Las vesículas unilamelares gigantes (GUVs) fueron preparadas

Las vesículas unilamelares gigantes (GUVs) fueron preparadas usando el método de
electroformación. El diámetro típico de dichas vesículas fue entre 20-80 µm.
Los experimentos de adición de sal fueron llevados a cabo empleando una solución de 0.2 M
de K2SO4/agua, y agregando directamente una o dos gotas a la muestra de GUVs. Un
portaobjetos con una superfice concava fue empleado, para tener un mejor control de la
difucion de la solucion salina en el sistema. El K2SO4 fue seleccionado debido a que el ion
sulfato es un anion fuertemente hidratante y tiene un effecto desestabilizante, induce
agregacion en soluciones coloidales. Lo anterior de acuerdo a la serie de Hofmeister la cual
establece la jerarquización de los iones de las sales en la agregación de proteínas.
En la figura 1, se observan una secuencia de fotografías tomadas antes y después de la
adición de la sal. En la figura 1 (a) varias vesículas están adheridas al electrodo (en negro).
Después de unos segundos de la adición (figura 19 (b-h)), se observa como se acumula
progresivamente un cierto material en la superficie del electrodo. Sin embargo, cuando se
agregó más sal a la misma muestra (fotografías no mostradas), no se observó agregación
debido a que la adición de la sal provoco la difusión de las vesículas. De varios experimentos
realizados, esta fue la única vez que se presenció este comportamiento de aglomeración. Se
piensa que la agregación fue una consecuencia de la difusión de la sal en el sistema, quizá
generando pequeñas corrientes de convección en la muestra, las cuales causaron que las
vesículas se adhirieran unas con otras, y que en cierta manera, formaran un aglomerado.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Figura 1. Varias vesículas están adheridas al electrodo (en negro) (a). Secuencia de siete
fotografías tomadas después de la adición de 0.2 M K2SO4 (b-h). Se observa claramente
material agregado en (g) y (h), después de unos segundos de la adición de la sal.
Los experimentos con nanovesiculas consistieron en observar el efecto que tienen las sales en
el radio hidrodinámico (Rh) cuando se adiciona una pequeña cantidad de solución salina (0.1
ml) a la muestra. Un incremento del Rh indicaría indicios de agregación. Las nanovesiculas
fueron preparadas a partir de una solución de 0.1 %w/w de E16B22 en agua y el Rh fue medido
usando el equipo de dispersión dinámica de la luz (DLS). En una primera instancia, las
soluciones salinas fueron preparadas usando como unidad de concentración la molalidad (m),
debido a que resultó más fácil realizar el procedimiento experimental. Después, la molalidad
(m) fue convertida a molaridad (M) para poder interpretar el efecto del soluto (sal) sobre la
solución de nanovesiculas. De acuerdo a la serie de Hofmeister, los cationes tienen un
pequeño efecto sobre las aglomeraciones coloidales (“salting-out effect”). Por consiguiente,
se analizaron diferentes aniones, pero manteniendo constante el mismo catión, en el sistema
E16B22/agua. La tabla 1 resume las sales usadas.
m
M
m
M
m
M
NaI
5
4.14
1
0.96
0.3
0.29
NaH2PO4
5
3.05
1
0.88
0.3
0.29
1
0.95
Sal
Na2SO4
NaBr
5
4.31
Tabla 1. Esta tabla especifica las soluciones de sales usadas, junto con sus respectivas
concentraciones, para los experimentos con el equipo de DLS.
(a)
(b)
Figura 2. Efecto de la adición de sales sobre el radio hidrodinámico normalizado de las
nanovesículas, de una solución de polímero al 0.1%w/w, a 0.29 M (a) y cerca de 1 M (b).
(a)
(b)
Figura 3. Efecto de la adición de sales a altas concentraciones (a) y grafica logarítmica en
donde se muestra todos los experimentos realizados a altas y bajas concentraciones (b).
La figura 2 (a) muestra los efectos de las sales de NaI y NaH2PO4, a 0.29 M, sobre las
nanovesículas. Se puede observar que para las dos sales, hasta alrededor de 0.05 M, el Rh en
la grafica es constante. A 0.07 M, hay un pequeño incremento para la solución de NaH2PO4,
pero este se encuentra en el rango del error experimental. En la figura 2 (b) a más altas
concentraciones, se observa el efecto de NaH2PO4, NaI y Na2SO4. La solución de NaI
muestra un comportamiento errático a lo largo de la grafica, teniendo pequeñas fluctuaciones
en el Rh pero dentro del error experimental. Teniendo en cuenta lo anterior, el NaI no tiene
algún efecto sobre el Rh del sistema coloidal. Sin embargo, para las sales de Na2SO4 y
NaH2PO4 la tendencia es que cuando se incrementa la molaridad de la solución, el Rh se
incrementa ligeramente en una forma casi lineal. Lo cual indicaría un cierto indicio de
agregación y el efecto relativo de los iones SO4-2 y H2PO4-2, es decir, el lugar que ocupan
estos iones en la serie de Hofmeister.
En la figura 3 (a) se tienen un segmento de la solución salina de NaH2PO4, esto se realizo
para poder apreciar mejor el efecto de ésta sal en comparación con las otras. En esta grafica, a
una concentración de alrededor de 0.5 M, se observa que el Rh empieza a incrementarse con
la adición del NaH2PO4. En la figura 3 (b), se tiene una grafica logarítmica en la cual se
representan todos los experimentos realizados a altas y bajas concentraciones. El incremento
más significativo fue para la sal de NaH2PO4. Aproximadamente 0.7 M de la grafica, el
incremento del Rh fue de alrededor de 1.8 µm, el cual indica un claro efecto de agregación
(“salting-out effect”). En el caso de las sales de NaI y NaBr, a la misma concentración, el Rh
fue de 50.9 y 48.5 nm, respectivamente. Esto revela un incremento de alrededor de 40 veces
más grande para el NaH2PO4 con respecto a las otras dos sales.
La muestra de la solución de polímero, en donde se adicionó 3.0 M de NaH2PO4, se analizo
usando un microscopio óptico. En esta muestra se observaron agregados entre 10 y 60 µm a
una magnificación de 60x (figuras 4 (a) y (b)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 4. Fotografías tomadas a 60x de magnificación (a-b) y fotografías tomadas usando el
microscopio de transmisión electrónica (TEM) (c-e). (c) y (d) son muestras sin adición de la
sal y (e) contiene la adición de 0.1 M de Na2SO4/agua.
En otros experimentos, figura 4 (c-e), se tomaron fotografías usando el microscopio de
transmisión electrónica (TEM). Dichas muestras fueron preparadas con la técnica de
“negative staining”. En la figura 4 (c) se observa el tamaño de las nanovesiculas, el cual es
entre 30 y 100 nm. En otra zona de la misma muestra, figura 4 (d), se tienen estructuras tipo
“rod-like”. Al parecer, estas dos morfologías coexisten en equilibrio en la solución de E16B22;
o quizá sea solamente una consecuencia de como la muestra fue preparada (artefactos) para
su análisis en TEM. Finalmente, en la figura 4 (e), se tiene la adición de 0.1 M de Na2SO4. En
general, estas vesículas son mas largas y tienen un mayor grado de agregación. Sin embargo,
los resultados del TEM deben de tomarse con cautela debido a que la agregación de vesículas
puede deberse a la técnica de preparación usada en TEM (“negative staining”).
Las conclusiones a las que se llegaron fueron las siguientes: (1) no hay evidencias suficientes
que indiquen que la adición de 0.2 M de K2SO4 tenga un efecto claro en la agregación de las
GUV’s. (2) a bajas concentraciones de sales (0.29 M de NaH2PO4, 0.29 M de NaI y 0.1 M de
Na2SO4) no se encontró algún efecto en el Rh, o agregación, de las nanovesículas. (3) a más
altas concentraciones (0.96 M de NaI, 0.95 M de Na2SO4 y 0.88 M de NaH2PO4) se
observaron pequeños incrementos en el Rh de las nanovesiculas y se puede señalar que en
nuestro sistema, E16B22/Agua/”X “ sal de potasio, la serie de Hofmeister es la siguiente: SO4-2
˃ H2PO4 - ˃ I -. (4) El efecto desestabilizador de las sales (“salting-out effect”) fue claramente
observado a altas concentraciones, a 3.0 M de NaH2PO4, donde se tiene una serie de
agregados en la muestra. A dichas concentraciones (3.0 M de NaH2PO4, 4.3 M de NaBr y 4.1
M de NaI) este sistema sigue la serie de Hofmeister en el siguiente orden: H2PO4 - ˃ Br - ˃ I-.