CITOTOXICIDAD CELULAR Pb Pb Control 0,5 XB Pb2+ : 1 y 10 mM

Citotoxicidad (Nov-08)-1
CITOTOXICIDAD CELULAR
1.- INTRODUCCIÓN
El plomo es un metal pesado altamente tóxico para la mayoría de los organismos. Los mecanismos de acción
del plomo a nivel molecular no están bien establecidos, aunque se ha observado que actúa sobre una gran variedad de
actividades biológicas en células y tejidos. Ha sido muy descrita su toxicidad sobre el sistema nervioso, en la figura
inferior se muestran sus posibles actuaciones a diferentes niveles intracelulares en las neuronas: canales dependientes de
voltaje, primeros, segundos y terceros mensajeros.
Nosotros vamos a determinar la toxicidad del plomo, de un antitumoral (DQA) y/ de PCBs sobre la viabilidad
de células procedentes de leucemias (NB4 es promielocítica aguda) utilizando dos procedimientos:
1. Recuento de células vivas íntegras por exclusión del azul de tripano
2. Ensayo colorimétrico basado en la reducción metabólica del MTT por células que respiran.
1. El azul de tripano es un colorante utilizado para el recuento de células íntegras por exclusión de dicho colorante. Este
método esta basado en que las células vivas (viables) no captan el azul de tripan mientras que las células muertas (no
viables) si lo hacen. Se cuentan como muertas las células teñidas de azul y como vivas las refringentes.
2. Las sales de tetrazolio (MTT) son especialmente útiles para ensayos de cuantificación de células viables porque la
conversión de las sales de tetrazolio (amarillo y soluble) a cristales de formazan (púrpura e insoluble) sólo se puede
producir por la actuación de las deshidrogenasas mitocondriales de las células vivas; las mitocondrias de las células
muertas no respiran.
Las células se siembran a una densidad de 75 000 células por pocillo suspendidas en 0.5 mL de medio (en placas de 6
pocillos, ver esquema en pág. siguiente). Se añaden los volúmenes convenientes de las soluciones de AcPb o de DQA
para que queden a las concentraciones indicadas en el esquema y se incuban durante 24-30 horas. Pasado el periodo de
2+
incubación se estudia la viabilidad celular. La solución madre de Pb es 50 mM y de DQA 10 mM.
Pb
Control
Pb
DQA DQA ESQUEMA DE LAS PLACAS DE CULTIVO
Todos los pocillos tienen las mismas
células y el mismo medio de cultivo.
Diferentes filas o columnas estarán en
condiciones control o tratadas
0,5 XB
Pb2+ : 1 y 10 mM
5 XB
DQA: 5 y 20 µM
Aroclor 1254: 100 y 400 µM
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1.
En resumen se incuban las células en presencia del xenobiótico a 37ºC y al cabo de 3 días se recoge el medio con
las células de cada uno de los pocillos hasta un tubo eppendorf, debidamente rotulado. El estudio de viabilidad
celular se efectua por dos métodos:
a) la reducción del MTT para detectar y cuantificar las células activas metabólicamente.
b) el método de exclusión del azul de tripano que muestra íntegras las células que excluyen el colorante.
A. REDUCCIÓN DEL MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio)
Se prepara una placa de 96 pocillos para añadir las mezclas de células con MTT. Rotular la placa para que cada taquilla
disponga sus muestras (4 de Pb y 4 de DQA) en una columna. Entre dos taquillas se dejará una columna libre.
1.- Se añaden 100 µL de suspensión celular (cuidar la homogeneidad de la suspensión), cada muestra en un pocillo
consecutivo en columna.
2.- Se pipetea 10 µL de MTT (concentración final 0.2 mg/mL) sobre cada uno de los pocillos y se incuba 2 horas a
37ºC.
3.-Se añaden 100 µL de tampón de solubilización y se incuba a 37ºC toda la noche.
4.- Se lee la absorbancia a 550 nm y a 690 nm . Esta última es la longitud de referencia para restar el fondo, por tanto
los valores de absorbancia se expresan mediante las diferencias Abs 550-Abs 690.
5.- Calcular la viabilidad celular en función de los valores de las absorbancias. Los valores de las muestras con XB se
expresan como porcentajes de la absorbancia de la muestra control (100% de células viables). Recoger los datos en la
tabla I.
TABLA I.CONTROL
0.5 mM Pb
5 mM
CONTROL
0.5 µM DQA
5 µM
∆ Absorb (550-690)
% VIVAS
∆ Absorb (550-690)
% VIVAS
100 %
6.- Representar gráficamente los porcentajes de células vivas frente a las concentraciones de tóxico.
B. RECUENTO de CÉLULAS por EXCLUSIÓN del AZUL DE TRIPANO
1.
Se añaden 90 µL de la suspensión celular recogida previamente en tubos eppendorf y 10 µL de azul de tripano; se
mezcla bien y se incuba 3 minutos. (Nota: tiempos muy largos de exposición al colorante pueden hacer que las
células vivas acaben por captar también éste).
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3. Recuento celular en la cámara de Neubauer. Para ello se añade una pequeña cantidad de la mezcla de células y azul
de tripano sobre el porta y se coloca un cubreobjetos sobre la muestra. Una vez enfocadas las cuadrículas se cuentan
las células que hay en los recuadros divididos en 16 cuadrículas (ver esquema: recuadros A, B, C y D).
Amplificación de una cámara del hemocitómetro
Conjunto de 16 cuadrículas (1)
Volumen de recuento = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm
A
B
C
D
1 mm
V = 0,1 mm3 = 10-4 cm3
Factor de la cámara = 104
Diagrama que indica las células que deben
ser contadas
Célula que debe ser contada
Célula que no debe ser contada
2.
Anotar el nº de células en TABLA II.Control
0,5 mM o µM
VIVAS
MUERTAS
VIVAS
5 mM o µM
MUERTAS
VIVAS
MUERTAS
A:
B:
C:
D:
MEDIA
4 - La media aritmética de los 4 recuentos efectuados (A,B,C y D), multiplicada por el factor de la cámara (10.000) y
por el factor de dilución (100/90) ofrece la concentración de células en la muestra (Nº células / mL), datos en Tabla III.
5 - Calcular el número total de células por pocillo = (Nº cels / mL) x volumen original (0,5 mL) y el porcentaje de
células vivas en las muestras con tóxico respecto a las células en el pocillo control.
TABLA III.- Datos de las células viables en cultivos control o tratados
CONTROL
PB 1 mM
A-1254 400 µM
Vivas
Muertas
TOTAL
Vivas
Muertas
TOTAL
Vivas
Muertas
TOTAL
MEDIA RECUENTO
Nº células/mL
Nº total células
% VIVAS / total
% MUERTAS / total
% VIVAS / control
100 %
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TABLA IV.- Datos de los cultivos en presencia de DQA
CONTROL
5 uM
Vivas
Muertas
TOTAL
Vivas
Muertas
20 µM
TOTAL
Vivas
Muertas
TOTAL
MEDIA RECUENTO
Nº células/mL
Nº total células
% VIVAS / total
% MUERTAS / total
% VIVAS / control
100 %
6- Representar gráficamente los porcentajes de células VIVAS frente a las dosis de tóxico.
7 - Comparar los resultados de células viables obtenidos por los dos métodos y comentar la eficacia y la sensibilidad
de cada uno de los métodos.
3.- MATERIALES Y REACTIVOS
3.1.- MATERIAL
.- Placas de cultivo P-24 (24 pocillos de 1,9 cm2/pocillo).
.- Cubetas de espectrofotometría.
.- Espectrofotómetro o Lector de placas.
.- Puntas de pipeta estériles.
.- Pipetas.
.- Hemocitómetro o cámara Neubauer.
3.2.- REACTIVOS
.- Medio de crecimiento: Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), al que se le añade:
10% de suero de caballo
5% de suero fetal bovino
1% de antibióticos.
.- Acetato de plomo 50 mM: disolver en agua estéril, Pm = 379,3).
Nota: todos los materiales y reactivos que se empleen para el cultivo celular deben estar esterilizados.
.- PBS: tampón fosfato
10 mM, pH 7,4
137 mM de NaCl
2,7 mM de KCl.
.- Kit para el estudio de proliferación celular ((MTT) (de la casa Boehringer cat. nº: 1 465 007).
.- Alternativamente, este reactivo se puede preparar en el laboratorio, con sal de MTT y el disolvente DMSO.
.- Azul tripano 0,4%: disuelto en agua y filtrado con filtro de 0,22 µm para prevenir agentes bacterianos.
.- Células: línea celular PC12, procedentes de un feocromocitoma adrenal de rata; estas células tumorales cultivadas en
medio con factor de crecimiento nervioso presentan muchas características semejantes a las neuronas; de hecho es una
línea celular empleada en investigación para el estudio de las características bioquímicas de las células nerviosas.
.- Línea celular NB4, procedentes de leucemia promielocítica aguda humana.
.- Línea celular K562, procedentes de leucemia mieloide crónica humana.
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