estudio en c. elegans del papel de los genes de la vía de apoptosis

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
ESTUDIO EN C. ELEGANS DEL
PAPEL DE LOS GENES DE LA VÍA
DE APOPTOSIS COMO
MEDIADORES DE LONGEVIDAD
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNO/A: ANA BARETTINO GREDIAGA
TUTOR/A: DR. RAFAEL SIRERA PÉREZ
COTUTOR/A: DRA. NURIA FLAMES BONILLA
Curso Académico: 2014-2015
VALENCIA, MAYO 2014
Licencia Creative Commons “Reconocimiento no Comercial –Sin Obra Derivada”
Estudio en Caenorhabditis elegans del papel de los genes de la vía de
apoptosis como mediadores de longevidad
Autor: Ana Barettino Grediaga
Tutor: Dr. Rafael Sirera Pérez
Cotutor: Dra. Nuria Flames Bonilla
Valencia, Mayo 2015
RESUMEN:
A pesar de la importancia de la muerte celular programada (apoptosis) como proceso clave en
regulación y mantenimiento de la homeostásis, y su papel central en numerosas patologías
asociadas con la edad como cáncer, no existen resultados previos que asocien directamente
niveles altos o bajos de los genes que regulan apoptosis con una mayor longevidad.
Este TFG propone el uso del modelo animal Caenorhabditis elegans para estudiar el papel de
los genes de la vía de apoptosis en longevidad in vivo. Para ello se obtuvieron distintos
mutantes de la vía de la apoptosis (incluyendo un mutante de ganancia de función del
homólogo de Bcl-xL, ced-9) y se realizaron curvas de longevidad para estudiar si estas
mutaciones alargaban significativamente la vida del nematodo, además se realizaron estudios
de envejecimiento saludable para testar su posible implicación en este proceso. En base a los
resultados obtenidos en este estudio se puede sugerir que niveles reducidos de apoptosis
intrínseca pueden asociarse a una mayor longevidad y, aún más importante, pueden promover
un envejecimiento más saludable.
Palabras clave: Apoptosis, longevidad, envejecimiento, C. elegans.
Licencia: Creative Commons, “Reconocimiento no Comercial -Sin Obra Derivada”.
Study in Caenorhabditis elegans of the role of apoptosis pathway genes
as mediators in longevity
Author: Ana Barettino Grediaga
Supervisor: Dr. Rafael Sirera Pérez
Co-supervisor: Dr. Nuria Flames Bonilla
Valencia, May 2015
ABSTRACT:
Despite the importance of programmed cell death (apoptosis) as a key process in the
regulation and maintenance of homeostasis, and its central role in numerous age-associated
pathologies such as cancer, there are no existing results that directly associate high or low
levels of apoptosis regulating genes with an increased longevity. This dissertation proposes the
use of the animal model Caenorhabditis elegans for the study of the role of the genes of the
apoptosis pathway in longevity in vivo. With this aim different mutants of the apoptosis
pathway were raised (including a gain-of-function mutant of the Bcl-xL homologue, ced-9) and
longevity curves were obtained in order to study if these mutations significantly extend the
nematode’s lifespan. In addition, studies of healthy aging were carried out to test the genes’
possible implication in the process. Based on the results of the study it can be suggested that
reduced levels of intrinsic apoptosis are associated with a longer lifespan, and importantly, can
promote a healthier aging.
Keywords: Apoptosis, longevity, aging, C. elegans.
License Type: Creative commons, “Attribution-Noncommercial-No Derivative Works”.
AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a mi cotutora Nuria Flames Bonilla,
de la Unidad de Neurobiología del Desarrollo del Instituto de Biomedicina de Valencia, por su
excelente dirección, apoyo, paciencia y conocimiento de los que he podido disfrutar durante
el desarrollo de este proyecto, así como por ser el claro ejemplo de que en ciencia hay que ser
atrevido y adentrarse en campos de investigación fuera de tu zona de confort.
Me gustaría agradecerle especialmente haberme dado la oportunidad de unirme a su
equipo durante todo este año, donde me he encontrado con compañeros que me han hecho
sentir como en casa, cada uno de ellos aportando su granito de arena tanto en lo científico
como en lo personal todos y cada uno de los días.
Por otra parte, no me considero apta para expresar con palabras la gratitud que siento
hacia Carla Lloret Fernández, que me ha proporcionado inestimable orientación en la
investigación. No solo eso, sino que ha sido mi bote salvavidas cuando se me hacía difícil
compaginar el proyecto con otras obligaciones debido a las características del mismo, y cuya
ayuda y apoyo moral han sido clave en estos meses.
No quisiera olvidarme de agradecer a toda mi familia que me han animado y
respaldado durante el desarrollo del trabajo, en especial a mi madre y a mi hermana por su
comprensión y confianza.
Me gustaría agradecerle a Maite Castaño el apoyo desde la distancia y a pesar de ello
estar siempre a mi lado.
Agradecer también a todos mis amigos el enseñarme tanto y ayudarme en los
momentos malos.
También quisiera agradecer a Ramón y Mariche el apoyo y el ser mis padrinos en el
ámbito investigador, y a mi tutor Rafa Sirera por aceptar ser mi tutor y proporcionarme
consejos.
Por último, quisiera agradecerle a mi padre el haberme dado el mejor ejemplo.
ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AKT: Protein kinase B, proteína quinasa B
Apaf: Apoptosis protease-activating factor, factor activador de la proteasa de apoptosis
Bcl: B-cell lymphoma, linfoma de células B
Bcl-Xl: B-cell lymphoma-extra large, linfoma de las células B extra grande
C+: Control positivo
C-: Control negativo
ced: CEll Death abnormality, anormalidad en la muerte celular
C. elegans: Caenorhabditis elegans
cep: C. Elegans P-53-like protein, proteína de tipo P-53 en C. elegans
clk: CLocK (biological timing) abnormality, anormalidad en relojes biológicos
daf: abnormal DAuer Formation, anormal en la formación de dauer
dNTPs: deoxinucleósido trifosfato
E. coli: Escherichia coli
egl: EGg Laying defective, defecto en la puesta de hevos
F(1-4): Generación filial (1-4)
FOXO: Forkhead box TF, factor de transcripción de cabeza de tenedor
GF: Gain of function, ganancia de función.
GFP: Green Fluorescent Protein, proteína verde fluorescente.
hus: human HUS1 related, relacionada a la HUS1 humana
IGF: Insulin Growth Factor, factor de crecimiento insulínico
IIS: insulina/IGF-I
ILPs: Insulin like peptides, péptidos de tipo insulina.
Kb: Kilobases
KO: Knock Out
L(1-4): Estadío larvario (1-4)
LF: Loss of Function, pérdida de función
M: Marcador de pesos moleculares
Mb: Megabases
MUT: Mutante
n: Tamaño de la muestra
N2: Cepa salvaje de referencia N2
NCBI: National Center for Biotechnology Information, centro nacional para información
biotecnológica
NIH: National Institutes of Health, Instituto nacional de salud
n.s.: No significativo
P0: Generación parental 0
pb: Pares de bases
PDE: Posterior Deirid Neurons, neuronas posteriors de la deirid
PI3: Phosphoinositol 3- kinase, fosfoinositol 3-quinasa
r.p.m.: revoluciones por minuto
SGK: Serine/threonine-protein kinases, serina/treonina protein quinasas
WT: Wild Type, tipo salvaje/silvestre
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………..……….1
1.1. Generalidades……………………………………………………………………………………………………….…..1
1.2. C. elegans como organismo modelo…………………………………………………………..…………..…2
1.3. Muerte celular programada en C. elegans……………………………………………………………..….5
1.3.1.Control genético: genes que afectan a la apoptosis……………………………………..……5
1.3.2.Genes ‘asesinos’, genes de supervivencia y genes ‘guardianes’………………………..7
1.3.3. Conservación de la apoptosis entre nematodos y mamíferos ………………………….8
1.4. Envejecimiento en C. elegans…………………………………………………………………………….………9
1.4.1.Control genético de la esperanza de vida, genes daf……………………………………....10
1.4.2.Genes clk…………………………………………………………………………………………..………………11
1.5. Relación entre apoptosis y envejecimiento………………………………………………………………11
2. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………..……………………..12
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………..………………………..………………………..……………………….13
3.1. Cepas de Caenorhabditis elegans…………………..………………………..………………………………13
3.2. Cultivo de las cepas de C. elegans…………………..………………………..………………………..……13
3.3. Extracción de ADN genómico…………………..………………………..……………………..…..…………14
3.4. Cebadores…………………..………………………..………………………..………………………..……..………14
3.5. Creación de las cepas salvaje y mutante de fondo genético común……………………….…15
3.5.1.Cruce y selección de candidatos…………………..………………………..…………………….…..15
3.5.2.Genotipado por PCR…………………..………………………..………………………..…….…………..17
3.5.3.Electroforesis en geles de agarosa…………………..………………………..……………………..18
3.5.4.Genotipado por secuenciación…………………..………………………..…………………………..19
3.6. Ensayo de longevidad …………………..………………………..………………………..……………………..19
3.6.1.Obtención de la población de estudio ………………………………………………………………19
3.6.2.Análisis de supervivencia……………..……………..……………..……………..…………………….20
3.6.3.Eventos de muerte censurados……………..……………..……………..……………..…………..20
3.6.4.Curvas de longevidad……………..……………..……………..……………..……………..…………..20
3.7. Ensayo de envejecimiento saludable (healthspan) ……………..……………..……………..……21
3.7.1.Estrés térmico……………..……………..……………..……………..……………..……………..………21
3.7.2.Estrés oxidativo……………..……………..……………..……………..……………..…………………...21
3.7.3.Locomoción en medio sólido……………..……………..……………..……………..……………….21
3.7.4.Locomoción en medio líquido……………..……………..……………..……………..……………..21
3.8. Técnicas de microscopía……………..……………..……………..……………..……………..………….…..22
4. RESULTADOS……………..……………..……………..……………..……………..……………..……………..……..…23
4.1. Obtención de las cepas salvaje y mutante de fondo genético común……………………...23
4.2. Curvas de longevidad……………..……………..……………..……………..……………..……………..……25
4.2.1.ced-9(n1950) alelo ganancia de función de Bcl-2……………..……………..………………..25
4.2.2.ced-4(n1162) alelo pérdida de función de Apaf-1……………..……………..……………..26
4.2.3.ced-3(n717) alelo de pérdida de función de Caspasa 9……………..……………..………27
4.2.4.hus-1(op241) alelo de pérdida de función del “check point” de ciclo celular
hus-1…………………………………………………………………………………………………….…….…….28
4.3. Envejecimiento saludable……………..……………..…………………………...……………..…………...29
5. DISCUSIÓN……………..……………..……………..……………..……………..……………..……………..……………30
6. CONCLUSIONES……………..……………..……………..……………..……………..……………..…………………..32
7. BIBLIOGRAFÍA……………..……………..……………..……………..……………..……………..……………..………33
I
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Enfermedades en las que están involucradas alteraciones en la apoptosis………….……1
Tabla 2. Genes con función en apoptosis en C. elegans. …………………………………………………….……5
Tabla 3. Cepas de C. elegans empleadas en el proyecto. ………………………………………………….……13
Tabla 4. Componentes del medio de recuperación de nematodos (M9). ………………………………14
Tabla 5. Componentes de la solución de lisis para los nematodos. ……………………………………….14
Tabla 6. Cebadores utilizados en el proyecto. D: cebador directo; R: cebador reverso…………..15
Tabla 7. Mezcla Reacción PCR Estándar..…………………………………………………………………………...…18
Tabla 8. Mezcla Reacción PCR Estándar con betaína. ………………………………………………………...…18
Tabla 9. Programa PCR Estándar……………………………………………………………………………………………18
Tabla 10. Componentes de la solución de Egg Prep…………………………………………………………….…19
Tabla 11. Resumen p-valor de la curva de longevidad WT vs. ced-9(n1950) réplica 1
y réplica 2……………………………………………………………………………………………………………….....26
Tabla 12. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa silvestre
vs. ced-9(n1950) en las réplicas 1 y 2………………………………………………………………………...26
Tabla 13. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa tipo silvestre
vs. ced-4(n1164)………………………………………………………………………………………………………...27
Tabla 14. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de la cepa tipo silvestre
vs. ced-3(n717)……………………………………………………………………………………………………….….28
Tabla 15. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa tipo silvestre
vs. hus-1(op241)……………………………………………………………………………………………..………..28
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. (A) Fotografía de C. elegans al microscopio óptico (Leaver M., Hyman lab) ……………..3
Figura 1. (B) Esquema de la anatomía de C. elegans y distribución de los tejidos
(Schroeder K.D.)……………………………………………………………………………………………………….…..3
Figura 2. Esquema del ciclo de desarrollo de C. elegans (WORM ATLAS)………………………………...4
Figura 3. Regulación del proceso de apoptosis en C. elegans (WORMBOOK)……………………..….7
Figura 4. Conservación de la ruta de la apoptosis en C. elegans y mamíferos
(Colin et al, 2009)…………………………………………………………………………………………………………8
Figura 5. Historia de la vida de C. elegans. (Gems & Doonan, 2008)…………………………………..….9
Figura 6. Modelo de la trasducción de señales de eje insulina/IGF-1 (Antebi, 2007)…………….10
Figura 7. Diagrama de cruces realizados ejemplificado con el gen ced-3(IV) y cat-1(III)………16
Figura 8. Gel de electroforesis para el genotipado del gen ced-4……………………………………..…..23
Figura 9. Gel de electroforesis para el genotipado del gen cep-1. …………………………………………23
Figura 10. Resultado de la secuenciación para el gen ced-4(n1162) en cepa salvaje…………….24
Figura 11. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en cepa salvaje……………………....24
Figura 12. Resultado de la secuenciación para el gen ced-4(n1162) en cepa mutante…….…..24
Figura 13. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en cepa mutante…………………..…25
Figura 14. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en la cepa heterocigoto…….…….25
Figura 15. Curva de longevidad WT vs. ced-9(n1950) réplica 2……………………………………..……...26
Figura 16. Curva de longevidad WT vs ced-4(n1162)…………………………………………………………....27
Figura 17. Curva de longevidad WT vs ced-3(n717)…………………………………………………….…………27
Figura 18. Curva de longevidad WT vs hus-1(op241)…………………………………………………….……...28
Figura 19. Resultado de las pruebas de envejecimiento saludable. (A-D)………………………….…..29
.
III
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Generalidades
El ser humano ha pasado mucho tiempo buscando el significado de la vida, pero en las
últimas décadas los biólogos han estado aún más absortos en encontrar el significado de la
muerte.
La apoptosis (muerte celular programada) es un importante proceso celular conservado en la
evolución para el desarrollo y mantenimiento de la homeostasis. La mayoría de las células
apoptóticas comparten una serie de características morfológicas y fisiológicas que las
distinguen de las muertes por necrosis. Éstas fueron descritas por Kerr et al. en 1972, pero su
importancia fue desestimada durante muchos años. Estudios genéticos han indicado que estos
cambios característicos resultan de la activación de un ‘programa de suicidio’ endógeno
presente de forma latente en todas las células (Chinnaiyan & Dixit, 1996). En la apoptosis, la
célula ejecuta un programa genético de muerte donde las señales o estímulos que inician el
proceso conducen a la activación de una vía común. Hoy en día, la apoptosis tiene un papel
central por su implicación en numerosos procesos biológicos, desde la embriogénesis y la
homeostasis normal de un tejido, hasta el desarrollo de muchas enfermedades humanas
(indicadas en la Tabla 1). Por este motivo se ha convertido en uno de los campos más activos
de la investigación biomédica ya que, no solo está involucrada en la patología, sino que la
apoptosis también ofrece herramientas para el posible desarrollo de terapias.
Tabla 1. Enfermedades en las que están involucradas alteraciones en la apoptosis.
Patologías con alteraciones en la apoptosis
Cáncer
Pecho
Pulmón
Riñón
Ovario y útero
CNS
Tracto gastro-intestinal
Cabeza y cuello
Melanoma
Linfoma
Leucemia
Desórdenes neurológicos
Alzheimer
Parkinson
Huntington
Esclerosis lateral amilotrópica
Accidente cerebrovascular
Desordenes cardiovasculares
Isquemia
Insuficiencia cardiaca
Enfermedades infecciosas
Bacterianas
Virales
Enfermedades autoinmunes
Lupus eritematoso sistémico
Síndrome autoinmune linfoproliferativo
Artritis reumatoide
Tiroiditis
1
No obstante, uno de los campos que más ha llamado la atención a los investigadores es el
posible papel de la apoptosis en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con éste,
ya que desentrañar los elementos que regulan este complejo proceso biológico es algo que se
lleva persiguiendo desde el inicio de los tiempos, algo como la ‘receta’ de la longevidad.
El envejecimiento es un fenómeno fisiológico esencial e inevitable, caracterizado por una
acumulación progresiva de daños moleculares deletéreos en las células y tejidos durante el
deterioro posterior a la etapa de madurez, que reduce la habilidad de sobrevivir e incrementa
el riesgo de muerte (Finch, 1990). El proceso de envejecimiento tiene muchas facetas. El
principal fenotipo durante el envejecimiento resulta de la acumulación estocástica de daño
molecular que desencadena en heterogeneidad molecular e insuficiencia funcional (Rattan,
2006). La senescencia celular es el estado en que las células han perdido irreversiblemente su
capacidad de proliferación y exhiben deficiencias en cuanto al mantenimiento de la
homeostasis, y ésta aumenta en los tejidos conforme van envejeciendo (Muller, 2009).
Se han postulado muchas teorías sobre el envejecimiento, agrupándose en las estocásticas y
las de genética del desarrollo (Troen, 2003). La degeneración asociada con la edad puede ser
una consecuencia del programa genético o puede ser un proceso entrópico. En última
estancia, desórdenes en los procesos básicos celulares ponen en peligro la homeostasis y
exponen a las células a la muerte por apoptosis y/o necrosis.
Como se ha mencionado, la apoptosis es también un proceso necesario en el mantenimiento
de la homeostasis de tejidos y hay evidencias que sugieren que, al menos parcialmente, la
desregulación de la apoptosis está asociada al proceso de envejecimiento y la tumorogéneis en
mamíferos (Warner, 1997). No obstante, aún está bajo debate si el envejecimiento suprime o
fomenta la apoptosis in vivo (Warner, 2006).
Por todo ello, es de crucial interés dilucidar esta posible conexión entre envejecimiento y
apoptosis, no sólo por la posible participación de la apoptosis en la longevidad, sino también
por el posible papel central de la apoptosis en el desarrollo de enfermedades asociadas con la
edad y envejecimiento saludable. Esto último es algo a tener muy en cuenta hoy en día debido
al envejecimiento actual de las poblaciones. Los avances en tecnología, salud y nutrición han
conseguido aumentar la esperanza de vida en los países desarrollados, dando lugar a su vez a
una tasa de natalidad y de mortalidad menor, que en definitiva suponen un aumento en el
número de individuos ancianos. De hecho, según la Organización Mundial de la Salud, se prevé
que la población global de gente mayor de 85 años aumente en un 351% en los próximos 40
años (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014).
Puesto que el envejecimiento viene acompañado de un incremento en la incidencia de muchas
enfermedades, incluyendo cáncer, artritis, obesidad y diabetes, la mayoría de los costes
asociados a los últimos años de vida llevaría a una situación insostenible económicamente
(Meara et al. 2004). Con esto en mente, investigar en incrementar la salud de este rango de la
población podría ser una posible solución para el próximo escenario futuro al que tendremos
que enfrentarnos (Christensen et al., 2009).
1.2 C. elegans como organismo modelo
C. elegans fue racionalmente establecido como organismo modelo en los años sesenta por
el biólogo sudafricano Sidney Brenner, este nematodo fue elegido entre una baraja de
organismos ya que presentaba ventajas notables frente a modelos animales más complejos
(Brenner, 1974). C. elegans es un nematodo trasparente no parásito que suele habitar en
suelos húmedos y templados, pudiendo ser empleado en el laboratorio de manera segura. Es
de muy pequeño tamaño, mide entorno a 1mm de longitud, lo que facilita su manipulación y
cultivo, pudiendo ser almacenados en grandes cantidades en incubadores en un espacio muy
reducido (10.000 gusanos por placa Petri). Además, su alimentación es a base de cepas
bacterianas como Escherichia coli, haciendo que su cultivo sea sencillo y económico. Por otra
2
parte, C. elegans es de los pocos organismos que pueden ser congelados y descongelados y
permanecer viables, permitiendo un almacenaje a largo plazo de los mismos.
Anatómicamente, C. elegans es un nematodo segmentado, vermiforme y de simetría bilateral.
Cuenta con una cutícula (cubierta exterior dura), cuatro cordones epiteliales y un
pseudoceloma (cavidad corporal) lleno de líquido. La anatomía básica de C. elegans contiene
múltiples tejidos e incluye una boca, faringe, intestino, las gónadas, y la cutícula de colágeno
(apreciables en la Figura 1) aunque, como todos los nematodos, no tienen ni sistema
circulatorio ni respiratorio. Las cuatro bandas de músculos que se disponen a lo largo del
cuerpo están conectadas a un sistema neural que permite a los músculos mover el cuerpo del
animal.
Figura 1. (A) Fotografía de C. elegans al microscopio óptico (Leaver M., Hyman lab)
(B) Esquema de la anatomía de C. elegans y distribución de los tejidos (Schroeder K.D.)
En cuanto a su genética, C. elegans es un organismo relativamente simple. Consta de cinco
parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales, siendo su tamaño
de 100 millones de pares de bases de nucleótidos; veinte veces mayor que el genoma de E. coli
y sobre 1/30 parte del genoma humano.
C. elegans fue el primer organismo multicelular eucariota cuyo genoma se secuenció
completamente en 1998, revelando 97 Mb (Mega bases) de secuencia codificante
correspondiente a los 19.000 genes predichos (C. elegans Sequencing Consortium, 1998).
Debido a su simplicidad anatómica y genética, se ha convertido en un sistema modelo animal
muy estudiado, ya que además posee elevada similitud con el genoma humano (40% de
homología), haciéndolo atractivo para el estudio de patologías humanas.
Otra ventaja a destacar es su transparencia, que permite la observación bajo el microscopio
óptico del desarrollo y linaje celular in vivo, así como los distintos tejidos. Destacar que gracias
a ello, el linaje celular de C. elegans está perfectamente establecido, lo que puede aportar una
información interesante y emplearse de herramienta como se hizo en este trabajo. Otra
aplicación que hace uso de esa característica es la utilización de cepas reporteras que marcan
distintos tejidos mediante la expresión de proteínas fluorescentes (como la proteína verde
fluorescente, GFP), que en nuestro caso se empleó para poder visualizar la morfología
neuronal in vivo.
Además, otro rasgo destacable es que únicamente existen machos y hermafroditas, no
hembras. La gran mayoría de la población es hermafrodita, las cuales se autofecundan y dan
origen a poblaciones isogénicas formadas por generaciones filiales idénticas a ellas, lo que
también es conocido como generaciones clonales. Esto es una gran ventaja, ya que facilita
mucho la expansión y mantenimiento de las cepas de C. elegans: la colocación de un sólo
animal fundador en una placa genera una población entera. Sin embargo, también se podrá
3
introducir el factor variabilidad mediante su fecundación vía machos. Los machos aparecen de
modo espontáneo con una frecuencia inferior al 0,3% y son los responsables de aumentar la
diversidad genética. En el laboratorio podemos inducir la presencia de machos y utilizarlos
para generar cruces entre cepas.
Por último, se han descrito métodos para generar animales transgénicos y knock out (KO). Por
todas las características comentadas, en definitiva, C. elegans se ha establecido rápidamente
como el ‘E. coli de los metazoos’.
No sólo es C. elegans un organismo modelo muy útil en general, sino que tiene una serie de
características que lo hacen especialmente interesante para el estudio de la vía de la
apoptosis, que está muy conservada en la evolución y fue originariamente descrita en C.
elegans. Aunque tiene distintos tipos de células, tiene una anatomía invariante. Por ejemplo, el
hermafrodita adulto tiene exactamente 959 células somáticas y 131 células que son generadas
en desarrollo pero cuyo destino final es la apoptosis. Además, como se ha comentado
anteriormente, el cuerpo transparente de C. elegans permite observar el linaje de cada célula
individualmente y seguirla mientras se divide, diferencia o muere.
De igual manera, hay características añadidas que hacen al nematodo muy útil para el estudio
del envejecimiento, ya que los factores genéticos y ambientales que afectan a C. elegans son
similares a aquellos que afectan a humanos, principalmente estrés oxidativo (muy fácil de
inducir en el gusano), restricción calórica y sarcopenia (pérdida degenerativa de masa
muscular y fuerza al envejecer). Es decir, el proceso de envejecimiento en el nematodo es
equiparable al de humanos presentando grandes paralelismos.
El animal también cuenta con un tiempo de generación rápido y una vida media relativamente
corta, permitiendo que estudios genéticos de longevidad puedan ser realizados en un periodo
de tiempo razonable y con un valor estadístico mayor debido al empleo de grandes
poblaciones. Su ciclo de vida es muy corto, de tan sólo 3 días (Figura 2). La esperanza media de
vida es de 2 a 3 semanas bajo condiciones adecuadas, lo que es de vital importancia para
justificar el empleo de este organismo modelo en el proyecto (mucho más corto si se compara
a la esperanza de vida de un ratón que es de dos años o más). Además, un nematodo puede
llegar a poner entre 200 y 300 huevos produciendo una descendencia muy numerosa. En
comparación con otros organismos modelo, como el ratón, el ciclo de vida corto y la numerosa
descendencia de C. elegans reduce el ciclo experimental y facilita el estudio biológico, además
de que no se tienen efectos negativos en la longevidad causados por consanguineidad.
Figura 2. Esquema del ciclo de desarrollo de C. elegans (WORM ATLAS). L1: Estadío larvario; L2: Estadío larvario2;
L3: Estadío larvario3; L4: Estadío larvario 4.
4
1.3 Muerte celular programada en C. elegans
El proceso de muerte celular programada en C. elegans comparte una serie de rasgos
morfológicos y fisiológicos característicos de la apoptosis que lo distinguen de muerte por
necrosis (Wyllie et al., 1980): conforme la célula del gusano muere, su volumen se reduce y su
núcleo se condensa (Robertson & Thomson, 1982). Los orgánulos citoplasmáticos permanecen
intactos durante las fases tempranas de la muerte. La célula ‘condenada’ es reconocida
rápidamente y engullida por una célula vecina (no hay fagocitos profesionales en C. elegans) y
finalmente degradada por fusión con lisosomas. La muerte celular programada es un proceso
muy rápido en C. elegans: en menos de una hora pueden apreciarse de los primeros cambios
morfológicos hasta la desaparición completa de la célula bajo el microscopio óptico.
Como en mamíferos, el desarrollo de C. elegans va acompañado de una extensa muerte celular
programada: de las 1090 células generadas durante su desarrollo, 131 mueren (Sulston &
Horvitz, 1977; Sulston et al., 1983), es decir, en torno a un 12%. Como casi todo en el
desarrollo de C. elegans, estas muertes son altamente reproducibles de un animal a otro: las
mismas células mueren en su punto característico del desarrollo. Por tanto, la muerte de
células individuales puede ser estudiada en el organismo.
No obstante, existen otros factores ambientales o estímulos que pueden acabar lanzando a la
célula al proceso de apoptosis, con especial importancia el daño al ADN o la infección por
patógenos.
1.3.1 Control genético: genes que afectan a la apoptosis
Durante los últimos 25 años, estudios genéticos han llevado a la identificación de un gran
número de genes involucrados en la muerte celular programada, dividiendo el proceso de
apoptosis en cuatro pasos separados temporalmente: decisión de ‘suicidio celular’, ejecución
de la sentencia de muerte, atrapamiento de las células condenadas por las células vecinas y
degradación final de la célula.
Estos genes identificados, la función de su proteína y su proteína homóloga en mamíferos (la
homología se define por el mejor resultado de BLAST recíproco) (Lettre & Hengartner, 2006) se
encuentran recogidas en la Tabla 2.
Tabla 2. Genes con función en apoptosis en C. elegans. ABC. ATP-binding cassette; AIF. apoptosis-inducing factor;
APAF1. apoptotic protease activating factor-1; Bcl-2. B-cell lymphoma-2; BH3. Bcl-2-homology domain-3; bHLH. basic helix–
loop–helix; BTB. ‘Broad complex, Tramtrack, Bric-a-brac’ domain; bZIP. basic-region leucine zipper; C. elegans. Caenorhabditis
elegans; ces. cell-death selection abnormal; ced. cell death abnormal; CPS-6. CED-3 protease suppressor-6; crn. cell-deathrelated nuclease; egl-1. egg-laying defective-1; ELMO. engulfment and cell-motility protein; EndoG. endonuclease G; EOR. egl-1
suppressor/DiO uptake defective/raf enhancer; FEN1. Flap endonuclease; GULP. engulfment adapter protein; HLH2/3. helix–
loop–helix protein-2/3; ICD-1. inhibitor of cell death-1; MEGF10, multiple epidermal-growth-factor-like motifs-10; MIG-2,
abnormal cell migration-2; βNAC, β-subunit of the nascent-polypeptide-associated complex; NEX-1. annexin-family member-1;
NUC-1. abnormal nuclease-1; PH domain. pleckstrin-homology domain; PLZF. promyelocytic leukaemia zinc-finger protein;
PSR-1. phosphatidylserine receptor-1; SH2/3. Src-homology-2/3 domain; TRA-1. transformer-1; UNC-73. uncoordinated-73;
WAH-1. worm AIF homologue-1; XK. Kell blood-group precursor.
Gen C. elegans
Decisión
ces-1
ces-2
hlh-2
hlh-3
tra-1
eor-1
eor-2
Función de la proteína
Proteína
mamífero
Factor de transcripción dedos
de zinc de tipo C2H2 (Familia
Snail)
Factor de trascripción bZIP
Factor de transcripción bHLH
(Daughterless-like)
Factor de transcripción bHLH
(Achaete-scute-like)
Proteína dedos de zinc
Factor
de
trascripción
BTB/dedos de zinc
Nueva
Slug
5
homóloga
Proteína de unión a sitio D
Factor de trascripción E2-α
Achaete-scute homólogo-1
GLI3
PLZF
KIAA1205
en
Ejecución
ced-3
ced-4
ced-9
egl-1
ced-13
Atrapamiento
ced-1
ced-2
ced-5
ced-6
ced-7
ced-10
ced-12
mig-2
unc-73
nex-1
psr-1
Degradación de ADN
nuc-1
cps-6
wah-1
crn-1
Otras
ced-8
icd-1
Caspasa
Proteína adaptadora
Proteína anti-apoptótica del
tipo BCL-2
Proteína pro-apoptótica de
dominio único BH3
Proteína pro-apoptótica de
dominio único BH3
Caspasa-3/Caspasa-9
APAF1
BCL2
Proteína Transmembrana
Proteína adaptadora con
dominios SH2 y SH3
Proteína de andamiaje
Proteína adaptadora
Transportador ABC
Pequeña GTPasa, de tipo Rac
Proteína de dominio PH
Pequeña GTPasa, de tipo Rho
Factor de intercambio de
nucleótido guanina
Proteína
de
unión
a
fosfolípido dependiente de
Calcio
Receptor fosfatidilserina
MEGF10
CrkII
Deoxiribonucleasa
Endonucleasa mitocondrial
Oxidoreductasa
5’→3’ exonucleasa
DNasell
EndoG
AIF
FEN1
Transportador de membrana
Proteína mitocondrial
XK
βNAC
Proteína de dominio BH3
Proteína de dominio BH3
DOCK180
GULP
ABCA1
Rac
ELMO
RhoG
TRIO
AnnexinA13
PSR
Además de los genes involucrados en el mecanismo de apoptosis en sí, distintos tipos de
estímulos pueden llevar a la célula a la apoptosis e involucran un abanico de genes más amplio
en el proceso, como se ilustra en el esquema general de regulación de la apoptosis en la Figura
3. Una vez se definió que la apoptosis fisiológica de las células germinales es un mecanismo
corriente en el animal, sobre todo durante la fase de desarrollo como se ha indicado, se
impulsaron estudios para probar la posibilidad de que el daño del ADN podría inducir la
apoptosis de células germinales (Gartner et al., 2000). El correcto mantenimiento y duplicación
de la información genética es vital en la célula que cuenta con puntos de control de ADN
conservados que conducen a la reparación del ADN, arresto del ciclo celular o a la apoptosis.
Pese a que la apoptosis fisiológica e inducida por daño a ADN no pueden diferenciarse a simple
vista, múltiples genes se requieren específicamente para la inducción de la apoptosis causada
por daño al ADN y no para la apoptosis de células somáticas o apoptosis fisiológica de las
células germinales (Gartner et al., 2000), sugiriendo que están reguladas por una ruta
diferente pese a que ambos comparten la misma maquinaria central de ejecución de la
apoptosis como se muestra en la Figura 3 , cuyos componentes principales serán descritos en
detalle más adelante.
6
Figura 3. Regulación del proceso de apoptosis en C. elegans. Entre paréntesis se indica el gen homólogo
en humanos. Rodeados en azul se muestran los genes de especial importancia en el proyecto actual.
(WORMBOOK,2015) Bcl-2: B-cell lymphoma-2; BH3: Bcl-2-homology domain-3; ced: CEll Death abnormality; cep-1: C. Elegans
P-53-like protein; dpl: vertebrate transcription factor DP-Like; efl: E2F-like (mammalian transcription factor); egl: EGg Laying
defective; hus-1: human HUS1 related; lin: abnormal cell LINeage; MPK: MAP Kinase; MRT: MoRTal germline; pax: PAX (Paired box)
transcription factor, Rb: retinoblastoma.
1.3.2 Genes ‘asesinos’, genes de supervivencia y genes ‘guardianes’
Hasta ahora, en el presente trabajo se ha hecho referencia a diversidad de genes, de los
cuales ced-3, ced-4, ced-9 y hus-1 son de especial relevancia para la compresión del trabajo. Así
pues, su función y posición en la ruta de apoptosis se explicará más en detalle en este
apartado, así como las características de sus mutantes.
Screens genéticos de mutantes con patrones de muerte celular anormales identificaron cuatro
genes que regulan todas las muertes de células somáticas en C. elegans, llamados ‘los cuatro
esenciales’: cell death abnormal ced-3, ced-4, ced-9 y egg-laying defective (egl)-1.
Mutaciones de pérdida de función (loss of function ‘lf’) en ced-3 y ced-4 resultan en la
supervivencia de casi todas las células ‘condenadas’ (~131), lo que indica que estos dos genes
tienen funciones pro-apoptóticas y son esenciales para la muerte celular programada en C.
elegans. Pese a que estos mutantes tienen un 12% más de células que sus correspondientes
cepas salvajes no muestran ninguna anormalidad morfológica o de comportamiento: son
viables, fértiles e indistinguibles de la cepa salvaje en cuanto a locomoción, alimentación y
muchos otros comportamientos. No obstante un análisis más profundo desvela defectos
sutiles: los mutantes de ced-3 y ced-4 crecen más lentamente y tienen una fertilidad
ligeramente reducida, y son de alguna manera defectuosos en tareas complejas como la
quimiotaxis (Ellis et al., 1991b). Las células ‘no muertas’ en los mutantes de ced-3 y ced-4 no se
dividen nunca, pero se diferencian adoptando el destino de su célula hermana (Avery &
Horvitz, 1987). Mientras que las neuronas muestran mayor variabilidad en posición y
conectividad que sus hermanas normales (Ellis & Horvitz, 1986; White et al., 1991), son
claramente sanas y de apariencia normal, sugiriendo que la ausencia de la función de ced-3 y
ced-4 bloquea el programa de muerte celular en estadios tempranos, anteriores a que ningún
evento ‘irreversible’ haya tenido lugar.
En contraste, ced-9 tiene un papel anti-apoptótico ya que el mutante de ganancia de función
(gain of function ‘gf’) de ced-9 bloquea la apoptosis, mientras que los mutantes de pérdida de
función de ced-9 (lf) mueren durante el desarrollo temprano debido a muerte celular excesiva
que afecta a células esenciales. Por tanto, el gen ced-9 es un regulador negativo de la
apoptosis en C. elegans (Hengartner et al., 1992) cuya sobreexpresión resulta en un fenotipo
similar al observado en animales que carecían de ced-3 o ced-4 (Hengartner & Horvitz, 1994b).
7
Por tanto, mientras que la muerte celular programada per se no es esencial en C. elegans,
puesto que los mutantes de ced-3 y ced-4 son viables y fértiles, el control adecuado de la
apoptosis es claramente crucial incluso en este organismo tan simple.
Otro de los genes que es conveniente destacar para el trabajo es hus-1, que codifica para una
proteína de punto de control de daño a ADN. En C. elegans, la actividad de hus-1 se requiere
para el arresto del ciclo celular y apoptosis inducido por daño al ADN, mantenimiento de los
telómeros y por tanto, estabilidad del genoma y desarrollo. Específicamente, hus-1 es
requerida para el incremento en la expresión de egl-1 dependiente de CEP-1(p53 o ‘el
guardián del genoma’) (Hofmann et al., 2002), cuyo papel en la ruta está indicado en la Figura
3.
1.3.3 Conservación de la apoptosis entre nematodos y mamíferos
Los análisis moleculares de ced-3, ced-4, ced-9 y egl-1 en los años noventa proporcionaron
pistas muy importantes para entender cómo funciona la maquinaria apoptótica, no sólo en C.
elegans, sino en otras especies. La ruta de muerte celular programada caracterizada en
nematodos permanece conservada en la evolución y también funciona en mamíferos; de
hecho, los cuatro genes codifican reguladores apoptóticos conservados.
ced-3 codifica para una proteasa de la familia de las caspasas (un grupo de enzimas cisteína
proteasas esenciales por su papel en la apoptosis). CED-4 es una proteína adaptadora similar al
factor-1 de activación de proteasas apoptóticas (apoptotic protease-activating factor-1
(APAF1)). Como sus homólogos en mamíferos, CED-3 y CED-4 oligomerizan y forman un
complejo de tipo apoptosoma, unión que es requerida para la activación de la apoptosis.
Por otra parte, la proteína CED-9 muestra significativa similaridad con el producto del protooncogen Bcl-2 en mamíferos que, como ced-9, es un regulador negativo de la apoptosis
(revisado por Korsmeyer et al., 1993; Reed, 1994). Además, Bcl-2 puede impedir la apoptosis
cuando es sobreexpersada en los gusanos, y puede sustituir parcialmente a ced-9, sugiriendo
que esas dos proteínas tienen un mecanismo de acción molecular similar (Vaux et al., 1992;
Hengartner and Horvitz, 1994a).
La participación de miembros de las familias génicas de ced-9/Bcl-2 y ced-3/caspasa en la
mediación de la muerte celular programada, tanto en C. elegans como en humanos, y la
observación de que esos genes estructuralmente similares son funcionalmente
intercambiables sugiere encarecidamente que los nematodos y mamíferos comparten un
camino molecular común para el proceso de apoptosis. De hecho, no sólo CED-9 y CED-3, sino
todo el resto de la ruta de apoptosis que ha sido caracterizada en C. elegans está conservada
en la evolución como se ilustra en la Figura 4.
Figura 4. Conservación de la ruta de la apoptosis en C. elegans y mamíferos. ( Colin et al, 2009).
8
Apaf-1: apoptotic protease activating factor-1; Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B-cell lymphoma-2; BH3: Bcl-2-homology
domain-3; ced: CEll Death abnormality; cyt-c: cytochrome complex; egl: EGg Laying defective; IAP: Inhibitors of apoptosis
proteins.
Así pues, en definitiva, los estudios en el nematodo C. elegans, la mosca de la fruta Drosophila
melanogaster y en ratón, indican que la maquinaria molecular de la apoptosis está conservada
en la evolución y es intrínseca a todas las células de metazoos. Por tanto, investigar la
apoptosis en C. elegans puede proporcionar pistas para comprender mejor la apoptosis en
humanos.
1.4 Envejecimiento en C. elegans
Los nematodos C. elegans tienen una vida media de en torno a 18-20 días cuando crecen a
20ºC. Son organismos poiquilotermos, lo que significa que este valor varía drásticamente con
la temperatura: la esperanza de vida aumenta a 22 días a 15ºC y se reduce a menos de una
docena de días a 25ºC (Lakowski & Hekimi, 1996). El desarrollo embrionario y larval dura de
tres a cuatro días. Tras alcanzar la etapa adulta y la madurez sexual, son capaces de generar
progenie durante unos cinco días. La semana restante de la vida del animal, comprende el
periodo post-reproductivo o de senescencia como se muestra en la Figura 5.
Figura 5. Historia de la vida de C. elegans. L1 corresponde a estadio larvario 1, habiendo hasta 4
estadios larvarios. La ‘d’ hace referencia al estado alternativo de arresto dauer, en el que el gusano
entra cuando las condiciones de desarrollo no son favorables (ausencia de alimento, temperatura
alta, exceso de población) y puede permanecer en él hasta 3 meses. Además, es capaz de reanudar el
ciclo de vida normal cuando las condiciones vuelven a ser favorables sin ningún efecto. De este modo
aumenta cuatro veces su esperanza de vida media. (Gems & Doonan, 2008).
Este nematodo, presenta una serie de cambios relacionados con la edad equiparables a los
observados en otros organismos, incluidos los humanos. Conforme aumenta la edad, los
gusanos son menos activos, muestran movimientos descoordinados, y finalmente dejan de
moverse, resultado de la degeneración muscular, mientras que el sistema neuronal permanece
relativamente intacto. Otros cambios observados son la aparición de arrugas en la cutícula, la
acumulación de lipofuscina, pigmentos oscuros, presencia de estructuras de tipo vacuola y
niveles altos de proteínas oxidadas y carboniladas, así como una reducción en la fertilidad,
problemas en la alimentación y deleciones en el ADN mitocondrial.
Los principales estudios sobre envejecimiento en C. elegans se han dirigido hacia la genética
del proceso, analizando el efecto de mutaciones puntuales en búsqueda de aquellas que
alargaban la vida del nematodo y han sido muy útiles para identificar rutas de señalización y
genes conservados en la evolución que incrementan la esperanza de vida. No obstante, en los
últimos años se ha redirigido la investigación hacia saber si aumentar la vida media también
supone aumentar el ‘periodo saludable’ (healthspan, periodo en el que animal posee una
capacidad funcional mayor que el 50% de la capacidad máxima funcional del tipo salvaje) o
simplemente se está prolongando el ‘periodo de fragilidad’ (gerospan, periodo en que el
animal posee una capacidad funcional inferior al 50% de la capacidad funcional máxima del
tipo salvaje) con el consecuente incremento de enfermedades asociadas con la edad. Así pues,
surge la necesidad de desdoblar los estudios de envejecimiento en estudios de longevidad o
lifespan y estudios de envejecimiento saludable o healthspan (Bansal et al, 2014), que serán
integrados en el desarrollo de este proyecto.
9
1.4.1 Control genético de la esperanza de vida, genes daf
El descubrimiento de que mutaciones en un sólo gen, age-1 o daf-2, podían extender la
esperanza de vida llegando a duplicarla reveló que la longevidad está ciertamente bajo control
genético (Friedman & Johnson, 1988) (Kenyon et al., 1993). También se vio que la longevidad
es dependiente de daf-16, definiendo la existencia de un camino de epistasis para este
proceso. Además, la identificación molecular de estos tres genes como componentes de la ruta
de señalización de la insulina/IGF-I (IIS) ((Morris et al.,1996), (Kimura et al., 1997),(Ogg et al.,
1997), (Lin et al., 1997)) finalmente llevó a la comprensión de que una modesta regulación a la
baja de la IIS promueve resistencia al estrés y longevidad en los diferentes taxones (Clancy et
al., 2001)(Tatar et al., 2001) (Bluher et al., 2003)(Holzenberger et al., 2003). Estudios de
genética molecular sugieren que, en respuesta a los péptidos de tipo insulina (insulin-like
peptides, ILPs), la activación del receptor tirosina kinasa DAF-2/insulina/IGF-1 desencadena
una cascada de quinasas PI3/AKT/SGK que fosforila al factor de transcripción DAF-16/FOXO,
como se muestra en la Figura 6 (Paradis & Ruvkun, 1998) (Ogg & Ruvkun, 1998) (Paradis et al.,
1999). En consecuencia, se retiene a DAF-16/FOXO en el citoplasma y los animales tienen una
vida media normal.
Figura 6. Modelo de la trasducción de señales de eje insulina/IGF-1, mostrando las kinasas asociadas
(azul) y los factores nucleares (verde). (Antebi, 2007). AKT: proteín quinasa B; AMPK: proteín quinasa activada
por AMP; Βcat: β-catenina; DAF: abnormal DAuer Formation ; FOXO: Forkhead box protein; HSF: factor de
transcripción de choque térmico ; Ins: Insulina; Ins/IGFR: Insuline/ Insuline Growth Factor Receptor; IRS: Insulin
receptor substrate; JNK: Quinasas c-Jun N-terminal; MAPK: Mitogen-activated protein kinases; MST: mammalian
sterile 20–like kinase; P: Phosphate groups; PDK: Pyruvate dehydrogenase kinase; PIP: phosphatidylinositol di/tri
phosphate; PI3K: fosfoinositol 3-quinasas; PTEN: Phosphatase and tensin homolog; RLE: ubiquitin ligase; SGK:
Serine/threonine-protein kinases; SIR: yeast SIR related; MK: SMEK (Dictyostelium Suppressor of MEK null) homolog.
En respuesta al incremento de la actividad DAF-18/PTEN, estrés (térmico, oxidativo, inanición)
o reducida IIS, DAF-16/FOXO entra en el núcleo (Lee et al., 2001) (Lin et al., 2001) (Henderson
& Johnson, 2001) y activa los genes de supervivencia, incluyendo los que controlan el estrés
oxidativo, de choque térmico, inmunidad innata, metabolismo, autofagia y respuesta a
xenobioticos, entre otros.
Así pues, IIS se entiende mejor como una ruta de señalización seleccionada a lo largo de la
evolución para regular la supervivencia del organismo, no el envejecimiento per se. De hecho,
durante el desarrollo larval, DAF-16/FOXO especifica el paso a la diapausa dauer, un estado
10
larval altamente resistente al estrés y de larga vida, especializado en la supervivencia durante
condiciones adversas. Sin embargo, tras recuperar unas condiciones de crecimiento normales,
los nematodos son capaces de recuperar el ciclo de vida normal y desencadenar la longevidad
en adultos (Dillin, 2002). Evidentemente, el papel funcional del IIS es proporcionar resistencia
somática para sobrellevar los tiempos difíciles y, por el contrario, especificar crecimiento y
reproducción en los buenos tiempos, con consecuencias secundarias en la vida media del
adulto. Consecuentemente, muchos mutantes de la longevidad tienen aptitudes Darwinianas
(fitness) reducidas bajo condiciones que favorecen un rendimiento reproductivo rápido a corto
tiempo (Jenkins et al., 2004).
1.4.2 Genes clk
Desde que se elucidó la ruta central explicada en el apartado 1.4.1, se han ido detectado
muchos más de los llamados ‘genes de longevidad’, algunos relativos o que convergen en la
ruta de IIS, como los genes sir y los genes old, y otros que no, como son los genes clk (clock
abnormal biological timing). Éstos son de especial interés puesto que, a diferencia del resto,
afectan a la esperanza de vida no sólo en el periodo postreproductivo.
Los genes clk regulan los relojes fisiológicos, del desarrollo y del comportamiento durante su
ciclo vital. Se han identificado cuatro mutantes clk que muestran un moderado incremento en
la longevidad: clk-l, clk-2, clk-3, y gro-1 (Hekimi et al., 1995; Wong et al., 1995; Lakowski &
Hekimi, 1996). Mutaciones en estos genes ralentizan la mayoría de los procesos dependientes
de tiempo y también los comportamientos rítmicos en C. elegans, incluyendo la sincronización
de las divisiones celulares durante el desarrollo embrionario, la alimentación, defecación y
locomoción.
Pese a que muchas de las mutaciones que desencadenan longevidad se han acabado
relacionando con la función de daf-16 o convergen en su ruta, la existencia de estos mutantes
cuya longevidad es independiente a daf-16 sugiere que esas clases de genes afectan al proceso
de envejecimiento por mecanismos distintos. De hecho, los dobles mutantes para los genes clk
y los genes de la ruta de formación de dauer tienen efectos aditivos en la esperanza de vida
(Lakowski & Hekimi, 1996). Esto hace pensar que realmente no nos encontramos frente a un
único programa de envejecimiento, sino múltiples.
1.5 Relación entre apoptosis y envejecimiento
A pesar de la importancia de los procesos de apoptosis y envejecimiento, y de que la
amplia investigación efectuada en ambos campos parece sugerir que los dos procesos podrían
estar relacionados de alguna manera, no existen evidencias que asocien directamente niveles
altos o bajos de los genes que regulan apoptosis con una mayor longevidad.
El grupo del Dr. José Viña, de la Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, en
colaboración con el Grupo Español para el Estudio de Centenarios, ha analizado un grupo de
centenarios de la Comunidad Valenciana y su estudio revela patrones específicos de expresión
en centenarios. En esta investigación, se realizaron estudios de transcriptómica con
microarrays en los que se comparan tres poblaciones: centenarios, septuagenarios y jóvenes.
Se observó que genes sobreexpresados en centenarios no lo estaban en septuagenarios y sí en
personas jóvenes. De entre los genes regulados de manera diferencial en centenarios,
destacan aquellos asociados con el control de la apoptosis y senescencia celular, poseyendo
niveles elevados de la proteína antiapoptótica Bcl-xL (Borrás et al., resultados en preparación
para publicar).
El análisis por PCR de transcripción reversa (RT-PCR) de células mononucleares periféricas de la
sangre desveló que, de hecho, los centenarios regulaban positivamente Bcl-xL comparado con
septuagenarios y gente joven.
Sus resultados, en definitiva, sugieren que los centenarios reprimen la apoptosis intrínseca,
proporcionando una pista de cómo las personas más longevas en la sociedad consiguen vidas
tan largas, y a la vez tan saludables.
11
2. OBJETIVOS
El principal interés de este trabajo es comprobar la hipótesis de que los genes de apoptosis
podrían estar directamente involucrados en longevidad y envejecimiento saludable, con
especial interés en Bcl-xL. Hasta ahora, se ha encontrado una correlación mediante estudios de
transcriptómica entre niveles de expresión de Bcl-xl y longevidad, pero no existe evidencia
funcional in vivo de causalidad entre nivel de Bcl-xl y esperanza de vida. Por ello, se propone al
organismo Caenorhabditis elegans como herramienta para este estudio.
Para ello, se han propuesto una serie de objetivos:
1. Creación de cepas de mutantes de la vía de la apoptosis y su respectiva cepa salvaje
con un fondo genético común mediante la realización de cruces.
2. Constatación del efecto de las mutaciones en la vida del nematodo mediante la
realización de curvas de longevidad.
3. Análisis de envejecimiento saludable mediante cuatro pruebas de healthspan.
12
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Cepas de Caenorhabditis elegans
Las cepas de C. elegans empleadas están detalladas en la siguiente Tabla 3:
Tabla 3. Cepas de C. elegans empleadas en el proyecto. La procedencia de las mismas viene indicada con
el superíndice, siendo a: cedidas por el laboratorio de Oliver Hobert en la Universidad de Columbia; b:
adquiridas del Caenorhabditis Genetics Center (CGC); c: generadas en el laboratorio.
Nombre
N2
Genotipo
Cromosoma
a
Tipo de Mutación
Descripción
Ninguna
Cepa
silvestre
de
referencia
Cepa reportero GFP en
PDE
Cepa reportero GFP en
PDE
Cepa mutante de la
apoptosis
Cepa mutante de la
apoptosis
OH8246a
otIs221(cat-1::gfp)
III
Ninguna
OH8249a
otIs224(cat-1::gfp)
Ninguna
DL308b
ced-3(n717)
Desconocido
No III
IV
MT2547b
ced-4(n1162)
III
WS2277b
hus-1(op241)
I
MT8735b
egl-1(n1084n3082)
V
TJ1b
cep-1(gk138)
I
MD792b
ced-13(sv32)
X
NFB469c
ced-9(n1950)
III
cep-1(gk138)
I
Deleción
1660pb
Mutación KO
ced-4(n1162)
III
Sustitución
C>T codón
prematuro
ced-3(n717)
IV
Sustitución
C>T
hus-1(op241)
I
Sustitución
G>A
Sustitución
C>T
Sustitución
C>T codón de
prematuro
Sustitución
G>A
Desconocida
parada
Cepa mutante
apoptosis
Cepa mutante
apoptosis
Cepa mutante
apoptosis
Deleción
1660pb
Mutación KO
Delección
1304pb
NFB470c
NFB654c
NFB655c
NFB677c
NFB678c
NFB679c
NFB680c
NFB681c
NFB682c
de
parada
de
la
de
la
de
la
Cepa mutante de la
apoptosis
Cepa mutante de la
apoptosis
de
fondo
genético común a NFB470
Cepa silvestre de fondo
genético común a NFB469
Cepa mutante de la
apoptosis
de
fondo
genético común a NFB655
Cepa silvestre de fondo
genético común a NFB654
Cepa silvestre de fondo
genético común a NFB678
Cepa mutante de la
apoptosis
de
fondo
genético común a NFB677
Cepa silvestre de fondo
genético común a NFB680
Cepa mutante de la
apoptosis
de
fondo
genético común a NFB679
Cepa silvestre de fondo
genético común a NFB682
Cepa mutante de la
apoptosis
de
fondo
genético común a NFB681
3.2 Cultivo de las cepas de C. elegans
El mantenimiento de los cultivos se hizo de acuerdo a lo establecido por el método de
Sydney Brenner (Brenner, 1974), el cual está basado en el uso de placas Petri que contienen
NGM (Nematode Growth Medium) agar sobre el cual se adiciona la cepa OP50-1 de Escherichia
Coli. El medio NG agar contiene NaCl (3gL-1), agar (17 gL-1), peptona (2,5 gL-1), CaCl (1M, 1 ml L1
), MgSO4 (1M, 1 ml L-1), tampón KPO4 (1M, ph=6.0, 25 ml L-1), colesterol (5 mg ml-1 en etanol al
13
95% 1 ml L-1), agua mili-Q y nistatina (Sigma) que actúa como antifúngico y antibiótico. Los
nematodos pueden ser crecidos a 15, 20 ó 25 ºC, sin embargo en este experimento se
crecieron siempre a 20ºC para asegurar que la temperatura de incubación no afecta a la
velocidad de crecimiento, y por tanto a su longevidad, de manera distinta entre cepas y
experimentos.
3.3 Extracción de ADN genómico
En los ensayos de genotipado el ADN genómico de gusano se extrajo mediante un lisado
de los nematodos, siguiendo la modificación descrita por Williams (Williams et al., 1992). En
primer lugar, se lavaron las placas con medio M9 para recuperar los nematodos y de cada
placa se pasaron a tubos de PCR independientes. Con ayuda de hielo se dejó sedimentar los
gusanos en el fondo del tubo, para posteriormente, retirar el sobrenadante. El pellet de
gusanos se resuspendió en 100 μl una solución de lisis y proteinasa K (20 mg/ml, Thermo
Scientific). Después, se incubaron a -80ºC durante 20 minutos para conseguir la rotura de las
células de los gusanos por la formación de cristales de hielo. Finalmente, se incubaron durante
4 horas a 65ºC para que la proteinasa K degradase los tejidos y posteriormente 30 minutos a
95ºC para inactivar el enzima. La composición del medio M9 y de la solución de lisis se
encuentra detallada en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4. Componentes del medio de recuperación de nematodos (M9).
Componente
Concentración
Na2HPO4·12H2O
80 mM
KH2PO4
22 mM
NaCl
8,5 mM
NH4Cl
0,2 M
Tabla 5. Componentes de la solución de lisis para los nematodos.
Componente
Concentración
KCl
50mM
Tris-HCl
10mM, pH 8.3
MgCl2
2,5mM
Triton X-100
0,45% (v/v)
Tween 20
0,45% (v/v), Sigma
3.4 Cebadores
En este trabajo se han empleado cebadores para el genotipado que permite discernir
entre cepa mutante y cepa salvaje con un fondo genético común. En el diseño de los
cebadores se han tenido en cuenta lo siguiente:
- Longitud entre 18 y 30 nucleótidos, siendo el tamaño ideal de 21-25 nucleótidos.
- Porcentaje de C/G aproximadamente un 40-60% del total de bases incorporadas
- Temperatura de fusión (Tm) entre 50-65 ºC
- La auto-complementariedad debe ser evitada para minimizar la formación de
estructuras secundarias y dímeros de cebadores.
- Posicionamiento de G y C en el extremo 3’ del cebador para propiciar la unión al ADN
molde.
Para el diseño de los cebadores se utilizó el programa Ape(A plasmid editor) versión 2.0.45,
indicándose el resultado obtenido en la Tabla 6.
Para el diseño de cebadores en el caso de que la mutación fuera una sustitución se empleó la
secuencia contigua a la mutación, de tal forma que se amplificara una banda en torno a 400—
800pb. Para las delecciones se emplearon tanto las secuencias flanqueantes como un cebador
interno en la secuencia de la delección que, por tanto, amplificará solo en las cepas salvajes. En
14
el caso de la mutación de egl-1, cuya naturaleza es desconocida, se emplearon las secuencias
adyacentes a la región del gen.
Tabla 6. Cebadores utilizados en el proyecto. D: cebador directo; R: cebador reverso.
Cebador
Secuencia 5’ →3’
Tm (ºC)
Aplicación
D
oCL18
TCTGAAATCCACAAGCGACC
58
Para secuenciar cedR
3(n717)
oCL19
CGCAAGTTCAGGTTGCAATT
D
oCL20
CGACTTTGAACCACGTGACGC
69.5
Para secuenciar cedR
4(n1162)
oCL21
ACGGGCTCGTCTTCAAACAC
D
oCL22
AAGGCTAGGCGGAGGAAGAG
70
Para secuenciar cedR
13(sv32)
oCL23
CGAGAAGGCTCACAAGAAGGAC
D
oCL24
R
oCL25
D
oCL26
R
oCL27
D
oCL28
R
oCL29
D
oCL30
R
oCL31
D
oCL32
oCL33
R
TTAACAACGGGACAACGGGAC
CGGAGGAACGCATCCATGAAG
AGATACTGCGGCAATCGACG
GACGTGTAAGAAACGGGACATC
GGGAGTTGGAGACGGAGAGATCG
GCACACCATTCATTCACACCCAAA
CGACGAACAATGCTGGCATACG
59.8
66
-
GTTTCTGTCCGCCTTCCTTCC
ACAAGTACGGTAGTCTCGACACG
-
AAAGACCGCAAGGCACATCG
Para secuenciar cep1(gk138)
Para secuenciar hus1(op241)
Para secuenciar egl1(n1084n3082
Para amplificar la
deleción en ced-13 (+
en cepa silvestre solo)
Para amplificar la
deleción en cep-1 (+ en
cepa silvestre solo)
3.5 Creación de las cepas salvaje y mutante de fondo genético común
3.5.1 Cruce y selección de candidatos
Se partió de cepas de mutantes de la vía de la apoptosis proporcionadas por el CGC
(recogidas en la Tabla 3) y se cruzaron con la cepa salvaje N2 con la finalidad de recuperar de
nuevo una cepa mutante y una cepa salvaje con un fondo genético común y así evitar la
posible influencia en la longevidad de otros elementos del genoma. Además, con el fin de
facilitar la selección de posibles candidatos de mutantes y cepa silvestre se introdujo mediante
cruces el reportero del gen cat-1 fusionado a GFP que se expresa en las dos neuronas
posteriores deirid (PDE) de la zona posterior de la gónada del nematodo. Estas neuronas son
bilaterales y tienen un linaje muy bien establecido, en cuyo último punto de división una célula
entra en procesos apoptótico y muere y la célula hermana da lugar a la neurona PDE. Puesto
que se emplearon cepas con alteraciones en el proceso de apoptosis, o muerte celular
programada, uno de los fenotipos de estos mutantes es que en el linaje del PDE, en el último
paso de división no se produce la muerte de la célula hermana a PDE y esto da lugar a la
presencia de neuronas PDE ectópicas en los gusanos mutantes. Por tanto, el uso de cepas cat1::gfp supone una herramienta de utilidad a la hora de discriminar entre cepa mutante
(animales con neuronas PDE ectópicas) y cepa salvaje (número normal de neuronas PDE). Para
introducir este reportero de la neurona PDE, se realizó un cruce de la cepa mutante en
cuestión con la cepa OH8246, portadora del reportero cat-1::gfp, en el cromosoma III. Esto se
hizo para todas las cepas excepto MT2547(ced-4 (n1162)) puesto que este gen también se
encuentra en el cromosoma III y al intentar poner en homocigosis a ambos se repelerían. Por
ello se empleó la cepa OH8249 con el reportero cat-1::gfp en un cromosoma distinto al III,.
Los cruces realizados vienen indicados a continuación en la Figura 7. A la hora de realizar un
cruce con C. elegans se utiliza una proporción de machos y de hermafroditas en estadio L4 3:1;
generalmente 12 machos y 4 hembras, para propiciar el cruce por encima de la
autofecundación cuando era lo deseado.
15
Figura 7. Diagrama de cruces realizados ejemplificado con el gen ced-3(IV) y cat-1(III).
Como se ve en la Figura 7, en primer lugar se indujeron machos de la cepa salvaje N2. Esto se
realizó mediante el método descrito por Lints & Hall (2009), que consiste en una sucesión de
incubaciones de larvas L4, estadio anterior al periodo reproductivo, a distintas temperaturas:
30’ a 27ºC, 6h a 30ºC y 2 días a 20ºC. Con estos choques térmicos se consigue generar un
estrés que inducirá el aumento de la frecuencia de machos para crear variabilidad como
mecanismo de supervivencia en la descendencia.
A continuación estos machos generados se cruzaron con la cepa que contiene el reportero cat1::gfp que marca las neuronas PDE por la finalidad comentada anteriormente, obteniendo así
machos con las neuronas marcadas en GPF que servirían como parentales P0 y se cruzaron con
hermafroditas mutantes para los genes de la vía de la apoptosis. Con este cruce se generó una
descendencia F1 (generación filial 1) uniforme de heterocigotos para la mutación de interés, la
mitad de ellos sin reportero y la otra mitad con reportero, siendo estos últimos seleccionados
a la lupa de fluorescencia. Se transfirieron diez gusanos individualmente a placas nuevas y se
analizó su descendencia proveniente de la autofecundación. En la segunda generación filial F2
se tuvieron tanto homocigotos para la mutación y para su ausencia como heterocigotos en
ambos cromosomas; es decir, para el reportero y para la mutación de la vía de la apoptosis. De
16
ellos, se seleccionó 20-30 gusanos que contenían el reportero verde y se observó el fenotipo
de la descendencia F3 para tratar de dilucidar el genotipo de los parentales F2.
- Si la F2 era homocigota salvaje, careciendo de la mutación, se contabilizaron sólo dos
neuronas PDE en todos los gusanos de la placa F3. Por tanto estos gusanos se tomaron
como candidatos para ser la cepa salvaje.
- Si la F2 era heterocigoto, se obtuvo una mezcla de gusanos con sólo dos o más
neuronas PDE en la F3.
- Si la F2 era homocigota para la mutación de la vía de la apoptosis, se observaron
gusanos que siempre tenían más de dos neuronas PDE. Por tanto, se tomaron como
candidatos para ser cepa mutante. Además, un punto muy importante es que estos
gusanos tendrían el mismo fondo genético que los salvajes, puesto que proceden de
una misma F2.
Una vez identificados los posibles homocigotos mutantes y salvajes de interés, se
seleccionaron diez gusanos de cada placa candidata (mutante y salvaje): cinco con reportero y
cinco sin, y se procedió a observar la F4 con la intención de constatar lo ya observado en la F3
relativo al número de neuronas PDE. En el caso de que en las cinco placas con reportero se
observara que todos gusanos poseían neuronas PDE extra, se confirmaría la naturaleza
mutante de éstos, y se utilizarían las placas sin reportero para genotipar. El hecho de
seleccionar gusanos sin reportero es debido a que no se desea ningún elemento adicional en el
genoma que pueda interferir en el estudio de longevidad a realizar. Del mismo modo, en el
caso de que todas las placas del candidato salvaje presentasen el número normal de neuronas
PDE, se utilizarían las placas sin reportero para genotipar y confirmar la naturaleza del gen.
3.5.2 Genotipado por PCR
Una vez obtenidos los candidatos de mutante y cepa salvaje para cada caso, se procedió a
su genotipado por PCR. El concepto de ‘genotipado’ hace referencia a un ensayo que revela los
alelos específicos heredados por un individuo, que resulta particularmente útil en situaciones
en las que más de una combinación genotípica pueden producir la misma presentación clínica
(GENEREVIEWS NCBI, 2015).
Para amplificar las regiones génicas de interés se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se ajustaron parámetros como el programa de PCR (la temperatura y tiempo de cada
ciclo, número de ciclos), la temperatura media de fusión de los cebadores y la mezcla de la
reacción (enzima, tampón, concentración de deoxinucleótidos (dNTPs) y de ADN molde,
volumen final).
El ADN utilizado en la PCR de genotipado procede de muestras lisadas de gusanos. Para poner
a punto la reacción se realizó una PCR de gradiente previa para averiguar la temperatura
media de fusión de los cebadores óptima para cada caso. Para ello se ha utilizado lisado N2
como control de cepa salvaje y lisado de cada cepa de los mutantes de la vía de la apoptosis,
indicadas en Tabla 3, como control de cepa mutante. Se ha analizado un rango de 10
temperaturas distintas (50ºC-70ºC) para la etapa de anillamiento de los cebadores al ADN
molde. En casos en que se observaron bandas inespecíficas en temperaturas altas, se empleó
la mezcla reacción PCR con betaína (Sigma), agente isoestabilizante que facilita la separación
de la doble cadena, aumenta el rendimiento de la reacción y la especificidad de los productos
de PCR. Otra alternativa fue disminuir la concentración de cloruro de magnesio, co-factor de la
ADN polimerasa, favoreciendo la especificidad del enzima.
Una vez se ha identificó la temperatura óptima de anillamiento de los cebadores, se procedió
al genotipado de los candidatos. En este trabajo se ha empleado una mezcla de reacción y un
17
programa de PCR estándar, mostrado en la Tabla 7, sobre el cual, se realizarán las
modificaciones pertinentes (Tabla 8).
Tabla 7. Mezcla Reacción PCR Estándar.
Mezcla Reacción PCR Estándar
3µL
ADN molde
0.5µL
dNTPs
(100mM,
Promega)
0.5µL
Cebadores (25nM
por cebador)
5µL
Tampón 10x (con
MgCl2
2.5µM,
Kappa Biosystems)
1µL
Enzima Kappa Taq
polimerasa 5U/µL,
(Kappa
Biosystems)
39.5µL
Agua de PCR
50µL
Volumen total
Tabla 8. Mezcla Reacción PCR Estándar con betaína.
Mezcla Reacción PCR Estándar con betaína
1.5µL
ADN molde
0.5µL
dNTPs
(100mM,
Promega)
0.5µL
Cebadores (25nM
por cebador)
2.5µL
Tampón 10x (con
MgCl2
2.5µM,
Kappa Biosystems)
5µL
Betaína 5x (Sigma)
1.5µL
Enzima Kappa Taq
polimerasa 5U/µL,
(Kappa
Biosystems)
13µL
Agua de PCR
25µL
Volumen total
En la Tabla 9 se muestra el programa de PCR empleado. Aparecen dos incógnitas (x e γ) que
hacen referencia respectivamente a la temperatura óptima de unión del cebador en cada caso
para la reacción, obtenida mediante PCR de gradiente que viene indicada en la Tabla 6 y al
tiempo de elongación necesario, que fue 1’ para las sustituciones y 2’30’’ para las deleciones
debido a que el producto a amplificar era mucho mayor. Generalmente se utiliza un minuto de
tiempo de elongación por cada kilobase de ADN amplificado.
Tabla 6. Programa PCR Estándar.
Programa PCR Estándar
Paso
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Unión del cebador
Tª, Tiempo
94ºC 2’
Ciclos
1
94ºC 30’’
x 30’’
35
Extensión
Extensión final
72ºC γ
72ºC 5’
1
4ºC
∞
3.5.3 Electroforesis en geles de agarosa
Para la resolución de las bandas de ADN se han empleado geles de agarosa al 1%
visualizados con Gel Red (Biotium), un agente intercalante. El tampón de electroforesis
utilizado ha sido TAE (Tris-acetato-EDTA) a una concentración 1X. Normalmente se ha utilizado
un voltaje constante de 100-120 voltios durante todo el proceso.
El tiempo de proceso varió en función del tamaño de gel y el tamaño y número de bandas a
visualizar. Para poder estimar el tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos y poder
seleccionar el tamaño deseado, se adicionó en cada gel unos 3 μl del marcador de pesos
moleculares (GeneRuler 1 Kb DNA Ladder (LifeTechnologies)). Para la visualización de las
bandas de ADN se utilizó un transiluminador de luz UV permitiendo la captura del gel en una
fotografía.
18
3.5.4 Genotipado por secuenciación
De todos los candidatos mutantes y salvajes, una vez confirmada la presencia de producto
de PCR vía electroforesis, se procedió a purificar estos productos de PCR y se prepararon a una
concentración de 10ng/µL. Éstos se enviaron a secuenciar para confirmar los resultados
obtenidos en el Servicio de Secuenciación de ADN del Instituto de Biología Molecular y Celular
de Plantas (IBMCP) de la Universidad Politécnica de Valencia. Este servicio emplea la
secuenciación tipo Sanger, basado en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo
hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una
cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. Esto es así ya
que la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y
el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
Concretamente, se utilizan dideoxinucleótidos marcados con compuestos fluorescentes (Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1) llevando a cabo la reacción de secuenciación en
termocicladores ABI GeneAmp PCR System 9700 cuya resolución y análisis de los productos
marcados se realiza en un secuenciador capilar ABI 3100.
3.6 Ensayo de longevidad
3.6.1 Obtención de la población de estudio
Con el fin de obtener una población con un número de individuos suficientemente
grande, sin contaminación y además sincronizada para llevar a cabo las curvas de longevidad,
se realizó la sincronización por lejía llamada Egg Preparation. Este método (modificación de
WORMBOOK, 2015) consiste en dejar crecer a los gusanos hasta obtener adultos con muchos
huevos dentro sin llegar a acabarse la comida de la placa y someterlos a tres lavados con M9
1x centrifugando 2’ a 2500 r.p.m. A continuación se añade la solución de Egg Prep
(composición en Tabla 10) agitándolo en agitador de vórtice (vortex) durante 8 minutos para
conseguir la rotura de los gusanos, mientras que la lejía de la solución descompone los tejidos
del gusano, consiguiendo la liberación de los huevos. Después se centrifuga a 3200 r.p.m 5’
para que precipiten los huevos preferentemente. Este paso se repite hasta llegar a un
consenso entre gusanos rotos y huevos sin dañar y se retira la solución de Egg Prep
sustituyéndola por M9 1x para 3 lavados sucesivos.
Tabla 10. Componentes de la solución de Egg Prep por cada 100mL.
Componente
Volumen
NaOCl (~37%)
5mL
KOH(5M)
3.2mL
H2O MiliQ
91.8mL
Una vez realizada la Egg Prep, los huevos se dejaron crecer a 20ºC en agitación (180rpm)
durante 1 ó 2 noches en M9 1x, quedando los nematodos arrestados en el estadío de larva L1
hasta que se transfirieron a las placas NGM agar para el comienzo del estudio. Una
peculiaridad de C. elegans es que las larvas en estadío larvario 1 (L1) son capaces de sobrevivir
en ausencia de comida varios días. Esto se aprovecha para para permitir que todos los
embriones se desarrollen hasta alcanzar el estadío L1, sincronizando así la población.
En caso de que este método no funcionara por la sensibilidad de ciertas cepas a la lejía se
obtuvo la población para el estudio mediante el método de puesta de huevos o Egg Laying,
como se describe en Yee et al., (2014), que consiste en dejar a los nematodos adultos poner
huevos durante un corto periodo de tiempo en placas nuevas. A continuación, se eliminaron
los adultos y se dejó a los huevos eclosionar, obteniendo así la población sincronizada.
19
3.6.2 Análisis de supervivencia
Una vez obtenida la población, se transfirieron a 15 placas 10 gusanos hermafrodita de la
misma edad, obteniendo una n=150 para el estudio de cada cepa. Todas las cepas se
mantuvieron a 20ºC.
En estos ensayos se contrastó la longevidad de cada cepa mutante con su cepa salvaje de
mismo fondo genético. Para ello, se contabilizó el número de gusanos vivos y muertos
diariamente y a posteriori se calculó el porcentaje de animales vivos dando lugar a las curvas
de Kaplan-Meier. Esto se llevó a cabo visualizando si se movían y, en caso de nematodos de
edad avanzada cuando el músculo está más degenerado y dejan de moverse, mediante el
toque suave de la cabeza del gusano con un pelo de pestaña, al cual reaccionan en caso de
estar vivos.
Para mantener las condiciones óptimas necesarias para el estudio y que éstas tengan el
mínimo efecto en la longevidad, que es el parámetro de interés a analizar, los nematodos
fueron transferidos diariamente a placas nuevas con comida recién sembrada. Esto
garantizaba que los gusanos tuvieran comida fresca siempre, evitando el paso al estadio de
arresto dauer o el simple efecto que podía tener la privación de nutrientes en los mismos, así
como el efecto perjudicial que puede tener la ingesta de bacterias demasiado crecidas sobre
ellos o incluso que el agar estuviera demasiado seco. Además un punto crucial era conseguir
mantener la población de estudio controlada, puesto que los gusanos descendientes pueden
llegar a alcanzar un tamaño similar a los gusanos de interés si se dejan crecer unos días, y
transfiriéndolos a placas nuevas se garantizaba el deshacerse de esas generaciones de
descendientes que no eran de interés y podían distorsionar el análisis.
3.6.3 Eventos de muerte censurados
Según los métodos descritos por Lionaki & Tavernarakis (2013), se excluyeron ciertos
gusanos del análisis cuando presentaban defectos obvios que interferían en el proceso normal
de envejecimiento, o bien habían sido comprometidos por mal manejo experimental o
accidentes. Ejemplos de estos eventos censurados son:
- Eclosión de huevo interna (fenotipo bag-of-worms): Son gusanos hermafrodita con
huevos eclosionados en su interior moviéndose que, literalmente, devoran a la madre
hasta que son capaces de escapar penetrando la cutícula.
- Protrusión de la vulva: Gusanos cuya vulva está desplazada hacia delante y sobresale
de sus límites normales, interfiriendo así en el proceso normal de puesta de huevos.
- Rotura de la vulva: El intestino queda expuesto fuera de su cuerpo a través de la
abertura de la vulva.
- Parálisis o movimiento descoordinado: Puesto que no van asociados al fenotipo, estos
síntomas indican el daño o mal manejo experimental del gusano.
- Contaminación fúngica o bacteriana: Contaminación de las placas de NGM agar con
bacterias ajenas a las intencionadas para la alimentación o hongos pueden tener un
efecto negativo en la supervivencia del nematodo.
Con el fin de mantener una población de 150 gusanos por cepa, se llevó de manera paralela y
en las mismas condiciones una reserva de gusanos sincronizados con los que reponer a los
gusanos de estudio en caso de que sufrieran un evento de muerte censurado.
3.6.4 Curvas de longevidad
Se analizaron los datos mediante el software de GraphPad Prism v6.0, que genera una
matriz en la que ‘1’ es evento de muerte y ‘0’ evento censurado, a los que hay que asignar día
e individuo. Con estos datos, se dibujaron las curvas de longevidad y se sometieron a dos test
estadísticos, el test Log-rank (Mantel-Cox) y el test de Gehan-Breslow-Wilcoxon, para analizar
su significatividad.
El test Log-rank (Mantel-Cox) es una técnica estadística para contrastar las funciones de
supervivencia de dos poblaciones. Es una prueba no paramétrica que puede usarse en
20
presencia de datos censurados. La prueba de Mantel-Cox compara las estimaciones de la
función de riesgo de dos grupos en cada unidad de tiempo en que ocurre un evento. Se
construye comparando el número observado y esperado de sucesos en uno de los grupos en
cada uno de esos momentos y agrupando los resultados para obtener un valor global.
El test de Gehan-Breslow-Wilcoxon da más peso a los eventos de muerte en tiempos
tempranos, en contraste con lo que hace el test Log-rank que da el mismo peso en todos los
tiempos.
El test Log-rank es el más estandarizado y potente de los dos, si la asunción de riesgos
proporcionales es verdadera. Riesgos proporcionales implica que el ratio de funciones de
riesgo (muertes por tiempo) es el mismo en todos los puntos. El test de Gehan-BreslowWilcoxon no requiere un ratio de riesgo constante, pero sí que un grupo tenga mayor riesgo
consistentemente que el otro. Si las dos curvas se cruzan, un grupo tendrá mayor riesgo en
tiempos tempranos y otro en tiempos tardíos. Eso podría ser sólo una coincidencia del
muestreo aleatorio, y la asunción de riesgos proporcionales ser aún válida, lo que hace a este
test útil en estos casos.
3.7 Ensayo de envejecimiento saludable (healthspan)
Se generó una población sincronizada de gusanos mediante Egg Prep (apartado 3.6.1) y se
dejaron crecer a 20ºC hasta alcanzar el estadío de adultos jóvenes. Desde entonces, cada 5
días, se sometieron a 4 pruebas descritas por Bansal, A. et al (2014) para tratar de dilucidar si
el incrementar la longevidad implica incrementar también el periodo de vida saludable o
simplemente se está prolongando el periodo de fragilidad con su respectivo aumento de
incidencias de enfermedades relacionadas con la edad.
3.7.1 Estrés térmico
Cada 5 días, una palca con 30 gusanos fue transferida a 37ºC y se evaluó la capacidad de
los gusanos a resistir este estrés contabilizando las muertes cada 2 horas. El porcentaje de
vivos y la supervivencia media bajo estrés térmico se calcularon.
3.7.2 Estrés oxidativo
Se prepararon placas de 24 pocillos con NGM agar y E. coli sobre las cuales se depositó
75µL de una solución de paraquat (36541 FLUKA) a una concentración de 0.25M, dejándolas
en el agitador 1 hora y 2 horas en la cabina de flujo laminar para su completo secado. El
paraquat es un agente oxidante que actúa sobre el sistema de membranas del Fotosistema I.
Los electrones libres del Fotosistema I reaccionan con el ión de paraquat para darle forma de
radical libre, que en presencia de oxígeno rápidamente se reconvierte y en ese proceso
produce súper óxidos (PARAQUAT INFORMATION CENTER, 2015). Los súper óxidos atacan a los
ácidos grasos insaturados de la membrana, abriendo rápidamente y desintegrando las
membranas y tejidos de las células. Luego, el proceso del ión de paraquat / radical libre se
recicla y produce más cantidades de súper óxido hasta que cesa el suministro de electrones
libre
Cada 5 días, 30 gusanos en grupos de 10 fueron transferidos a estas placas para someterlos a
estrés oxidativo, contabilizando las muertes cada 2 días, y transfiriéndolos a pocillos con
medio, comida y paraquat nuevo cada 5 días. El porcentaje de vivos y la supervivencia media
bajo estrés oxidativo se calcularon.
3.7.3 Locomoción en medio sólido
Cada 5 días, 15 gusanos se transfieren a placas nuevas individualmente dejándolos 5
minutos moverse a su antojo para después eliminarlos y fotografiar el recorrido en el colchón
de bacteria comida añadiendo un patrón de 0.5cm para posibilitar el análisis y comparación de
trayectorias. Las imágenes se analizaron con ImageJ (NIH) contabilizando la distancia media del
recorrido realizado.
3.7.4 Locomoción en medio líquido
Cada 5 días, 15 gusanos se transfirieron individualmente a placas de 24 pocillos con 1mL
de M9 1x en cada pocillo. Se dejaron 30 segundos para que el gusano se equilibrara y a
21
continuación se grabó el thrashing (movimiento del gusano en el que cambia completamente
la dirección de su cabeza y/o cola hacia un mismo lado al nadar en medio líquido). La media de
thrashings por minuto (frecuencia) fue calculada.
3.8 Técnicas de microscopía
En este trabajo ha sido necesario el uso de distintas técnicas de microscopía que han
permitido la fácil manipulación y visualización de los nematodos. La lupa binocular (Leica,
modelo MZ6 40x) es la más indispensable puesto que es la más accesible para el manejo
eficiente de C. elegans. En los casos de cruzamientos detallados en el apartado 3.5.1, en los
que había que llevar a cabo la selección de candidatos mutantes y salvajes mediante la
visualización del reportero de GFP, se utilizó la lupa de fluorescencia 1FAxioZoom V16 112x
(Zeiss). Esta lupa permitía visualizar la proteína GFP en las neuronas marcadas de los
nematodos vivos.
Para los estudios de healthspan tanto las fotos como los vídeos fueron tomados con la lupa de
fluorescencia nombrada anteriormente acoplada a la cámara AxioCam MRm Zeiss empleando
el software de Zeiss ZEN pro 2011, para su obtención, y el ImageJ (NIH) para su procesamiento
y posterior análisis como viene indicado en el apartado correspondiente 3.7.3.
22
4. RESULTADOS
4.1 Obtención de las cepas salvaje y mutante de fondo genético común
Las cepas generadas en este proyecto mediante cruces genéticos (apartado 3.5) están
incluidas en la Tabla 3. Concretamente son las cepas NFB654, NFB655, NFB677, NFB678,
NFB679, NFB680, NFB681 y NFB682.
Para garantizar la presencia de la mutación en homocigosis en las cepas es conveniente el
genotipado de las mismas. El genotipado permite la identificación de individuos mutantes,
salvajes y heterocigotos para la mutación. Los cebadores utilizados están incluidos en la Tabla
A5 del Anexo II y las PCRs se pusieron a punto mediante PCR de gradiente como se especifica
en el apartado 3.5.2. Se encontraron problemas para poner a punto las PCRs de egl-1 y ced-13
debido a que son mutaciones desconocidas o delecciones de varias kilobases respectivamente,
por lo que no se pudieron genotipar dichas cepas y no se utilizaron en este trabajo.
En la Figura 8 se muestra un ejemplo de genotipado de la cepa salvaje y mutante para el gen
ced-4(n1162), que sirve de manera análoga para ilustrar lo observado en todos los casos en
que la mutación era una sustitución (indicado en Tabla 3). En este caso se emplearon 10 placas
F2 de los posibles candidatos y se incluyó un control positivo (C+; ADN procedente de un lisado
de gusanos salvajes N2 que hubiese funcionado previamente en otras PCRs) y un control
negativo (C-; mezcla de la reacción de PCR sin ADN)
Figura 8. Gel de electroforesis para el genotipado del gen ced-4. Donde: (M) Marcador de pesos
moleculares de 1Kb, (C-) control negativo, (C+) control positivo, (1-10) candidatos WT y mutantes. Según
los cebadores diseñados, el tamaño de banda esperado es de 799 pb. En todos los casos se aprecia que el
tamaño es el correcto. Puesto que es una sustitución, no se pueden apreciar diferencias entre cepas
salvajes y mutantes en cuanto a tamaño del producto de PCR, el paso siguiente para distinguir entre wt,
heterocigotos y mutantes fue mandar estas bandas a secuenciar.
El segundo tipo de genotipado fue el de las deleciones (Tabla 3), ejemplificado en la Figura 9.
En este caso se mapeó la variación alélica gk138 del gen cep-1 que consiste en una deleción de
1304 pb. Los cebadores se diseñaron flanqueando la deleción, de modo que se amplificara una
región de 2199 pb en la cepa salvaje y de 539 pb en la cepa mutante.
Figura 9. Gel de electroforesis para el genotipado del gen cep-1. Donde: (M) Marcador de pesos
moleculares de 1Kb, (C-) control negativo (sin ADN), (C+N2) control positivo de cepa salvaje con una
banda esperada de 2199pb, (C+MUT) control positivo del mutante de cep-1, variación alélica gk138, con
23
una banda esperada de 539pb correspondiente a mutante según los cebadores diseñados con una
delección de 1304pb, (1-3) candidatos a cepa salvaje, (4-9) candidatos a cepa mutante. Para confirmar
los resultados se procedió a secuenciar todos los candidatos.
Como se ha detallado en el apartado 3.5.4, todos los resultados obtenidos en gel de la Figura 8
se analizaron por secuenciación, obteniendo cromatogramas que fueron analizados como se
muestra a continuación. La mutación ced-4(n1162) consiste en una sustitución de un
nucleótido citosina (C) por uno timidina (T), simbolizando el cambio como C>T. Entre nuestros
candidatos podríamos contemplar las tres casuísticas posibles: homocigoto salvaje (dos
variantes alélicas C), heterocigoto (una variante alélica C y otra T) y homocigoto mutante (dos
variantes alélicas T).
A continuación se muestra los resultados de la secuenciación para el gen ced-4. La Figura 11
muestra un fragmento de la secuencia del gen y en azul se resalta el nucleótido que varía en la
mutación n1162. En este caso se observa una citosina, lo que indica que se trata de un
individuo salvaje. Esto se corrobora en su correspondiente cromatograma (Figura 2) donde se
aprecia un único pico correspondiente al nucleótido C.
En primer lugar, si el individuo fuera de tipo salvaje, el gen ced-4(n1162) tendría una C en la
posición indicada, como se puede apreciar en la secuencia (Figura 10) y su respectivo
cromatograma (Figura 11).
Figura 10. Resultado de la secuenciación para el gen ced-4(n1162) en cepa salvaje. En azul se muestra la
citosina en su posición natural.
Figura 11. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en cepa salvaje, con el nucleótido citosina
encuadrado en azul, así como su respectivo pico.
De manera análoga se analizó el resto de candidatos identificando los mutantes como se
ejemplifica en las Figuras 12 y 13.
Figura 12. Resultado de la secuenciación para el gen ced-4(n1162) en cepa mutante. En azul se muestra
la timina mutada en la posición de la citosina natural.
24
Figura 13. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en cepa mutante con el nucleótido timina
encuadrado en azul, así como su respectivo pico.
Por último, a pesar de la preselección por el fenotipo cat-1::gfp del PDE de los candidatos
salvaje y mutante se dio la casuística de identificación de algún heterocigotos en los cuales,
como era de esperar, se observó doble pico C/T como se indica a continuación en la Figura 14.
Figura 14. Cromatograma de la secuencia de ced-4(n1162) en la cepa heterocigoto. Señalado con el
recuadro azul se observan dos picos solapados que corresponden a citosina y timina, indicando que es un
individuo heterocigoto.
4.2 Curvas de longevidad
Se constató el efecto de las mutaciones de la vía de la apoptosis en la vida del nematodo
obteniendo las siguientes curvas de longevidad donde se representa el porcentaje de animales
vivos frente al tiempo (días). En las curvas se hace referencia a los animales salvajes con su
término en inglés wild type (WT) y a los animales mutantes con el nombre del gen de la vía de
la apoptosis correspondiente.
4.2.1 ced-9(n1950) alelo ganancia de función de Bcl-2
Puesto que el gen ced-9 era de especial interés al ser el homólogo en C. elegans de Bcl-2,
se realizaron dos réplicas biológicas del ensayo de longevidad.
En ambas réplicas, las curvas generadas (Figura 15) se sometieron al análisis estadístico
mencionado en el apartado 3.6.4 y se obtuvo una diferencia significativa entre ambas. Los
resultados resumidos se muestran en la Tabla 11.
25
Figura 15. Curva de longevidad WT vs. ced-9(n1950) réplica 2.
Tabla 11. Resumen p-valor de la curva de longevidad WT vs. ced-9(n1950) réplica 1 y réplica 2.
p-valor test Log- p-valor test Gehan- Resumen p-valor
rank (Mantel-Cox)
Breslow-Wilcoxon
Réplica 1
Réplica 2
0.0010
0.0003
0.0044
0.0002
**
***
De la misma manera, cuando se analizaron los parámetros relativos a la esperanza de vida, se
encontró que entre la cepa salvaje y la mutante para ced-9(n1950) había una diferencia de un
día en la vida media de la cepa silvestre y la mutante en ambas réplicas, cosa que para un
organismo que vive una media de 19 días supuso una diferencia a recalcar, supone alrededor
de un 4% de extensión en la esperanza de vida lo que equivale a aumentar en unos 3 años la
esperanza de vida en humanos. Además, la supervivencia máxima, es decir, los gusanos más
longevos que podrían ser considerados los ‘centenarios’ de estos ensayos y por tanto eran de
interés, vivían en torno a 4 días más en estos mutantes que en la cepa silvestre como se
muestra en la Tabla 12 (unos 12 años de más si se considera en escala humana).
Tabla 12. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa silvestre vs. ced-9(n1950) en las
réplicas 1 y 2.
Supervivencia media (días)
Supervivencia máxima (días)
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 1
Réplica 2
WT
19
18
33
29
ced-9(n1950)
20
19
37
34
4.2.2 ced-4(n1162) alelo pérdida de función de Apaf
El análisis comparativo entre animales salvajes y mutantes ced-4 resultó en una diferencia
significativa entre ambas al realizar el test de Gehan-Breslow-Wilcoxon. No obstante, con el
test log-rank se obtuvo un p=0.0938, siendo no significativa. Esto puede deberse a las
diferencias entre ambos test comentadas en el respectivo apartado 3.6.4. (Figura 16)
26
Figura 16. Curva de longevidad WT vs ced-4(n1162).
En esta ocasión, también se halló un día de diferencia en la supervivencia media de los
animales y cinco en la supervivencia máxima como se ilustra en la Tabla 13.
Tabla 13. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa tipo silvestre vs. ced-4(n1164).
Supervivencia media (días)
Supervivencia máxima (días)
WT
18
29
ced-4(n1162)
19
34
4.2.3 ced-3(n717) alelo de pérdida de función de Caspasa 9
En este caso, las curvas de longevidad de los animales salvajes y mutantes para el gen ced3 no resultaron significativamente diferentes. Ninguno de los tests estadísticos desveló una
diferencia significativa entre ambas curvas (Figura 17) y, de la misma manera, se encontró que
la supervivencia media era la misma en ambas cepas. Sin embargo, la supervivencia máxima
fue mayor en el mutante (Tabla 14).
Figura 17. Curva de longevidad WT vs ced-3(n717).
27
Tabla 14. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de la cepa tipo silvestre vs. ced-3(n717)
Supervivencia media (días)
Supervivencia máxima (días)
WT
19
34
ced-4(n1162)
19
36
4.2.4
hus-1(op241) alelo de pérdida de función del “check point” de ciclo celular
hus-1
Sorprendentemente, el caso del gen hus-1 reveló una diferencia significativa siendo más
longevo el mutante que el tipo silvestre (Figura 18) con un valor de significación p=0.0022 en el
test de Gehan-Breslow-Wilcoxon y de p= 0.0262 en el test Log-rank.
Figura 18. Curva de longevidad WT vs hus-1(op241).
Los datos de supervivencia media desvelaron un día de diferencia entre animales salvajes y
mutantes (Tabla 15), aunque esta vez la supervivencia máxima resultó ser mayor en la cepa
salvaje.
Tabla 15. Datos de supervivencia media y supervivencia máxima de cepa tipo silvestre vs. hus-1(op241).
Supervivencia media (días)
Supervivencia máxima (días)
WT
19
34
ced-4(n1162)
19
36
4.3 Envejecimiento saludable
Puesto que se tenía especial interés en el posible papel de Bcl-2 como mediador de
envejecimiento saludable, las pruebas de healthspan se realizaron comparando cepa salvaje y
la cepa ced-9(n1950) (alelo ganancia de función de Bcl-2). Los resultados obtenidos en las
pruebas descritas en el apartado 3.7 son los siguientes (Figura 19 A-D).
28
Figura 19. Resultado de las pruebas de envejecimiento saludable. (A) Resistencia a estrés
térmico, (B) Resistencia a estrés oxidativo, (C) Locomoción en medio sólids, (D) Locomoción en
medio líquido.
En un análisis estadístico preliminar realizado en GraphPad Prism v6.0 de análisis por grupos
realizando múltiples t-test sin asumir una desviación típica constante, empleando el método
de corrección para comparaciones múltiples de Holm-Sidak con α=5.000% desveló que
algunos de los resultados eran significativos (indicados con asteriscos). No obstante, se está
buscando un mejor modelo estadístico que se ajuste al tipo de datos obtenidos y las
características del estudio presente.
Pese a esto, y a ser una primera ronda de experimentos bastante preliminar, los resultados
tienden a indicar que podría existir una tendencia en los mutantes de ced-9(n1950) de llevar
un envejecimiento más saludable que en animales salvajes reteniendo una mayor tolerancia al
estrés térmico y oxidativo y una mejor movilidad.
29
5. DISCUSIÓN
El estudio de los mecanismos que regulan envejecimiento, y más aún aquellos
responsables de un envejecimiento saludable, es de gran interés ya que el conocimiento
adquirido puede beneficiar la calidad de vida de muchas personas y familiares.
En el presente trabajo nos planteamos estudiar una posible relación entre niveles
elevados de la proteína antiapoptótica Bcl-2/Bcl-xl (ced-9 en C. elegans) con longevidad y
elevado ‘healthspan’. El proyecto se plantea en base a unos resultados previos del laboratorio
del Dr José Viña (Borras et al., articulo en preparación) donde el estudio comparativo de los
patrones de expresión entre centenarios, septuagenarios y jóvenes revela que los centenarios
tienen activada la proteína Bcl-xl.
Para dar una base funcional a esta correlación nos planteamos el uso de C. elegans como
modelo in vivo de longevidad.
En primer lugar, nos centramos en el estudio de ced-9(n1950) (ganancia de función de
Bcl-2, proteína antiapoptótica). Nuestros resultados parecen indicar que podría ser que niveles
altos de dicha proteína
actuaran reprimiendo el proceso de apoptosis intrínseca
(mitocondrial) y que esto tuviera un efecto mediando longevidad in vivo.
Por otra parte, estudios en cultivos celulares en que se infectaron fibroblastos embrionarios de
ratón (mouse embryo fibroblasts, MEFs) con retrovirus que contenía un vector codificando
Bcl-xL dieron lugar a una expresión reducida de reguladores del ciclo celular asociados con la
edad en comparación con los MEFs control. Por añadido, en estas células la expresión de BclxL disminuyó significativamente la actividad β-galactosidasa y Dcr2, marcadores de
senescencia, y les confirió efectos protectores contra daño oxidativo (Borras et al., articulo en
preparación). Así pues, parece que la sobreexpresión de Bcl-xL tiene efectos antiapoptóticos y
de antienvejecimiento celular, es decir, que la sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas
podría estar teniendo un efecto en envejecimiento saludable o bien ‘envejecimiento
excepcional’.
Para ahondar en el posible papel de niveles altos de Bcl-xl no solo en longevidad sino
también en longevidad saludable realizamos nuestros ensayos de ‘healthspan vs. gerospan’ en
el mismo mutante ced-9(n1950). Nuestros resultados, pese a que son preliminares, apoyan
esta idea puesto que parece que los nematodos mutantes que tienen reprimida la apoptosis
intrínseca no solo viven más, sino que parece entreverse que envejecen mejor como muestra
su resistencia a calor extremo, estrés oxidativo y su mayor movilidad. Todas estas capacidades
son claves en personas de avanzada edad para mantener una vida más autónoma y saludable.
Finalmente, los resultados obtenidos del análisis de los mutantes ced-9 nos hicieron
plantearnos hasta qué punto otros mediadores de apoptosis puedan tener un papel
importante en longevidad. Hay multitud de genes que regulan apoptosis, en este trabajo,
como primera aproximación nos centramos en estudiar la longevidad en mutantes de pérdida
de función de tres proteínas pro-apoptóticas: la caspasa ced-3, el complejo Apaf-1 ced-4 y la
‘DNA damage chackpoint’ hus-1.
Nuestros resultados, aunque preliminares, parecen mostrar que mutantes tanto para
ced-4 como para hus-1 tienen elevada longevidad. Esto refuerza la idea de que niveles bajos
de apoptosis intrínseca son beneficiosos. Por otro lado, es interesante que mutantes de ced-3
no parecen tener diferencias significativas respecto a animales salvajes, en un futuro
realizaremos curvas de longevidad con otros alelos de ced-3 para confirmar que nuestra
observación inicial es cierta. De ser así, esto nos podría indicar que el efecto de ced-9, ced-4 y
hus-1 en longevidad no son debidos específicamente a un bloqueo de apoptosis (que también
ocurre en los mutantes de ced-3) y que ha de explicarse por otros mecanismos. Uno de esos
posibles mecanismos sería la protección del estrés oxidativo y la integridad de la mitocondria
ya que tanto ced-9 como ced-4 interaccionan con este orgánulo. De hecho, mutaciones en cyc30
1 (citocromo C oxidasa) tienen elevada longevidad (Lee et al., 2003), lo que concuerda con el
papel protector de las mutaciones ced-9 y ced-4 y una protección de la mitocondria.
En resumen, los resultados de este TFG son la primera demostración in vivo de que
niveles reducidos de apoptosis intrínseca pueden asociarse a una mayor longevidad y, aún más
importante a un envejecimiento más saludable. Por tanto, estos resultados serán incluidos en
el artículo que el Dr. Viña está preparando y supondrán la primera publicación científica en que
participe (Borras et al., articulo en preparación). Además, estos resultados plantean muchas
nuevas preguntas, y gracias a las herramientas que nos proporciona el uso de C. elegans en
longevidad abren un nuevo proyecto que el laboratorio de la Dra. Nuria Flames se plantea
abordar en el futuro.
31
6. CONCLUSIONES
I.
Se han obtenido 8 cepas para el estudio del efecto de las mutaciones en la vía de la
apoptosis como mediadores de longevidad. Actualmente se está trabajando para
genotipar las dos restantes cepas mutantes y sus correspondientes cepas salvajes de
mismo fondo genético.
II.
C. elegans es un modelo útil y valioso para el estudio in vivo de longevidad y apoptosis.
Su uso nos puede ayudar a desvelar mecanismos de control de la longevidad que estén
filogenéticamente conservados.
III.
La mutación de ganancia de función de la proteína anti-apoptótica ced-9 (homólogo de
Bcl-2) resulta en un incremento en la supervivencia media y máxima del nematodo, así
como en una tendencia a retener la capacidad de resistencia a estreses térmicos y
oxidativos y a una mejor locomoción a lo largo del tiempo, aunque son necesarias más
replicas biológicas para poder confirmar esto último. Este efecto podría deberse a una
aparente represión de la apoptosis intrínseca en base a los estudios complementarios
del laboratorio del Dr Viña mencionados en la discusión.
IV.
La mutación de pérdida de función en las proteínas pro-apoptóticas ced-4 (Apaf-1) y
hus-1 (‘checkpoint protein’) resulta de la misma manera en un incremento en la
supervivencia media del nematodo, sugiriendo igualmente que niveles bajos de
apoptosis intrínseca son beneficiosos.
V.
La mutación de pérdida de función de la proteína pro-apoptótica ced-3 (Caspasa 9) del
alelo de referencia (n717) parece no tener efectos en la longevidad de C. elegans, lo
que podría sugerir que el efecto observado en ced-9, ced-4 y hus-1 no vendría
mediado por la vía canónica de la apoptosis. No obstante se debe comprobar esta
afirmación para otros alelos y estudiar otros posibles mecanismos implicados.
32
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