III. PRODUCCION DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE

III. PRODUCCION DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO
LÁCTEO ENTERO E HIDROLIZADO CON Aspergillus niger, POR
VÍA FERMENTATIVA
Leal D. 1, Pico Y2, Castro J.3, Guerra J.4, Castro G.5*
1,2,3,4,5
Programa de Ingeniería de Alimentos.
Facultad de Ingeniería. Universidad de la Salle
Cra 2 Nº 10-70, Bloque D piso 7
*[email protected]
RESUMEN
El suero lácteo es un subproducto obtenido en gran cantidad en la elaboración de
quesos, por lo cual se buscan nuevas alternativas de aprovechamiento, una opción es
producir acido cítrico utilizando el suero lácteo como sustrato. En este trabajo se produjo
acido cítrico a partir del suero lácteo entero (SE) e hidrolizado (SH) por medio de una
fermentación realizada con Aspergillus niger 765. Se inoculó el hongo en los medios
preparados de suero entero e hidrolizado con adición de 48 mg de fosfato diácido de
amonio ((NH4)H2PO4), se incubaron los medios a 30 ºC por ocho días durante los cuales
se realizaron pruebas para determinar azucares reductores totales (ART), biomasa,
producción de acido cítrico, glucosa y pH. Hubo un consumo de azúcares similar en los
dos medios tratados (SE y SH), se presentó disminución de pH debido a la fermentación,
un aumento exponencial de los microorganismo siendo mayor en el hidrolizado por tener
disponibilidad de glucosa en el tiempo inicial. La producción de acido cítrico fue similar en
los dos medios, lo cual indica que independiente de la hidrolisis de azúcares complejos
realizada a uno de los medios (SH), el Aspergillus niger tiene la capacidad de producir
ácido cítrico desdoblando por si mismo la lactosa. La cantidad de biomasa producida en
cada medio fue de 8,7g/L para SE y 15,2g/L para SH. La producción final de acido cítrico
para el suero entero e hidrolizado fue de 9,9g/L y 9,6g/L respectivamente.
Palabras claves: ácido cítrico, Aspergillus niger, suero de leche, hidrólisis de lactosa.
ABSTRACT
The whey is a byproduct obtained in large quantities in the manufacture of cheese, so it
is looking for new alternative uses; one option is to produce citric acid using cheese whey
as substrate. In this work, citric acid produced from whey whole (SE) and hydrolyzed (SH)
through fermentation by Aspergillus niger 765. The fungus was inoculated in the media
prepared whole and hydrolyzed whey with the addition of 48mg of ammonium dihydrogen
phosphate (NH4) H2 PO4, media were incubated at 30 °C for eight days during which tests
were used to determine total reducing sugars (TRS, biomass, production citric acid,
glucose and pH. There was a similar sugar consumption in the two media treated (SE and
SH), there was a pH decreasing and a microorganism exponential increase being higher in
the hydrolyzate due to the availability of glucose in the initial time. The production of citric
acid is similar in both media, indicating that despite the complex sugars hydrolysis in one
of the means (SH), Aspergillus niger is capable of producing citric acid unfolding itself
lactose. The final production of citric acid in whole whey and hydrolyzed whey was 5.246 g
/L and 6.752g /L respectively.
Key Words: Citric acid, Aspergillus niger, cheese whey, lactose hydrolysis.
I.
INTRODUCCIÓN
La industria de alimentos es una de
las que producen mayor contaminación,
esto debido a la generación de residuos
orgánicos e inorgánicos durante sus
procesos. En la industria láctea, algunos
efluentes como el suero lácteo, forman
parte de los residuos de mayor
proporción que existen; obtenido a partir
de la elaboración de los diferentes
quesos del mercado; este subproducto
comprende del 80 al 90% del volumen de
la materia transformada. A pesar de los
diferentes manejos que se han dado,
casi el 50% del suero es descargado en
suelo, drenajes y cuerpos de agua, el
porcentaje restante es utilizado en la
elaboración de otros productos lácteos.
Una
alternativa
para
el
aprovechamiento de subproductos se
busca por medio de la biotecnología; en
donde el suero puede suministrar fuentes
de carbono y energía (por medio de la
lactosa contenida en este), como medio
de cultivo para el desarrollo de diferentes
microorganismos y por consiguiente la
obtención de metabolitos de gran
importancia (Sánchez et al., 2004). Es de
aclarar
que
hay
muy
pocos
microorganismos que pueden utilizar la
lactosa como fuente, pero al hidrolizar
este disacárido obteniendo glucosa y
galactosa, se aumenta la posibilidad de
utilizar más microorganismos para estos
procesos fermentativos (López et al.,
2006). El suero de leche ha sido de gran
uso en la obtención de diferentes ácidos,
como lo son láctico, acético, propiónico,
glucónico y cítrico, (López et al., 2006),
además es empleado en la misma
medida para la propagación de inóculos
en queserías, producción de vinos, entre
otras aplicaciones.
El
acido
cítrico
es
obtenido
industrialmente por la fermentación de la
glucosa o sacarosa obtenida de melaza
de caña con Aspergillus níger (Sánchez
et al., 2004), el proceso tiene varias
etapas como lo son la preparación del
sustrato de la melaza de caña, La
fermentación
por
parte
del
microorganismo A. niger, separación,
purificación, cristalización y secado del
acido cítrico. Siendo importante este
ácido por ser un producto de gran
demanda
en
diferentes
industrias
(farmacéutica,
cosmética,
plásticos,
detergentes) especialmente en alimentos
como modificador de pH y acidulante.
II. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. Microorganismo
Para la experimentación se utilizó una
cepa
de
Aspergillus
niger
765,
suministrada por la Universidad de los
Andes, la cual fue mantenida en
refrigeración a 4 ºC. Para su posterior
uso se realizó una re-siembra en Agar
Saboraud en cajas de petri y en tubos,
incubado a 25 ºC por 7 días hasta que
germinaran las esporas. Luego se
realizaron
suspensiones
en
agua
esterilizada
con
twin
80
de
aproximadamente 2 x 107 esporas/mL
para su posterior inoculación en los
medios elaborados (Sánchez et al.,
2004).
2.2. Suero de leche
Se utilizó suero lácteo deshidratado
(proteína
del
9%
base
seca),
posteriormente reconstituido, con el fin
de obtener una humedad del 97%,
simulando
el
que
se
obtiene
normalmente en plantas queseras. El
50% del suero reconstituido fue sometido
a un proceso de hidrólisis por vía
enzimática, la cual es de mayor eficiencia
que la hidrólisis ácida (Ríos et al., 2006),
utilizando la enzima Maxilact (Lactasa
comercial). Se toman 250 mL de suero y
se adiciona 2 mL de Maxilact a 37 ºC y
pH=6.6 durante 1 hora para obtener una
hidrólisis del 80% (López et al., 2006).
Para asegurar que el suero ha sido
hidrolizado adecuadamente, se realizó
una prueba de determinación de
hidrólisis de la lactosa por el método de
glucosa-oxidasa.
2.3 Medio de cultivo de Aspergillus
niger para producción de ácido cítrico
Los medios utilizados para la
experimentación fueron suero entero
(SE) y suero hidrolizado (SH); con el fin
de comparar entre ellos, cual es el mejor
sustrato para la producción de ácido
cítrico, se adicionan 100 mL de cada tipo
de suero en erlenmeyers de 250 mL, a
los cuales se les adicionó fosfato diácido
de amonio ((NH4)H2PO4) en relación de
48 mg/kg, el pH se ajustó a 4 utilizando
ácido
clorhídrico
(HCl)
0.1N.
Posteriormente fueron esterilizados a
121 ºC por 15 min. Se inoculó cada
medio con 3,4 mL de la suspensión de
esporas (3%v/v) y se incubaron a una
temperatura de 30 ºC (Sánchez et al.,
2004).
2.4. Métodos de análisis
Luego de establecer las variables a
manejar y las condiciones de producción
de acido cítrico, Se realizó un
seguimiento durante 8 días, evaluando
azúcares reductores totales (ART),
contenido de glucosa, biomasa y
producción de acido cítrico a una
temperatura de 30 ºC, en donde se
tomaron muestras cada 24 h. Para
evaluar el contenido de azúcares
reductores totales, se determinó por el
método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico),
la glucosa se determinó por el método
cuantitativo de glucosa IVD, las muestras
fueron previamente desproteinizadas con
ácido tricloroacetico al 10%, para evitar
que estas interfirieran con los resultados.
El contenido de ácido cítrico se estimó
por el método espectrofotométrico de la
piridina-anhídrido acético (Marier y
Boulet, 1958). La determinación de
biomasa se llevó a cabo por el método
de peso seco (contenido de sólidos) de
las
células
bacterianas
que
se
encuentran en una suspensión se
obtiene por el secado de un volumen en
un horno a 105 °C hasta peso constante.
SUERO DESHIDRATADO
RECONSTITUCIÓN DEL SUERO
SUERO
para suero hidrolizado, lo cual supera lo
encontrado por López 7,02 g/L para
suero desproteinizado, como en este
caso.
HIDROLISIS
SUERO
ADICIONAR 48mg DE PO4-3
ESTERILIZAR MEDIOS (15min a 125 ºC)
AJUSTE pH
INOCULACION
Gráfica 1. Producción de de acido cítrico
INCUBACION
PRUEBAS
3.2. Consumo de glucosa
Diagrama 1. Preparación de medios de
cultivo para producción de ácido cítrico
2.5 Tratamiento de datos
Las pruebas se realizaron por
duplicado, analizándolas por método
descriptivo y de varianza ANOVA con un
nivel de confianza del 95%.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Producción de ácido cítrico
En la producción de acido cítrico se
observa una similitud en la cantidad
producida entre los dos medios de suero
preparados.
La producción final de ácido cítrico en
cada medio fue muy similar obteniéndose
9,963 g/L para suero entero y 9,581 g/L
La gráfica 2. Muestra que el medio
hidrolizado tiene mayor disponibilidad
inicial de glucosa con 16,15 g/L en
comparación con el suero entero con un
valor inicial de 4,91g/L, esto debido a la
acción de la enzima Maxilac, la cual
desdobla la lactosa en glucosa y
galactosa. En ambos casos se ve
disminuida la glucosa durante el tiempo y
en el día ocho se observa el consumo
total de glucosa en los dos medios,
alcanzando niveles similares de glucosa
en las últimas tomas.
Para el suero entero se puede inferir
que a medida que el microorganismo
desdobla la lactosa, la convierte de
inmediato en ácido cítrico, ya que no se
observa una lectura alta de la glucosa
para ninguno de los días.
Gráfica 2. Determinación del contenido
de glucosa durante el tiempo de análisis
Gráfica 3. Determinación del contenido
de ART durante el tiempo de análisis.
3.5. Determinación pH
3.3.
Consumo
Reductores Totales
de
Azúcares
La gráfica 3. Muestra que hay mayor
cantidad de azúcares reductores iníciales
en el hidrolizado que en el entero con
valores de 46,1 g/L y 23,7 g/L
respectivamente. Pero en el día cuatro
tienen la misma reducción hasta 13 g/L y
en el último día de análisis tienen valores
de aproximadamente 3 g/L al comparar
esto con la gráfica 2 donde se reporta el
consumo total de la glucosa se determinó
que la disponibilidad reportada en esta
gráfica se trata de otros azúcares
reductores diferentes a este; sin embargo
la fuente utilizada para producción de
ácido cítrico es la glucosa y no la
galactosa, por lo cual esta cantidad
restante no es utilizada para la
producción de este ácido.
Inicialmente el suero tiene un pH de
4,1 y después de los ocho días de
análisis el pH obtenido estuvo entre 3,5 y
3,8, como se observa en la Gráfica 4. Lo
cual indica una acidificación del medio
producido por la fermentación que realiza
el Aspergillus niger al producir el ácido
cítrico, es evidente la relación directa
entre la producción de éste y el descenso
en el pH. Estos valores coinciden con los
trabajados por Sánchez.
Gráfica 4. Determinación del contenido
de pH durante el tiempo de análisis.
3.6. Producción de Biomasa
En el día uno, la producción de
biomasa en el medio de suero entero es
mayor que el hidrolizado, pero en el
ultimo día el fenómeno es contrario por
que
hay
mayor
cantidad
de
microorganismos en el medio de suero
hidrolizado por tener desde el inicio una
fuente alta de glucosa. La cantidad de
biomasa en el suero hidrolizado fue de
15,21 g/L y en el suero entero de 8,75
g/L mostrando una diferencia significativa
(gráfica 5). Esta diferencia en la cantidad
de biomasa obtenida en el medio, se
debe a la cantidad de glucosa disponible,
sin ser un factor que afecte la producción
final de ácido cítrico, ya que
metabólicamente la biomasa se puede
aumentar, con la mayor disposición de
azúcares reductores diferentes a la
glucosa, para el suero hidrolizado. López
obtuvo
un
valor
de
16
g/L
aproximadamente,
utilizando
suero
entero
pueden perderse por el secado y puede
existir alguna degradación. Además, la
muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el
ambiente tiene una humedad relativa
alta.
IV. CONCLUSIONES
Se puede concluir que el Aspergillus
niger, es un microorganismo adecuado
para la producción de ácido cítrico a
partir del suero lácteo, sin observar
diferencia entre el suero entero e
hidrolizado,
es
decir
que
este
microorganismo es capaz de sintetizar de
forma eficiente la lactosa y tomar la
glucosa como fuente de energía para su
crecimiento; y así realizar la fermentación
para producir este ácido.
La cantidad de glucosa en el medio el
día ocho fue de 0.27 g/L en suero entero
y 0.20 g/L en suero hidrolizado.
Gráfica 5. Determinación del contenido
de biomasa durante el tiempo de análisis.
El tiempo de seguimiento escogido fue
de ocho días siendo suficiente para
agotar la glucosa y producir el ácido
cítrico, su producción fue en forma
logarítmica proporcional al crecimiento
de los microorganismos con una
concentración final de ácido cítrico de
9,963 g/L en suero entero y 9,581 g/L en
suero hidrolizado y una biomasa de 8.75
g/L y 15.21 g/L respectivamente,
indicando que hidrólisis de lactosa solo
favorece
al
crecimiento
del
microorganismo
y
no
influye
significativamente en la producción de
ácido.
La desventaja de este método es que
componentes volátiles de la célula
Se recomienda que el ácido cítrico
obtenido a partir del suero lácteo por
Aspergillus niger, sea extraído y refinado
para posteriores
aplicaciones en la
industria alimentaria, además que su
efecto sea comparado con el obtenido
industrialmente con la melaza de la caña.
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