clinical Medicine.10 ed.Oxford Blackwell.1997:63-114.
2. Jones JM.Influence of polymer on the efficacy of serum
albumin of a potentiator of “incomplete” Rh aglutinins.
Nature.1969,222:452-63.
3.Romans DG,Tilley LA,Crookston MC,Falk RE,Dorrington
KJ.Conversion of incomplete antibodies to direct aglutininis
by mild reduction: Evidence for segmental flexibility within
the
Fc
fragment
of
imunoglobulin.Proc.
Natl.Acad.1977;74(6):2531-5.
4. Mandy WJ, Fudenberg HH, Lewis FB. On incomplete anti Rh
antibodies: mechanismo of direct agglutination induced by
mercaptoethanol.J Clin Invest 1965;44:1352-61.
5. Scott ML,Guest AR,Anster DJ.Subclass dependence of reduction
and alkylation of imcomplete IgGmonoclonal anti-D to
complete anti-D (Abstract).Transf.1989;29:Suppl 575.
6. Jones J,Scott L and Voak D.Monoclonal anti-D specificity
and RhO structure:criteria for selection of monoclonal antiD reagents for routine typing of patients and donors.
Transf.Med.1995;5:171-184.
7. Guidelines for the Blood Transfusion Service. H.M.S.O.
London.UK.1992.
8. Walker Richard MD.Technical Manual.11.ed.American
Association of Blood Books.1993.
Recibido: 3 de mayo del 2000.
Aprobado: 6 de junio del 2000.
Lic. Odalys Martín González. Calle 84A No. 4105 e/ 41 y 43.
Marianao. Ciudad de La Habana. Teléf:441769
16
SUMMARY
The serum hemoclasificador chemically modified anti-D is one
of the diagnosticians of sanguine group used in the sanguine
typing in banks of blood and services of transfusions, also in
many cases it allows the detection of weak antigens. It is used in
the qualitative evaluation of the hemorrhage fetomaternal and
in the tipificación of the antigen D eritrocitario like test head
pre-transfusional. This work had as purpose the production of a
serum anti-D that is functional and that it used the smallest
quantity in agent possible potentiator. We used a process of
modification of the molecule of IgG anti-D for technical of
reduction and alkylation, besides potentiator of the reagent with
bovine albumin reactivates. A serum anti-D was obtained
chemically modified with characteristic similar to the anti-D of
national production with the use of a lot of smaller quantity of
reagent potentiator, what reduces its production.
Key words: chemically modified anti-D - potentiator, chemically
modified anti-D - production.
2. Jones JM.Influence of polymer on the efficacy of serum
albumin of a potentiator of “incomplete” Rh aglutinins.
Nature.1969,222:452-63.
3.Romans DG,Tilley LA,Crookston MC,Falk RE,Dorrington
KJ.Conversion of incomplete antibodies to direct aglutininis
by mild reduction: Evidence for segmental flexibility within
the
Fc
fragment
of
imunoglobulin.Proc.
Natl.Acad.1977;74(6):2531-5.
4. Mandy WJ, Fudenberg HH, Lewis FB. On incomplete anti Rh
antibodies: mechanismo of direct agglutination induced by
mercaptoethanol.J Clin Invest 1965;44:1352-61.
5. Scott ML,Guest AR,Anster DJ.Subclass dependence of reduction
and alkylation of imcomplete IgGmonoclonal anti-D to
complete anti-D (Abstract).Transf.1989;29:Suppl 575.
6. Jones J,Scott L and Voak D.Monoclonal anti-D specificity
and RhO structure:criteria for selection of monoclonal antiD reagents for routine typing of patients and donors.
Transf.Med.1995;5:171-184.
7. Guidelines for the Blood Transfusion Service. H.M.S.O.
London.UK.1992.
8. Walker Richard MD.Technical Manual.11.ed.American
Association of Blood Books.1993.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Recibido: 3 de mayo del 2000.
1. Mollison PL,Engelfriet LP,Contreras M.Blood transfusion
in Clinical Medicine.10 ed.Oxford Blackwell.1997:63-114.
Lic. Odalys Martín González. Calle 84A No. 4105 e/ 41 y 43.
Marianao. Ciudad de La Habana. Teléf:441769
Aprobado: 6 de junio del 2000.