el impacto de calidad seminal en los programas de iatf

EL IMPACTO DE CALIDAD SEMINAL EN LOS PROGRAMAS DE IATF
G. M. Brogliatti
Director técnico del Centro Genético Bovino de Eolia SA y del
Centro de Inseminación Artificial La Argentina Chica
INTRODUCCION
La inseminación artificial (IA) es la biotecnología de mayor difusión entre los
ganaderos del mundo. La misma posee un gran impacto en el avance genético
poblacional y un costo reducido. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta
en un programa de inseminación artificial es la calidad del material seminal, donde debe
incluirse la sanidad propia de los reproductores, la higiene durante el proceso de
congelación y la calidad biológica evaluada mediante parámetros como la motilidad y la
morfología.
Para garantizar la fertilidad del semen de toro congelado para IA, las partidas de semen
de los eyaculados criopreservados son solamente evaluados -en forma rutinaria- por sus
niveles de motilidad espermática post-descongelado. Estas evaluaciones son realizadas,
comúnmente, en forma subjetiva, por medio de la observación de una muestra de semen
y un cubreobjetos en un microscopio de luz equipado preferentemente con óptica de
contraste de fases. La morfología espermática también es utilizada como indicador de la
habilidad de los espermatozoides para sobrellevar los procesos de congelado y
descongelado. Los resultados obtenidos dependen enteramente de la habilidad y
experiencia del evaluador.
En Europa y USA cada vez más centros de inseminación artificial incorporan
analizadores de motilidad espermática computarizados (los llamados instrumentos
CASA), con el propósito de tener una mayor objetividad en la evaluación seminal y la
posibilidad de analizar los diferentes patrones de motilidad espermática que se
encuentran en una muestra de semen, particularmente luego de su procesado.
EQUIPOS Y METODOLOGIA DE TRABAJO
Computer Assisted Semen Análisis (CASA) fue desarrollado en la Universidad de
Pennsylvania por Liu y Warne en 1977 y perfeccionado por Amann y Hammersatedt en
1980. El sistema involucra una cámara de video conectada a un microscopio de interfase
y a una computadora que digitaliza las imágenes del tamaño y de los movimientos
espermáticos. Las imágenes digitalizadas a través del tiempo permiten analizar la
velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular o lateral. En sus comienzos
las máquinas tardaban varios minutos para realizar los cálculos matemáticos;
actualmente el conteo de todas las variables se realiza en una fracción de segundo. Otros
problemas ya solucionados fueron los diluyentes con leche descremada y yema de
huevo los cuales dificultan la identificación de los espermatozoides y el análisis.
Actualmente este inconveniente fue solucionado con una tinción de Hoechst específica
para ADN y una luz Ultravioleta.
CASA - IVOS Sperm Analizer Hamilton Thorne
El equipo IVOS sperm analizer de Hamilton-Thorne es un sistema integrado ópticovisual computarizado que realiza un análisis seminal preciso y objetivo. IVOS es un
sistema internacionalmente conocido por ser un equipo rápido, certero, constante y
científicamente testeado y validado.
Opuesto a la iluminación continua de los microscopios tradicionales, el equipo IVOS
utiliza una luz estroboscópica a una velocidad de 1/1000 de segundo para visualizar el
movimiento de los espermatozoides. De esta forma una cámara de video colecta en
tiempo real 60 fotografías por segundo y así puede definir de manera muy precisa el
desplazamiento de los espermatozoides. A través de complejos cálculos matemáticos
desarrollado por una computadora, el IVOS permite hacer un análisis con el más alto
nivel de certeza en mediciones de velocidad y parámetros de motilidad seminal. El
equipo IVOS permite el cálculo del conteo total de una muestra seminal, la cantidad de
espermatozoides mótiles y concentración como también todos los valores de velocidad,
movimiento lateral, progresivo y linealidad de la trayectoria espermática.
El sistema IDENT, es una tinción utilizada para evaluar semen que ha sido diluido
común diluyente a base de leche. La muestra es incubada con el colorante Hoescht
33348 el cual se incorpora al ADN de los espermatozoides y de esta manera puede ser
identificado a través de la iluminación con luz ultravioleta y fluorescencia, permitiendo
la evaluación de la concentración y motilidad espermática.
Para evaluar morfología espermática se realiza un frotis con eosina y nigrosina y se
evalúan 100 células en microscopio óptico a 1000X con objetivo de inmersión. Los
espermatozoides anormales deben ser valorados como defectos de cabeza y cola o
acrosomas.
CORRELACION ENTRE LOS PARAMETROS DEL CASA, LA FERTILIZACION
IN VITRO Y LOS PORCENTAJES DE PREÑEZ A CAMPO
Como se ha descrito anteriormente, pocos parámetros individuales de viabilidad
espermática muestran una relación significativa con la fertilidad de la muestra de semen
descongelada, especialmente si los porcentajes de viabilidad se encuentran dentro de
límites de normalidad aceptables. Por lo tanto, tests funcionales in vitro, capaces de
discernir la habilidad del semen descongelado para llevar a cabo procesos celulares
específicos y complicados como la capacitación, la reacción acrosomal, la fecundación
in vitro (FIV) y la inducción del desarrollo embrionario in vitro han sido diseñados y
testados para determinar su relación con la fertilidad obtenida luego de la IA (H
Rodríguez-Martinez , 2000).
Estudios retrospectivos del semen criopreservado de toros con un rango amplio de
fertilidad post-IA han demostrado una correlación positiva y estadísticamente
significativa entre tasas de clivaje zigótico in vitro y las tasas de no retorno al estro 56
días después de la IA. Evaluando los resultados a nivel de la producción de blastocitos
in vitro, la correlación con la fertilidad in vivo existió, pero con coeficientes de
correlación más bajos, probablemente debido a la mayor dependencia por parte del
embrión temprano de las condiciones de cultivo que de la fuente de los espermatozoides
para alcanzar el estadio de blastocito.
La técnica de producción in Vitro de embriones es utilizada actualmente para obtener
descendencia de vacas de alto valor genético que poseen alguna falla en la ovulación o
en la superovulación y en la transferencia de embriones. Como describíamos
anteriormente esta técnica también puede ser utilizada para evaluar toros de diferente
fertilidad. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue de determinar cual de los
parámetros de motilidad espermática estaba correlacionado con los porcentajes de
fertilización in vitro de cuatro diferentes toros. Para ellos se obtuvieron ovocitos de
ovarios de frigorífico los cuales fueron madurados entre 18-24 h en medio de
maduración y luego fueron designados al azar en cuatro diferentes grupos con una
concentración final de 2x106 células espermaticas/ml. 24 horas después estos zigotos
fueron cultivados en medio SOFaas por un día y en medio SOFaas con 1,5M glucosa
por 6 días más. Los parámetros de motilidad fueron determinados con un CASA (HTMceros 12.1, USA) a las 0 y a las 1:30 h del procesamiento e incubadas en Hepes-TALP a
38º C. La correlación entre los porcentajes de fertilización In Vitro y los parámetros de
motilidad medidos por el CASA fueron analizados por una regresión lineal y los valores
de r2 fueron comparados para cada parámetro en la Tabla 6 y 7. El número de
espermatozoides mótiles mostró una significativa correlación con el porcentaje de
fertilización.
Tabla 6: parámetros del CASA y porcentaje de clivaje en cuatro toros diferentes
utilizados en fertilización in vitro.
n=
%FIV PARAMETROS
ovocitos
PMS VAP ALH BCF
A
112
67.86 1.09 91.5 7
31
M7 97
50.52 0.91 77.9 4.7 37.3
CL 89
43.82 0.2 85 5.4 33.9
MP 115
39.13 0.15 97 7.1 35
Toro
Tabla
7:
Lineal entre los parámetros del CASA y el porcentaje de FIV
PARAMETROS
PMS
VAP
ALH
BCF
LIN
LIN
53
54
52
46
Correlación
r2
0.8
0.004
0.038
0.4
0.39
Podemos concluir que el número de espermatozoides mótiles progresivos obtenidos por
el CASA muestra una considerable correlación lineal con los porcentajes de
fertilización in vitro en los cuatro toros. Este parámetro se puede utilizar como una
herramienta más para predecir la fertilidad de un toro. La linealidad como indicamos
anteriormente es un factor que al ser incluido en una fórmula de fertilidad incrementa el
resultado. De todas manera, el coeficiente de fertilidad in vitro es de baja correlación.
En un experimento en el que se inseminaron a tiempo fijo un grupo de 69 vaquillonas
Braford en el norte de Santa Fe con dos toros de diferente linealidad se observo que el
porcentaje de preñez total fue de 62 %. El porcentaje de preñez de toro de baja
linealidad en la primer replica fue de 60 % y en la segunda del 30 %; mientras del
porcentaje de preñez de toro de alta linealidad fue de 64 % y del 44 %, respectivamente.
No se observaron diferencias significativas pero sí numéricas (entre el 4 y el 14 % mas)
en el porcentaje de preñez de ambos toros a pesar de tener diferente LIN. Posiblemente
al incrementar el número de animales involucrados los resultados sean significativos.
Tanto en los experimentos realizados in vitro como en la prueba a campo observamos
que la linealidad es un factor importante a atener en cuenta al evaluar material seminal.
En un programa de inseminación artificial a gran escala se podrán evaluar este y otros
parámetros que correlacionen con la fertilidad del semen.
SEMEN REFRIGERADO VS CONGELADO EN PROGRAMAS DE IATF
El uso de semen fresco en sistemas de IATF podría disminuir el costo de la preñez
lograda a través de una mayor eficiencia (menor cantidad de espermatozoides totales
por dosis) y también, aumentando la tasa de concepción (mayor tiempo de vida útil del
semen en el oviducto por no haber sufrido la agresión del proceso de congelado).
Este experimento se realizó para evaluar los porcentajes de preñez obtenidos con semen
fresco vs. congelado y correlacionar algunos parámetros evaluados en el semen fresco
con los porcentajes de preñez. Se utilizaron 176 vaquillonas cruzas (Bos indicus x Bos
taurus). En el Día 0 todas las vaquillonas recibieron un dispositivo intravaginal con
progesterona CIDR-B (Pfizer Sanidad Animal, Argentina.) y 2 mg de benzoato de
estradiol (EB, Syntex S.A., Argentina) intramuscular (im). En el Día 8 se retiró el
CIDR-B y se aplicó 500 µg de Cloprostenol (Celar, Zoovet, Argentina) im., 24 h más
tarde (Día 9), se aplicó 1 mg de EB im. En este mismo día, se colectó el semen de tres
toros de raza Tuli por electroeyaculación y se realizó la evaluación por microscopia
común, y sistema computarizado de imágenes (CASA). También mediante la coloración
con cloruro de tetraciclina (CTC), se determinó la reacción de acrosoma. La mitad del
eyaculado fue diluido y congelado con un diluyente comercial Andromed (Minitub,
Alemania) y la otra mitad fue rediluida al doble y refrigerada a 5 grados centígrados con
otro diluyente comercial, Laiciphos (IMV, Francia). La dosis final, tanto del semen
congelado como del refrigerado fue de aproximadamente 10 millones de
espermatozoides mótiles por dosis y ambos fueron evaluados nuevamente en el
momento de la IATF en porcentaje de motilidad por microscopía común y en porcentaje
de acrosomas intactos por CTC. En el Día 10 del tratamiento (52 a 56 h posterior al
retiro del CIDR-B) las vaquillonas fueron divididas al azar en dos grupos, uno de ellos
(IA Fresco; n=85) fue IATF con semen que había sido refrigerado a 5 grados
centígrados de 24 a 30 h antes, mientras que el grupo restante (IA Congelado; n=91) fue
IATF con semen congelado. El diagnóstico de preñez fue realizado a los 30 días de la
IATF por ultrasonografía transrectal. Los datos fueron analizados a través de Regresión
Logística.
No se observaron diferencias significativas entre la utilización de semen fresco y
congelado [IA Fresco 46/85 (54,1%); IA Congelado 40/91 (44,0%); P=0,1820), toro
utilizado (P=0,7228), tampoco se encontraron correlaciones entre porcentaje de
motilidad y preñez, ni entre porcentaje de acrosomas intactos y preñez. Los resultados
obtenidos sugieren que el semen refrigerado puede ser una buena alternativa para
utilizar en programas de IATF, ya que utilizando la mitad de la dosis se pueden obtener
aproximadamente un 10% más de preñez.
CONCLUSIONES FINALES
Como han descripto otros autores anteriormente, pocos parámetros espermáticos
individuales evaluados in vitro se relacionan estadísticamente con la fertilidad in vivo.
Sin embargo, combinando los resultados de algunos análisis seminales incluidos en un
análisis de regresión múltiple ha demostrado tener una relación significativa con la
fertilidad de los toros evaluados con poder discriminativo, aunque de carácter
retrospectivo.
En la actualidad en Suecia, se exige como prerrequisito que todos los toros de un test de
progenie sean evaluados previamente por medio de CASA y Fertilizacion in vitro. Los
resultados de dichos métodos de análisis son combinados para calcular un valor
predictivo y una fertilidad potencial esperada (como tasas de no retorno) la cual ha
mostrado una fuerte relación con la fertilidad post-IA.
Estos experimentos realizados indican, que es posible el uso del análisis computarizado
del movimiento del semen y una combinación de tests de laboratorio para determinar la
calidad seminal y para predecir la fertilidad potencial de un toro para IA.
La calidad del semen a utilizar en un programa de IATF es un factor preponderante.
Una pajuela de semen de calidad debe tener una concentración, motilidad, morfología e
higiene controlada. Entendemos por calidad de una pajuela una concentración de 30 a
40 millones de esperamatozoides totales con un 30 % de motilidad progresiva a la
descongelación Esto estaría indicando un total de 9 millones de espermatozoides
motiles progresivos. Con respecto a la morfología es necesario tener un mínimo de 70%
de espermatozoides normales con no mas del 20 % de defectos de cabeza y del 25 % de
defectos de cola y acrosoma. La norma de OIE para higiene del material seminal indica
que debe poseer menos de 500 UFC / ml para ser considerada de clase I. Es
Obligatorios en nuestro país que los toros de colecta sean libres de enfermedades como
Brucelosis, TBC, y venéreas como Tricomonas y Campilobacter es ideal que también
sean libres de IBR, DVB, Leucosis, Neospora y Leptospira.