(1 3)-β-D
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Diagnóstico de Aspergilosis y Mucoramicosis Iris Agorio Micología Laboratorio de Microbiología Hospital Británico de Buenos Aires MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO CLÁSICO EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO CULTIVO ESTUDIOS HISTOPATOLÓGICOS PRUEBAS SEROLÓGICAS ANTÍGENOS: GALACTOMANANO, ELISA (1 3) - β - D - GLUCANOS, COLORIMÉTRICO DETECCIÓN DE ANTICUERPOS TÉCNICAS MOLECULARES: PCR Técnicas convencionales Esputo BAL Biopsias Líquidos Etc. Histopatología MUESTRA Distinta de suero Técnicas convencionales Microscopía directa Histopatología MUESTRA Distinta de suero Diagrama de morfogénesis Candida albicans in vitro Formación de: Seudohifas Formación de: Hifas Formación de: Hifas Kwon-Chung, Bennett Medical Mycology 1992 Microscopía directa Examen en fresco (EF) Luz brillante Microscopio Óptico Contraste de fase Microscopía directa EF c/ líquido de montaje Calcoflúor KOH AL 10% Agentes quimiofluorescentes Microscopía directa Histopatología Tinción Coloración Argéntica Técnicas convencionales Cultivo Histopatología MUESTRA Distinta de suero Estructuras morfológicas de género Aspergillus Cabezas conidiales Conidias Fialides Métula Columnar Radial Vesícula Conidióforo Célula “pie” Uniseriado Biseriado Células de Hülle CULTIVO Según Tipo de Muestras Colonización con Aspergillus esta aumentada en Fumadores y Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica Hisopado nasal Estudio de vigilancia (Inmonocomprometido) No inmunocomprometidos Tumor sólido no neutropénicos Cultivo de Esputo Positivo Inmunocomp. No Neutropénicos Pacientes tratados con esteroides Leucemia aguda Neutropénicos Trasplante de Pulmón BAL Grupos de alto riesgo Nunca se asocia con Aspergil. pulmonar Baja especificidad Tiene un valor predictivo alto de Aspergilosis Invasiva Muy Buena especificidad Rendimiento de las técnicas Hospital Británico Paciente oncohematológico Microscopía directa Fresco Calcoflúor Cultivo 8 / 17 17 / 17 6 / 17 Inmunocompetentes Inmunodifusión MUESTRA Suero CIGOMICOSIS ó MUCORAMICOSIS Hongos Filamentosos Hialinos Cenocíticos Anemófilos Hifas septadas Hifas aseptadas Micelio Tabicado Micelio NO Tabicado FORMACIÓN DE ESPOROS ASEXUADOS INTERNOS ESPORANGIOSPOROS CIGOTES Cigomicosis • Clase: Zygomycetes • Orden: – Mucorales: • Rhizopus • Absidia • Mucor • Rhizomucor – Entomophthorales Hifas anchas, hialinas no tabicadas (micelio cenocítico). Forma sexuada: cigosporos. Forma asexuada: esporos asexuados internos. REINO EUMYCOTA (HONGOS) Nomenclatura Nombraremos cada rango por su nombre seguido por un subfijo: Nombres en latín y letras en itálicas PHYLUM: ~mycota SUBPHYLUM: ~mycotina CLASE: ~mycetes ORDEN: ~ales FAMILIA: ~aceae GÉNERO ESPECIE PHYLUM: Zygo~mycota SUBPHYLUM: Mucoro~mycotina CLASE: ORDEN: FAMILIA: GÉNERO: Zygo~mycetes Mucor~ales Mucor~aceae Rhizopus ESPECIE: oryzae Ejemplo: Rhizopus oryzae AGENTES ETIOLÓGICOS Subphylum Mucoromycotina Mucorales: – Lichtheimia spp. (Absidia) – Rhizopus – Mucor – Rhizomucor Otros: Syncephalastrum, Cunningamella, Morteriella. Vías de ingreso • Inhalación esporas (ductos - ventilación) • Inoculación directa – Politraumatismos, – Quemaduras extensas – Apósitos contaminados-húmedos en sitio donde sujeta sondas nasogástricas. • Invasión por contigüidad por rotura de barreras anatómicas defensivas. Huésped normal Neutrófilos Huésped susceptible Angoinvasión Trombosis venosa Diseminación hematógena Vaso sanguíneo Tejidos Angioinvasión Necrosis MUCORAMICOSIS Mucoramicosis • Rendimiento de los cultivos es bajo. • No se realiza pruebas serológicas FORMACIÓN DE ESPOROS ASEXUADOS INTERNOS ESPORANGIO Formas de Reproducción Asexuada (Anamórfica) Artroconidios Blastoconidios Clamidoconidios Microaleurioconidios Dictioconidios Microconidios Macroaleurioconidios Macroconidios Conidióforos A. Bonifaz. Micología Médica Básica 4ta. Ed. Macroconidios Esporangiosporas ó endosporas Inmunocomprometido Directo y Cultivo Positivo Hemocultivo S < 1% NO biopsia Enf crítico sitio no abordable Biopsia baja carga fúngica/ no viable Sitios NO estériles Sitios estériles Diagnóstico de AI Esputo BAL Hisopado nasal Colonización Pte. crítico ¿? Búsqueda Técnicas alternativas Énfasis en vigilancia DETECCIÓN DE ANTÍGENOS FÚNGICOS Específicos ► ELISA para Galactomananos de: Aspergillus spp. Panfúngicos ► Test cromogénico para la detección de β - D - glucanos. Marcadores Biológicos en Infección Fúngica Invasora Pared celular Específico de Aspergillus spp. Galactomananos NO Específico de Asperg. spp. (1 - 3) β-D-glucanos Citoplasmáticos ADN UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE GALACTOMANANO PACIENTES NEUTROPÉNICOS ADULTOS DE ALTO RIESGO < 100 neutrófilos / mm3 > 3 semanas Trasplante de médula ósea no relacionado Enfermedad injerto contra huésped Neutropenia < 500 neutrófilos / mm3 > 5 semanas Corticosteroides > 2 mg/kg > 2 semanas Corticosteroides > 1mg/kg con neutropenia AraC a altas dosis Fludarabina Alemtuzumab Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284 Prentice y col. GALACTOMANANO UTILIDAD DIAGNÓSTICA RELATIVA EN: Receptores de trasplante de órganos sólidos SIDA Enfermedad granulomatosa crónica Neoplasias de órgano sólido Grandes quemados Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284 Prentice y col. Factores predisponentes de Aspergilosis invasora • Leucocitos polimorfonucleares entre 500/mm3 y 100/mm3 . • Neutropenia prolongada (12 – 15 dias). • Infección por Citomegalovirus (trasplantes de pulmón / TMO). • Terapia con corticoides. DESARROLLO EN LA DETECCIÓN DE GALACTOMANANOS (GM) EN FLUÍDOS BIOLÓGICOS Estructura química del antígeno Galactofurano [-s M - M - M - M -]n G G Selección de anticuerpos monoclonales, específicos contra la cadena lateral de Galactofuranos (G) ausente en humanos [G] [G]R M: Manano G: Galactofurano n = 10 R>3 Ac monoclonal EBA-2 Clin Microbiol. Rev 1999; 12:310-350 Latgé EIA en suero para Galactomananos Galactomananos (GM) Suero Microplaca M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004 EIA en suero para Galactomananos Galactomananos (GM) Ac EBA-2 GM Peroxidasa Suero Microplaca M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004 EIA en suero para Galactomananos Galactomananos (GM) Ac EBA-2 GM Peroxidasa Cromógeno Microplaca M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004 EIA en suero para Galactomananos Galactomananos (GM) Ac EBA-2 GM Peroxidasa Cromógeno Microplaca M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004 EIA en suero para Galactomananos Galactomananos (GM) Ac EBA-2 GM Peroxidasa Cromógeno Microplaca M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol 4 June 2004 Kit anterior Kit nuevo Nombre Platelia Aspergillus EIA Platelia Aspergillus Ag Código 62796 62794 Detección de antígeno galactomanano en suero Detección de antígeno galactomanano en suero de adultos, adultos, pediátricos, BAL, Suero pediátricos, BALotros y líquidos biológicos otros líquidos biológicos Uso Composición R1 Microplaca sensibilizada 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos) R2 Sln. lavado 10x thimerosal Microplaca sensibilizada 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos) Sln. lavado lavado20x 20xproclin proclin Controles Liofilizados sin conservante Controles Listopara parasu usar Controles Listo uso (preservativo <1,5% proclin TM 300) R6 Conjugado Ac monocl. Anti GM marcado peroxidasa. Conservante 0,01% thimerosal Conjugado Ac monocl. Anti GM marcado peroxidasa. Conservante: 1,5% proclin TM 300 R7 Solución para tratamiento (EDTA) Solución para tratamiento (EDTA) R8 TMB sustrato buffer (listo para usar). Ác cítrico, acetato de sodio, 0,009% H2O2, 4% DMSO Sólo R9 sin R8 R9 90% DMSO, con 0,6% tetramethilbenzidine (TMB) Cromógeno TMBlisto listopara parausar usar Cromógeno TMB 3,3´,5,5´tetramethilbenzidine (<0,1%), H2O2 < 1% R10 Ácido sulfúrico (H2SO4) 1,5 N Ácido sulfúrico (H2SO4) 1 N Desarrollado Europa 2 insertos (Europa/US) US 1 inserto internacional R3 / R4 / R5 FACTORES QUE INFLUENCIAN LA DETECCIÓN DE ANTÍGENO EN ASPERGILOSIS INVASORA BIOLÓGICOS EPIDEMIOLÓGICOS Sitio de infección Población de pacientes Especies de Aspergillus Estrategia de muestreo Microambiente en el sitio: O2, pH Definición de resultado positivo Tratamiento antifúngicos Definición de paciente infectado Estructura de la molécula de GM Prevalencia de la infección Nivel-grado de inmunosupresión Cut-off Clearence renal Experiencia del laboratorio Metabolismo hepático Presencia de Ac anti-GM Conservación de la muestra ELISA: pre-tratamiento Factores involucrados en la realización del ELISA para diagnóstico de aspergilosis invasora Sitio de infección Especie O2 Cepa Ramificaciones F: 2 y 3 GM/galf-glicoprot 35-94 kDa Laboratorio Frecuencia de muestreo Glucosa Hifa GM 20 kDa Sangre circulante Factores paciente edad Cond. subyacentes citoquinas Ac anti-Aspergillus Suero Conservación Pre-tratamiento Clearence renal/hepático Antígenos GM/galf circulantes Número de epitopes Lipopéptido GM >100 kDa Antifúngicos Neutrófilos circulantes The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357 Mennink-Kersten y col. ELISA Definición de positivo Cut-off Experiencia PLACA DE LECTURA DE ELISA ASPERGILLUS Control NEGATIVO CUT-OFF Control POSITIVO CUT-OFF Resultados Se expresa como índice (I) Cociente entre: Densidad óptica (DO) de la muestra / DO del control de punto de corte (cut-off) I = DO muestra / DO cut-off Detección de galactomananos por ELISA Valores de cut-off Niveles de punto de corte Fabricante del equipo PlateliaR Bio-Rad, hasta marzo 2007 I ≥ 1,5 (2 muestras consecutivas) Presencia de GM I entre 1,0 - 1,5 Indeterminado I < 1,0 Ausencia de GM Propuesta en adultos Maertens et al.* (2004) Punto de corte estático I ≥ 0,8 (1muestra) Punto de corte dinámico I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas) Propuesta Maertens et al ***** (2007) Propuesta Mennink-Kersten et al. ** (2004) I ≥ 0,7 I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas) Propuesta Kawazu et al. *** (2004) I ≥ 0,6 Propuesta US Food and Drug Administration **** (2005) I ≥ 0,5 * Maertens et al. B. J. Haematology 2004; 126: 852-860. ** Mennink-Kersten et al. The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357. *** Kawazu et al. JCM, June 2004, p.2733-41. **** US Food and Drug Administration (FDA Upton A. et al. J.Clin.Microbiol 2005;43:4796-4800. *****Maertens J. A.et al. Optimization of the Cutoff Value for the Aspergillus Double-Sandwich Enzyme mmunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336. Detección de Galactomananos Falsos Positivos Reacción cruzada con antígenos de otros géneros: Penicillium, Paecilomyces, Alternaria, Geotrichum, Histoplasma y Candida Rn cruzada por bacteriemias Antibióticos de Origen fúngico: Pip-Tazo / AMCla. Contaminación con algodón Mucositis intensa Colonización masiva intestinal por Aspergillus Transfusiones Falsos Negativos Profilaxis antifúngica Población no seleccionada Encapsulación de la infección Formación de inmunocomplejos: Ac. anti-Aspergillus PRIMEROS ESTUDIOS PROSPECTIVOS GM Maertens et al. (1) Maertens et al. (2) Sulahian et al. (3) Punto de corte ( Nº de muestras positivas ) 1 (2) 1 (2) 1,5 (2) Aspergilosis invasora (Probada+Probable) (n) 33 39 53 Sensibilidad (%) 93 90 91 Especificidad (%) 95 98 94 VPP (%) 93 87 SD VPN (%) 95 98 SD Falsos positivos (%) 8 14 12 6 (54) 5 (68) 7 (40) 94 95 SD Precocidad en días (%) Eficacia global (%) VPP: Valor predictivo positivo VPN: Valor predictivo negativo SD: Sin datos 1) J Clin Microbiol 1999; 37:3223-28. Maertens et al. 2) Blood 2001; 97:1604-10. Maertens et al. 3) Cancer 2001; 91: 311-18. Sulahian et al. GALACTOMANANOS VERSUS DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS DATOS GLOBALES DE 27 ESTUDIOS DESDE 1966 HASTA FEBRERO 2005 Probada Sensibilidad: 61% Especificidad: 89% VPN: 95% VPP: 26% Probada + Probable Sensibilidad: 71% Especificidad: 93% VPN: 98% VPP: 53% CID 2006-42; 1417.1427. Pfeiffer y col. CID 2006-42; 1428-1429. John H. Rex. GALACTOMANANOS VERSUS DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS DATOS 2007 Punto de corte: I ≥ 0,5 Sensibilidad: de 76,3% a 97,4% Especificidad: de 97,5% a 90,5% Maertens J. A., et al. Optimization of the Cut off Value for the Aspergillus Double-Sandwich Enzyme Immunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336. ANTIGENEMIA de ASPERGILLUS Detección de Galactomananos Método: ELISA Selección de entidad/es clínica/s en las que se realizará la prueba Investigación comienza: al inicio de la neutropenia Frecuencia: 2 muestras semanales Consenso EORTC/MSG 2002 Propone su uso Clasificando Dos Resultados Consecutivos Positivos en la Categoría de “Infección Probable” CID 2002; 34:7-14. Definición Infección Fúngica Invasora. Consenso EORTC/MSG Índice de Galactomananos como Monitoreo de Respuesta al Tratamiento Antifúngico Disminución de I de GM se asocia con respuesta al tratamiento. Valores persistentes o aumentados indican aspergilosis progresiva. Miceli M. H.,Grazziotti M. L., et al. Strong correlation between serum Aspergillus galactomannan index and outcome of aspergillosis in patients with hematological cancer: clinical and research implications. Clin Infec Dis. 2008; 46:1412-1422. Marr K. A. Aspergillus galactomannan index: a surrogate end point to asses outcome of therapy?. Clin Infec Dis 2008; 46:1423-5. COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO ASPERGILOSIS SENSIBILIDAD MICROSCOPÍA CULTIVO 53% 50% GM SUERO GM BAL 55% ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD 88% 40% ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD 58% 69% 40% 100% 100% 100% 73/98% 69% 58% 100% ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD 100% 93% 55% 69% 72% ESPECIFICIDAD 58% 96% SENSIBILIDAD 78% 78% ESPECIFICIDAD 100% 92% 79% 64% SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD 29% 57% 100% Referencia Maertens CID 2009 Cut-off 1,0 Hsu BMC I. Dis 2010 Cut-off 0,5/1,0 Luong Diag Micro Inf Dis 2010 Cut-off 2,0 Bergeron Chest 2010 Cut-off 0,5 Desai Pediat Inf Dis J 2009 Cut-off 0,98 Paugan Pathol Biol 2010 Cut-off 0,5 Chadi A. et al. Current Opinion in Pulmonary Medicine 2011, 17: 167-171. GALACTOMANANOS Muestras distintas a suero En lavado broncoalveolar J. Maertens propone el uso de un Cut-off ≥ 1,0. Muestras obtenidas de sitios estériles, biopsias, líquidos de punción en evaluación. CID 2009; 49:1688-1693. J. Maertens y col. Índice de Galactomananos en suero Hospital Británico 2004 a 2008 Total 138 pacientes 641 GM Promedio de 5 por paciente Sensibilidad: 81,8% Especificidad: 81,9% Valor Predictivo Positivo: 28,1% Valor Predictivo Negativo: 98,1% Natalia Enriquez, Gustavo Mendez, Rosana Jordán, Ernesto Efron, Amalia Schiel, Iris Agorio. Datos no publicados a la fecha Índice de Galactomananos en suero versus cultivo positivo para Aspergillus spp. Hospital Británico 2004 a 2009 Pacientes oncohematológicos y trasplante de células progenitoras hematopoyéticas. Cultivo Positivo para especies de Aspergillus 17 GM Positivo 12 (70%) GM Negativo 5 (30%) Mendez G., Jordan R., Martinez J, Enriquez N, Verbanaz S, Giorgio P, Efron E. Galactomananos en suero falsos positivos asociados a Piperacilina/Tazobactam (PT) Herrera F. Y col. Poster presentado en VII Congreso SADEBAC 2012. CEMIC NEUTROPÉNICOS FEBRILES CON ALTO USO PT 195 episodios, 17 Falsos Positivos (8,71%). La frecuencia de FP durante uso de PT no fue mayor comparado con FP durante uso de otros ATB. En los episodios con FP se realizaron más TAC de tórax y se indicó más frecuentemente tratamiento AF empírico; sin embargo, la duración del tratamiento antifúngico no se prolongó en forma significativa. Diagnóstico de Micosis por Hongos Filamentosos en inmunocomprometidos en Argentina. REMIIN 2010 - 2012 Diagnóstico en 51 (75%) pacientes Total 68 pacientes sólo 1 prueba positiva Cultivo: 38 Otros 15% Histopatología + GM 3% Aspergillus spp. 43% GM: 9 GM 12% Histopatología: 4 Aspergillus Histopatología 8% Fusarium Mucorales Diagnóstico en 17 (25%) pacientes Mucorales 6% Fusarium spp. 13% mas de 1 prueba positiva Histología GM Histología + GM Otros Dignani MC, Davel G y col. Grupo REMIIN (registro de micosis invasoras) 3er Simposio de la Sociedad Argentina de Hematología. [Abstract 13]. 2012;16:125 (1 3)-β-D-GLUCANO Es un constituyente de la pared celular de la mayoría de los hongos de importancia médica Excepción: Cryptococcus y Zygomycetes Detecta picogramos Revisión de Definición de Enfermedad Fúngica Invasora EORTC/MSG CID 2008; 46:1813-21 Probable Se aplica al paciente inmunocomprometido Cancer, Trasplante de Médula Ósea, Receptores de Trasplantes de Órganos Sólidos, e Inmunodeficiencias Primarias Se incorpora como evidencia micológica la detección de β (1 3)-D-Glucano en suero Fungitec G-Test MK Β-glucan Test Wako B-G Star Fungitell Seikagaku Corporation Wako Pure Chemical Maruha Corporation Associates of Cape Code Japón Japón Japón USA 1995 1996 2001 2004 Método Cinética cromogénica Cinética turbidimétrica Punto final cromogénico Cinética cromogénica Muestra Suero o Plasma Suero o Plasma Suero o Plasma Suero Álcali Dilución y calentamiento Dilución y calentamiento Álcali Standard β-glucan Pachyman Carboxymethylcurdlan Lentinan Pachyman Origen Tachypleus tridentatus Limulus polyphemus Tachypleus tridentatus Limulus polyphemus Cutoff pg/mL 20 11 11 60 o 80 Rango pg/mL 3,9 - 500 6 - 600 1,2 – 120 31,25 - 500 Tpo. minutos 30 90 30 40 Fabricante País Año aprobado Pretratamiento CID 2008:46 (15 June). Obayashi y col. (1 3)-β-D-GLUCANO Diferentes equipos, diferentes géneros de cangrejos • Fungitell (Glucatell) (Limulus polyhemus) Distintos puntos de corte ≥ 60 / ≥80 / ≥ 120 pg/mL • FungiTec-G (Tachypleus tridentatus) Cut-off 20 pg/mL Muestra: suero o plasma Muestras no aptas para procesar son sueros: • Lipémicos • Hemolizados • Presencia de bilirrubina • Turbios Frecuencia: 2 a 3 veces por semana ENSAYO COLORIMÉTRICO DETECCIÓN DE ( 1 3 ) - - D - GLUCANO Camino metabólico de coagulación cangrejo de herradura ENDOTOXINA (LPS) FACTOR C FACTOR C ACTIVADO FACTOR B FACTOR B ACTIVADO ENZIMA DE COAGULACIÓN INACTIVA SUSTRATO CROMOGÉNICO ( 13 ) - - D - GLUCANO FACTOR G FACTOR G ACTIVADO ENZIMA DE COAGULACIÓN ACTIVA CROMÓFORO Abs 405 nm LECTURA Sistema de Detección (1 3)-β-D-GLUCANO DISEÑO DE REALIZACIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B S1 100 1 4 7 10 13 16 19 C S2 50 1 4 7 10 13 16 19 D E S3 25 2 5 8 11 14 17 20 S4 12 2 5 8 11 14 17 20 F S5 6 3 6 9 12 15 18 21 G B 0 3 6 9 12 15 18 21 H B = BLANCO S = CONTROLES Curva en pg-ml 1 = MUESTRAS (1 3)-β-D-GLUCANO CURVA DE CALIBRACIÓN DO/min a 405 nm DO muestra 6 12 25 50 70 100 Concentración de Glucanos picogramos/mL (1 3)-β-D-GLUCANO Falsos positivos Insuficiencia renal Hemodiálisis con filtros de celulosa Inmunoglobulinas ó sus derivados Albúmina Factores de coagulación Fracciones de proteínas plasmáticas Exposición de serosas ó superficie corporal a gasas o algodón Ciertos Streptococcus producen polímeros simil glucano Exceso de manipulación de la muestra (1 3)-β-D-Glucano Fungitec G-Test MK Sensibilidad y Especificidad Fungitec G-Test MK Cutoff S% E% Obayashi y col. 1995 (41 IFI) 20 pg/mL 90 100 Obayashi y col. 2008 (54 IFI) 30 pg/mL 95,1 85,7 60 pg/mL 85,4 95,2 80 pg/mL 78 98,4 20 pg/mL 63 20 pg/mL 88 Kami 2000 16 aspergilosis incluyó aspergilomas Kami 2000 sólo aspergilosis diseminada Obayashi y col. CID 2008;46 (15 June) 1864-70 (1 3)-β-D-Glucano Fungitell Sensibilidad y Especificidad Fungitell Cutoff S% Odabasi 2004 20 IFI 60 pg/mL 100 Pazos y col. 2005 7 Aspergilosis invasora 120 pg/mL 87,5 Ostrosky-Zeichner 2005 107 Candidiasis 60 pg/mL 81,3 Ostrosky-Zeichner 2005 10 Aspergilosis 60/80 pg/mL 80 80 pg/mL 93,3 Pickering 2005 Hemo bact Gram + Falsos + E% 89,6 77,2 (1 3)-β-D-GLUCANO Odabasi Glucatell y Fungitec-G-Test MK CID 2004; 39 Fungitec-G-Test: cut-off 20 pg/mL Glucatell: cut-off >= 60 pg/mL S: 97% E: 93% Pazos Glucatell JCM Enero 2005 Cut-off >= 120 pg/mL 1mtra S: 87,5% E: 89,6% Pickering Fungitell JCM Dec 2005 Cut-off >= 80 pg/mL S: 92,9% E: 100% (1 3)-β-D-GLUCANO Senn L. y col. CID 2008;46:878-885 Ptes. Neutropénicos. 190 Episodios. 95 pacientes Ensayo Wako: Tachypleus tridentatus Punto de corte 2 determinaciones ≥ 7 pg/ml Sensibilidad: 63% Especificidad: 96% VPP: 79% VPN: 91% Demostró que el Beta glucan fue capaz de demostrar IFI en estadíos tempranos, antes que las manifestaciones radiológicas ocurran. (1 3)-β-D-GLUCANO Ostrosky-Zeichner y col. CID 2005;41:654-59 Estudio Multicéntrico (6 US) EFI n = 163 1 Muestra por paciente Ensayo Fungitell, Limulus polyphemus Punto de corte 60 pg/ml Punto de corte 80 pg/ml Sensibilidad: 69,9 % Sensibilidad: 64,4 % Especificidad: 87,1 % Especificidad: 92,4 % VPP: 83,8 % VPP: 89 % VPN: 75,1 % VPN: 73 % (1 3)-β-D-GLUCANO Pneumocystis jiroveci Niveles de beta-D-glucano como indicador temprano en el diagnóstico de neumonía. Niveles de beta-D-glucano evaluación de la respuesta al tratamiento como valor pronóstico. Clin Microbiol Infect. 2010 Dec 27. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03452 Held J, Wagner D. Clin Microbiol Infect. 2011 Apr;17(4):595-602. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03318.x. Held J, Koch MS, Reischl U, Danner T, Serr A. (1 3)-β-D-Glucano Utilidad diagnóstica Dosaje de β-D-Glucano, puede servir como herramienta útil para el diagnóstico de candidemias asociadas a cateter. Nett et al. J. Infect Dis 2007. 195:1705-1712 (1 3)-β-D-GLUCANO en pacientes oncohematológicos Racil et al. J Medical Microbiology 2010;59:1016-1022 S = 89-44% E = 20-56% VPP:10 a 12 %. Alto VPN. Sensibilidad limitada por la alta frecuencia de falsos +. Falsos +: Mucositis / colonización con Candida /bacteriemia /uso de antimicrobianos /productos hemáticos filtrados como eritrocitos plaquetas /, muestras recolectadas através de catéteres venosos. Limitada utilidad en pacientes con malignidad hematológica. BD positivo, NO puede ser usado para comenzar un tratamiento antifúngico anticipado (pre-emptive) en este grupo de ptes. (1 3)-β-D-GLUCANO Meta-análisis Karageorgopoulos et al. CID 2011;52(6):750-770 Sobre 16 estudios desde 1995 – 2010. Total pacientes: 2979. 594 con IFI Probada ó Probable (excluyeron infección por Pneumocystis jiroveci) SENSIBILIDAD: 77% ESPECIFICIDAD: 85% A pesar de la heterogeneidad entre los diferentes estudios, tiene buena precisión para distinguir pacientes de Probada o Probable IFI, de NO IFI. Adicional estudios prospectivos necesitan ser realizados. (1 3)-β-D-GLUCANO Revisión - Meta-análisis (ECIL-3) Pacientes Oncohematológicos Lamoth et al. CID 2012;54(5):633-643 Total: 1771 adultos. 215 con IFI Probada ó Probable. Para 2 test consecutivos. SENSIBILIDAD: 50% ESPECIFICIDAD: 99% VPP: 84% VPN: 95% Dos pruebas consecutivas positivas tienen alta especificidad y VPP y VPN. Sensibilidad es baja la prueba necesita ser combinada con hallazgos clínicos, radiológicos y microbiológicos. COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO / GALACTOMANANO / PCR Real-Time JCM, June 2004, p.2733-41. Kawazu et al. Pacientes oncohematlógicos Total de episodios: 149 AI Probada: 9 AI Probable: 2 AI Posible: 13 NO AI: 125 Frecuencia: 1 muestra semanal ELISA Cut-off: I = 0,6 β-glucan Wako: 11 ng/mL S Galactomanano (GM) 100% PCR real-time: 40 cop./mL E VPP VPN 93% 55% 100% β-D-Glucano (BG) 55% 98% 40% 96% PCR Real-Time 55% 93% 40% 96% COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO vs. GALACTOMANANO JCM, Jan 2005, p.299-305. Pazos et al. Pacientes oncohematlógicos Total de episodios: 40 Glucatell AI Probada: 5 Cut-off >= 120 ng / mL AI Probable: 3 AI Posible: 3 NO AI : 29 BG tendió a convertirse en positivo mas temprano que GM BG y GM fueron positivos en los mismos pacientes Discrepancias en los valores positivos para c/u de las pruebas ayudó a detectar falsos + S E VPP VPN Falsos + β-D-Glucano (BG) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3% Galactomanano (GM) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3% Pruebas combinadas 87,5% 100% 100% 96,3% Galactomanano y (1 3)-β-D-glucano Enfermos críticos no-neutropénicos Acosta et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2012) 31:721-731 AI probada + probable GM comparable con BD SENSIBILIDAD: 67% ESPECIFICIDAD: 98% VPP: 80% VPN: 95% Ambos se hicieron positivos con una media de 6,5 días antes que el cultivo de Aspergillus. Mejora diagnóstico ambas determinaciones juntas Candidiasis invasora probada BD SENSIBILIDAD: 70% ESPECIFICIDAD: 59% VPN: 94,5% Se hizo positivo con una media de 3,25 días antes que el cultivo de Candida. ELISA (1 3)-β-D-GLUCANO Utiliza: Fragmentos recombinantes de la proteína, Factor G. Sensibilidad comparable al mét. Colorimétrico. Tpos. de reacción más cortos. Instrumenal común en lab. de análisis clínicos Lectores de ELISA. Journal of Inmunological Methods. 365 (2011) 158-165. Yoneda A., y Kurokawa T. BIOMARCADORES Recomendaciones y Grados de Evidencia en Leucemia y TMO - ECIL El diagnóstico convencional sigue siendo el método de referencia Técnica diagnóstica Detección de GM en suero AI Grado de recomendación A-II AI = Aspergilosis invasora IFD = Infección Fúngica Diseminada Bone Marrow Transplantation (2012) 47,846-854. Recomendaciones ECIL-3 Uso Biomarcadores en Diag Enf. Fúngica Invasora en Leucemia y TMO. BIOMARCADORES Recomendaciones y Grados de Evidencia en Leucemia y TMO - ECIL El diagnóstico convencional sigue siendo el método de referencia Técnica diagnóstica Detección de GM en suero AI Grado de recomendación A-II Basados en los resultados obtenidos con criterios EORTC/MSG para definir Inf Fúngica Diseminada, integrando signos clínicos, radiológicos y microbiológicos. Detección de BD en suero IFD B-II AI = Aspergilosis invasora IFD = Infección Fúngica Diseminada Bone Marrow Transplantation (2012) 47,846-854. Recomendaciones ECIL-3 Uso Biomarcadores en Diag Enf. Fúngica Invasora en Leucemia y TMO. Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación Suero seriado + Tomografía de alta resolución, en adultos neutropénicos bajo quimio. por Temprana leucemia ó TMO alogeneico detección Galactomanano Cut-off un solo resultado I > 0,7 de aspergilosis ó Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5 J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación Suero seriado + Tomografía de alta resolución, en adultos neutropénicos bajo quimio. por Temprana leucemia ó TMO alogeneico detección Galactomanano Cut-off un solo resultado I > 0,7 de ó aspergilosis Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5 En ptes no-neutropénicos GM en suero NO tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Galactomanano Indicado Recomendación Suero seriado + Tomografía de alta resolución, en adultos neutropénicos bajo quimio. por Temprana leucemia ó TMO alogeneico detección Galactomanano Cut-off un solo resultado I > 0,7 de ó aspergilosis Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5 En ptes no-neutropénicos GM en suero no tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación Suero seriado + Tomografía de alta resolución, en adultos neutropénicos bajo quimio. por Temprana leucemia ó TMO alogeneico detección Galactomanano Cut-off un solo resultado I > 0,7 de ó aspergilosis Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5 En ptes no-neutropénicos GM en suero no tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos tratados, se considera un signo de falla terapéutica J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación Suero seriado + Tomografía de alta resolución, en adultos neutropénicos bajo quimio. por Temprana leucemia ó TMO alogeneico detección Galactomanano Cut-off un solo resultado I > 0,7 de ó aspergilosis Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5 En ptes no-neutropénicos GM en suero no tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos tratados, se considera un signo de falla terapéutica Ptes neutropénicos y no-neutropénicos puede ser útil BAL cut-off > 1 LCR cut-off > 0,5 (BIII) J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método β-D-Glucano Indicado Recomendación Diagnóstico de Infección fúngica Invasora Suero seriado en ptes. neutropénicos y no-neutropénicos Fungitell Cut-off > 60-80 pg/mL Wako Cut-off > 7 pg/mL J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método β-D-Glucano Indicado Recomendación Diagnóstico de Infección fúngica Invasora Suero seriado en ptes. neutropénicos y noneutropénicos Fungitell Cut-off > 60-80 pg/mL Wako Cut-off > 7 pg/mL En ptes hematológicos ha sido descripta baja precisión, lo cual podría ser una limitación significativa para usarlo como screenning J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella Recomendaciones Biomarcadores Método β-D-Glucano Indicado Recomendación Diagnóstico de Infección fúngica Invasora Suero seriado en ptes. neutropénicos y noneutropénicos Fungitell Cut-off > 60-80 pg/mL Wako Cut-off > 7 pg/mL En ptes hematológicos ha sido descripta baja precisión, lo cual podría ser una limitación significativa para usarlo como screenning Menos usado que GM. Menos datos disponibles. J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella CONCLUSIÓN Pacientes neutropénicos Pacientes críticos Aspergilosis GM suero Galactomanano Técnica mas reproducible que BG Tiene alta especificidad Integrar signos clínicos, estudios radiológicos (TC) y microbiológicos. Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico, Síndrome de reconstitución inmune CONCLUSIÓN Pacientes neutropénicos Pacientes críticos Aspergilosis GM suero (1 BD suero 3)-β-D-glucano Puede ser usado para excluir AI en un entorno clínico con GM negativo Para aumentar la certeza de AI en la presencia de un GM positivo ó un aislamiento positivo de un sitio no estéril CONCLUSIÓN Pacientes neutropénicos Aspergilosis GM suero Pacientes críticos Aspergilosis Candidiasis BD suero BD suero Neumocistosis (1 3)-β-D-glucano Parece ser mas sensible que GM en la detección de AI, no obstante carece de especifcidad micológica intrínseca, requiere integración de datos clínicos, radiológicos y microbiológicos para una correcta interpretación. Herramienta de screening para vigilancia de AI y otras infecciones fúngicas diseminadas, en poblaciones con riesgo Realización mas compleja que GM con un costo mayor CONCLUSIÓN Pacientes neutropénicos Aspergilosis Pacientes críticos Aspergilosis GM BAL GM suero Candidiasis BD suero BD suero Neumocistosis Galactomanano en BAL Datos indican mas Sensibilidad que en suero DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO PRECOZ EN EL PACIENTE NEUTROPÉNICO FEBRIL, SE ASOCIA CON AUMENTO DE LA SUPERVIVENCIA. FACTOR TIEMPO JUEGA UN ROL MUY IMPORTANTE BIOMARCADORES CONCLUSIONES Marcadores biológicos Aún no se tienen evidencias sólidas para recomendarlas como métodos aplicables al laboratorio asistencial. Al momento combinar los 2 Biomarcadores parece ser la mejor opción tanto para diagnóstico temprano como para seguimiento de paciente. ¡Costos vs. beneficios! El diagnóstico temprano sigue siendo dificultoso y por lo tanto requiere enfoque multidisciplinario. MUCHAS GRACIAS…
