Guión en pdf

Prácticas de
Ingeniería genética
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3
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5
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C
A
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G
C
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G
A G C AA C T
TA C G T TC
5’ A T
T
G
3’
TA
lacZα
Guión de alumnos
(2012-2013)
http://www.bbm1.ucm.es/public_html/public_html//teach/biol/web05/index.html
malE
Pág
Cuadro de tareas
0
Introducción
1
Experimentos
5
Esquemas generales
5
Esquema diario
9
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
Protocolos
9
10
11
13
14
16
PCR
16
PCR comprobación de orientación
17
Transformación
18
Digestiones
19
Inducción con IPTG y Lisados
20
Electroforesis / Western Blot
21
Cuestiones
24
Apéndice
26
El método “quick change”
26
Diseño de Oligos
27
Código genético
28
Secuencias de oligos para PCRs
28
Mapas y secuencias de pMalc2x y pUCTcKm
29
MUTAGÉNESIS PCR
MUTAGÉNESIS NSERCIÓN
DIA 1
DIA 2
-Diseño exp.
- Digestión Dpn I
-PCR
-Transformación (DH5α):
-resultado PCR
-pMalc2x wt (eq 1)
-pMalc2x mut (eq 2)
DIA 3
- Preinóculos para inducción con IPTG
DIA 4
- Inducir con IPTG
- Lisar
- EF
DIA 5
-Western Blot
-Discutir resultados
- Comprobar diferencia de
tamaño wt / mut
- Transferencia
-Diseño exp.
-Transformación (DH5α)
-Digestión:
pMalc2X / pUCTcKmK
-Ligación
- Preinóculos para inducción con IPTG
- Comprobar colonias
- Gel de agarosa
-PCR orientación inserto.
-Western Blot
-Inducir con IPTG
-Lisar
-EF
-Transferencia
-Discutir resultados
Introducción
INTRODUCCIÓN
El siguiente guión pretende guiaros a través de estas prácticas de Ingeniería
Genética en las que utilizaréis algunas de las técnicas más habituales de Biología
Molecular. Aquí encontraréis un esquema de los experimentos a realizar y una
descripción detallada de los protocolos para poder llevarlos a cabo. Además, se
proporciona información complementaria en el apéndice que será de utilidad a la
hora de comprender el fundamento de los experimentos. Por otra parte, hemos preparado una serie de cuestiones a las que deberéis responder y que nos permitirán
evaluar vuestro grado de comprensión de estas prácticas.
El objetivo de las prácticas es alterar la actividad de una proteína codificada
en el plásmido pMalc2x. Para ello se realizarán mutagénesis de dicho plásmido por
diferentes métodos.
Antes de diseñar las estrategias adecuadas para producir esas mutaciones debemos conocer como funciona el sistema donde vamos a llevarlas a
cabo.
El sistema pMal/DH5α
Hoy en día se dispone de un amplio rango de bacterias modificadas genéticamente. Muchas de esas modificaciones se han diseñado para facilitar la utilización de cada determinada estirpe en diferentes experimentos tales como: clonación
de vectores, selección de esos vectores clonados o expresión eficaz de proteínas
en diversas condiciones. Así, casi todas las estirpes utilizadas en el laboratorio se
encuentran perfectamente caracterizadas conociéndose con exactitud las modificaciones que portan en su material genético. (Se puede acceder a las características
de las diferentes estirpes de Escherichia coli en distintas paginas de “internet” por
ejemplo: http://cgsc.biology.yale.edu)
Una de esas estirpes de E. coli es DH5α que, entre otras modificaciones que
pueden resultar interesantes, contiene la mutación lacZ∆M15. Esa mutación consiste
en la eliminación de una zona del gen lacZ de manera que la β-galactosidasa que
producen esas células carece de los aminoácidos 11 a 41 y no es funcional, dado
que no puede interaccionar con las otras subunidades de la enzima y formar el
tetrámero que es el que posee actividad enzimática. Como consecuencia, la estirpe
DH5α no puede metabolizar lactosa y por tanto (lo que es más interesante desde el
punto de vista de estas prácticas) no es capaz de transformar el X-Gal en el correspondiente derivado coloreado. En definitiva, cuando se plaquea DH5α en LB + X-Gal
se obtienen colonias blancas (no coloreadas).
Aprovechando esta característica de esa y otras muchas estirpes de E. coli,
se han diseñado una serie de plásmidos que permiten α complementación, es decir,
portan un fragmento del gen lacZ (también llamado lacZα) de manera que cuando
una célula de la estirpe DH5α ha sido transformada con uno de esos vectores, la
expresión del péptido LacZα codificado en el plásmido es capaz de restablecer la
capacidad de dicha célula para metabolizar lactosa (y por tanto, X-Gal).
1
Introducción
En estas prácticas vamos a utilizar el vector pMalc2x (podréis encontrar el
acceso a su secuencia completa en la página web de las prácticas)
El vector pMalc2x permite llevar a cabo α-complementación puesto que contiene el gen malE-lacZα. La expresión de este gen produce una proteína de fusión
que resulta funcional y que lleva en su extremo N terminal la proteína de unión a
maltosa (MBP) y en su extremo C terminal el péptido LacZα. Además, este gen se
encuentra bajo el control del promotor Ptac, un promotor muy fuerte e inducible por
IPTG. Para completar la funcionalidad del sistema, el plásmido pMalc2x lleva también el gen lac Iq que codifica el represor Lac I.
Mutagénesis
Nuestro primer objetivo será diseñar un experimento que nos permita eliminar
la funcionalidad de la proteína MBP-LacZ mediante mutagénesis. En concreto, de
las diferentes estrategias disponibles, a lo largo de estas prácticas emplearemos
dos aproximaciones experimentales para alterar la secuencia de DNA que codifica
la función de nuestra proteína:
A)
Mutagénesis dirigida (que nos permitirá introducir un cambio puntual
en la secuencia de MBP-LacZα)
B)
Interrupción del gen mediante la introducción de una secuencia de
DNA en el interior de dicho gen.
2
Introducción
A) Mutagénesis dirigida mediante PCR
1.
En primer lugar deberemos determinar cual es la posición de la secuencia más adecuada para llevar a cabo esa mutagénesis. Para ello podéis consultar la secuencia del plásmido pMalc2x y también las estructuras tridimensionales
de las proteínas MBP y β-galactosidasa (que se puede encontrar en el apéndice de
este guión y en la página web de las prácticas:
http://www.bbm1.ucm.es/teach/biol/web05/index.html).
2.
A continuación habrá que diseñar los oligonucleótidos necesarios
para poder llevar a cabo ese cambio mediante el método “quick change” (ver apéndice para más información –allí podrás encontrar también una descripción de las
características que deben cumplir esos oligonucleótidos).
3.
Una vez seleccionado el codón a mutagenizar y obtenidos los oligonucleótidos ya podemos llevar a cabo la reacción de mutagénesis mediante PCR y
obtener bacterias que lleven el plásmido mutante (ver protocolos).
4.
Finalmente comprobaremos que efectivamente hemos conseguido la
mutación esperada en nuestro plásmido comprobando que, una vez expresada, la
proteína ha incorporado el cambio y que por tanto no es capaz de α-complementar.
B) Mutagénesis por inserción (knock out)
En el caso de la mutagénesis por inserción procederemos a introducir una
secuencia de DNA [la de un casete que codifica un gen de resistencia a kanamicina
(Km)] dentro del gen malE-lacZα con el fin de interrumpir su expresión e impedir así
la traducción de una proteína capaz de α-complementar.
1.
En primer lugar deberemos determinar cual es el sitio de la secuencia más adecuado para llevar a cabo esa inserción. Para ello podéis consultar la
secuencia del plásmido pMalc2x y también la del casete de Km (que se puede encontrar en el apéndice de este guión y en la página web de las prácticas:
http://www.bbm1.ucm.es/teach/biol/web05/index.html).
2.
A continuación habrá que digerir con enzimas de restricción tanto el
plásmido pMalc2x como el plásmido portador del casete de Km para poder ligar el
casete dentro de la región elegida de pMalc2x.
3.
Una vez conseguidos los plásmidos mutantes habrá que comprobar si
su introducción dentro de bacterias DH5α lleva a la obtención de células incapaces
de llevar cabo α-complementación.
4.
Finalmente comprobaremos que el plásmido lleva un inserto del tamaño esperado mediante electroforesis y comprobaremos la orientación del mismo
mediante PCR.
3
Introducción
A lo largo de las siguientes secciones encontraréis una descripción detallada
de los pasos a seguir para llevar a cabo estos experimentos. En cualquier caso, es
importante que, además del desarrollo experimental, comprendáis la base de los
experimentos y el manejo de las secuencias de DNA y los programas que utilizaremos (todo ello lo podréis encontrar tanto en el apéndice de este guión como en la
página web de las prácticas:
http://www.bbm1.ucm.es/public_html/public_html//teach/biol/web05/index.html
4
Experimentos
Esquema mutagénesis PCR
(Equipo 2)
(Equipo 1)
Digestión con Dpn I
pMalc2x mut
pMalc2x wt
Transformación
Día 1
PCR
Día 2
Transformación
Transformación
Día 3
Seleccionar
colonia azul
LB+Amp+
X-Gal+IPTG
Seleccionar
colonias blancas
LB+Amp+
X-Gal+IPTG
Picar e inocular varias
colonias mutantes / grupo
LB+Amp
26 º C
(o/n)
IPTG
1mM
LB+Amp
LB+Amp
26 º C (o/n)
26 º C
(o/n)
Día 4
37 ºC (2 h)
37 ºC (2 h)
IPTG
1mM
(1C + 1 IPTG/ Eq 1)
37 ºC (2 h)
37 ºC (2 h)
37 ºC (2 h)
Lisar (wt)
IPTG
1mM
37 ºC (2 h)
Lisar (mut)
(1C + 1 IPTG/Eq 2)
Lisar (mut)
(1C + 1 IPTG/ Eq 3, 4 y 5)
5
Experimentos
Esquema mutagénesis por inserción
pUCTcKm
pMalc2x
Digerir con Pst I
Día 1
Digerir con Pst I
Inactivar PstI
Común con
experimento
mutagénesis
PCR
Mezclar y añadir ligasa
16 ºC (o/n)
(Equipo 4)
(Equipo 3)
pMalc2x Km Or1 pMalc2x Km Or2
pMalc2x wt
Transformación
Día 2
Transformación
Transformación Transformación
Día 3
LB+Amp+Km
XGal+IPTG
LB+Amp+Km
XGal+IPTG
2 col / equipo
LB+Amp
+Km
26 º C
(o/n)
IPTG
26 º C
(o/n)
Verificar orientación
en las colonias
con inserto
LB+Amp
(PCR de colonia)
+Km
LB+Amp
+Km
26 º C
(o/n)
Día 4
IPTG
IPTG
Lisados
Lisados
Lisados
6
Experimentos
Verificar orientación
en las colonias
con inserto
(PCR de colonia)
Preparar muestras
Aplicar muestras en un gel
Verificar 3 col/grupo
Los controles de pMalc2Km
Orientación 1 y
Orientación 2 comunes para
todo el laboratorio
Preparar muestras y aplicar en gel
de agarosa
Correr electroforesis
(1 hora /100 Vol)
Día 4 ( cont)
Lisados
(PCR)
Lisados
(Inserción)
Gel
Cada gel debe llevar lisados de
-Control (-/+ IPTG)
-Control mutante PCR (+ IPTG)
-Control mutante Ins Or 1(+ IPTG)
-Control mutante Ins Or 2(+ IPTG)
-Mutantes PCR e Ins (-/+ IPTG)
-DH5α
Transferir a membrana
Teñir gel y analizar resultado
Día 5
Bloquear membrana
Incubar con anticuerpo 1º
lavar
Incubar con anticuerpo 2º
Revelar y
analizar resultado
7
Experimentos
8
Experimentos / Día 1
MUTAGÉNESIS PCR / Día 1
1. Mezclar los componentes de la reacción e iniciar la PCR (ver protocolo
PCR/mutagénesis de la página 16) (una reacción por equipo)
MUTAGÉNESIS POR INSERCIÓN / Día 1
1. En primer lugar se llevarán a cabo las digestiones de los plásmidos
pMalc2x y pUCTcKm (ver protocolo digestiones en la página 19).
-pMalc2x con Pst I (apertura del vector)
-pUCTcKm con Pst I (obtención del inserto)
Componente
pMalc2x
Tampón 10x
PstI
H2O
volumen
5 μl
2 μl
1 μl
12 μl
Componente
pUCTcKm
Tampón 10x
PstI
H2O
volumen
10 μl
2 μl
1 μl
7 μl
Volumen final
20 μl
Volumen final
20 μl
2. Una vez añadidas las enzimas, las reacciones se incubarán durante 4560 min a 37 ºC
3. Finalizada la reacción se procederá a inactivar las enzimas incubando
los tubos durante otros 20 min a 60ºC o en el termobloque 10 min.
4. Finalmente se ligará mezclando vector e inserto
Componente
Vector (pMalc2x / Pst I)
Inserto (pUCTcKm / Pst I )
Tampón 10 x ligasa
Ligasa
volumen
6 μl
15 μl
2,5 μl
1,5 μl
Volumen final
25 μl
5. Se le da un pulso con la microfuga a la mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante toda la noche.
9
Experimentos / Día 2
MUTAGÉNESIS PCR / Día 2
1. Una vez terminada la reacción de PCR, sacar los tubos del termociclador,
añadir 1μl de Dpn I a cada tubo e incubar durante 2 h a 37 ºC (ver protocolo
de mutagénesis en la página 16) (una reacción por equipo)
2. Una vez finalizada la digestión con Dpn I se transformarán células DH5α
competentes (ver protocolo de transformación en la página 19). Para ello se
emplearán:
-
20 μl de la reacción de PCR digerida con Dpn I (una transformación por equipo)
Además, para llevar en paralelo controles de los plásmidos wt y mutado
los equipos 1 y 2 de cada grupo utilizarán:
- 1 μl del plásmido control (pMalc2x) (Equipo 1)
- 1 μl del plásmido mutado (pMalc2x mut) (Equipo 2)
para transformar células competentes (DH5α)
3. Por último se sembrarán las células en placas de LB+Amp+X-Gal+IPTG
MUTAGÉNESIS POR INSERCIÓN / Día 2
1. Las reacciones de ligación serán empleadas para transformar células competentes. Para ello cada equipo utilizará:
- 10 μl de la mezcla de ligación (una transformación por equipo)
Además, para llevar en paralelo controles de los plásmidos mutados
los equipos 3 y 4 de cada grupo utilizarán:
-1 μl del plásmido mutado por inserción (pMalc2x Km Or 1) (Equipo 3)
-1 μl del plásmido mutado por inserción (pMalc2x Km Or 2) (Equipo 4)
para transformar células competentes (DH5 α).
2. Finalmente las células que hayan sido transformadas con el plásmido control (equipo 1) se sembrarán en placas de LB+Amp+X-Gal+IPTG mientras
que aquellas células que hayan sido transformadas con el plásmido
pMalc2x Km Or 1 u Or2 (equipos 3 y 4) o con el resultado de la ligación (todos los equipos) se sembrarán en placas de LB+Amp+Km+X-Gal+IPTG.
10
Experimentos / Día 3
MUTAGÉNESIS PCR / Día 3
1.
A partir de las colonias obtenidas tras la transformación de células DH5α
con el producto de la PCR (plásmido mutado), cada equipo tomará con
un palillo 1 de esas colonias (de entre las que sean de color blanco, mutantes), la introducirá en un eppendorff con 50 µl de agua destilada y la
resuspenderá cuidadosamente. A continuación se emplearán 20µl/tubo
para inocular 2 tubos Falcon con 1,5 ml de LB + Amp (los tubos se crecerán a 26ºC o/n para posterior inducción con IPTG y lisado).
2.
A partir de las colonias obtenidas tras la transformación con el plásmido
control [pMalc2x (wt)], el equipo 1 tomará con un palillo 1 colonia que
sea azul, la introducirá en un eppendorff con 50 µl de agua destilada y la
resuspenderá cuidadosamente. A continuación se emplearán 20µl/tubo
para inocular 2 tubos Falcon con 1,5 ml de LB + Amp (crecimiento a 26ºC
o/n).
3.
Por último a partir de las colonias obtenidas tras la transformación con el
plásmido mutado [pMalc2x mut], el equipo 2 tomará con un palillo 1 colonia que sea de color blanco, la introducirá en un eppendorff con 50 µl
de agua destilada y la resuspenderá cuidadosamente. A continuación se
emplearán 20µl/tubo para inocular 2 tubos Falcon con 1,5 ml de LB + Amp
(crecimiento a 26ºC o/n).
MUTAGÉNESIS POR INSERCIÓN / Día 3
1.
A partir de las colonias obtenidas tras la transformación de células DH5α
con el producto de la ligación (plásmido mutado Km), cada equipo tomará con un palillo 1 de esas colonias (de entre las que sean de color
blanco), la introducirá en un eppendorff con 50 µl de agua destilada y la
resuspenderá cuidadosamente. A continuación se emplearán 20µl/tubo
para inocular 2 tubos Falcon con 1,5 ml de LB + Amp + Km (los tubos se
crecerán a 26ºC o/n para posterior inducción con IPTG y lisado).
.
2.
Por último, a partir de las colonias obtenidas tras la transformación con el
plásmido mutado [pMalc2x Km Or1 y Or2], los equipos 3 (Or1) y 4 (Or2)
tomarán con un palillo 1 colonia que sea de color blanco de cada una
de las orientaciones, la introducirá en un eppendorff con 50 µl de agua
destilada y la resuspenderá cuidadosamente. A continuación se emplearán 20µl/tubo para inocular 2 tubos Falcon con 1,5 ml de LB + Amp + Km
(los tubos se crecerá a 26ºC o/n para posterior inducción con IPTG y lisado).
11
Experimentos / Día 3
3.
Comprobaremos además la orientación de la inserción mediante PCR de
colonias. Para ello, emplearemos el volumen restante tras la resuspensión
de las colonias seleccionadas y la inoculación en tubos Falcon realizada
en los puntos 1 y 2, y seguiremos el protocolo de la página 17.
a. Para los cultivos provenientes de bacterias transformadas con el
resultado de la mutagénesis por inserción (mutantes) que sean
defectivos en actividad β-galactosidasa (colonias blancas).
b. Para los cultivos provenientes de bacterias transformadas con los
controles del plásmido mutante pMalc2x Km Or1 y Or2 (mutantes), que también sean defectivos en actividad β-galactosidasa
(colonias blancas).
12
Experimentos / Día 4
MUTAGÉNESIS PCR / Día 4
1.
2 horas antes de realizar el lisado de los cultivos seleccionados, se llevará a cabo la inducción con IPTG, y se aplicarán las muestras en los geles de electroforesis (ver protocolos en la página 20).
2.
Se hará una transferencia de los geles a una membrana de nitrocelulosa
para realizar posteriormente un Western blot de la proteína expresada.
MUTAGÉNESIS POR INSERCIÓN / Día 4
1. 2 horas antes de realizar el lisado de los cultivos seleccionados, se llevará a cabo la inducción con IPTG, y se aplicarán las muestras en los
geles de electroforesis (ver protocolos en la página 20) utilizando:
-
2 cultivos de entre los generados a partir de células transformadas con el resultado de la ligación (plásmidos mutantes)
-
2 cultivos de entre los generados a partir de células transformadas con el plásmido pMalc2x Km (uno con Or1 y otro con
Or2)
2. Las muestras se cargarán en 1 gel de electroforesis que se correrá durante 1h a 150-200 V. Transcurrido ese tiempo, se transferirá a una
membrana de nitrocelulosa para posterior Western blot.
3. Con objeto de visualizar la orientación del inserto en las muestras de
DNA amplificadas por PCR de colonia en el día 3, se mezclarán 10 μl
del resultado de la amplificación con 2,5 μl del tampón de carga 5x.
Se aplicarán 10 µl de cada una de las muestras en un gel de agarosa al
1,5 % y se correrán durante 45-60 min a 100 V.
Finalmente los geles se teñirán durante 10 min en una solución de Bromuro de etidio y se analizarán los resultados.
13
Experimentos / Día 5
MUTAGÉNESIS PCR / Día 5
1. Tras el bloqueo de la membrana con leche al 5% se incubará con el
anticuerpo primario (anti-MBP) (ver protocolo de Western Blot en
página 23).
2. Después de los correspondientes lavados se incubará con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa.
3. Finalmente se obtendrá el correspondiente luminograma mediante la
utilización de una solución conteniendo agua oxigenada (que permita
revelar la presencia de peroxidasa) y una película fotográfica (ver
protocolo).
14
15
Protocolos
MUTAGÉNESIS / PCR
1. Para llevar a cabo la mutagénesis por el método “quick change” (se describe en la página 26 del guión) en la zona elegida del plásmido pMac2x se
mezclarán en un tubo de PCR los siguientes componentes en el orden indicado:
[stock]
Reactivo
[final]
Volúmen
-
H2O destilada
-
22 μl
5x
Tampón Polimerasa
1x
10 μl
2.5 mM
dNTPs
200 μM
4 μl
5 μM
Oligo Mut-F
0.5 μM
5 μl
5 μM
Oligo Mut-R
0.5 μM
5 μl
50 mM
MgCl2
1.5 mM
1.5 μl
10 ng/μl
DNA molde (pMalc2x)
10-20 ng
2 μl (1/20)
2 u/μl
Polimerasa “Phusion”
1u
0.5 μl
2. A continuación, se colocarán los tubos en los correspondientes orificios del
termociclador y se programará y ejecutará una secuencia de PCR tal y como se describe en el cuadro adjunto.
3’
20”
30”
3’30”
Hold
98 ºC
98 ºC
69 ºC
72 ºC
4 ºC
98 ºC
72 ºC
69 ºC
3’
20’’
3’ 30”
30’’
x25
10 ºC
hold
3. Una vez finalizada la reacción (día 2) añadir 1 μl de la enzima Dpn I (20 unidades) a cada reacción de PCR e incubar a 37 ºC durante dos horas
4. Transformar células supercompetentes E. coli de la cepa DH5α con el resultado de la reacción.
16
Protocolos
COMPROBACIÓN DE ORIENTACIÓN / PCR
Obtención de DNA de colonia
1. Se toma con un asa de siembra o con un palillo una colonia (o un poco de la
estría seleccionada), se introduce en un eppendorff con 50 µl de agua destilada
y se resuspende.
2. Se calienta la muestra a 95ºC durante 5’ en el baño de bloques.
3. Se enfría 1-2 min en hielo agitando después en el vortex
4. Centrifugar en microfuga a 14000 rpm, 5 min.
5. Finalmente se tomarán 4 μl del sobrenadante para realizar la PCR
Protocolo PCR
1. Para comprobar la orientación del inserto dentro del plásmido pMalc2X se
mezclarán en un tubo de PCR los siguientes componentes en el orden indicado:
[stock]
Reactivo
[final]
Volúmen
-
H2O destilada
-
26 μl
10 x
Tampón Polimerasa
1x
5 μl
2.5 mM
dNTPs
200 μM
4 μl
5 μM
Oligo MalEF
0,5 μM
5 μl
5 μM
Oligo KM2 o KM2R
0,5 μM
5 μl
-
Sobrenadante
-
4 μl
5 u/μl
Taq Polimerasa
-
1 μl
2. A continuación, se colocarán los tubos en los correspondientes orificios del
termociclador y se programará y ejecutará una secuencia de PCR tal y como se describe en el cuadro adjunto.
3’
15”
30”
40”
Hold
95 ºC
95 ºC
68 ºC
72 ºC
10 ºC
95 ºC
72 ºC
68
60 ºC
3’
15’’
40’’
30’’
x28
10 ºC
hold
17
Protocolos
TRANSFORMACIÓN
1. El primer paso será descongelar tubos conteniendo alicuotas de 200 μl de
células competentes (E. Coli -DH5α) en un barreño con hielo.
2. Una vez que las células competentes estén descongeladas se añadirá 1 μl
(en el caso de una transformación utilizando los plásmidos control wt o control mutantes - plásmidos intactos que no presentan nicks), 20 μl en el caso
de los productos de PCR mutados) o 10 μl (en el caso de la mezcla de ligación) del correspondiente plásmido y se incubarán las células durante 30
min en hielo.
3. Shock térmico: A continuación se introducirán las células en un baño a 42
ºC durante exactamente 1’30” y a continuación se volverán a incubar en
hielo durante 5 min.
4. Periodo de recuperación: Se añadirán 750 μl de LB a cada uno de los tubos
y se incubarán las células durante 45 min - 1 h a 37 ºC con agitación
mecánica.
5. Al cabo de ese tiempo se centrifugarán las células durante 1 min a 12.000
rpm en la microfuga.
6. Tras la centrifugación se elimina el sobrenadante por decantación dejando
aproximadamente las células en unos 100-150 μl de LB.
7. Finalmente se plaquean las células en placas de LB/agar con el correspondiente antibiótico.
18
Protocolos
DIGESTIONES CON ER
Para llevar a cabo las digestiones con endonucleasas de restricción se mezclarán los siguientes componentes:
-Aproximadamente (0.8- 1μg) (unos 8 μl) del correspondiente plásmido
-1 μl de la correspondiente endonucleasa de restricción
-*X μl de tampón 10 x (**)
-H2O hasta completar el volumen deseado
* NOTA: Para que las ER sean activas deben actuar en una disolución que
contenga < 10% de glicerol. Considerando que las enzimas son suministradas
en una disolución de glicerol, es necesario preparar un volumen de reacción al
menos 10 veces mayor que el volumen de la enzima que se va a añadir (por
ejemplo si se va a añadir 1 μl de enzima se suelen hacer las reacciones en un
volumen final de 15 μl)
**NOTA: La elección del tampón y la temperatura de reacción son esenciales
para conseguir la correcta funcionalidad de las enzimas de restricción. Por tanto, antes de llevar a cabo cualquier digestión, hay que elegir el tampón más
adecuado para cada enzima (consultar tablas según la marca comercial).
En el caso de digestiones dobles hay que comprobar que el tampón utilizado sea compatible para ambas enzimas. En caso contrario las digestiones
deben hacerse de forma secuencial.
19
Protocolos
INDUCCIÓN CON IPTG, LISADOS Y PREPARACIÓN DE
MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS
Inducción con IPTG
Para la inducción con IPTG, se requiere que el cultivo se encuentre creciendo
en fase exponencial.
1. Para ello se picarán colonias (utilizando una punta amarilla o un palillo estéril) a partir de las placas de bacterias conteniendo el plásmido pMalc2x wt,
mutante o pMalc2x Km y se inocularán 2 tubos Falcon con 1,5 ml de medio
de LB+Amp o LB+Amp+Km según corresponda.
2. Los inóculos se dejarán crecer toda la noche a 26 ºC con agitación.
3. A la mañana siguiente se cambiarán a 37 ºC durante una hora (hasta que el
cultivo alcance una densidad óptica de 0.8).
4. A 1 de los tubos del cultivo se le añadirán 1.5 μl de IPTG 1M.
5. Ambos tubos se incubarán otras 2 horas a 37 ºC con agitación.
Lisados
6. Después de dos horas de incubación se transferirán 200 μl de cada cultivo a
tubos eppendorf y se centrifugarán durante 1 min a 12.000 rpm.
7. Tras descartar los sobrenadantes se añadirán 100 μl de SBL (1x)
Preparación de muestras para electroforesis
8. Finalmente las muestras serán calentadas durante 5 min a 95 ºC
9. Las muestras (10 μl ) serán cargadas en los geles.
20
Protocolos
ELECTROFORESIS (PAGE-SDS), TRANSFERENCIA Y
WESTERN BLOT
Electroforesis (PAGE-SDS)
1. Las muestras (aproximadamente 10 μl) se aplicarán en geles discontinuos de poliacrilamida (gel separador al 10%) (que serán preparados
previamente por los técnicos de laboratorio).
2. Los geles cargados se conectarán a la fuente de electroforesis y se correrán a 150-200 v (aproximadamente 1 h) hasta que el frente de azul
de bromofenol esté llegando al final del gel.
3. Los geles de electroforesis se separarán cuidadosamente de los cristales de montaje y se colocarán en una bandeja con tampón de transferencia.
Transferencia
1. Se sumergirá el gel durante 15 min en tampón de transferencia
2. En paralelo se prepararán:
-2 almohadillas para transferencia
-2 rectángulos (de tamaño algo mayor al del gel a transferir) de papel
Whatman 3MM.
-1 rectángulo de membrana de PVDF (de tamaño algo mayor que el
gel a transferir)
y también se empaparán en tampón de transferencia durante 10-15 min.
3. A continuación se procederá al montaje del sándwich:
- Sobre la parte negra del equipo de transferencia (que corresponderá al
polo negativo) se colocarán sucesivamente: una almohadilla, un
rectángulo de papel Whatman, el gel de electroforesis, la membrana de
nitrocelulosa, el otro rectángulo de papel Whatman y la otra almohadilla
(cada paso deberá realizarse asegurando –utilizando para ello una pipeta pasteur o un tubo de ensayo- que no quedan burbujas y que el
contacto entre cada una de las capas superpuestas y la anterior es
completo)
- Posteriormente se procederá al cerrado del sándwich y su colocación
dentro de la cubeta de transferencia.
21
Protocolos
- A continuación, se llenará la cubeta con tampón de transferencia fresco
hasta que cubra completamente las almohadillas conteniendo los geles.
Almohadilla
Papel Whatman
Membrana de
nitrocelulosa
Gel
4. Para comenzar la transferencia se conectará la cubeta de transferencia
a una fuente de electroforesis y se procederá a electrotransferir los geles
durante 1,5 h a 100 v (también se pede transferir o/n a 24 v)
5. Una vez terminada la transferencia se sacarán las membranas de los
sandwiches y se teñirán con rojo Ponceau durante 2 min con agitación
(La tinción con rojo Ponceau permite localizar la posición de las proteínas en la membrana verificando que la transferencia ha tenido lugar).
6. Finalmente se desteñirán las membranas enjuagándolas con agua destilada durante 5-10 min..
22
Protocolos
Western Blot
La técnica de Western blot (WB) permite identificar de manera específica la
presencia de proteínas que sean reconocidas por un anticuerpo. Para ello una
vez transferidas las proteínas a una membrana de nitrocelulosa:
1. Se incubará la membrana en una cubeta con 10-15 ml de leche desnatada al 5 % durante 30-60 min (también se puede incubar o/n a 4º C)
con el fin de bloquear la membrana e impedir uniones inespecíficas a la
misma.
2. Tras eliminar la leche, se incubará la membrana dutrante 1 h con 10 ml
del anticuerpo primario anti-MBP (dilución 1:4000 + TBS-tween 0.1%BSA 1%) a temperatura ambiente, con agitación en balancín.
3. A continuación se recogerá el anticuerpo primario y se lavará la membrana con TBS-tween 0.1 % utilizando el siguiente protocolo :
-2 lavados rápidos,
-1x 10 min
-2x 5 min
4. Después se incuba la membrana a temperatura ambiente durante 45
min - 1 h con 10-15 ml del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa “anti mouse” (dilución 1:5000 en TBS-tween 0.1%).
5. Tras eliminar el anticuerpo secundario, se lava la membrana con TBStween 0.1%:
-2 lavados rápidos
-1x 20 min
-4x 5 min
6. A continuación hay que proceder a incubar la membrana con la solución
de revelado que contiene H2O2. Para ello:
-Se prepara la mezcla añadiendo 4 ml de solución A + 100 μl de
H2O2.
-Se incuba la membrana durante 1 min en presencia de dicha solución
-Tras escurrir levemente la membrana se coloca dentro de un recipiente de plástico (una bolsa de plástico para termo-sellado o
entre dos láminas de acetato para transparencias) y se coloca en
una casete para autorradiografía.
7. Finalmente (en la cámara oscura) se procede a exponer la membrana a
una película fotográfica durante 1–5 min y se revela la película en la
máquina reveladora.
23
Cuestiones
CUESTIONES SOBRE LAS PRÁCTICAS
1. Comparar el método de mutagénesis por PCR con el utilizado. Cuáles
son las principales diferencias entre los dos métodos?
2. ¿Qué interés puede tener la modificación mediante mutagénesis de una
proteína?
3. Localiza la(s) zona(s) de la secuencia del gen más adecuada(s) para
modificar la proteína MBP-LacZα mediante mutagénesis dirigida. Explica
las diferentes estrategias que se pueden utilizar para inactivar la proteína y razona la respuesta en función del tipo de mutación.
4. Diseña los oligonucleótidos adecuados para poder hacer la mutagénesis
dirigida en el sitio elegido en la cuestión anterior (en un sitio diferente al
que se lleva a cabo en el laboratorio) por el método “quick change”.
5. Identifica las regiones a digerir en los plásmidos pMalc2x y pUCTcKm
para poder insertar el casete de Km dentro del gen malE-LacZα.
6. Predice la secuencia de la proteína que se obtendrá tras la introducción
del inserto. ¿qué ocurre con la expresión del gen malE-lacZα?
7. Diseña un experimento (incluyendo la secuencia de los oligonucleótidos
necesarios) para determinar la orientación del casete de Km dentro del
gen malE-LacZα. Utiliza unos oligonucleótidos diferentes a los utilizados
en las prácticas.
8. ¿Cual sería la estrategia a seguir si quisieras que el gen de resistencia a
Km se introdujese dentro del marco de lectura del gen malE-LacZα?.
Describe el método a utilizar incluyendo, si procede, el diseño de oligonucleótidos, esquematiza el proceso de forma detallada y muestra la secuencia de nucleótidos de la región correspondiente del plásmido así
como la de aminoácidos de la proteína antes y después. Detalla cada
uno de los pasos a seguir.
9. Tras la reacción en el termociclador ¿por qué es necesario digerir con la
enzima Dpn I en el caso de la mutagénesis por el método “quick change”?
10. ¿Crees que la mutación introducida es la única que puede tener lugar al
llevar a cabo la reacción en el termociclador?¿Cómo podrías comprobarlo?
11. Haz un esquema que explique como afectan las mutaciones introducidas a la capacidad de metabolizar lactosa en nuestro sistema.
12. ¿Se podría comprobar la eficacia de la mutagénesis llevada a cabo en
el gen malE-lacZα en cualquier cepa de E. coli?
24
25
Apéndice
El método “quick change”
Existen diversos métodos para introducir mutaciones dentro de una determinada secuencia utilizando la técnica de PCR. Nosotros aquí vamos a utilizar uno
de ellos denominado “quick change”. Como su propio nombre indica, este
método tiene la ventaja de que una sola reacción de PCR permite introducir la
mutación dentro de las dos hebras de DNA del plásmido que se desea mutar.
Podréis conocer más acerca de este método en la página
http://www.stratagene.com/products/showProduct.aspx?pid=131
Este procedimiento se basa en la utilización de: dos oligonucleótidos complementarios y antiparalelos que lleven la mutación elegida (así, cada oligonucleótido hibridará con una de las dos hebras del plásmido a amplificar) y de
un tipo de polimerasa como es la Phusion, la Pfu turbo (o alguna equivalente)
que sea capaz de polimerizar varias kilobases con una tasa de mutación muy
baja (este tipo de enzimas poseen una actividad correctora de errores).
Así, se desarrollará una reacción PCR en la que se utilizará como molde un
plásmido que lleve la secuencia a mutagenizar, como cebadores los oligonucleótidos mutagénicos diseñados específicamente y como polimerasa la Phusion polimerasa u otra equivalente.
Una vez desarrollada la reacción, nos aprovecharemos del hecho de que
el DNA obtenido a partir de aquellas estirpes de E. Coli -como DH5α− que poseen el sistema Dam1 se encuentra metilado en las adeninas de las secuencias
GAmTC y digeriremos con la enzima Dpn I (que precisamente reconoce y digiere exclusivamente el DNA que se encuentra metilado en GAmTC) con lo que se
digerirá el DNA molde pero no el plásmido mutado que proviene de una reacción de PCR y por tanto no se encuentra metilado. Finalmente se transforma
con el DNA mutado.
26
Apéndice
1
(Para más información sobre los sistemas de metilación consultar la página:
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html )
Diseño de oligonucleótidos (mutagénesis dirigida)
El diseño de oligonucleótidos para reacciones de PCR tiene una serie de normas que deben ser respetadas para conseguir que las hibridaciones que tienen
que tener lugar durante la reacción ocurran de la manera adecuada. Esas normas se refieren sobre todo al porcentaje de GC en la secuencia y la existencia
de posibles zonas de estructura 2ª que puedan dificultar la hibridación específica de los oligonuceótidos.
En el caso de los cebadores para llevar a cabo la mutagénesis mediante el
método “quick change” es necesario contemplar algunas normas adicionales:
1. Los dos oligonucleótidos mutagénicos deben contener la mutación deseada e hibridar en la misma secuencia en hebras opuestas del plásmido.
2. Los oligos deben tener de 25 a 45 pares de bases de longitud, y la Tm de
los cebadores debe ser mayor o igual a 78ºC.
Se puede utilizar la siguiente fórmula para estimar dicha temperatura:
Tm= 81.5 + 0.41 (%GC) - 675 / (N -% de no hibridación)
N= nº de nucleótidos del cebador
3. La mutación deseada debe estar en el medio del oligonucleótido con 10
o 15 bases de secuencia correcta en ambos lados
4. Los cebadores deben tener un % mínimo de GC del 40% y deben terminar en C o G.
5. Los cebadores no tienen que estar fosforilados en 5´ pero deben estar
purificados por FPLC o PAGE
Calculo de Tm de oligonucleótidos (PCR convencional)
En el caso de las PCR convencionales lo normal es hacer oligos de 18-20 nucleótidos de longitud que sean complementarios al DNA en la región correspondiente del mismo. En este caso como todos los nulcleótidos son complementarios a región que se pretende amplificar no es necesario que los oligos
sean tan largos como en el caso anterior.
Se puede utilizar esta fórmula para el cálculo de Tm de estos oligos:
Tm = (A+C) x 2 + (C+G) x 4
27
Apéndice
El código genético
T
C
A
G
TTT Phe (F)
TTC "
T
TTA Leu (L)
TTG "
TCT Ser (S)
TCC "
TCA "
TCG "
TAT Tyr (Y)
TAC
TAA Ter
TAG Ter
TGT Cys (C)
TGC
TGA Ter
TGG Trp (W)
CTT Leu (L)
CTC "
C
CTA "
CTG "
CCT Pro (P)
CCC "
CCA "
CCG "
CAT His (H)
CAC "
CAA Gln (Q)
CAG "
CGT Arg (R)
CGC "
CGA "
CGG "
ATT Ile (I)
ATC "
A
ATA "
ATG Met (M)
ACT Thr (T)
ACC "
ACA "
ACG "
AAT Asn (N)
AAC "
AAA Lys (K)
AAG "
AGT Ser (S)
AGC "
AGA Arg (R)
AGG "
GTT Val (V)
GTC "
G
GTA "
GTG "
GCT Ala (A)
GCC "
GCA "
GCG "
GAT Asp (D)
GAC "
GAA Glu (E)
GAG "
GGT Gly (G)
GGC "
GGA "
GGG "
Oligonucleótidos mutagénicos
A continuación se encuentra la secuencia de los oligonucleótidos mutagénicos
que se han seleccionado para la mutación en la proteína MBP-LacZα:
Mutmal E1 (F):
GATGTCCGCTTTCTGATATGCCGTGCGTACTG
Mutmal E2 (R):
CAGTACGCACGGCATATCAGAAAGCGGACATC
Oligonucleótidos para comprobar la orientación
A continuación se encuentra la secuencia de los oligonucleótidos que se han
seleccionado para verificar la orientación del inserto Km en el plásmido
pMalc2x:
MalEF
GATGAAGCCCTGAAAGACGCGC
KM2
GAAGGAGAAAACTCACCGAGGC
KM2R
GCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTC
28
Apéndice
PLÁSMIDOS
29
Apéndice
Nota: En las secuencias incluidas en esta sección, los aminoácidos (en código de una letra)
están colocados debajo del nucleótido central del triplete codificante.
30
31
Apéndice
32
33
Apéndice
34
35
Nota: En las secuencias incluidas en esta sección, los aminoácidos (en código de una letra)
están colocados debajo del nucleótido central del triplete codificante. En las secuencias de las
regiones de los genes detallados, es importante comprobar el sentido de los marcos de lectura
abiertos codificantes.
36
Apéndice
37
Apéndice
38