Diagnóstico microbiológico de las infecciones por Chlamydia spp. y

Procedimientos en Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica
Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón
44.
Diagnóstico microbiológico
de las infecciones por
Chlamydia spp. y especies
relacionadas
2
0
Coordinador:
Autores:
1
2
Juan Carlos Galán
Roberto Alonso
Juan Carlos Galán
José Gutiérrez Fernández
Mario Rodríguez-Domínguez
Jesús Salinas
Sara Sanbonmatsu Gámez
ISBN- 978-84-616-0701-3
I
ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO:
1. Introducción
2. Controversia en la taxonomía de la familia Chlamydiaceae
3. Epidemiología
3.1. Chlamydia trachomatis
3.2. Chlamydia pneumoniae
3.3. Chlamydia psittaci
4. Características biológicas de la familia Chlamydiaceae
4.1. Ciclo biológico
4.2. Estructura antigénica y factores de virulencia
4.2.1. Lipopolisacárido
4.2.2. Proteínas de membrana externa
4.2.2.1. MOMP: principal proteína de membrana externa
4.2.2.2. PMPs: proteínas polimórficas de membrana
4.2.2.3. COMC: complejo proteico de membrana externa rico en residuos de cisteína
4.2.3. Proteínas del proceso celular: proteínas Hsp
4.2.4. Sistema de secreción tipo III
4.2.5. Otros mecanismos patogénicos
5. Manifestaciones clínicas de las infecciones en humanos causadas por especies del orden Chlamydiales.
5.1. Infecciones en humanos por Chlamydia trachomatis
5.1.1. Tracoma
5.1.2. Linfogranuloma venéreo (LGV)
5.1.3. Infección óculo-genital
5.1.3.1. Uretritis
5.1.3.2. Cervicitis
5.1.3.3. Infección perinatal
5.2. Infecciones en humanos por Chlamydia pneumoniae
5.2.1. Infecciones agudas del tracto respiratorio
5.2.2. Implicaciones de Chlamydia pneumoniae en patologías crónicas
5.2.2.1. Asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica
5.2.2.2. Aterosclerosis
5.2.2.3. Esclerosis múltiple
5.2.2.4. Artritis reactiva
5.3. Infecciones en humanos por Chlamydia psittaci
5.3.1. Infección respiratoria
5.3.2. Infección extrarrespiratoria
5.4. Potencial patógeno de las nuevas Chlamydiae
6. Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por especies del orden Chlamydiales
6.1. Diagnóstico de las infecciones causadas por Chlamydia trachomatis
6.1.1. Amplificación de ácidos nucleicos (TAAN)
6.1.2. Hibridación de ácidos nucleicos
6.1.3. Detección de antígenos
6.1.4. Cultivo en línea celular
6.1.5. Recogida, transporte y conservación de las muestras
6.2. Diagnóstico de las infecciones causadas por Chlamydia pneumoniae
6.2.1. Diagnóstico indirecto: serología
6.2.1.1. Recogida, transporte y conservación de las muestras
6.2.1.2. Microinmunofluorescencia
6.2.1.3. Enzimoinmunoensayo
6.2.1.4. Fijación del complemento
6.2.2. Diagnóstico directo: cultivo
6.2.2.1. Recogida, transporte y conservación de las muestras
6.2.2.2. Selección de líneas celulares. Condiciones para la optimización de los resultados del cultivo
6.2.3. Diagnóstico directo no basado en el cultivo
6.2.3.1. Técnicas de detección de antígeno
6.2.3.2. Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
6.2.3.2.1. Recogida, transporte, conservación y procesamiento de las muestras
II
6.2.3.2.2. Descripción de las técnicas disponibles
6.2.3.3. Hibridación in situ
6.3. Diagnóstico de las infecciones causadas por Chlamidia psittaci
6.3.1. Diagnóstico indirecto de la psitacosis: serología
6.3.1.1. Fijación del complemento
6.3.1.2. Microinmunofluorescencia
6.3.1.3. Enzimoinmunoensayo
6.3.2. Diagnóstico directo: cultivo
6.3.2.1. Recogida, transporte, conservación y procesamiento de las muestras
6.3.2.2. Condiciones para la realización del cultivo
6.3.3. Diagnóstico directo no basado en cultivo
6.3.3.1. Microscopía mediante tinción
6.3.3.2. Técnicas de detección de antígenos
6.3.4. Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (TAAN)
6.4. Diagnóstico de las infecciones causadas por nuevas Chlamydiae
7. Tratamiento antibiótico de las infecciones producidas por miembros de la familia Chlamydiaceae
7.1. Técnicas de evaluación de la sensibilidad antimicrobiana
8. Tipación molecular en Chlamydiae
9. Implicaciones en Salud Pública
9.1. Implicaciones en Salud Pública de las infecciones por Chlamydia trachomatis
9.2. Implicaciones en Salud Pública de las infecciones por Chlamydia psittaci
10. Bibliografía
DOCUMENTOS TÉCNICOS:
PNT-DC-01. Detección molecular de Chlamydia trachomatis genotipo linfogranuloma venéreo mediante
PCR en tiempo real
PNT-DC-02. Diagnóstico serológico de la neumonía por Chlamydia pneumoniae mediante
microinmunofluorescencia
PNT-DC-03. Aislamiento de Chlamydia psittaci en la línea celular McCoy
III
Procedimientos en Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica
Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón
44. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS
Chlamydia spp. Y ESPECIES RELACIONADAS. 2012
Coordinador:
Autores:
INFECCIONES
POR
Juan Carlos Galán
Roberto Alonso
Juan Carlos Galán
José Gutiérrez Fernández
Mario Rodríguez-Domínguez
Jesús Salinas
Sara Sanbonmatsu Gámez
2
DOCUMENTO CIENTÍFICO
1. INTRODUCCIÓN
Las especies patógenas para el hombre de la familia
Chlamydiaceae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia
pneumoniae y Chlamydia psittaci pertenecen a una
división bacteriana muy divergente del resto del árbol
evolutivo de las eubacterias. Constituyen junto con
los micoplasmas, las especies bacterianas con los
genomas más pequeños entre 1,04-1,23 Mb (25%
del genoma de Escherichia coli), posiblemente
debido a que son bacterias intracelulares obligadas
desde hace mucho tiempo, lo que les ha permitido
perder ciertas rutas metabólicas como la biosíntesis
de aminoácidos o la fermentación anaeróbica.
Además, las características de su ciclo biológico, no
facilitan la posibilidad de intercambio y adquisición
de material genético exógeno.
La detección e identificación precisa de estas
bacterias como agentes causales de ciertas
patologías
humanas
no
ha
resultado
tradicionalmente fácil de realizar, debido a la
necesidad de disponer de instalaciones de
bioseguridad para el aislamiento de estas bacterias
mediante cultivo celular, a los problemas
relacionados con las reacciones cruzadas de las
pruebas serológicas disponibles, y al hecho de ser
muchas veces responsables de patologías de
evolución lenta e inespecífica. La disponibilidad de
pruebas de amplificación de ácidos nucleicos
altamente específicas, sensibles y de fácil
implantación, ha incrementado sensiblemente el
potencial diagnóstico de estas bacterias en los
laboratorios de Microbiología. Por otra parte, la
simplificación y abaratamiento de las técnicas de
secuenciación genómica ha revelado que la
biodiversidad del orden Chlamydiales es mucho
mayor de lo previamente esperado; además se han
podido identificar e implicar a nuevas especies
evolutivamente próximas como Parachlamydia
acanthamoebae,
Simkania
negevensis
o
Rhabdochlamydia spp. en procesos patológicos para
el hombre.
2. CONTROVERSIA EN LA TAXONOMÍA DE LA
FAMILIA Chlamydiaceae
La clasificación taxonómica de las bacterias
pertenecientes a la familia Chlamydiaceae ha sido
muy discutida en los últimos años. Basándose en el
análisis genético de las subunidades 16S y 23S del
ADNr, Everett y cols, establecieron, en 1999, los
géneros Chlamydia (C. trachomatis, Chlamydia suis
y
Chlamydia
muridarum)
y
Chlamydophila
(Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci,
Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum,
Chlamydophila caviae y Chlamydophila felis). Sin
embargo, la propuesta de establecer un nuevo
género no ha sido bien aceptada, ya que se
considera que podría llevar a confusiones tanto en el
ámbito de la investigación básica, como en Salud
Pública. Así el subcomité sobre la taxonomía de las
clamidias, dependiente del International Committee
on Systematics of Prokaryotes ha recomendado
reiteradamente que los dos géneros se refunden en
uno, Chlamydia, conservándose las nueve especies
establecidas anteriormente. La edición de 2011 del
Manual Bergey, se hace eco de esta recomendación.
Si bien, debemos aceptar esta última propuesta
como la clasificación actual, la página web del
National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/taxonomy) no solo
mantiene los dos géneros sino que además las
especies incluidas en cada género no coinciden con
la propuesta de Everett y cols, contribuyendo a
mantener la confusión sobre la posición y
distribución taxonómica de las especies de
Chlamydia (última fecha de acceso 21 Junio 2012).
El género Chlamydia es por tanto el único género de
la familia Chlamydiaceae, que tradicionalmente era la
única familia del orden Chlamydiales, sin embargo la
disponibilidad de técnicas de secuenciación masiva y
los conceptos de biología de poblaciones aplicados a
la taxonomía bacteriana, permite identificar ahora
otras 6 familias pertenecientes a este mismo orden:
Criblamydiaceae, Parachlamydiaceae, Piscichlamydiaceae, Rhabdochlamydiaceae, Simkaniaceae, y
Waddliacea. Algunas de estas familias engloban
especies patógenas para el hombre. Este continuo
cambio en la taxonomía bacteriana debido a la
facilidad para obtener nuevas secuencias génicas,
casi garantiza futuros cambios taxonómicos en este
grupo de bacterias tan separado evolutivamente del
resto de las bacterias.
3. EPIDEMIOLOGÍA
3.1. Chamydia trachomatis
Las infecciones por C. trachomatis afectan
exclusivamente a humanos y están entre las
infecciones bacterianas más comunes en el mundo.
Los 18 serovares descritos se distribuyen en tres
biovares o patotipos, responsables cada uno de un
cuadro infeccioso: a) tracoma (serovares A, B/Ba, C),
b) linfogranuloma venéreo, LGV (serovares L1, L2,
L2a, L3) y c) enfermedad óculo-genital no invasiva
(serovares D/Da, E, F, G, H, I/Ia, J, K). Cada una de
estas patologías tiene una distribución geográfica
diferente y afecta mayoritariamente a distintos
grupos poblacionales. El tracoma que se manifiesta
como una conjuntivitis folicular crónica, es endémico
en más de 50 países, especialmente en áreas
rurales de África sub-sahariana. Aunque no hay
casos descritos en España en la actualidad, a finales
de los años 60 el litoral mediterráneo español, desde
Gerona a Almería se consideraba endémico. La
OMS formó en 1997 la alianza para la eliminación
global
del
tracoma
para
2020
(http://www.who.int/blindness/en). Su transmisión
esta relacionada con las bajas condiciones
higiénicas y ocurre por vía de contacto directo con
fómites, contacto con ojos o bien a través de
moscas. En zonas endémicas, los niños y en menor
medida las mujeres son los principalmente
afectados. El LGV es una infección de transmisión
sexual que invade los tejidos linfoides, es endémico
de Africa, India, Sudamérica o el Caribe. El LGV
“clásico” se caracteriza por un síndrome inflamatorio
inespecífico (uretritis o cervicitis) que progresa hacia
linfadenopatías inguinales. Hasta principios del siglo
3
XXI, los casos detectados en Occidente se
consideraban importados de estas regiones. Desde
2003 se ha expandido una nueva presentación de la
enfermedad entre hombres que mantienen
relaciones sexuales con hombres (HSH) en Europa y
Norteamérica. La característica en común es la
presencia de proctitis, y está considerada hoy en día
un problema de Salud Pública, especialmente por la
estrecha asociación entre el LGV y el VIH.
La infección óculo-genital no invasora es la principal
causa infecciosa de transmisión sexual en el mundo
y el número de casos nuevos crece cada año,
especialmente desde 2008, pero no está claro si este
incremento está directamente relacionado con
mayores tasas de transmisión o con la implantación
generalizada de técnicas de diagnóstico molecular,
más sensibles y específicas. Esta infección afecta
fundamentalmente a mujeres entre 15-24 años,
aunque el 60% de los casos son asintomáticos. Este
desequilibrio hacia las mujeres podría no ser real, ya
que muchos de los casos se detectan en los
cribados de controles periódicos rutinarios a los que
las mujeres acuden con mayor frecuencia. Por el
contrario entre el 10-20% de las infecciones de cérvix
evolucionan hacia enfermedad inflamatoria pélvica,
embarazos ectópicos e infertilidad. Los cuadros de
conjuntivitis están asociados a niños menores de 2
años que se infectan en el canal del parto de madres
portadoras de los serovares D-K de C. trachomatis.
3.2. Chlamydia pneumoniae
C. pneumoniae es un microorganismo con una
amplia distribución geográfica y temporal y que tiene
un amplio rango de hospedadores. Existen 3
biovares aceptados: humano, caballo y koala.
Mientras que del biovar koala, no hay ninguna
descripción de infección en humanos y tan sólo una
infección descrita por el biovar caballo, C.
pneumoniae biovar humano es un patógeno
reconocido de las vías respiratorias altas y bajas,
responsable de aproximadamente el 10% de las
neumonías comunitarias y el 5% de los casos de
bronquitis y sinusitis en adultos. El hombre es el
único hospedador de C. pneumoniae biovar humano,
transmitiendose de humano a humano, sin reservorio
animal, a través de las secreciones respiratorias. Se
han documentado casos de contagio en personal de
laboratorio mediante aerosoles, así como brotes
epidémicos de infección respiratoria por C.
pneumoniae en familias y poblaciones cerradas tales
como campamentos militares y residencias de
ancianos. A pesar de que las cepas humanas son
genéticamente muy homogéneas entre sí, las
reinfecciones son frecuentes, sugiriendo que la
inmunidad inducida es incompleta o de corta
duración o ambas.
La primoinfección suele ocurrir durante la edad
escolar y se incrementa drásticamente con la edad,
hasta el 50% de adultos jóvenes y el 75% en
ancianos, por lo que se deduce que la mayoría de
las infecciones son asintomáticas o cursan con
clínica leve. En los casos sintomáticos, la infección
producida por C. pneumoniae se puede diferenciar
en aguda o crónica. La infección aguda esta
relacionada con otitis, sinusitis, resfriado común,
bronquitis o neumonía, mientras que la infección
persistente o crónica, que podría estar asociada con
las formas aberrantes de Chlamydia generadas
durante el ciclo biológico (ver apartado 4.1), está
relacionada con procesos no infecciosos como asma,
artritis, aterosclerosis, esclerosis múltiple o incluso el
Alzheimer, si bien, esta asociación es aún
controvertida y se necesitan estudios que la
demuestren definitivamente (ver apartado 5.2.2).
3.3. Chlamydia psittaci
C. psittaci ha sido aislada en cerca de 500 especies
de aves pertenecientes a más de 30 géneros, donde
causa infecciones latentes o clínicamente poco
relevantes. Sin embargo, en situaciones de estrés
para el animal, pueden convertirse en infecciones
severas afectando fundamentalmente al tracto
intestinal y respiratorio. La transmisión a humanos
está estrechamente relacionada con el contacto
(esporádico o permanente) con pájaros de compañía
como loros, o aves domésticas presentes en
zoológicos o granjas, por lo que no debe ser
considerada solamente una zoonosis profesional. La
vía de transmisión a humanos es por polvo de heces
u orina desecadas o por secreciones del animal
infectado. La transmisión humano-humano es
posible, pero se clasifica como rara. La psitacosis
humana suele afectar más a varones jóvenes
aunque este dato podría estar sesgado por razones
ocupacionales de exposición. Antes de la
introducción de los antibióticos la mortalidad en
humanos por psitacosis era 10-20%, pero descendió
al 1% desde la introducción de los antibióticos.
Desde principios del siglo XX se han sucedido
brotes pandémicos, y han estado asociados en
numerosas ocasiones a la importación de aves
psitácidas desde Sudamérica a Europa o a América
del Norte. Las medidas de aislamiento de aves
importadas y el tratamiento con tetraciclinas redujo
drásticamente los casos de psitacosis humana (∼50
casos/año). Sin embargo en los últimos años, se han
descrito, en varios países europeos, numerosos
casos de infecciones humanas asociadas a brotes
de clamidiosis aviar, especialmente en explotaciones
de pavos y patos.
4. CARACTERISTICAS BIOLÓGICAS DE LA
FAMILIA Chlamydiaceae
4.1. CICLO BIOLÓGICO
Las clamidias tienen un ciclo biológico bifásico único:
el cuerpo elemental (CE), que es la forma infecciosa
y el cuerpo reticular (CR), que es la forma replicativa
y metabólicamente activa (figura 1).
El ciclo biológico se divide en tres fases:
1) Penetración de la forma infecciosa o cuerpo
elemental (CE) en la célula hospedadora.
2) Multiplicación del CR mediante fisión binaria y
conversión en CE.
3) Liberación de los CE de la célula hospedadora.
4
PERSISTENCIA
CICLO REPRODUCTIVO
4 h.
CE
CR
10 h.
Formas
aberrantes
+IFN-γ
20 h.
-IFN-γ
CE: Cuerpo Elemental
CR: Cuerpo Reticular
48-72 h.
Figura 1. Ciclo de desarrollo biológico de Chlamydia.
1) Penetración de la forma infecciosa o cuerpo
elemental. El CE esta perfectamente adaptado al
medio extracelular ya que su membrana externa
contiene una gran cantidad de proteínas muy ricas
en aminoácidos azufrados, como cisteína. La
proteína más abundante es MOMP (del término
inglés major outer membrane protein), codificada por
el gen ompA, aunque también se encuentran otras
dos proteínas de membrana externa (Omp2 y
Omp3), que forman numerosos puentes disulfuro y
son las responsables de la rigidez y escasa
permeabilidad de CE. Sin embargo el CE es incapaz
de replicarse por división, requiriendo la penetración
al interior de la célula eucariota para continuar su
ciclo biológico. La adhesión de las bacterias a la
célula hospedadora es necesaria como un paso
previo a la fagocitosis. Estas bacterias son
fagocitadas, con más facilidad que otras bacterias
como Escherichia coli, sugiriendo un proceso
específico. No se conocen bien los receptores
específicos de la célula huésped ni de la bacteria
implicados en este proceso, pero se sugiere que los
distintos serovares pueden emplear diferentes y
quizás multiples estrategias de adhesión (MOMP,
PMPs, TarP…). C. trachomatis patotipos LGV y C.
psittaci tienen más afinidad por macrófagos, mientras
que C. pneumoniae y los patotipos de tracoma de C.
trachomatis tienen más afinidad hacia células
epiteliales de mucosas.
2) Multiplicación del CR mediante fisión binaria. Una
vez en el interior del fagosoma, comienza un proceso
de reorganización o diferenciación del CE a CR. Los
primeros cambios tras la formación del fagosoma,
son el inicio de la síntesis proteica y la
transformación de la MOMP de su forma trimérica a
monomérica, con lo que aparecen poros de un
tamaño adecuado para el paso de ATP y nutrientes.
Tras estos sucesos iniciales, a las 12 horas postinfección, todas las bacterias intracelulares están en
forma de CR. Los CR se dividen por fisión binaria sin
una aparente septación. Durante esta etapa se
produce un crecimiento exponencial dentro del
fagosoma hasta 100-1000 bacterias (figura 1), con
un tiempo de duplicación de 2-3 h que dura ∼12 a 20
horas (aunque algunos patotipos como los
implicados en el LGV tienen una velocidad de
crecimiento mayor). A la conclusión de este ciclo de
crecimiento, comienza una nueva reorganización de
los CR a CE para formar una inclusión madura. La
reorganización no es un proceso sincrónico, es decir
que coexisten CR en reproducción junto a CE
maduros.
3) Liberación de los CE de la célula hospedadora. El
mecanismo de liberación no se conoce aún con
exactitud. Generalmente los CE son detectados en el
medio extracelular tras la lisis de la célula
hospedadora, lisis que se produce como
consecuencia de la liberación tardía de enzimas
lisosomales así como por la acción de una proteasa
de origen clamidial. Además, en estudios
ultraestructurales sobre cultivos celulares infectados
con C. trachomatis, se ha descrito un mecanismo de
liberación del microorganismo semejante a la
exocitosis, lo que también ocurre in vivo en
infecciones intestinales por C. pecorum. El proceso
global del ciclo de desarrollo biológico es de 48-72h
Parece ser que, al menos en condiciones in vitro,
factores como el IFN-γ, ciertos antibióticos como los
β-lactámicos (pese a ser bacterias gramnegativas
carentes de peptidoglicano) y factores nutricionales
esenciales como el triptófano inducen la aparición de
unos cuerpos reticulares anormales, también
5
denominados formas aberrantes (FA) en los que la
actividad metabólica disminuye y el organismo suele
ser resistente al tratamiento antibiótico (figura 1). El
efecto de estos factores inductores de las FA es
reversible, ya que cuando son aclarados del medio,
las FA pasan a CE normales. Las FA permanecen en
el interior de la célula como agente infeccioso latente
o persistente y se ha asociado la presencia de FA
con procesos crónicos infecciosos y no infecciosos.
4.2. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA Y FACTORES DE
VIRULENCIA
Para estudiar los antígenos presentes en las
bacterias de la familia Chlamydiaceae, se describen
previamente aquellos comunes a las especies
patógenas humanas más importantes.
4.2.1. Lipopolisacárido. El lipopolisacárido (LPS) es
un antígeno termoestable común a todos los
miembros de la familia Chlamydiaceae, que fue
puesto en evidencia por primera vez en 1936 por
Bedson mediante la prueba de fijación del
complemento con suspensiones no purificadas de
estas bacterias. Pero la demostración de la relación
del LPS como factor de virulencia en especies de
Chlamydia ha sido establecida recientemente,
cuando en 2011 Nguyen y cols. constataron que en
ausencia de LPS, las clamidias no son capaces de
realizar la transición de CR a CE, que es la forma
infectiva.
El LPS clamidial presenta reacción cruzada en las
pruebas serológicas, no sólo entre los distintos
miembros de la familia Chlamydiaceae, también con
algunos de los LPS de los mutantes rugosos de las
enterobacterias (aquellos mutantes a los que les falta
la parte correspondiente al antígeno O y tienen
incompleto el núcleo oligosacarídico), en concreto
con cepas de Salmonella typhimurium y Salmonella
minnesota así como con cepas de E. coli.
4.2.2. Proteínas de membrana externa
4.2.2.1. MOMP: principal proteína de membrana
externa. La MOMP representa el 60% del peso seco
de la membrana de Chlamydia spp. y es, sin duda, el
antígeno dominante, al menos en C. trachomatis y C.
psittaci ya que en estas especies la proteína está
expuesta en la superficie de la membrana y por tanto
es muy inmunogénica. Por el contrario en C.
pneumoniae, la MOMP no está expuesta en la
superficie de la membrana, por lo que no parece ser
un antígeno inmunodominante, como demuestra la
obtención de secuencias genéticas casi idénticas de
aislados de diferentes áreas geográficas. La baja
capacidad inmunógena de la MOMP en C.
pneumoniae parece ser debida a la existencia de
una proteína de 54 kDa, específica de esta especie
que presenta una localización más externa que
MOMP.
La estructura trimérica de la MOMP actúa como
adhesina, facilitando las interacciones no específicas
y la penetración de los CEs al interior de la célula
eucariota. Por otra parte, la estructura monomérica
actúa como porina en los CRs facilitando la
permeabilidad de nutrientes y de ATP. La topología
proteica de la MOMP es bien conocida en las
diferentes serovariedades de C. trachomatis, C.
pneumoniae, C. abortus y C. psittaci. Consta de 5
dominios transmembranarios conservados (CDI-V) y
4 dominios variables (VDI-IV) que están expuestos
en la superficie externa. Diversos autores han
estudiado la importancia de los VDs de la MOMP,
llegando a la conclusión de que los dominios VDI,
VDII y VDIV son donde se localizan los epítopos
reconocidos por los linfocitos B. La variabilidad de
los epítopos localizados en esta proteína parece
responder a la presión inmunológica a la que se ve
sometida la bacteria. Hay una remarcarda evidencia
de que las mutaciones en MOMP están relacionadas
con las estrategias de evasión del sistema inmune:
acumula más cambios aminoacídicos que cualquier
otra proteína, estos cambios se producen 4,3 veces
más frecuentemente en los dominios variables que
interaccionan con los linfocitos B. La clasificación de
las 18 serovariedades de C. trachomatis, se basa en
las diferentes respuestas serológicas de los dominios
variables de la MOMP, aunque no existe relación
entre serovar y patotipo.
4.2.2.2. PMPs: proteínas polimórficas de membrana.
Las PMPs son una familia única de proteínas de
membrana, con un alto grado de diversidad entre
ellas (>50%), que tienen un papel importante en la
biología y patogénesis de todas las clamidias,
aunque su número varía en las diferentes especies.
C. pneumoniae y C. psittaci tienen 21 de estas
proteínas, mientras que C. trachomatis tan solo 9,
llegando a representar entre 3,5-5% de la capacidad
codificante del genoma. Su síntesis se lleva a cabo
en las últimas fases del ciclo de desarrollo y tienen la
función de autotransporte y adhesinas. Así, por
ejemplo, anticuerpos específicos frente a la PMP21
de C. pneumoniae bloquean la infectividad de la
bacteria en las células epiteliales.
En C. trachomatis, a diferencia de la MOMP, las
reconstrucciones filogenéticas de las PMPs, permiten
agrupar correctamente los patotipos de las diferentes
enfermedades descritas, indicando que estas
proteínas pueden estar modulando el tropismo
tisular. Este dato sugiere que estas proteínas juegan
un papel importante en la diversificación antigénica
para escapar del sistema inmune del huésped.
4.2.2.3. COMC: complejo proteico de membrana
externa rico en residuos de cisteína. El CE está
envuelto por un complejo proteico que gracias a los
residuos azufrados de los muchos aminoácidos
cisteína que contiene pueden formar un
conglomerado de interacciones inter e intraproteicos. Este complejo contribuye a la rigidez y
estabilidad osmótica del CE y participa en las
primeras fases del anclaje del CE a la célula
eucariota como otra adhesina. Recientemente se ha
podido definir que hasta 28 proteínas forman parte
de ese complejo, entre ellas PmpB, PmpC, PmpE,
PmpF, PmpG, PmpH, OprB o PorB. Pero las 2
proteínas más prevalentes de este complejo son
OmcA y OmcB. La proteína OmcB, (también
denominada Omp2 o EnvB) es la más abundante del
complejo y está en una proporción 1:5 respecto de
MOMP. Parece estar implicada en la transición de
6
CR a CE, por lo que esta proteína tiene un papel
más relevante en la virulencia. Es muy
inmunogénica, aunque no es específica de especie,
compartiendo
epítopos
con
otras
especies
bacterianas.
4.2.3. Proteínas del proceso celular: proteínas
Hsp. Se trata de proteínas con una estructura muy
conservada durante la evolución, presentes en todos
los organismos, desde las bacterias al hombre.
Tienen dos funciones principales: actúan como
chaperonas, y se inducen en respuesta al estrés. Las
proteínas Hsp se clasifican en diferentes familias de
acuerdo con su peso molecular, más que por su
función.
La Hsp60 ó “GroEL-like”, aparece durante las
infecciones crónicas persistentes y se ha descrito su
presencia en macrófagos presentes en lesiones
ateroscleróticas durante infecciones por C.
pneumoniae. Igualmente, esta proteína parece
asociarse a fenómenos de infertilidad tubárica,
enfermedad inflamatoria pélvica o gestación ectópica
en pacientes infectados crónicamente con C.
trachomatis, donde la exposición de manera
prolongada a la Hsp60 de C. trachomatis, parece
conducir a la existencia de fenómenos autoinmunes.
La Hsp70 ó “Dnak-like”, se localiza en el citoplasma y
en la membrana externa de los CE. Se le sugiere un
papel mediador en la adhesión de C. trachomatis a la
célula hospedadora, papel que no se ha verificado
en el resto de especies. Lo que sí se ha comprobado
es que inducen una respuesta inmune de tipo
humoral.
4.2.4. Sistema de secreción tipo III. El sistema de
secreción tipo III (TTSS) es un mecanismo clave de
la virulencia ya que facilita la interacción entre la
célula huésped y el patógeno bacteriano. Los TTSS
presentes en todas las especies de clamidias son
como una compleja jeringa molecular consistente en
>40 ORFs que libera proteínas efectoras
directamente al citosol o a la membrana de inclusión.
Muchas de estas proteínas efectoras están
relacionadas con la patogénesis de las clamidias:
como la TarP (del término inglés translocated actin
recruiting phosphoprotein) relacionada con la
invasión, o las proteínas Inc que parecen estar
localizadas en las membranas de las inclusiones
clamidiales. Existen 7 proteínas Inc bien
caracterizadas en C. trachomatis (IncA-G) y sólo tres
en C. pneumoniae y C. psittaci (IncA-C). En C.
trachomatis la expresión de IncD-G se produce 2 h
después de la infección y podría esta relacionada
con la transición desde CE a CR. En C. psittaci, IncB
podría tener un papel importante en impedir la fusión
del lisosoma una vez que el CE ha sido fagocitado. A
medida que se avanza en el estudio del genoma
clamidial, se están identificando otros candidatos de
proteínas Inc. Dentro de estas proteínas se
encuentra una denominada CrpA que parece activar
a los linfocitos CD8+ y conferir una protección parcial
en ratones infectados con C. trachomatis. Otra
posible proteína secretada a través del sistema
TTSS es la recientemente identificada CPAF (siglas
del término inglés “chlamydial protease-like activity
factor”). Se ha comprobado que las proteínas CPAF
son secretadas en el interior de la célula
hospedadora, donde puede degradar los factores
implicados en la transcripción del hospedador,
necesarios para la presentación de los antígenos por
parte de los complejos MCH-I y MCH-II, lo que
interfiere en la habilidad del hospedador a la hora de
responder frente a la infección clamidial.
4.2.5.
Otros
mecanismos
patogénicos.
C.pneumoniae comienza infectando las células
epiteliales de las vías respiratorias y los monocitos.
La capacidad de infectar los monocitos posibilita la
diseminación a localizaciones anatómicas alejadas
del aparato respiratorio.
Una vez dentro de la célula huésped C.
pneumoniae actúa sobre la apoptosis celular,
inhibiéndola o activándola en función de la fase del
ciclo en el que se encuentre. En estudios in vitro se
ha observado que la infección aguda por C.
pneumoniae induce la apoptosis en la célula
hospedadora facilitando la liberación de CEs,
mientras que la infección crónica produce cambios
que inhiben la apoptosis lo que sugiere que esta
modulación tenga un papel protector del
microorganismo durante la fase de persistencia.
La respuesta inmune celular ante los antígenos de
C. pneumoniae activan linfocitos T CD4 que
segregan citocinas implicadas en la inflamación,
activación de macrófagos y linfocitos B productores
de anticuerpos específicos. El IFN-γ inhibe la
replicación de C. pneumoniae induciendo la síntesis
de indolamina-2,3-dioxienasa (IDO), enzima que
degrada el triptófano, aminoácido esencial para el
desarrollo de la bacteria por lo que ésta queda
detenida en estado de latencia o persistencia. La
adición de triptófano al medio revierte esta situación
activándose de nuevo el crecimiento del
microorganismo.
5. MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LAS
INFECCIONES EN HUMANOS CAUSADAS POR
ESPECIES DEL ORDEN Chlamydiales
5.1. INFECCIONES EN HUMANOS POR Chamydia
trachomatis
Las infecciones por C. trachomatis se pueden dividir
en 3 categorías: tracoma, LGV e infección óculogenital, incluyendo la infección perinatal.
5.1.1. Tracoma. Clínicamente la enfermedad del
tracoma se produce por los serovares A, B/Ba y C de
C. trachomatis, y puede dividirse en 2 etapas: fase
aguda o tracoma activo y fase crónica. La fase
aguda es más frecuente en niños mientras que la
fase crónica es más común en adultos jóvenes.
La fase aguda, cuyo período de incubación oscila
entre 5-12 días, se caracteriza por una conjuntivitis
folicular de la conjuntiva tarsal (párpado superior),
acompañada de una descarga mucoide o
mínimamente acuosa. Esta etapa inicial puede
resolverse espontáneamente, aunque son frecuentes
las sobreinfecciones por Haemophilus influenzae,
adenovirus o Molluscum contagiosum. El cuadro
evoluciona hacia un incremento de la respuesta
inflamatoria que causa hinchazón y edema del
7
párpado. Este es muchas veces el primer signo de la
enfermedad. Si no se instaura tratamiento, la
enfermedad evoluciona hacia la fase crónica,
apareciendo cicatrices en la conjuntiva. Las
cicatrices pueden deformar el párpado, y las
pestañas entran en contacto con el globo ocular,
dando como resultado una abrasión (triquiasis). Este
daño crónico de la córnea genera pérdida de visión y
ceguera en último término. La OMS promueve la
lucha contra el tracoma bajo un enfoque
multidisciplinar que implica la cirugía, la distribución
masiva de antibióticos, el fomento de la higiene facial
y mejoras medioambientales. Estas intervenciones
se han asociado con reducciones significativas en la
prevalencia de la enfermedad activa en los últimos
20 años, pero sigue habiendo un gran número de
personas con triquiasis que están en riesgo de
desarrollar ceguera.
5.1.2. Linfogranuloma venéreo (LGV). El LGV es
una enfermedad de transmisión sexual causada por
los serovares L1, L2 (y sus genovariantes
recientemente descritas 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f y 2g) y
L3 de C. trachomatis, que causa una infección
sistémica (se puede recuperar de la sangre o del
LCR) que implica invasión de los nodos linfoides
(causando
linfadenitis).
Clínicamente
pueden
diferenciarse tres fases:
La primera etapa (3-30 días después de la práctica
de riesgo) se caracteriza por una lesión o lesiones
ulcerativas o herpetiformes en la mucosa genital o
piel adyacente. Esta lesión inicial puede ser también
intrauretral, cervical o rectal causando uretritis,
cervicitis o proctitis, respectivamente. Pero
generalmente esta etapa suele ser asintomática o
con muy pocos síntomas. La segunda etapa se
produce 2-4 semanas después y se caracteriza por
una linfadenopatía inguinal eritematosa y dolorosa
(bubones), generalmente unilateral. Los bubones
pueden romperse espontáneamente, drenando pus.
Las manifestaciones sistémicas durante esta etapa
son fiebre, dolor de cabeza, mialgias, etc. La tercera
etapa implica complicaciones severas como el
engrosamiento hipertrófico crónico con ulceración de
los genitales externos que puede llegar a elefantiasis
e infertilidad.
Debe tenerse en cuenta en el diagnóstico
diferencial de otras infecciones de transmisión sexual
como herpes simplex, sífilis, pero también de
linfomas y enfermedades inflamatorias intestinales,
como la enfermedad de Crohn.
5.1.3. Infección óculo-genital. Los serovares D-K
de C. trachomatis y ocasionalmente B y Ba producen
una amplia variedad de infecciones óculo-genitales.
Estas pueden diferenciarse en infecciones en el
hombre adulto: uretritis (y sus complicaciones como
epididimitis y artritis reactiva incluyendo el síndrome
de Reiter), proctitis y conjuntivitis, infecciones en la
mujer adulta: cervicitis (y sus complicaciones como
endometritis, salpingitis y peritonitis o perihepatitis),
proctitis, uretritis y conjuntivitis y en caso de mujeres
embarazadas responsable de partos prematuros, e
infecciones en el recién nacido en el que producen
conjuntivitis y neumonía.
5.1.3.1. Uretritis. C. trachomatis es la causa del 2055% de las uretritis no gonocócicas en el hombre, si
bien la mitad de los casos son asintomáticos. En
∼20% de los casos existe coinfección simultánea con
Neisseria gonorrhoeae. En estos casos, son
frecuentes
las
descripciones
de
uretritis
postgonocócicas; pero no son el resultado de una
sobreinfección
o
postinfección,
sino
un
enmascaramiento debido a que el período de
incubación de N. gonorrhoeae es más corto (4 días y
entre 7-14 días el de C. trachomatis) y por tanto la
sintomatología de uretritis gonocócica aparecerá
antes. Además, la tinción de Gram del exudado
uretral
revelaría
abundantes
leucocitos
polimorfonucleares
(PMN)
y
diplococos
gramnegativos como en el caso de una
monoinfección por N. gonorrhoeae (ya que la
infección por C. trachomatis se caracteriza por pocos
PMNs y ausencia de microorganismos). Finalmente
el tratamiento empírico de la uretritis gonocócica con
β-lactámicos, facilitará la eliminación de N.
gonorrhoeae, pero no eliminará C. trachomatis,
facilitando incluso la formación de las formas
aberrantes.
Cuando C. trachomatis se disemina desde la uretra
al epidídimo, causa epididimitis (en 1-3% de los
hombres infectados). Se caracteriza por un dolor
testicular y escrotal generalmente unilateral. En la
fase aguda se observa oligoespermia, pero no
parece que ocasione infertilidad. Como artritis
reactiva se conoce a la respuesta inflamatoria, de
origen inmune, a nivel de las articulaciones,
secundaria a una infección primaria de las mucosas.
La artritis aséptica ocurre en 1% de los casos de
uretritis no gonocócica, cursando en un 30% de
éstos con uretritis, conjuntivitis y lesiones cutáneas
(síndrome de Reiter). Los casos de artritis reactiva
debidos a una infección primaria por C. trachomatis,
clásicamente se han asociado a los serovares D-K,
sin embargo en los últimos años se han descrito
casos asociados a la infección por el genotipo L2b
relacionado con el patotipo de LGV. En estos
pacientes hay un elevado nivel de anticuerpos en
suero y líquido sinovial frente a Hsp60.
La uretritis también se puede producir en mujeres,
y se caracteriza por disuria, piuria y micción
frecuente, pero se puede confundir con una infección
urinaria.
5.1.3.2. Cervicitis. La cervicitis mucopurulenta
causada por C. trachomatis en mujeres es el
equivalente a la uretritis no gonocócica del hombre.
Aproximadamente 50-70% de las mujeres con
infección por C. trachomatis no presentan síntomas o
la sintomatología es muy leve, pero las
complicaciones son más serias que en el hombre,
probablemente porque C. trachomatis puede persistir
en estado asintomático por períodos prolongados en
el tracto genital femenino. De hecho, en el 45-50%
de mujeres con infección por C. trachomatis no
tratada, la infección persiste 1 año después de la
detección. Esta cronificación puede facilitar la
diseminación de C. trachomatis hacia el endometrio,
causando endometritis, hacia las trompas de Falopio
8
causando salpingitis o hacia el peritoneo causando
peritonitis. Por difusión a través del peritoneo puede
desarrollarse ascitis y perihepatitis (síndrome de FitzHugh-Curtis que está frecuentemente asociado a
infecciones por C. trachomatis). Esas infecciones del
tracto genital femenino se denominan colectivamente
enfermedad inflamatoria pélvica y se produce entre
el 10-20% de los casos de cervicitis. Las
consecuencias a largo plazo de la enfermedad
inflamatoria pélvica son dolor pélvico crónico,
embarazos ectópicos, prematuridad, e infertilidad. Se
estima que dos tercios de todos los casos de
infertilidad debido a un factor tubárico y una tercera
parte de todos los casos de embarazo ectópico
pueden ser debidos a una infección por C.
trachomatis no diagnosticada. Esta es la razón de
recomendar el cribado sistemático a mujeres en
edad fértil. Sin embargo la persistencia y por tanto la
mayor probabilidad de desarrollar complicaciones
puede estar relacionada también con el tipo de
serovar. Así, se ha documentado que los serovares
B, D, E H, I, J y K son 2 veces más propensos a la
persistencia que los serovares F y G, revelando la
importancia del subtipado de los serovares de C.
trachomatis en las infecciones genitales en mujeres.
5.1.3.3. Infección perinatal. La infección perinatal
inicialmente afecta a las membranas mucosas de los
ojos,
provocando
conjuntivitis,
denominada
conjuntivitis de inclusión, que se desarrolla 5-12 días
después del nacimiento, tras exposición a C.
trachomatis presente en el cuello del útero de la
madre infectada (20-45% de los casos).
Clínicamente se observa una inflamación de la
conjuntiva con un exudado claro o mucopurulento,
pero se resuelve espontáneamente transcurridos 312 meses, aunque la infección subclínica pueda
permanecer durante años.
La neumonía aparece en el 10-20% de los casos,
probablemente
por
diseminación
desde
la
nasofaringe ya que el 70% de los niños infectados
tienen cultivos positivos de esta localización. La
radiografía de tórax refleja un infiltrado intersticial
bilateral, hipoxemia y es característica la aparición de
eosinofilia y aumento de los títulos de IgM. En recién
nacidos con poco tiempo de vida la infección puede
ser más severa y relacionarse con la aparición de
apneas. En un estudio, con seguimiento durante 8
años, de niños que habían sufrido infección
respiratoria por C. trachomatis en los primeros 6
meses de vida, se demostró un mayor desarrollo de
asma y trastornos obstructivos de las vías
respiratorias.
5.2. INFECCIONES EN HUMANOS POR Chamydia
pneumoniae
Se pueden distinguir dos grandes grupos de
patologías producidas por C. pneumoniae: las
infecciones agudas que afectan al tracto respiratorio,
en las que está bien establecida la implicación de
esta bacteria y las infecciones persistentes que se
han asociado a procesos crónicos en los que su
papel es mucho más controvertido.
5.2.1. Infecciones agudas del tracto respiratorio.
C. pneumoniae es un patógeno que afecta a las vías
respiratorias bajas (neumonía) y altas (sinusitis,
faringitis y laringitis). La mayoría de las infecciones
por este microorganismo son asintomáticas, aunque
puede causar enfermedad grave sobre todo en
ancianos,
pacientes
con
enfermedades
cardiovasculares o inmunodeprimidos, aunque
también se han descrito casos graves en pacientes
inmunocompetentes
sin
factores
de
riesgo
conocidos.
C. pneumoniae se considera responsable del 3-8%
de las faringitis en el contexto de un síndrome gripal
con frecuencia acompañada de algún otro patógeno
respiratorio. La bronquitis es otra de las
manifestaciones clínicas de la infección por C.
pneumoniae, causando hasta el 5% de los casos. La
tos, ronquera y dolor de garganta suelen estar
presentes en estos cuadros respiratorios, con
presencia o no de fiebre. El período de incubación es
prolongado, de unas 3 semanas. El comienzo de los
síntomas suele ser gradual, la tos puede aparecer
días o semanas después y tardar en desaparecer
incluso meses. Otras presentaciones clínicas de vías
altas como laringitis, otitis o sinusitis, son menos
frecuentes y el papel de C. pneumoniae en estos
procesos es más discutible.
El cuadro clínico más característico es la
neumonía, estimándose que es responsable del 520% de las neumonías adquiridas en la comunidad.
Inicialmente se describió como neumonía atípica, de
menor gravedad y sintomatología más leve, similar a
la producida por Mycoplasma pneumoniae, aunque
estudios posteriores han demostrado que es
clínicamente indistinguible de la producida por otros
microorganismos. Es frecuente su detección
simultánea junto con otros patógenos respiratorios
especialmente Streptococcus pneumoniae.
5.2.2. Implicaciones de C. pneumoniae en
patologías crónicas. Se ha relacionado a C.
pneumoniae
con
enfermedades
respiratorias
crónicas,
como
asma,
o
exhacerbaciones
respiratorias en pacientes con fibrosis quística o
cáncer de pulmón, pero también en enfermedades
cardiovasculares como aterosclerosis y otras
enfermedades crónicas como espondiloartritis,
esclerosis múltiple o enfermedad de Alzheimer.
La controversia existente en torno a la implicación
o no de C. pneumoniae en el desarrollo de
patologías crónicas, en principio no infecciosas, se
debe en gran parte a la ausencia de métodos
estandarizados que permitan diagnosticar de una
forma fiable la infección por C. pneumoniae en sus
diferentes etapas. Este hecho ocasiona que los
distintos
estudios
obtengan
resultados
contradictorios y poco reproducibles, y no puedan
compararse entre sí, ya que dependen en gran
medida de las técnicas elegidas, su interpretación y
la población analizada.
5.2.2.1. Asma y enfermedad pulmonar obstructiva
crónica. C. pneumoniae se ha asociado con
exacerbaciones de enfermedades inflamatorias
crónicas pulmonares tales como asma y la
9
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
La primera asociación entre asma e infección por
C.pneumoniae fue en 1991, por Hahn y cols. Hay
evidencias de la relación entre asma e infección por
C. pneumoniae tales como: títulos elevados de
anticuerpos frente a C. pneumoniae en asmáticos,
tasas de infección entre 4,5-25% veces superiores
en episodios de asma o mayor afectación y gravedad
de los síntomas en pacientes infectados frente a los
que no lo están. El factor de virluencia previamente
descrito Hsp60 y el factor de transcripción kappa-B
pueden contribuir en estos procesos al provocar
hiperreactividad e inflamación en las vías
respiratorias. La inflamación provocada por la
infección crónica en el caso de la infección por C.
pneumoniae en pacientes con EPOC conlleva un
mayor daño de las células epiteliales bronquiales y
alteración de la función ciliar, situación que facilita la
colonización o infección por otros microorganismos.
Este círculo vicioso acelera la progresión de la
enfermedad de base.
5.2.2.2. Aterosclerosis. Una de las asociaciones más
estudiadas es la que relaciona a C. pneumoniae con
la aterosclerosis y sus manifestaciones clínicas,
infarto, enfermedad coronaria y enfermedad vascular
periférica. Son numerosos los estudios que apoyan
esta asociación basados en el mayor riesgo de
padecer
enfermedades
cardiovasculares
en
individuos con anticuerpos anti-C. pneumoniae
respecto a individuos seronegativos, o el aislamiento
del microorganismo en cultivo celular a partir de
placas de ateroma, o la detección de antígenos
(inmunohistoquímica) o ácidos nucleicos (TAAN) en
lesiones arterioscleróticas.
Es cierto que C. pneumoniae puede infectar y
replicarse en el interior de macrófagos y monocitos, y
propagarse de esa manera desde el tracto
respiratorio a otras localizaciones anatómicas.
También es capaz de infectar células del endotelio
vascular y músculo liso, inducir la producción de
citoquinas y otros procesos implicados en la
aterogénesis. Sin embargo, con las evidencias de las
que se dispone actualmente no se puede afirmar que
C. pneumoniae es causa suficiente, ni tampoco
imprescindible para producir aterosclerosis, aunque
puede ser un factor de riesgo importante que
contribuya al desarrollo de esta patología.
5.2.2.3. Esclerosis múltiple. La asociación entre C.
pneumoniae y la esclerosis múltiple se apoyó
inicialmente en estudios que encontraron ácidos
nucleicos de C. pneumoniae en el 80% de LCR de
pacientes con esclerosis múltiple frente a un 20% en
pacientes con otra enfermedad neurológica. Estos
hallazgos no pudieron confirmarse por otros
investigadores. Estas discrepancias en los resultados
se deben en gran parte a la heterogeneicidad en las
técnicas de PCRs utilizadas, algunas de ellas con
muy baja especificidad. Las técnicas moleculares no
detectaron evidencia de C. pneumoniae en LCR. En
un subgrupo de pacientes con una forma progresiva
de esclerosis múltiple se obtuvieron PCR positivas
para C. pneumoniae. Estos datos sugieren que C.
pneumonae podría no tener un papel central en la
patogénesis de la esclerosis múltiple, pero sí que la
infección crónica persistente en el cerebro podría ser
un cofactor en el desarrollo de la enfermedad. Por
tanto, son necesarios nuevos estudios prospectivos,
controlados, con un número suficiente de pacientes y
controles, que utilicen técnicas diagnósticas
estandarizadas o comparables.
5.2.2.4. Artritis reactiva. La artritis reactiva es una
inflamación no purulenta de una o varias
articulaciones, que ocurre como respuesta a una
infección aunque ésta se produzca en un órgano
distinto al afectado por la artritis, por similitud entre
antígenos
humanos,
o
por
depósitos
de
inmunocomplejos en la articulación. Algunos
microorganismos intracelulares como Yersinia spp.,
Campylobacter
spp.,
Salmonella
spp.o
C.
trachomatis pueden desencadenar esta misma
reacción inflamatoria. C. pneumoniae, aunque con
menor frecuencia que los anteriores, también puede
ocasionar estos cuadros. La infección previa por C.
pneumoniae puede ser asíntomatica, dificultando la
identificación del microorganismo desencadenante
de la artritis. Mediante técnicas de PCR se ha podido
demostrar en algunos casos la presencia de ADN de
C. pneumoniae y C. trachomatis en el líquido sinovial
y sangre periférica de pacientes afectados. Estos
hallazgos sugieren que en estos cuadros crónicos no
infecciosos, el tratamiento antibiótico adecuado
podría ser una medida eficaz para eliminar el
microorganismo, contribuyendo a un estado general
de mejoría.
5.3. INFECCIONES EN HUMANOS POR Chlamydia
psittaci
La psitacosis, también conocida como ornitosis, es
una infección con escasa incidencia en el hombre.
Anecdóticamente, desde 1988 hasta 2003, el CDC
registró sólo 935 casos de infección humana por
Chlamydia psittaci. En Europa los países que
tradicionalmente comunican un mayor número de
casos humanos son Gran Bretaña, Alemania y
Holanda. Los casos de psitacosis humana descritos
en nuestro país, tanto esporádicos como epidémicos,
son muy escasos y muy frecuentemente en personas
relacionadas con las aves. El contacto frecuente con
aves es, por tanto, un factor de riesgo fundamental
en la infección, aunque se han dado casos de
infección por contactos esporádicos.
Pese a estos datos, el impacto de las infecciones
por C. psittaci en la salud humana es difícil de
cuantificar y se considera que el diagnóstico está
subestimado ya que es una enfermedad de
declaración obligatoria en pocos países y su
sintomatología respiratoria se puede confundir con
otras infecciones más frecuentes como las
infecciones por Legionella pneumophila. Los
médicos no suelen incluir C. psittaci en el diagnóstico
diferencial, ni los laboratorios tienen instauradas
técnicas diagnósticas implementadas, necesarias
para la definición del caso. Además, la infección
humana por C. psittaci es dificil de diagnosticar pues
responde bien al tratamiento empírico de la
neumonía adquirida en la comunidad. Un ejemplo en
10
este sentido fue el brote que se produjo en 2008 en
Pays de la Loire (Francia) en relación a una feria de
aves, que pudo afectar hasta a 48 personas (pero
solamente hubo 2 casos confirmados y 2 posibles).
5.3.1. Infección respiratoria. La infección se
presenta generalmente como una neumonía atípica
con fiebre alta, cefalea y tos en pacientes con
historia de contacto con aves. La tos no productiva
se presenta el 80% de los casos. El período de
incubación medio oscila entre 5 y 14 días, aunque
puede prolongarse hasta más de un mes. Muy rara
vez se presenta con expectoración o incluso con
hemoptisis. Pueden evidenciarse alteraciones de la
auscultación
como
estertores
o,
menos
frecuentemente, roncus pero aunque los pacientes
refieren dolor torácico el derrame pleural es raro. La
radiografía revela un infiltado unilateral en el lóbulo
inferior, y las imágenes de alta resolución, muestran
infiltrados nodulares rodeados por un halo de
apariencia de “vidrio deslustrado”. La cefalea es
frecuente e intensa y puede estar acompañada de
fotofobia. Hasta un 25% de los pacientes pueden
presentar además dolor abdominal, diarreas y
cuadros de desorientación. Se describe con cierta
frecuencia un rash maculopapular (manchas de
Horder) que recuerda ligeramente a las manchas
que se evidencian en la fiebre tifoidea. Se han
descrito casos de insuficiencia respiratoria severa
con consecuencias fatales. Los pacientes con
afectación
respiratoria
grave,
generalmente
manifiestan complicaciones neurológicas, renales o
gastrointestinales. Aunque la infección por C. psittaci
en el hombre es generalmente leve o asintomática,
se
han
descrito
también
complicaciones
hematológicas severas con coagulación intravascular
diseminada.
El diagnóstico diferencial de la psitacosis debe
establecerse con otras entidades que cursan con
neumonía atípica, principalmente la infección
bacteriana por Legionella, Mycoplasma pneumoniae,
Coxiella burnetii, Chlamydia pneumoniae o por
etiologías víricas como el virus influenza.
5.3.2. Infección extrarrespiratoria. Se puede
afectar cualquier orgáno, pero siempre con
posterioridad a la infección primaria respiratoria y
como complicación de ésta. Los casos de
endocarditis asociados a C. psittaci son muy
escasos. Esta etiología debe considerarse en
cualquier caso de endocarditis con hemocultivo
negativo. Los pacientes afectados suelen requerir
cirugía, que cuenta con una elevada tasa de
mortalidad (hasta del 50%). Si se dispone de tejido
valvular, debe intentarse el diagnóstico etiológico con
sistemas
de
detección
molecular
o
inmunofluorescencia. La miocarditis es también una
complicación muy rara. Se ha publicado un caso de
miocarditis con diagnóstico serológico de infección
por C. psittaci, con dilatación del ventrículo izquierdo
y gran compromiso de la función ventricular.
Se han descrito casos de meningitis, encefalitis e
incluso cerebelitis. En un paciente con enfermedad
neurológica severa se detectó la presencia de ADN
de C. psittaci mediante PCR en LCR. Se han descrito
casos de uveítis y parálisis del 4º, 6º, 7º y 12º par
craneal en asociación con meningoencefalitis,
diplopía persistente durante meses, sordera
transitoria neurosensorial o incluso mielitis transversa
relacionada con psitacosis. Adicionalmente, parece
que podría aparecer síndrome de Guillain-Barré
como consecuencia de una infección aguda por C.
psittaci. Se ha descrito con cierta frecuencia la
afectación renal leve, con proteinuria y oliguria.
Los casos de hepatitis asociadas a C. psittaci son
muy raros y no ha podido establecerse una clara
relación causa-efecto. Se ha publicado un caso de
afectación
hepatoesplénica
con
colestasis,
acompañada de ligera pericarditis y fiebre de 1 mes
de evolución en un varón de 18 años hospitalizado.
La ecografía reveló múltiples formaciones nodulares
en hígado y bazo y la biopsia hepática evidenció
lesiones granulomatosas con focos de hiperplasia de
las células de Kuppfer rodeadas de tejido sano. El
paciente fue diagnosticado de infección por C.
psittaci por seroconversión, utilizándose una técnica
de fijación de complemento. El paciente evolucionó
favorablemente tras el inicio de tratamiento con
tetraciclinas, la fiebre desapareció, la función
hepática se normalizó y las imágenes hepáticas
mejoraron considerablemente.
Entre las raras complicaciones del sistema
musculoesquelético cabe destacar artritis, poliartritis
simétrica o artritis reactiva (síndrome de Reiter) e
incluso la rabdomiolisis. La crioglobulinemia es
relativamente frecuente en las complicaciones
hematológicas, por contrario la anemia y la
hiperbilirrubinemia son muy raras.
5.4. POTENCIAL PATÓGENO DE LAS NUEVAS
Chlamydiae
Históricamente el término “clamidia-like” ha servido
para definir organismos intracelulares que al igual
que Chlamydiaceae tienen un ciclo biológico en 2
etapas. Pero el término “clamidia-like” es solamente
descriptivo. La secuenciación genómica de esos
microorganismos aislados de procesos patológicos
en humanos ha permitido identificar nuevas familias
evolutivamente muy relacionadas con la familia
Chlamydiaceae
en
algunas
patologías.
Probablemente las dos especies mejor descritas
actualmente son Parachlamydia acanthamoebae
(familia Parachlamydiaceae) y Simkania negavensis
(familia Simkaniaceae).
Hay varias líneas de evidencia que relacionan P.
acanthamoebae con infección respiratoria humana,
si bien en los casos descritos hasta la fecha son
pacientes con algún grado de inmunosupresión
(pacientes trasplantados, infectados por el VIH,
politraumatizados en unidades de cuidados
intensivos), sugiriendo que se trata de un patógeno
oportunista. Se ha relacionado a P. acanthamoebae
con bronquitis, neumonía adquirida en la comunidad
y neumonía por aspiración (hasta en 13% de los
pacientes de larga duranción en unidades de
cuidados intensivos). Existen también publicaciones
que implican a P. acanthamoebae en cuadros de
queratitis y arteriosclerosis.
11
Simkania negevensis se ha asociado a cuadros de
bronquiolitis en niños, a infecciones del tracto
respiratorio inferior en adultos y en biopsias
arteriales, se ha relacionado con cuadros de
aterosclerosis.
6. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS
INFECCIONES CAUSADAS POR ESPECIES DEL
ORDEN Chlamydiales
Muchos estudios han demostrado una correlación
pobre entre los resultados obtenidos por cultivo, por
serología y por PCR, mientras que en otros casos la
correlación
es
buena.
Estos
resultados
aparentemente contradictorios sólo estan indicando
la necesidad de definir con precisión la fase de la
infección o el tiempo en el que se obtiene la muestra,
para saber qué técnica de referencia debe ser
comparada en cada caso o que técnica ofrece el
diagnóstico más preciso. En la figura 2 se representa
la dinámica de aparición de los anticuerpos y
marcadores moleculares específicos.
Figura 2.- Dinámica de la aparición de títulos de anticuerpos y marcadores moleculares para ser detectado por
serología o técnicas de PCR (Adaptado de Hvidsten, Clin Microbiol Infec 2009; 15: 42-49).
6.1. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES
CAUSADAS POR Chlamydia trachomatis
Hasta principios de los años 80, el principal método
de diagnóstico de infección por clamidias fue el
cultivo celular, pero paulatinamente fueron
reemplazados por otras técnicas mas sencillas,
rápidas y que permitieran un flujo de trabajo mayor.
En esa época aparecieron los primeros ensayos de
inmunofluorescencia
usando
anticuerpos
monoclonales y las técnicas de enzimoinmunoensayo (EIA) que por su sencillez llegaron a
tener una gran aceptación. En los años 90 apareció
la técnica de hibridación de ácidos nucléicos. Pero el
gran desarrollo del diagnóstico de la infección por C.
trachomatis han sido las técnicas de amplificación de
ácidos nucleicos que permiten un flujo de trabajo
elevado con excelente sensibilidad y especificidad,
facilitando la instauración del cribado de la infección
por C. trachomatis en población sexualmente activa.
6.1.1. Amplificación de ácidos nucleicos (TAAN).
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
han supuesto el avance más importante para la
detección de las infecciones por clamidias desde el
desarrollo del cultivo celular. Son las técnicas de
última generación y dada su elevada sensibilidad y
especificidad han desplazado al resto de técnicas
convirtiéndose en el nuevo patrón de referencia para
el diagnóstico de las infecciones por C. trachomatis.
Aunque las primeras técnicas comerciales fueron
aprobadas en 1993, las técnicas actualmente
disponibles en el mercado empezaron a aprobarse
desde 2006 hasta nuestros días (tabla 1), basándose
en todos los casos, excepto en uno, en tecnología de
PCR en tiempo real (qPCR). Estas técnicas están
aprobadas para realizar la detección de C.
trachomatis en muestras oculares, cervicales,
uretrales, semen y muestras de orina. Algunas
publicaciones han ensayado la rentabilidad de estas
técnicas en otro tipo de muestras como faringe o
recto pero aún no han sido aprobadas por la FDA ni
por la CE.
12
Tabla 1.- Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos disponibles comercialmente.
Ensayo
Comercialización
(FDA/CE IVD)
Método
Diana
Roche
Amplicor CT
Cobas Amplicor
Cobas TaqMan
Cobas TaqMan v2.0
Cobas 4800
1993/1995
1998/2003
2006/2005
--/2008
2012/--
qPCR
qPCR
qPCR
qPCR
qPCR
Plásmido críptico
Plásmido críptico
Plásmido críptico
Plásmido críptico+OmpA
Plásmido críptico+OmpA
Abbott
RealTime CT/NG
--/2006
qPCR
2 dianas plásmido criptico
Qiagen
Artus plus RG PCR
--/2007
qPCR
Plásmido críptico+ompA
Becton-D
Probe Tec
--/2009
SDA
Plásmido críptico
Siemens
Versant kPCR
--/2010
qPCR
Plásmido críptico
BioRad
BioRad DX CT/NG/MG
--/2010
qPCR
Plásmido críptico
Cepheid
GeneXpert
--/2012
qPCR
Plásmido críptico
qPCR: PCR en tiempo real; SDA: amplificación por desplazamiento de hebra
Con el fin de aumentar la sensibilidad de la técnica,
estos tests se basan en la detección de genes
presentes en alto número de copias, como el
plásmido críptico X06707 (∼10 copias/ genoma)
presente tanto en los cuerpos elementales como en
los reticulados, o algunas técnicas caseras que se
basan en el 16S ADNr (2 copias/genoma). En 2006,
se detectó, en Suecia, una variante del serovar E
con una deleción de 377bp en la región del plásmido
utilizada como diana diagnóstica por los tests TAANs
disponibles en ese momento, que supuso un
infradiagnóstico en el número de casos (esta misma
deleción había sido detectada también en el
plásmido de C. pneumoniae). Como consecuencia
de esa pérdida de sensibilidad, los sistemas
disponibles
rápidamente
desarrollaron
una
modificación de la técnica que suponía la
incorporación de una segunda diana. Así los
sistemas Cobas TaqMan CT/NG v 2.0 de Roche y
Artus C. trachomatis plus RG PCR de Qiagen
detectan simultáneamente 2 dianas de C.
trachomatis, una en el plásmido críptico y otra en el
gen ompA que codifica para la proteína de
membrana externa MOMP, mientras que el sistema
Abbott RealTime CT/NG emplea 2 dianas en el
mismo plásmido críptico. Gracias a estas nuevas
plataformas se pudo concluir que en Suecia entre
10-65% de las nuevas infecciones fueron debidas a
esta nueva variante. Aunque esta nueva variante
apenas se ha descrito fuera de Suecia es
recomendable no usar técnicas que pudieran
fracasar en detectar esta variante. Las más recientes
técnicas comerciales aprobadas para el diagnóstico
de las infecciones por C. trachomatis, solamente
disponen de una única diana en el plásmido críptico
pero en otra región diferente de la deleción de 377
bp descrita. Aunque la sensibilidad global de todas
estas técnicas de TAAN oscila entre 300-350
copias/mL, el inconveniente de las plataformas que
solamente disponen de dianas en el plásmido
críptico es que existe ∼1% de cepas que carecen del
plásmido. Además en la nueva variante de Suecia
con la deleción descrita, el número de copias del
plásmido disminuye, disminuyendo también la
sensibilidad de aquellas plataformas que basan su
diagnóstico únicamente en dianas presentes en el
plásmido críptico.
Para reducir el efecto de los inhibidores, aumentar
aún mas la reproducibilidad y la capacidad de los
laboratorios de diagnóstico molecular, muchas de
estas plataformas están asociadas a sistemas de
extracción automática del material genético de las
muestras biológicas para las que están aprobados.
Así, Abbott RealTime, Versant kPCR de Siemens o
Cobas TaqMan de Roche disponen de sistemas de
extracción de alta capacidad. Probablemente el
mayor grado de automatización ha sido alcanzado
con el sistema Cobas 4800 de Roche, único sistema
de TAANs disponible en el mercado aprobado por
FDA.
Una limitación de todas estas técnicas diagnósticas
es la falta de discriminación entre los diferentes
biovares de C. trachomatis relacionados con
procesos patológicos diferentes que pueden
detectarse en muestras uretrales o cervicales.
Ninguna técnica puede discriminar entre los
serovares D-K y serovares L1-L3 relacionados con el
LGV. Así el diagnóstico diferencial tenía que estar
basado en datos clínicos y epidemiológicos. Es cierto
que hasta hace poco tiempo la identificación de
biovares relacionado con el LGV era muy infrecuente
en nuestro medio y se aceptaba como enfermedad
de los trópicos. Pero desde el año 2003, los casos
de LGV en Europa constituyen un problema
emergente de Salud Pública que requiere el diseño
de estrategias de diagnóstico diferencial. Esta falta
de tests diagnósticos se ha visto agravada con la
falta de conocimiento sobre si las TAANs eran
suficientemente
sensibles,
específicas
y
reproducibles para detectar C.trachomatis en
13
muestras rectales ya que los casos de LGV en
Europa están estrechamente relacionados a
población homosexual con prácticas de riesgo anal.
Aunque estas técnicas no están aun aprobadas por
la FDA, algunos grupos han realizado ensayos de
validación en muestras de recto con resultados de
sensibilidad y especificidad iguales o superiores al
cultivo. Actualmente se han publicado distintos tests
caseros, basados en la tecnología de qPCR, para la
diferenciación entre las serovariedades LGV y el
resto. Algunas de estas qPCR se basan en
diferencias nucleotídicas en las regiones variables
del gen ompA pero probablemente las técnicas más
robustas se basan en una deleción de 36 pb
presente en el gen pmpH característica de los
biovares L1-L3 causantes del LGV (ver PNT-DC-01
de este procedimiento).
6.1.2. Hibridación de ácidos nucleicos. Las
primeras versiones de esta tecnología fueron
aprobadas a finales de los años 80, como etapa
previa al desarrollo de las técnicas de amplificación
de ácidos nucléicos que llegaron a ser las técnicas
de referencia al ser mas sensibles. Son técnicas
basadas en técnicas de captura e hibridación de
ácidos nucleicos mediante el empleo de sondas
específicas. El sistema más ampliamente distribuido,
especialmente en EEUU, es Aptima CT o la versión
dual Aptima Combo 2 para detectar simultáneamente
C. trachomatis y N. gonorrhoeae, desarrollado por
Gen-Probe. Ambos han sido aprobados por la FDA
en 2005 y 2001 respectivamente, y también
disponen del marcado CE.
El sistema de Aptima, se basa en la tecnología
Pace2 que al igual que las estrategias de PCR en
tiempo real, usan como aproximación diagnóstica la
detección de las dianas que están en mayor número
de copias en la bacteria. Se trata de una tecnología
combinada,
basada
en
la
captación
(o
enriquecimiento) de las miles de copias del ARNr de
C. trachomatis (16S ARNr en el ensayo Aptima CT y
23S ARNr en Aptima Combo 2), amplificación
mediada por transcripción (TMA) y un ensayo de
hibridación (HPA). Sus ventajas son que es un
sistema
totalmente
automatizado
(fácil
estandarización), con una carga de trabajo superior a
otras plataformas, alta reproducibilidad al eliminar los
inhibidores en la fase de captación de la diana que
había supuesto una de las limitaciones de las
versiones de primera generación en muestras de
orina, y sensibilidad superior incluso a algunas
TAAN, como Probe Tec.
La técnica de hibridación de señal Digene Hybrid
Capture II (Qiagen), usa como diana de detección
fragmentos de ADN del plásmido críptico y OmpA. A
diferencia de Aptima, la diana es ADN y la sonda es
ARN. Su sensibilidad es comparable a las TAAN en
el caso de muestras cervicales, pero no está
adaptada para muestras de orina.
6.1.3. Detección de antígenos. En este punto, se
pueden distinguir dos grupos de técnicas, aquellas
basadas en la tinción directa de las muestras con
anticuerpos
monoclonales
marcados
con
fluoresceína (DFA) y los enzimoinmunoensayos
(EIA). Las plataformas que emplean DFA se basan
en el uso de anticuerpos especie-específicos
dirigidos principalmente frente al antígeno MOMP
(Syva Microtrak, Trinity Biotech.) y en menor medida
frente al LPS (Pathfinder, Sanofi) porque es más
probable que se observen reacciones cruzadas con
miembros de la familia. Este inconveniente ha sido
reconducido para ser una ventaja, ya que en
muestras conjuntivales, para descartar una
conjuntivitis por C. trachomatis de otras clamidias,
una amplificación positiva para LPS y negativa para
MOMP permite sugerir infección por C. pneumoniae.
Las principales ventajas de las DFA son su rapidez
(30 min) y especificidad cercana al 100%, la
sensibilidad es del 85-90%, respecto al cultivo y no
requiere un medio de transporte específico. Entre
sus desventajas está que la interpretación de los
resultados es subjetiva y requiere personal
experimentado, baja reproducibilidad y el volumen de
muestras no puede ser elevado.
La tecnología EIA se basa en la detección del
antígeno por la detección de una señal colorimétrica
generada por la reacción del antígeno (generalmente
regiones epitopo-específicas del LPS) con el
anticuerpo. Tradicionalmente han gozado de gran
popularidad por ser técnicas sencillas, objetivables y
automatizadas por lo que han sido de elección en
laboratorios con pocos recursos que no podían
implementar las técnicas moleculares pero con un
elevado número de muestras. La especificidad de
EIA es baja pudiendo darse falsos positivos por la
presencia de otros LPS bacterianos, especialmente
si la carga bacteriana es elevada (ver apartado
4.2.1). Por este motivo no puede emplearse en
muestras rectales ni faríngeas, tampoco en
poblaciones de baja prevalencia. No presentan una
buena sensibilidad, por lo que cualquier resultado
positivo debería confirmarse por otra técnica, bien
DFA o EIA usando otro antígeno.
Basada en la tecnología EIA se desarrollaron
varios test rápidos o point of care (entre 40s-30 min),
para su implantación en regiones con recursos
limitados o en consultas de cribado. Sin embargo,
pese a su tentadora sencillez, no debe
recomendarse su uso. Han demostrado una
sensibilidad entre 40% y 25% en población con alta y
baja prevalencia respectivamente, por lo que multitud
de trabajos desaconsejan su uso para la detección
de infecciones urogenitales incluso en regiones con
recursos limitados.
6.1.4. Cultivo en línea celular. Hasta finales del
siglo XX, el cultivo celular de C. trachomatis ha sido
el estándar de referencia frente al cual se han
comparado todas las demás pruebas. Pero debido
principalmente a la aparición de nuevos métodos
diagnósticos más fáciles de implementar, rápidos y
sensibles, el cultivo celular ha quedado relegado a
laboratorios de referencia, con utilidad en estudios
epidemiológicos y/o forenses. Una descripción más
detallada puede encontrarse en el PNT-DC-03 de
este procedimiento. Las líneas celulares óptimas
para el crecimiento de C. trachomatis son HeLa 229
y
McCoy.
Otra
particulariad,
respecto
al
14
procedimiento descrito en el PNT-DC-03 es que los
biotipos del LGV tienen una velocidad de crecimiento
mayor que otras clamidias, por lo que no es
necesario en la mayoría de los casos la incubación a
35ºC durante 3 días.
Presenta ventajas inherentes, sólo se detectan las
bacterias vivas, lo que supone una ventaja con las
técnicas moleculares basadas en ADN, pero es
tambien un inconveniente, pues al ser una bacteria
muy lábil, las condiciones de transporte deben de ser
excelentes, garantizando que no se pierda la cadena
de frío. Es por este motivo que aunque es una
técnica muy específica, la sensibilidad puede no ser
muy buena (75-80%) y dar lugar a falsos negativos,
por lo que actualmente se desaconseja su uso con
fines diagnósticos. Para garantizar una mejor tasa de
recuperación de organismos vivos es indispensable
usar un medio de transporte adecuado. Otra ventaja
añadida del cultivo celular, es la posibilidad de
realizar estudios de resistencia a antimicrobianos.
Sin embargo, los métodos de cultivo presentan
grandes
inconvenientes,
son
difíciles
de
estandarizar, son técnicamente exigentes, requieren
varios días de incubación (3-7 días) y personal muy
entrenado.
6.1.5. Recogida, transporte y conservación de las
muestras. En cuanto a los tipos de muestras, se
podrían clasificar en invasivas o no invasivas. Entre
las primeras se encuentra el raspado o cepillado
uretral y endocervical, también se pueden incluir en
este grupo las muestras conjuntivales, nasofaríngeas
y del tracto respiratorio inferior. Solo las TAAN y
Gen-Probe, han demostrado la utilidad en muestras
no invasivas como la primera porción de la orina,
torundas vaginales o rectales.
Tabla 2.- Ventajas y desventajas de las técnicas de diagnóstico descritas para C. trachomatis y los tipos de
muestras adecuadas en cada caso.
Método
diagnóstico
Procesamiento
TAANs
2-4 h
EIA
4h
DFA
1h
Cultivo
Celular
48-72 h
Ventajas
- Elevada sensibilidad (90-95%)
- Permite su empleo con
muestras vaginales y de orina
- Validadas para su empleo con
muestras no genitales, incluidas
muestras rectales
- Económicas
- Utilidad como point of care
- Puede emplearse con
cualquier espécimen.
- Elevada especificidad
- Útil con cualquier tipo de
muestra
La principal ventaja de las muestras no invasivas, es
que pueden ser auto-recogidas por el propio
paciente, punto importante en los programas de
cribado. La carga bacteriana de estas muestras no
invasivas, es menor que en las invasivas pero dada
la elevada sensibilidad de las técnicas moleculares,
permiten un diagnóstico adecuado. En general, en el
caso de los hombres se prefiere la primera porción
de la orina, mientras que en las mujeres se ha
comprobado que las muestras vaginales tienen una
mayor carga bacteriana que la orina (tabla 2). En las
muestras invasivas, las torundas adecuadas para la
toma de muestras serán de Dacron con vástago de
aluminio o plástico. No se deben emplear torundas
de alginato cálcico o con el vástago de madera, pues
pueden inhibir tanto el crecimiento en cultivo celular
como las técnicas de amplificación de ácidos
nucléicos (TAAN).
Con la excepción de la técnica DFA, las
condiciones de transporte son críticas para
garantizar que la bacteria es preservada hasta llegar
Desventajas
- Técnicas costosas
- El % de falsos positivos se
debe evaluar
- No aprobadas para
extragenitales
- Baja sensibilidad (40-70%)
- Baja sensibilidad
- Técnicamente laboriosas y
requieren personal entrenado
- Baja sensibilidad (60-80%)
- Laborioso
- Capacitación técnica
- No es útil con gran número
de muestras
la laboratorio. Por eso es importante que las
unidades o consultas de infecciones de transmisión
sexual, dispongan de un medio de transporte
adecuado en el que inocular las muestras.
Habitualmente, los medios de transporte son tampón
fosfato rico en sacarosa con antibacterianos como
anfotericina B, gentamicina y estreptomicina (medio
de transporte Bartels Flextrans), o anfotericina,
vancomicina y colistina (UTM Copan) entre otros.
Una vez inoculada la muestra en el medio de
transporte, esta puede mantenerse refrigerada a 4ºC,
no más de 24 horas, especialmente si se va a
inocular en shell-vial. Para períodos de conservación
superiores, hay que mantener a -70ºC.
6.2. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES
CAUSADAS POR Chlamydia pneumoniae
En 2001, los Centers for Disease Control and
Prevention de Estados Unidos (CDC) y el Laboratory
Centre for Disease Control (LCDC) de Canadá
publicaron
unas
recomendaciones
para
el
15
diagnóstico de C. pneumoniae, con el fin de
estandarizar la metodología e interpretación de los
resultados en la investigación de esta bacteria de
forma que las conclusiones de los distintos estudios
pudieran ser comparadas. Pese a estas
recomendaciones sigue existiendo un alto grado de
heterogenicidad en los métodos serológicos y los
criterios empleados. Así un estudio multicéntrico
realizado en Alemania en 2006 empleando técnicas
de PCR y microinmunofluorescencia reveló que sólo
el 0,9% de los pacientes podrían tener una infección
aguda por C. pneumoniae. De los casos positivos
ninguno mostró IgG, IgM o IgA anti-C. pneumoniae
confirmando la baja correlación entre las pruebas
serológicas y las basadas en técnicas de
amplificación de ácidos nucléicos (TAAN). Esta
dificultad en establecer un diagnóstico de certeza
puede ser la causa de las discrepancias entre
diferentes estudios para definir el papel de C.
pneumoniae en la neumonía adquirida en la
comunidad (NAC), que oscila entre 0%-45%, aunque
también se deben contemplar otras explicaciones
como las diferencias geográficas o la posibilidad de
infecciones cíclicas en la población con épocas
epidémicas y no epidémicas.
La fase de la infección en la que se obtiene la
muestra va a determinar en gran parte el rendimiento
de la técnica diagnóstica elegida. Las TAAN tienen
mayor rendimiento en las fases tempranas de la
infección y las pruebas serológicas cuando la
infección se encuentra en fase avanzada. Las
técnicas serológicas son las más utilizadas en los
laboratorios clínicos, pero tienen limitaciones de
especificidad, reproducibilidad y correlación clínica.
El cultivo de este microorganismo en líneas celulares
tiene un rendimiento muy escaso, es muy lento y
laborioso, quedando su uso relegado a laboratorios
de investigación y centros de referencia. Las TAAN,
son más sensibles y específicas especialmente la
PCR en tiempo real, aunque aún requiere protocolos
de estandarización, pero probablemente será la
técnica de elección en el futuro.
6.2.1. Diagnóstico indirecto: serología. La elevada
seroprevalencia de IgG frente a C. pneumoniae en la
población adulta sana (sin síntomas respiratorios), de
hasta un 70%, dificulta la interpretación de los
resultados obtenidos en un único suero. La
necesidad de un segundo suero para realizar un
diagnóstico fiable, limitan la utilidad de la serología
en el manejo del paciente con infección aguda. Para
poder interpretar los resultados de la serología es
importante conocer la cinética de la respuesta
inmune. En fase aguda, la IgM se detecta entre las
2-3 semanas tras la aparición de los síntomas
(período de incubación prolongado ∼3semanas),
hasta 2-6 meses después, mientras que la IgG
puede tardar en alcanzar títulos elevados hasta 6-8
semanas tras el comienzo de la enfermedad. El
retraso en la respuesta serológica condiciona que en
la mayoría de los casos el diagnóstico de infección
respiratoria se haga de forma retrospectiva.
Diversos estudios in vitro han observado cambios
en el nivel de expresión de genes de C. pneumoniae
cuando se induce el estado de persistencia mediante
exposición a IFN-γ o privación de hierro. En el caso
de infección persistente la IgA parece ser un
potencial marcador de infección persistente o
crónica, ya que su vida media es de 5-7 días,
mientras que la de la IgG es de semanas o meses.
Es posible por tanto, que el perfil antigénico
expresado durante la infección persistente sea
distinto, por lo que encontrar un marcador más
sensible y específico de esta fase sería de gran
ayuda para establecer el papel que juega C.
pneumoniae en patologías inflamatorias crónicas u
otros procesos.
Tradicionalmente los ensayos serológicos más
comunmente usados incluyen la fijación del
complemento, la microinmunofluorescencia y el
inmunoenzimoensayo para detectar IgM, IgG e IgA.
La fijación del complemento no es una técnica útil
porque tiene baja sensibilidad y no permite
diferenciar entre las diferentes especies de
Chlamydia (ver PNT-DC-01 de este procedimiento).
6.2.1.1. Recogida, transporte y conservación de las
muestras. La muestra de elección para el diagnóstico
serológico de la infección por C. pneumoniae es el
suero. Para su obtención se recomienda realizar
venopunción guardando las medidas generales de
asepsia, utilizando jeringa estéril o dispositivo para
tubo primario con vacío (por ejemplo, VacutainerTM).
Es recomendable utilizar un tubo seco para obtener
suero por centrifugación después de formado el
coágulo. Tratará de evitarse la utilización de tubos
con anticoagulante (obteniéndose así plasma) con el
fin
de
evitar
posibles
interferencias.
Las
recomendaciones son las generales para cualquier
suero que se envíe al laboratorio para su estudio. La
sangre debe llegar al laboratorio en el mínimo tiempo
posible (máximo 2-3 horas), donde será centrifugada,
separada y conservada en refrigeración. Se puede
mantener el suero refrigerado a 4ºC hasta 72 horas.
Si el ensayo no se va a realizar antes de ese tiempo
congelar la muestra a -20ºC. Si la muestra se quiere
conservar largos periodos de tiempo, se recomienda
su congelación a -80ºC. Se deben tomar dos
muestras de suero, una de fase aguda al comienzo
de la sintomatología y otra de fase convaleciente 4-8
semanas después.
6.2.1.2.
Microinmunofluorescencia.
La
microinmunofluorescencia (MIF) es la técnica de
referencia para el diagnóstico de la infección por C.
pneumoniae, fue desarrollada por Wang y cols. en
2000 para detectar anticuerpos específicos (IgM, IgG
e IgA) frente a C. pneumoniae y a día de hoy sigue
siendo el método de referencia para el
serodiagnóstico de la infección aguda por C.
pneumoniae, conforme a las recomendaciones del
CDC.
Los antígenos presentes en la fase CE del ciclo
biológico de C. pneumoniae (fase infectiva) son los
recomendados. Estos antígenos son purificados y
fijados a un portaobjetos. El procedimiento es
dependiente de cada casa comercial pero
básicamente se puede resumir en que la muestra de
suero a estudiar se incuba en los pocillos con el
16
antígeno, de manera que si hay anticuerpos frente a
C. pneumoniae se unirán a los antígenos del
portaobjetos. Tras un lavado con un tampón fosfato
salino (PBS) se eliminan todos los anticuerpos que
no se han unido y a continuación se añaden
anticuerpos
anti-inmunoglobulina
humana
conjugados con isotiocianato de fluoresceína que
formarán un complejo con los anticuerpos que hayan
quedado fijados en los pocillos. Esta anti-
inmunoglobulina puede ser específica de clase IgA,
IgG o IgM. Al examinar las preparaciones al
microscopio de fluorescencia, los pocillos en los que
se observe el patrón típico de fluorescencia indicarán
presencia de anticuerpos específicos de C.
pneumoniae en la muestra.
A continuación se muestran algunos sistemas
comerciales para la detección de C. pneumoniae por
MIF (ver tabla 3).
Tabla 3.- Sistemas comerciales para la detección de C. pneumoniae mediante microinmunofluorescencia (MIF)
Nombre equipo
Anticuerpos
Antígenos
C.pneumoniae IFA IgG
IgM/G
C. pneumoniae (CE)
DxSelectTM CHLAMYDIA
IgA/M/G
C. pneumoniae (CE)
SeroFIATM C. pneumoniae
IgA/M/G
PNEUMOSLIDE IgG
IgG
PNEUMOBACT
IgM/G
C. pneumoniae IgG/IgM o
IgA MIFA
IgA/M/G
Chlamydia IgG SeroFIATM
IgG
C. pneumoniae (CE)
C. pneumoniae (CE),
L. pneumophila,
M. pneumoniae,
C. burnetii,
AD, VRS, INFA, INFB,
PIV1,2,3
C. pneumoniae (CE)
L. pneumophila,
M. pneumoniae,
C. burnetii
C. pneumoniae,
C. psittaci,
C. trachomatis (CE)
C. pneumoniae,
C. psittaci,
C. trachomatis (CE)
Los criterios usados para identificar una infección
aguda por C. pneumoniae son: IgM ≥1:16 o
incremento de 4 veces el título de IgG (necesidad de
sueros pareados obtenidos con 4-8 semanas de
diferencia), o IgG ≥1:512 y una infección pasada si
IgG ≥1:16.
A pesar de ser el método de referencia, la MIF tiene
algunas limitaciones:
a) Problemas de estandarización, condicionada por
el antígeno empleado. Los CEs que se utilizan
como antígeno se obtienen mediante cultivo celular,
por lo que los antígenos presentes en su superficie
pueden ser distintos de los que se expresan
durante la infección natural. Esto implica que un
resultado negativo con una prueba que tenga un
100% de sensibilidad analítica podría no detectar
anticuerpos frente a C. pneumoniae en el suero de
un paciente infectado.
b) Repetidamente se ha demostrado que la MIF es
insensible en la detección de C. pneumoniae o
tiene poca correlación con la PCR o cultivo,
especialmente en niños (respuesta inmune
incompleta), incluso después de tres meses de
seguimiento.
c) Se ha demostrado la presencia de títulos
elevados de anticuerpos IgM ≥ 1:16 e IgG ≥ 1:512
Fabricante
VIRCELL, S.L
(Granada, España)
FOCUS
DIAGNOSTICS (CA,
USA)
SAVYON (Israel)
VIRCELL, S.L
(Granada, España)
VIRCELL, S.L
(Granada, España)
ANI LABSYSTEMS
(Vantaa, Finlandia)
SAVYON (Israel)
en individuos sanos asintomáticos, con cultivos y/o
PCR de C. pneumoniae negativos. Las posibles
explicaciones a estos posibles falsos positivos son:
1) reacción cruzada con otras especies de
Chlamydia, Mycoplasma spp., Bartonella spp, o
Yersinia spp.; 2) la presencia de factor reumatoide;
3) títulos elevados de anticuerpos IgG >1:512 en
individuos sanos asintomáticos o pacientes con
EPOC
que
pueden
mantener
títulos
persistentemente elevados de IgG; 4) personal
poco entrenado para diferenciar un resultado
positivo de artefactos en la inmunofluorescencia.
d) La presencia de anticuerpos IgG en neonatos
debe ser interpretada con precaución por la posible
transferencia de anticuerpos maternos al feto. La
determinación de IgM es mejor indicador de
infección en niños menores de 6 meses.
e) Elevada tasa de variabilidad interlaboratorio. La
concordancia entre diferentes laboratorios para
cuantificar el título de IgA e IgG es tan baja como
55-38% respectivamente.
f) No es una técnica muy práctica si la carga de
trabajo es elevada.
6.2.1.3. Enzimoinmunoensayo (EIA). Los EIAs
suelen ser las técnicas elegidas para el diagnóstico
serológico de C. pneumoniae en los laboratorios
17
clínicos por ser fácilmente automatizables,
permitiendo un mayor número de muestras
procesadas, objetividad en la lectura de los
resultados y ser técnicamente más sencillos que la
MIF. En Europa se comercializan numerosos equipos
con marcado CE, aunque en Estados Unidos todavía
no hay ninguno aprobado por la FDA para
diagnóstico in vitro. La sensibilidad y especificidad de
estos EIAs depende en gran medida de los
antígenos utilizados, que pueden ser antígenos
purificados de proteínas de membrana o antígenos
recombinantes de CE. Los equipos que contienen
LPS recombinante son específicos de género,
detectando anticuerpos frente a Chlamydia spp., a
diferencia de los que usan MOMPs, que son
específicas de especie. Estudios comparativos entre
diferentes fabricantes sugiere que SeroCP mostró los
mejores valores de sensibilidad, seguido por Vircell
ELISA (tabla 4).
Existen EIAs cualitativos, en los que el resultado es
positivo o negativo en función de unos puntos de
corte, generalmente establecidos por el fabricante.
La cuantificación en estos equipos se puede realizar
mediante titulación del suero hasta punto final (última
dilución con la que se obtiene un resultado positivo).
También se comercializan EIAs cuantitativos en los
que la densidad óptica es proporcional a la cantidad
de anticuerpos presentes en la muestra. Con
estándares de calibración que contienen una
cantidad conocida de anticuerpos, se calcula la curva
de cuantificación, correspondiendo un valor de
densidad óptica a una determinada concentración de
anticuerpos en la muestra. Todos estos equipos
deben estar validados frente a la técnica de
referencia de microinmunofluorescencia. Estudios
comparativos entre varios equipos de EIAs
comerciales frente a la técnica de referencia MIF
ofrecen resultados muy diversos de sensibilidad y
especificidad. La correlación entre los resultados de
MIF y EIAs para la detección de IgG en infección
respiratoria por C. pneumoniae oscila entre
sensibilidad 58-96% y especificidad 95-100%. En
general la MIF mostró mejores resultados de
sensibilidad con títulos bajos de anticuerpos. En la
tabla 4 se muestran algunos sistemas de EIA
comercializados para la detección de anticuerpos
frente a C. pneumoniae.
6.2.1.4. Fijación del complemento. La fijación del
complemento (FC) es una técnica capaz de detectar
incrementos en el título de anticuerpos entre
muestras tomadas con una sola semana de
diferencia y la lectura de resultados es objetiva.
Detecta anticuerpos frente a un determinante
antigénico del LPS común a todas las especies de
clamidias, por lo que no es específica de C.
pneumoniae. Actualmente no se recomienda la FC
como técnica para el diagnóstico de infección por C.
pneumoniae por la posibilidad de reacciones
cruzadas con otras especies de clamidias y bacilos
gramnegativos y por su baja sensibilidad.
6.2.2. Diagnóstico directo: cultivo. Los miembros
del género Chlamydia son bacterias intracelulares
obligadas, por tanto sólo pueden crecer en cultivos
celulares. El cultivo en línea celular Hep-2 o HL ha
sido tradicionalmente considerado un método de
referencia para cultivar C. pneumoniae, sin embargo
debido a las limitaciones del cultivo (técnica muy
laboriosa y larga, bajo rendimiento, fácil inactivación
durante el transporte, crecimiento lento y éxito
diagnóstico variable) hace que el cultivo permanezca
restringido a laboratorios especializados. El cultivo
sigue siendo insustituible en estudios de validación
de nuevos métodos diagnósticos como PCR, para
demostrar la viabilidad del microorganismo, obtener
cepas
para
caracterización,
producción
de
antígenos, en pruebas de sensibilidad a antibióticos
o en ensayos clínicos de eficacia de tratamientos. C.
pneumoniae es más difícil de cultivar que C.
trachomatis.
C. pneumoniae es un patógeno respiratorio que
requiere para su manejo un nivel de bioseguridad 2
por lo que las muestras y cultivos deben trabajarse
en cabina de seguridad biológica II (CSB-II), con el
equipo de protección adecuado (guantes, bata, etc) y
según todas las preucaciones recomendadas para
este nivel de bioseguridad (ver Procedimientos en
Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 “Seguridad
en el laboratorio de microbiología clínica”). Hay
casos documentados de transmisión de C.
pneumoniae en laboratorios a través de aerosoles,
por lo que debe evitarse la formación de éstos,
prestando especial atención durante los procesos en
los que hay mayor riesgo de formación de aerosoles
como la centrifugación, sonicación o disgregación.
6.2.2.1. Recogida, transporte y conservación de las
muestras. Las muestras clínicas más habituales para
el aislamiento de C. pneumoniae son las
respiratorias, siendo las más apropiadas para el
cultivo el exudado nasofaríngeo u orofaríngeo, el
lavado broncoalveolar (LBA) y el líquido pleural. El
esputo, aunque puede utilizarse, no es la mejor
muestra para la recuperación de C. pneumoniae ya
que puede inhibir el crecimiento celular y ser tóxico
para la monocapa. En ocasiones se ha conseguido
recuperar de tejidos y sangre periférica, pero resulta
muy difícil por la poca cantidad de organismos
viables y el bajo rendimiento intrínseco de este
procedimiento.
Las muestras de exudados naso/orofaríngeos se
toman con escobillones estériles de Dacron y con
mango de aluminio o de plástico. Hay que evitar los
escobillones de alginato, algodón o con mango de
madera ya que pueden inhibir el crecimiento de C.
pneumoniae. Se deben introducir los escobillones en
tubos con medio de transporte para clamidias (ver
sección 6.1.5). La viabilidad de clamidias se
mantiene mejor en medios de transporte
tamponados, con un pH 7,4-7,6, que contengan
sacarosa y fosfato, como 2SP (2 sacarosa fosfato) o
SPG (sacarosa, fosfato, glutámico).
18
Tabla 4.- Relación de sistemas comerciales para el diagnóstico de Chlamydia pneumoniae basado en enzimoinmunoensayo (EIA)
Anticuerpos
Antígenos
Nombre equipo
Específicos especie C. pneumoniae
C. pneumoniae ELISA IgA/M/G
IgA/M/G
CMOP, sin LPS
C. pneumoniae IgA/M/G sELISA
HITAZYME Anti-Chlamydia
pneumoniae IgA/G/gM Antibodies
SERO CP IgA/M/G
RIDASCREEN® C. pneumoniae
IgA/M/G
ImmunoLISA® C. pneumoniae
Ig(A/M/G)
Chlamydia pneumoniae IgA/M/G
ELISA
Específicos género Chlamydia spp.
ImmunoComb® bivalent Chlamydia IgG
RIDASCREEN® Chlamydiae IgM/G)
Chlamydia IgA/ M/G rELISA
Chlamydia ELISA IgG/M
Multitest
PNEUMOBACT ELISA IgG o IgM
Cuantificación
Chlamydia pneumoniae IgA/M/G
ELISA plus
SERO CP QUANT IgA/M/G
IgA/M/G
MOMP
IgA/M/G
CMOP
IgA/M/G
Proteinas de CE
IgA/M/G
CMOP
IgA/M/G
CMOP
IgA/M/G
Proteinas de CE
IgG
IgM/G
LPS
IgM/G
LPS
recombinante
IgM/G
IgA/M/G
IgM/G
Fabricante
Vircell, S.L
Medac Diagnostika
(Hamburgo, Alemania)
Hitachi Chemical
(Tokyo, Japón)
Sayvon Diagnostics
R-biopharm
(Darmstadt, Alemania)
Orgenics
(Yavne, Israel)
IBL International
(Hamburgo, Alemamia)
Orgenics
R-biopharm
Medac Diagnostika
Vircell, S.L
IgM/G
C. pneumoniae
(CMOP),
L. pneumophila
M. pneumoniae
C. burnetii
Vircell, S.L
IgA/M/G
MOMP
Medac Diagnostika
IgA/M/G
CE
Savyon Diagnostics
Se puede añadir un 10% de suero fetal bovino
(SFB) para aumentar la estabilidad de clamidias.
Para evitar que la microbiota saprófita de las
muestras no estériles prolifere y contamine los
cultivos celulares se añaden al medio de transporte
antibióticos
(gentamicina,
vancomicina)
y
antifúngicos (anfotericina B o nistatina). Hay que
conservar el medio de transporte a 4ºC. Las
muestras de LBA, líquido pleural, esputo, biopsias o
tejidos se recogen en frascos estériles con tapón de
rosca, a los que se añade medio de transporte para
clamidias en una proporción de 2 partes de medio de
transporte por 1 de muestra (1:2).
Las muestras se mantienen y transportan
refrigeradas a 4ºC. Si la muestra biológica se
procesara dentro de las 24 horas siguientes a la
toma de muestra, hay que mantenerla a 4ºC ya que
C. pneumoniae pierde el 99% de infectividad si se
mantiene durante 1 día a temperatura ambiente,
frente al 30% que pierde a 4ºC. Por el contrario, si la
muestra biológica no se procesara dentro de las 24
horas siguientes, se debe mantener menos de 4 h a
4ºC y a continuación congelarla a -70ºC. Si se
congela la muestra directamente, la pérdida de
infectividad es del 61%. Una vez congelada, se
puede
conservar
durante
años,
evitando
congelaciones y descongelaciones sucesivas.
6.2.2.2. Selección de líneas celulares. Condiciones
para la optimización de los resultados del cultivo.
Como se ha comentado anteriormente, debido a la
complejidad técnica y eficiencia en la recuperación
de organismos viables, la instauración de esta
técnica en los laboratorios de diagnóstico clínico
tiene un interés escaso y muy limitado, quedando
reservada a laboratorios de referencia con fines de
sensibilidad antibiótica o producción de antígenos
entre otras aplicaciones. Las líneas celulares
humanas HL y Hep-2 son las que se utilizan para el
cultivo de C. pneumoniae por ser las que ofrecen
mayor sensibilidad. El cultivo se puede realizar en
shell-vial o en placas de cultivo celular de múltiples
pocillos (ver PNT-DC-03 de este procedimiento).
Se han publicado numerosos protocolos con
distintas estrategias para optimizar el cultivo de C.
pneumoniae, como el pretratamiento de las
monocapas celulares con polietilenglicol, dextrano o
tripsina, aumentar el número de veces que se
centrifuga la muestra sobre la monocapa, usar
medios de cultivo sin suero, etc. Sin embargo las dos
únicas estrategias con suficientes evidencias a su
favor como para recomendarlas de manera rutinaria
son la centrifugación de la muestra sobre la
monocapa y la adición de cicloheximida al medio de
inoculación. La realización de pases sucesivos y la
19
expansión lenta del cultivo con inóculos pequeños,
mejora el rendimiento de esta técnica en cuanto al
número de muestras clínicas positivas y cantidad de
microorganismos,
unidades
formadoras
de
inclusiones (UFI). Tras la incubación se tiñe la
monocapa de uno de los viales o pocillos con
anticuerpos
monoclonales
conjugados
con
fluoresceína, específicos de género o de especie,
para visualizar si hay inclusiones de C. pneumoniae.
Hay que fijar la monocapa con acetona, no se debe
utilizar metanol para este fin, ya que puede modificar
la estructura de algunas proteínas y alterar su
antigenicidad.
Interpretación de los resultados:
- Negativo: no se observan inclusiones tras dos
pases consecutivos.
- Posible positivo: se detectan ≥ 1 inclusiones por
vial o pocillo.
- Positivo confirmado: sólo si la cepa se puede
propagar en pases sucesivos o confirmarse
mediante otros métodos como PCR (TAAN) puede
confirmarse como “positivo”.
6.2.3. Diagnóstico directo no basado en el cultivo.
6.2.3.1. Técnicas de detección de antígeno. Las
técnicas de detección de antígeno tienen poca
sensibilidad para el diagnóstico de infecciones
respiratorias por C. pneumoniae, por lo que
actualmente su uso no está recomendado para este
fin (20-60% respecto del cultivo). La detección de
antígenos de C. pneumoniae en preparaciones
histológicas, mediante inmunofluorescencia (IF) y
sobre todo inmunohistoquímica (IHC), tiene utilidad
en estudios de investigación para demostrar la
presencia de este microorganismo en diversos
tejidos y conocer su implicación en patologías
crónicas. El método de ICH con anticuerpos
biotinilados y avidina es el más extendido. Con estas
técnicas se ha podido detectar C. pneumoniae en
tejido pulmonar, placas de ateroma, endotelio
vascular, músculo liso, macrófagos y tejido cerebral.
La interpretación de la IHC es complicada y requiere
personal muy entrenado y capacitado para
diferenciar las tinciones positivas de las señales de
fondo o las que presentan artefactos. Para evitar
resultados equívocos, se debe teñir cada muestra
con al menos dos anticuerpos anti-clamidia distintos.
6.2.3.2. Técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos (TAAN). La complejidad del cultivo de C.
pneumoniae y los inconvenientes de la serología han
motivado que se utilicen cada vez más las TAAN
para el diagnóstico de estas infecciones por su
rapidez, sensibilidad y especificidad. En 1992 fue
publicado el primer protocolo para la detección de C.
pneumoniae por PCR, desde entonces se han
propuesto multitud de protocolos, haciendo de la
PCR una atractiva alternativa para el diagnóstico de
las infecciones por C. pneumoniae. Sin embargo, a
pesar de la gran cantidad de artículos que describen
el uso de esta tecnología para la detección de C.
pneumoniae, ninguno de ellos ha sido aprobado por
la FDA (aunque algunos sí disponen de marcado
CE) debido principalmente a la falta de
estandarización en los procedimientos de extracción,
al número limitado de muestras de diferentes áreas
geográficas y grupos de edad testadas y la
correlación entre detección de ácidos nucleicos en
muestras respiratorias y su significación clínica. Más
complejo de interpretar resulta aún sin criterios
claramente validados la detección simultánea de
ácidos nucleicos de C. pneumoniae con otros
patógenos respiratorios (S. pneumoniae, virus
respiratorios, etc..) en muestras de pacientes
sintomáticos.
Las TAAN son las herramientas más sensibles
para el diagnóstico de C. pneumoniae durante las
etapas iniciales de la infección, que ofrecen
resultados rápidos y requieren poca manipulación, lo
que esta facilitando su rápida implantación en los
laboratorios de microbiología clínica. Pero no hay
que olvidar que pueden observarse resultados falsos
positivos y negativos y que éstos son más frecuentes
con algunos procedimientos. Así por ejemplo la PCR
anidada es más propensa a contaminación que la
PCR en tiempo real. La detección de ácidos
nucleicos de la bacteria en muestras respiratorias de
individuos asintomáticos se considera como falso
positivo. Para evaluar adecuadamente la utilidad de
las TAAN en el diagnóstico de las infecciones por C.
pneumoniae son necesarios estudios con pacientes
y controles sanos y un número suficiente de
muestras clínicas que permitan determinar valores
predictivos, sensibilidad y especifidad en el contexto
clínico.
6.2.3.2.1. Recogida, transporte, conservación y
procesamiento de las muestras. La mayoría de las
TAAN comerciales están validadas para su
utilización con muestras respiratorias. Pueden
aplicarse a las siguientes: LBA, esputo, lavado
nasofaríngeo, exudados nasofaríngeos, tejidos y
biopsias, sangre o cultivos celulares. Los
escobillones para la toma de muestra serán de
dacrón, rayon o poliéster, no deben usarse
escobillones de alginato cálcico. Una vez realizada la
muestra se remitirá al laboratorio en medio de
transporte específico que garantice la viabilidad de la
bacteria e inhiba el crecimiento de otras bacterias,
grampositivas y gramnegativas como el medio 2SP
chlamydial transport o el UTM (Universal Transport
Medium, Copan). Las muestras de sangre se
tomarán en tubos con un anticoagulante diferente a
la heparina. La muestra debe mantenerse a 4ºC.
El paso previo a la amplificación y detección de
ácidos nucleicos es la extracción de los mismos a
partir de la muestra clínica. Para la detección de
ácidos nucleicos de C. pneumoniae son válidas las
mismas consideraciones y recomendaciones que las
descritas en el apartado 5.3.3.1. “Consideraciones
generales de la aplicación de la técnica de PCR al
diagnóstico de infecciones por micoplasmas”, del
procedimiento número 40 de la SEIMC: “Diagnóstico
microbiológico de las infecciones por Mycoplasma
spp. y Ureaplasma spp.”
6.2.3.2.2. Descripción de las técnicas disponibles.
Las dianas más frecuentes para la detección de C.
pneumoniae son OmpA, PsTI, Pmp4 y 16S ADNr. La
mayoría de los más recientes protocolos son de PCR
20
en tiempo real, el los que la detección de los
fragmentos amplificados se realiza con sondas
fluorescentes específicas (TaqMan®, Scorpion®,
molecular beacon) o con colorantes fluorescentes
como SYBR® Green y determinación de curvas de
temperaturas de disociación. Pueden estar
diseñadas para detectar únicamente C. pneumoniae
o
ser
ensayos
multiplex
que
detectan
simultáneamente otros patógenos respiratorios. Hay
otras técnicas que aún no están comercializadas o
comercializadas para uso exclusivo en investigación
(Research Use Only, RUO) pero que han mostrado
su utilidad en el diagnóstico de C. pneumoniae. Una
de ellas es la detección de C. pneumoniae (diana:
gen ompA), Legionella spp. y M. pneumoniae
directamente de muestras respiratorias mediante una
PCR multiplex en tiempo real, detección con SYBR®
Green y curvas de temperatura de disociación sin
necesidad de extracción previa de ácidos nucleicos.
Usan un reactivo de PCR, AmpDirect® PLUS
(Shimadzu, Kyoto, Japón), que elimina los
inhibidores que pudieran contener las muestras, con
resultados equivalentes a los obtenidos si la PCR se
realiza a partir de ácidos nucleicos extraídos, en
cuanto a límite de detección, especificidad y
sensibilidad.
La amplificación isotérmica de ARN (nucleic acid
sequence-based amplification, NASBA) en tiempo
real y la detección con sondas fluorescentes
molecular beacons, se ha utilizado con el sistema
NucliSENS EasyQ® (bioMérieux, Francia) para la
detección de fragmentos del 16S ARNr de C.
pneumoniae y M. pneumoniae en muestras
respiratorias con resultados prometedores. Otra
estrategia es la utilizada por el sistema ResPlex I
(Qiagen), capaz de detectar C. pneumoniae y otros 6
patógenos respiratorios más. La amplificación se
realiza con dos pares de cebadores específicos
anidados para cada una de las dianas. Estos
cebadores se encuentran a una concentración muy
baja en la mezcla de reacción y se utilizan sólo para
el enriquecimiento inicial de copias diana. La
amplificación eficiente se realiza con unos cebadores
universales que hibridan con la pareja de cebadores
internos. El uso de estos cebadores universales
permite
homogeneizar
las
condiciones
de
amplificación. La detección se realiza mediante un
array en suspensión basado en la tecnología xMAP®
(Luminex®, USA) en el que bolas de poliestireno de
distintos colores se conjugan con las sondas de
oligonucleótidos específicas de cada patógeno. Un
láser identifica el color de las bolas y el otro identifica
la sonda unida al amplicón. En las tablas 5 y 6 se
indican diferentes sistemas comerciales para el
diagnóstico de C. pneumoniae basado en TAANs.
Tabla 5.- Relación de sistemas comerciales para el diagnóstico de Chlamydia pneumoniae basado en TAANs
Equipo
C. pneumonia Real-TM
Quant
C. pneumoniae Q-PCR
Alert Kit
C. pneumoniae. oligomix
Alert Kit
Speed-oligo® C.
pneumoniae
Prodesse® ProPneumo1 Assay
Mycoplasma
pneumoniae /
C. pneumoniae RealTime
Técnica amplificación/detección
PCR-TR / sondas TaqMan
Microorganismos
detectados
C. pneumoniae
Fabricante
Sacace
Biotechnologies
Nanogen Advance
Technology
Nanogen Advance
Technology
PCR-TR / sondas TaqMan
C. pneumoniae
PCR anidada / electroforesis
C. pneumoniae
PCR / oligocromatografía
C. pneumoniae
Vircell
PCR-TR / sondas fluorescentes
C. pneumoniae
M. pneumoniae
GenProbe
PCR-RT dual /sondas TaqMan
C. pneumoniae
M. pneumoniae
Sacace
Biotechnologies
RealCycler® MYCH
PCR-RT dual/ sondas fluorescentes
Progenie Molecular
Speed-oligo® Bacterial
pneumonia combi
PCR múltiple/ oligocromatografía
Seeplex®
PneumoBacter ACE
PCR Múltiple DPOTM/ electroforesis
C. pneumoniae
M. pneumoniae
C. pneumoniae
L. pneumophila
M. pneumoniae
C. pneumoniae
M. pneumoniae
L. pneumophila
B. pertussis
S. pneumoniae
H. influenzae
Vircell
Seegene
PCR-RT: PCR en tiempo real; DPO: Dual Priming Oligonucleotide.
21
Tabla 6.- Otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para detección de C. pneumoniae.
Equipo
Kit C. pneumoniae
1
ResPlexI1
EasyQ C.
pneumoniae/
M. pneumoniae2
AmpDirect® PLUS C.
pneumoniae, M.
pneumoniae, L.
pneumophila2
1
Técnica
amplificación/detección
PCR-TR/ sondas TaqMan
PCR / arrays en
suspensión
Microorganismos
detectados
C. pneumoniae
C. pneumoniae
M. pneumoniae
L. pneumophila
S. pneumoniae
N. meningitidis
H. influenzae
Adenovirus
Fabricante
TIB Molbiol
Qiagen
NASBA/ sondas
“molecular beacons”
C. pneumoniae
M. pneumoniae
bioMeriéux
PCR-TR sin
extracción/SYBR green y
temperatura disociación
C. pneumoniae
M. pneumoniae
L. pneumophila
Shimadzu
Comercializados para uso en investigación (RUO) 2No comercializados en España.
6.2.3.3. Hibridación in situ. Al igual que las técnicas
anteriores comentadas de detección de antígeno, la
utilidad principal de la hibridación de ácidos
nucléicos in situ es la detección de C. pneumoniae
en preparaciones histológicas, aunque su uso está
mucho menos extendido que la IHC.
En lugar de un anticuerpo anti-clamidia en esta
técnica se usan sondas de ADN que contienen
nucleótidos conjugados con digoxigenina (DIG
dUTPs) específicas de alguna región del genoma de
C. pneumoniae o del 16S ARNr. La visualización de
la unión de la sonda con la diana se realiza mediante
anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con
fosfatasa alcalina o peroxidasa y un sustrato
cromogénico, indolfostato/azul de nitrotetrazolio o
diaminobencidina respectivamente, que produce una
reacción cromogénica. También pueden conjugarse
los anticuerpos anti-digoxigenina con fluoresceína o
rodamina visualizándose la hibridación mediante
fluorescencia.
6.3. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES
CAUSADAS POR Chlamydia psittaci
6.3.1. Diagnóstico indirecto de la psitacosis:
serología. Dada la complejidad del cultivo del
microorganismo, las técnicas serológicas constituyen
la base del diagnóstico de la psitacosis. Según el
CDC, se considera que un paciente constituye un
caso de psitacosis confirmada si presenta un cuadro
clínico compatible con la enfermedad y si se confirma
por el laboratorio por uno de los siguientes métodos:
a) cultivo de C. psittaci de una muestra respiratoria;
b) evidencia por FC o MIF de una seroconversión de
anticuerpos frente a C. psittaci con un aumento de al
menos 4 títulos (en 2 muestras de suero de fase
aguda y fase convaleciente respectivamente,
separadas al menos 2 semanas) o c) detección de
inmunoglobulinas de clase IgM frente a C. psittaci
por MIF (con un título mayor o igual a 1/16). Se
considera caso probable de psitacosis si existe
cuadro clínico compatible y a) el paciente está
relacionado epidemiólogicamente con un caso
humano confirmado o b) se evidencia por CF o MIF
un único título mayor o igual a 1/32 en un suero
único obtenido después del inicio de los síntomas.
Tradicionalmente
se
han
utilizado
dos
procedimientos para este fin, la fijación de
complemento (FC) y la microinmunofluorescencia
(MIF), sin embargo no hay actualmente ningún test
serológico específico de C. psittaci, debido a las
reacciones cruzadas con diferentes especies de
clamidia, como C. trachomatis o C. pneumoniae, lo
que dificulta el diagnóstico diferencial de C. psittaci.
6.3.1.1. Fijación del complemento. La fijación del
complemento (FC) es la técnica que más se ha
utilizado para el diagnóstico serológico de clamidia,
aunque no es capaz de distinguir entre las diferentes
especies ya que utiliza como antígenos el LPS
presente en todas ellas o la proteína de shock
térmico. Es también conveniente evidenciar
seroconversión en parejas de sueros separados al
menos dos semanas. En caso de alta sospecha y
reacciones de FC negativas se recomienda repetir la
técnica con un nuevo suero pasadas otras dos
semanas. Si no se dispone de sueros pareados, un
título superior a 1/64 es altamente indicativo de
infección en pacientes con un síndrome clínico
compatible. El tratamiento con tetraciclinas puede
dificultar el diagnóstico por FC al retrasar o disminuir
la producción de anticuerpos.
6.3.1.2.
Microinmunofluorescencia.
La
microinmunofluorescencia
(MIF),
también
denominada inmunofluorescencia indirecta (IFI) es
probablemente la técnica más sensible para el
diagnóstico serológico de la psitacosis. Se utilizan
antígenos de superficie de C. psittaci como
moléculas de captura inmovilizados sobre un
portaobjetos. El portaobjetos se incuba con el suero
del paciente que, en caso de contar con anticuerpos
específicos quedarán unidos a las moléculas de
captura y posteriormente revelados con un
anticuerpo anti-humano conjugado con un marcaje
fluorescente. El marcaje se detecta con un
microscopio de fluorescencia. El kit comercial Focus
22
Diagnostics contiene antígenos para C. pneumoniae,
C. trachomatis y C. psittaci. Idealmente, la infección
se diagnostica por una elevación en cuatro veces el
título de anticuerpos IgG del paciente. Si no se
cuenta con dos sueros seriados, suele ser suficiente
un título superior a 1/16 de IgM o uno superior a 1/32
de IgG con una historia clínica compatible desde el
punto de vista epidemiológico. La MIF sigue siendo
un método con un gran valor predictivo negativo
(98%) y alta sensibilidad para la detección de
infecciones por clamidias. Algunos autores han
publicado la utilidad de detectar anticuerpos en
lágrima como indicio de infección ocular, aunque
esta afirmación no ha sido bien contrastada. La MIF
también ha sido utilizada con fines de tipación de
cepas.
6.3.1.3. Enzimoinmunoensayo. Se han descrito
también técnicas de enzimoinmunoensayo (EIA) para
detectar anticuerpos frente a C. psittaci. Existen
técnicas comerciales que detectan anticuerpos de
clase IgG aunque no cuentan con gran experiencia
en la bibliografía. Estas aproximaciones son menos
sensibles que la MIF y la FC aunque son una opción
válida
para
laboratorios
pequeños
o
no
especializados.
6.3.2. Diagnóstico directo: cultivo. Aunque sigue
siendo esencial para la caracterización biológica y
molecular de los aislados clínicos, pocos laboratorios
clínicos ofrecen el cultivo como medio de diagnóstico
de las infecciones por C. psittaci, ya que el cultivo de
este microorganismo implica un trabajo arduo y
complejo que requiere un laboratorio de bioseguridad
de nivel 3. Por ello, el cultivo solo debe realizarse a
partir de las muestras patológicas obtenidas de los
pacientes en los que se haya demostrado la
presencia de estos microorganismos por otros
métodos, y generalmente con objeto de realizar
estudios epidemiológicos. Además, cuando C.
psittaci crece en las líneas celulares, debe ser
confirmado por inmunofluorescencia y los cultivos
negativos deben ser confirmados después de 6 días
de cultivo realizando un subcultivo en un medio
nuevo.
6.3.2.1. Recogida, transporte, conservación y
procesamiento de las muestras. Las muestras
respiratorias apropiadas incluyen los frotis de
exudado faríngeo, esputos, aspirado bronquial y
endotraqueal, líquido de lavado broncoalveolar y
biopsias de tejido pulmonar. Es importante, para una
mejor conservación, que las muestras sean
recogidas en un medio de transporte adecuado,
como el SPG (siglas del término inglés
“sucrose/phosphate/glutamate”) suplementado con
antibióticos y antifúngicos que no afecten a la
supervivencia clamidial, tales como la gentamicina o
la estreptomicina, y la fungizona, respectivamente.
Además,
las
muestras
deben
mantenerse
refrigeradas a 4ºC durante el transporte, para tratar
de conservar la viabilidad y evitar el crecimiento de
bacterias contaminantes que resistan la acción de
estos antibióticos.
Una vez recibida la muestra en el laboratorio y
antes de inocular en las líneas celulares, las
muestras serán homogenizadas en el medio de
transporte mediante agitación vigorosa. La
inoculación en embrión de pollo es el método
descrito en 1957 y aunque ofrece buenos resultados
éstos son inferiores a los cultivos que se
desarrollaron posteriormente. En la actualidad, esta
metodología está siendo sustituida por el cultivo en
líneas celulares, que proporciona un mejor
crecimiento y permite un mejor seguimiento de la
evolución de la infección. Las líneas celulares más
utilizadas son las células McCoy, células HeLa 229,
células L-929, células “African Green Monkey”
(Vero), células BHK-21 y células de riñón de “Buffalo
Green Monkey” (BGM), siendo estas últimas las más
sensibles.
6.3.2.2. Condiciones para la realización del cultivo.
Las diferentes técnicas se diferencian únicamente en
los tratamientos físico-químicos que se aplican a las
células para favorecer la penetración y el desarrollo
de estos microorganismos. Se pueden clasificar en
dos grupos: aquellos que inhiben o retrasan la
multiplicación celular (ya que la infección celular
debe producirse cuando el cultivo se encuentre en la
fase estacionaria) y los que favorecen la penetración
de este microorganismo. Para los primeros se han
utilizado la adición al medio de cultivo (medio
esencial mínimo de Eagle, EMEM) de la
cicloheximida, que interfiere la síntesis del ADN de
las células eucariotas sin afectar a las clamidias; la
citocalasina
B,
que
interfiere
la
división
citoplasmática; la 5-yodo-2-desoxiuridina, que se
incorpora al ADN en sustitución de la timidina; la
irradiación, los corticoides y diversas sustancias
inhibidoras de la mitosis. De todos ellos, el más
empleado en la actualidad es el tratamiento con
cicloheximida. Entre los procedimientos utilizados
para favorecer la penetración de las estas bacterias
en la célula hospedadora (proceso lento y de baja
frecuencia) se pueden seleccionar la centrifugación,
el tratamiento con dietil-aminoetil dextrano (DEAED), policatión hidrosoluble que actúa de puente entre
las membranas del microorganismo y de las células
eucariotas cargadas negativamente, y el tratamiento
con polietilenglicol. En la práctica, se utilizan
combinaciones de dos o más de los métodos
indicados.
El cultivo de líneas celulares se realiza
normalmente en monocapas, sobre frascos de fondo
plano y también en placas de microtitulación de 24 ó
96 pocillos, practicándose la infección sobre estas
monocapas. Tras una incubación a 37ºC durante 3-4
días, las muestras deben ser fijadas en metanol o en
acetona para la confirmación de la presencia de C.
psittaci mediante la tinción de MayGrünwald-Giemsa
o mediante inmunofluorescencia, respectivamente, al
objeto de demostrar la presencia de inclusiones
intracitoplasmáticas (ver figura 3). En este segundo
supuesto resulta posible la identificación de la
serovariedad mediante el empleo de anticuerpos
monoclonales específicos, o también la titulación del
número de unidades formadoras de inclusiones
(UFI).
23
6.3.3. Diagnóstico directo no basado en cultivo.
6.3.3.1. Microscopía mediante tinción. Se basa en la
preparación de extensiones a partir de material de
exudados y secreciones procedentes de órganos o
tejidos afectados, aplicándose las tinciones
específicas para Chlamydia spp. Un primer grupo
incluye los métodos basados en la técnica
modificada de Ziehl-Neelsen, como los de Stamp
(figura 3), Macchiavello o Giménez, los cuales
utilizan como colorante principal la fucsina fenicada y
como colorante de contraste el verde malaquita o el
azul de metileno, realizándose la decoloración con
un ácido débil diluido (ácido acético o cítrico). Los
microorganismos se observan microscópicamente en
forma de agrupaciones de estructuras cocoides de
color rojo, sobre un fondo verde o azul, según el
colorante de contraste empleado. Con este tipo de
tinciones es necesario efectuar el diagnóstico
diferencial con respecto a Brucella spp. o Coxiella
spp., ya que estas bacterias también presentan
ácido-resistencia. La diferenciación con Coxiella spp.
es más dificil ya que poseen un tamaño muy
pequeño, semejante al de Chlamydia spp. Además,
en este último caso se complica el problema al
haberse descrito infecciones mixtas producidas por
ambas bacterias, lo que obliga a recurrir al empleo
de otras técnicas.
Otra tinción es la de May Grünwald-Giemsa (figura
3) que, a pesar de no ser específica de Chlamydia
spp., cuenta con la ventaja de proporcionar más
información sobre la morfología de la inclusión y la
composición y procedencia de las células del frotis.
Las bacterias sólo pueden ser observadas cuando
aparecen en el interior de las inclusiones, no en
localización extracelular. La inclusión se observa
más o menos densa dentro de la célula, con una
coloración
intensamente
basófila
sobre
un
citoplasma acidófilo.
Todos estos métodos adolecen del inconveniente
de su baja sensibilidad, lo que determina un gran
porcentaje de falsos negativos cuando la
concentración del microorganismo en la muestra es
escasa. Sí que resultan útiles, sin embargo, ante una
tinción positiva, al permitir emitir un diagnóstico
presuntivo, que deberá confirmarse mediante el
aislamiento o la aplicación de técnicas moleculares.
6.3.3.2. Técnicas de detección de antígenos. Se
basan en la utilización de anticuerpos específicos
para la detección de los antígenos de C. psittaci a
partir de órganos, tejidos o exudados. La reacción
inmunológica se revela mediante la utilización de
compuestos fluorescentes o mediante una enzima y
su sustrato. La inmunofluorescencia directa (IFD)
(figura 3), muy utilizada para el diagnóstico de este
tipo de infecciones, es una técnica más sensible que
los métodos de bacteroscopia tras tinciones
específicas, o los empleados para el aislamiento y
cultivo. Inicialmente, se utilizaban anticuerpos frente
al LPS clamidial, con especificidad de género, pero
la técnica se ha mejorado al introducir anticuerpos
monoclonales, que en la actualidad permiten la
diferenciación entre las diferentes serovariedades, si
bien, no están disponibles comercialmente. La
técnica de inmunocaptura es una variante de las
técnicas ELISA utilizadas en serología, en las que
las placas se tapizan con anticuerpos policlonales o
monoclonales frente a C. psittaci. Existen métodos
comerciales desarrollados para el diagnóstico de C.
trachomatis en humanos, que emplean anticuerpos
monoclonales frente al LPS, por lo que al ser esta
molécula específica de la familia Chlamydiaceae,
también puede recurrirse a ellos para la detección de
C. psittaci en muestras patológicas, con resultados
muy aceptables en comparación con el aislamiento y
la IF. Las técnicas inmunohistoquímicas (figura 3) se
aplican normalmente sobre órganos o tejidos fijados
en formol e incluidos en parafina, utilizando
anticuerpos secundarios conjugados con enzimas,
como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa,
añadiendo posteriormente el sustrato adecuado que,
al entrar en contacto con la enzima, precipita y
colorea el área donde se localiza el antígeno.
6.3.4. Técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos (TAAN). Se han utilizado distintas
aproximaciones basadas en PCR especialmente en
la caracterización de brotes epidémicos. Se han
publicado ensayos de TETR-PCR (touchdown
enzyme time release) que amplifican regiones del
gen 16S y los espaciadores 16S-23S ADNr para
detectar de forma sensible y específica las diferentes
especies del género Chlamydia. Se ha descrito
también un ensayo de PCR a tiempo real, que
amplifica el gen ompA de C. psittaci a partir de
muestra respiratoria con buenos resultados para el
diagnóstico rápido de psitacosis. Las técnicas de
PCR han demostrado ser positivas rápidamente (al
tercer día de inicio de los síntomas) mientras que el
diagnóstico serológico podría retrasarse hasta 14
días. Sin embargo ninguna de las TAAN están
disponibles comercialmente. También se ha
conseguido amplificar ADN de C. psittaci a partir de
muestras extrarrespiratorias como sangre y orina.
Recientemente se ha publicado un método de
detección de C. psittaci por PCR a tiempo real del
gen envB utilizando SYBR-Green. El método es
rápido y sensible aunque sólo se ha utilizado para
detectar el microorganismo en muestras de heces de
aves. Por otra parte su especicificidad es relativa, ya
que también detectaría otras especies del género.
6.4. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES
CAUSADAS POR NUEVAS Chlamydiae
Se han desarrollado TAANs no comerciales con fines
epidemiológicos y diagnósticos de las infecciones
por P. acanthamoebae y S. negevensis. Las técnicas
de
PCR
desarrolladas
estan
basadas
mayoritariamente en el operón ribosómico tanto 16S
ADNr como 23S ADNr, aunque también se han
descrito otras dianas como el gen tlc, que codifica
para la translocasa presente solo en Chlamydiales y
Rickettsiales. Los primeros protocolos publicados
eran realmente PCR “pan-clamidia” ya que el
objetivo era amplificar el 16S ADNr de cualquier
clamidia no caracterizada, por lo que solamente con
posterior secuenciación del producto amplificado se
podría identificar esas nuevas clamidias.
24
A
B
C
D
E
F
Figura 3. Detección de Chlamydia psittaci por diferentes métodos de diagnóstico. A) Corte semifino de células
McCoy infectadas por C. psittaci, teñido con azul de toluina, donde se observan las inclusiones
intracitoplasmáticas. B) Electronografía mostrando una inclusión clamidial. C) Técnica inmunocitoquímica
utilizando un anticuerpo monoclonal específico donde se muestra un foco de infección por Chlamydia spp. en
hígado. D) Inmunofluorescencia indirecta que muestra inclusiones intracitoplasmáticas de C. psittaci. E) Tinción de
Stamp mostrando C. psittaci en un frotis conjuntival de un loro, donde se observan a los microorganismos tanto
intracelularmente en inclusiones como extracelularmente, con una tonalidad rojiza. F) Tinción de May GrünwaldGiemsa donde se muestran las inclusiones de Chlamydia spp., muy basófilas, en el interior del citoplasma de
células HeLa 229, perteneciente a un control de aislamiento del microorganismo a partir de una muestra
patológica.
Esta aproximación tenía la ventaja de poder
identificar cualquier organismo, pero perdía
sensibilidad y especificidad. Recientemente se ha
desarrollado una nueva técnica de PCR en tiempo
real basada en el 16S ADNr para identificar
específicamente
miembros
de
las
familias
Parachlamydiaceae y Simkaniceae, aumentando su
especificidad y sensibilidad.
También se han
desarrollado técnicas de EIA no comerciales
específicamente para el diagnóstico de S.
negavensis, aunque presentan reacción cruzada con
C.
pneumoniae.
Asimismo,
técnicas
de
microinmunofluorescencia desarrolladas para C.
pneumoniae
se
han
empleado
para
P.
25
acanthamoebae, con resultado positivo. Estas
bacterias se han podido cultivar en las mismas líneas
celulares, como Vero, que se han empleado para
otras clamidias.
7. TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO DE LAS
INFECCIONES PRODUCIDAS POR MIEMBROS DE
LA FAMILIA Chlamydiaceae
En el tracoma activo el tratamiento de elección es
tetraciclina en pomada 2 veces al día durante 6
semanas, aunque es más recomendable la terapia
con macrólidos por vía oral, especialmente
azitromicina (20 mg/kg) ya que en niños (el grupo
mas afectado por esta infección) está contraindicado
el tratamiento con tetraciclinas. En las infecciones
por los serovares relacionados con infección
genitourinaria, el tratamiento recomendado es
doxicilina cada 12 h durante 7dias o azitromicina 1g
por vía oral en una única dosis que es el tratamiento
de elección en mujeres embarazadas, en quienes
está recomendado un test de TAAN 3 semanas
después de completar el tratamiento. Las tasas de
eficacia del tratamiento oscilan entre 97-98%. Si
existe o se sospecha una complicación como
epididimitis o enfermedad inflamatoria pélvica el
tratamiento debe prolongarse entre 10-14 días y
puede incluir ceftriaxona intramuscular como
tratamiento empírico frente a N. gonorrhoeae. En el
caso de los biovares relacionados con LGV el
tratamiento con doxicilina se prolonga durante 21
días o azitromicina semanalmente durante 3
semanas. También se pueden emplear las
quinolonas frente a C. trachomatis excepto
ciprofloxacino.
C. pneumoniae es sensible a las tetraciclinas,
macrólidos y fluoroquinolonas. El macrólido más
activo frente a C. pneumoniae es claritromicina,
mientras que levofloxacino es la fluoroquinolona más
activa. Difrentes ensayos clínicos han revelado que
el tratamiento con macrólidos o fluoroquinolonas
tienen un éxito de erradicación de C. pneumoniae
entre el 70-85% en pacientes con neumonía. El
tratamiento convencional es de 10-14 días, excepto
en regímenes con azitromicina que son solamente 5
días. En casos de complicaciones como artritis
reactiva por C. pneumoniae o C. trachomatis,
recientes ensayos clínicos revelan que es
significativamente más eficiente la terapia combinada
de doxicilina más rifampicina, o azitromicina más
rifampicina, durante 6 meses.
La psitacosis no tratada raramente es mortal. Las
tetraciclinas constituyen el tratamiento de elección
para la psitacosis (tetraciclina, 500 mg cada 6 horas,
o doxiciclina 100 mg cada 12 horas por vía oral
durante 10-21 días). La doxiciclina puede
administrarse por vía intravenosa (4,4 mg/kg de peso
dividido en dos dosis diarias) en los casos más
graves. También se ha utilizado con éxito la
minociclina.
Alternativamente,
los
macrólidos
(eritromicina, 500 mg cada 6 horas o la azitromicina,
en dosis total de 1,5 g administrada durante 3-5 días)
han demostrado ser un tratamiento eficaz en casos
en los que se desaconseja el tratamiento con
tetraciclinas.
Existe
alguna
experiencia
de
tratamiento con cloramfenicol y con rifampicina,
aunque la posibilidad de recidivas parece
considerable. El tratamiento con ofloxacino podría
ser otra opción válida aunque no existe una gran
experiencia al respecto.
Aunque los antibióticos beta-lactámicos, no deben
tener efecto sobre las clamidias, parece que los
beta-lactámicos reducen mucho la infectividad,
porque inhiben la maduración del cuerpo reticular
(CR).
7.1. TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE LA
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
La variabilidad inter-cepa en la sensibilidad a
antimicrobianos y la adquisición de resistencias son
fenómenos muy infrecuentes en el género
Chlamydia. Estos hechos, junto con la dificultad de
cultivo del microorganismo hacen que las técnicas de
evaluación de la sensibilidad a antimicrobianos se
realicen, casi exclusivamente, en laboratorios de
referencia muy especializados y que los datos
obtenidos tengan una escasa utilidad en la práctica
clínica.
No existe una técnica estandarizada pero, en
general, los microorganismos se cultivan en medio
libre de antibiótico previamente al ensayo de
sensibilidad. Se utiliza un inóculo ajustado de 100
unidades formadores de cuerpos de inclusión para
infectar monocapas celulares. Posteriormente, se
añaden diluciones seriadas del antibiótico en
evaluación, bien inmediatamente o a distintos
tiempos de incubación durante las primeras 24
horas. Después de 48 horas, se utilizan anticuerpos
monoclonales conjugados con fluoresceína para
identificar la mayor dilución del antimicrobiano que
inhibe la formación de cuerpos de inclusión (CMI).
Las monocapas pueden ser sometidas a nuevos
pases en medio sin antibiótico para estudiar la
máxima dilución que inhibe la viabilidad de los
microorganismos (CMB). Se difine la CMI como la
concentración de antibiótico más baja que inhibe
completamente la formación de placa partiendo de
105 partÍculas infectivas.
Se ha descrito resistencia a tetraciclinas por la
presencia del gent tet(C) y aunque no se han
descrito mecanismos de resistencia a azitromicina en
aislados clínicos, el bajo número de rrn (operón que
codifica para 16 y 23S ADNr) en chlamydia (2 en C.
trachomatis y 1 en C. pneumoniae o C. psittaci),
permite suponer una gran facilidad para desarrollar
resistencia por mutaciones puntuales en los genes
rrn. Esta sospecha teórica junto con el incremento de
fracaso terapéutico de azitromicina frente a N.
gonorrhoeae o Mycoplasma genitalium, está
cuestionando el uso generalizado de azitromicina
para el tratamiento de infecciones por Chlamydia
spp.
8. TIPACIÓN MOLECULAR EN Chlamydiae
Las técnicas de tipación permiten la comparación de
cepas, información de gran importancia en la
caracterización de brotes o en el estudio de nodos
26
de transmisión. En el caso de C. psittaci, sería
posible, por ejemplo, relacionar focos potenciales de
infección en determinadas aves con las cepas de
pacientes afectados, en el caso de C. trachomatis,
puede ser importante en los casos de identificar
redes de transmisión sexual.
La disponibilidad de genomas completos
secuenciados de miembros pertenecientes al orden
Chlamydiales, permite definir un genoma core común
a todos los miembros conocidos, que llega a ser de
más del 90% entre miembros de la familia
Chlamydiaceae. Este alto grado de sintenia entre las
diferentes especies de clamidias, está relacionado
con su ciclo biológico que dificulta la posibilidad de
intercambio genético con otras especies, pero
también sugiere que la tasa de variabilidad genética
es baja y basada fundamentalmente en mutaciones
puntuales, más que en eventos de recombinación.
Esto supone una dificultad añadida a la hora de
diseñar esquemas de tipación dentro de la familia
Chlamydiaceae. La elección de genes únicos como
potencial diana para obtener genotipados de alta
resolución han fracasado. En este escenario,
obviamente la mejor opción, pero poco realista
actualmente, sería la secuenciación de genomas
completos. En 2008 se han descrito dos sistemas de
tipificación alternativos que aportan un alto poder de
resolución: VNTR (variable number of tandem
repeats) y MLST (multilocus sequence typing). El
sistema VNTR son secuencias repetidas de una
misma secuencia nucleotídica en las regiones
genómicas CT1335, CT1299 y CT1291 y variaciones
en el número de repeticiones dan lugar a diferente
longitud del segmento genómico, lo que permite
diferenciar cepas. El poder discrimitanatio de esta
técnica aumenta al secuenciar también el gen ompA
denominado MLVA (Multi locus-VNTR-ompA). Esta
estrategia ofrece el mayor grado de discriminación.
Por MLVA
se ha alcanzado gran poder de
discriminación en cepas estudiadas de distintos
serotipos de C. psittaci y C. trachomatis de diferentes
orígenes geográficos.
Existen dos propuestas para realizar MLST en
Chlamydia. El sistema MLST7, se basa en la
secuenciación de 7 genes: gatA, oppA, hflX, gidA,
enoA, hemN y fumC y el sistema MLST5 basado el
los genes: hctB, CT058, CT144, CT172 y pbpB.
Curiosamente el sistema MLST5 ofrece mejor poder
discriminatorio que MLST7. Por ello, el subcomité
sobre la taxonomía de las clamidias sugiere en su
reunión de 2009 que al menos se deberían usar 5
genes housekeeping y que los criterios de distancia
génica
deberían
compararse
con
análisis
filogenéticos,
cuando
exista
un
número
suficientemente alto de secuencias conocidas. La
caracterización de cepas de C. psittaci por MLST ha
demostrado su utilidad para la clasificación de
genotipos de acuerdo a la especie del huésped. Sin
embargo esta estrategia tiene escaso poder de
discriminación en cepas de C.pneumoniae.
Recientemente se ha publicado un estudio basado
en la amplificación de una región variable de ompA
con un sistema de PCR a tiempo real, seguido de un
análisis del amplicón por high resolution melting
(HRM). El sistema, sencillo y rápido, demostró su
eficiencia en la detección y tipación de C. psittaci y
C. trachomatis. Una particularidad ha supuesto la
caracterización molecular de los aisldos de LGV.
Schaeffer y cols., describieron cómo la PCR y
secuenciación de pmpH y ompA ofrecía un excelente
poder discriminatorio, pero sólo para cepas de los
genotipos L1-L3 de LGV (ver PNT-DC-01 de este
procedimiento).
9. IMPLICACIONES EN SALUD PÚBLICA
9.1. IMPLICACIONES EN SALUD PÚBLICA DE LAS
INFECCIONES POR Chlamydia trachomatis
Las infecciones sexuales por C. trachomatis,
constituyen las infecciones más frecuentes de
transmisión sexual, siendo el grupo poblacional de
mujeres entre 15-24 años el más afectado. En la
mayoría de los casos son mujeres asintomáticas lo
que facilita la transmisión y el mantenimiento en la
población. Para controlar la alta tasa de infecciones
por C. trachomatis se han instaurado cribados
sistemáticos en la población sexualmente activa. Por
otra parte desde el European Centre for Disease
Prevention and Control (ECDC), la red de vigilancia
para el control de infecciones de transmisión sexual
presta especial atención a las producidas por C.
trachomatis. En España, el sistema de vigilancia de
las infecciones por C. trachomatis se realiza a través
de los centros centinelas y no obliga a la declaración
de casos, por lo que es posible que exista una
subestimación de los casos reales de C. trachomatis
procedentes de nuestro entorno.
Sin embargo, el mayor problema actual son los
casos de LGV que se estan describiendo en toda
Europa, incluido España. Los casos de LGV en
Europa se han considerado tradicionalmente casos
importados desde regiones tropicales, pero desde el
2003, se han descrito en población autóctona, desde
Portugal a Finlandia, brotes de LGV biovar L2b. El
grupo poblacional de individuos afectados son HSH.
Ante un diagnóstico de LGV debe de investigarse la
presencia de VIH y VHC ya que entre el 76-96% de
los pacientes diagnosticados de LGV estaban
también infectados por el VIH. Estos datos sugieren
que los biovares de LGV pueden facilitar la
transmisión de VIH y VHC. La desproporcionada y
preocupante asociación entre el VIH y el LGV en
personas homosexuales requiere una urgente
reevaluación de lo que se está haciendo para
controlar la epidemia.
9.2. IMPLICACIONES EN SALUD PÚBLICA DE LAS
INFECCIONES POR Chlamydia psittaci
El impacto de las infecciones por C. psittaci en los
humanos es difícil de determinar. En numerosos
países, aunque no en España, la psitacosis/ornitosis
es una enfermedad de declaración obligatoria en las
primeras 48 horas tras su diagnóstico. Sin embargo,
los datos proporcionados representan una gran
subestimación de los casos reales de infección
humana, no solo por la dificultad del diagnóstico y
por el habitual tratamiento común aplicado a las
27
neumonías atípicas, sino también porque no todas
las infecciones cursan con neumonía, y por tanto no
son comunicadas.
Hasta la fecha no existen vacunas comercializadas
para su empleo en las aves, por lo que el control se
basa en estrategias de reducción del riesgo de
contagio a los humanos, incluyendo el tratamiento
con antibióticos de los animales sospechosos. Hasta
hace poco, las normativas europeas 2000/666/EC y
2005/760/EC,
que
estaban
especialmente
destinadas al control de la enfermedad de Newcastle
y a la gripe aviar, incidían en el control de la
psitacosis al controlar la importación de aves de
terceros países.
Sin embargo, la normativa EC 318/2007
(http://www.boe.es/doue/2007/084/L00007-00029.pdf),
que deroga las anteriores, regula la importación de
aves de terceros países a la Unión Europea, y en
ella se incluye específicamente el control de C.
psittaci en las aves, al objeto de evitar el contagio a
los humanos.
10. BIBLIOGRAFÍA
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Chlamydia psittaci genotypes and host species. PLoS
One. 2010; 5:e14179.
4. Pedersen LN, Herrmann B, Møller JK. Typing
Chlamydia
trachomatis:
from
egg
yolk
to
nanotechnology. FEMS Immunol Med Microbiol.
2009; 55:120-130.
5. Rupp J, Solbach W, Gieffers J. Single-nucleotidepolymorphism-specific PCR for quantification and
discrimination of Chlamydia pneumoniae genotypes
by use of a "locked" nucleic acid. Appl Environ
Microbiol. 2006; 72:3785-3787.
29
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-DC-01
DETECCIÓN MOLECULAR DE Chlamydia trachomatis GENOTIPO linfogranuloma venéreo
MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL
ELABORADO
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
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01
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Fecha
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Edición inicial
COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital/Centro……………………………. La
información en él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable
de su elaboración. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.
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Detección molecular de Chlamydia trachomatis
genotipo linfogranuloma venéreo mediante PCR
en tiempo real
1. PROPÓSITO Y ALCANCE
Definir la metodología básica para la detección de
ADN de los serovares L1, L2 y L3 de Chlamydia
trachomatis causantes del linfogranuloma venéreo
(LGV) en muestras genitourinarias, rectales o
faríngeas mediante amplificación de ácidos
nucleicos por PCR en tiempo real.
2. FUNDAMENTO
El LGV es una enfermedad de transmisión sexual
causada por los genotipos L1, L2 y L3 de C.
trachomatis. Es una enfermedad endémica en
África, Latinoamérica y Asia. Los casos detectados
en Europa se consideraban casos importados, pero
desde 2003 se ha distribuido un brote de LGV por
Europa, Estados Unidos y Australia. Los métodos
comerciales de diagnóstico molecular de C.
trachomatis, no diferencian el LGV de otros
serovares de C. trachomatis de transmisión sexual
(serovares D-K). Es necesario por tanto, el
desarrollo de estrategias que permitan el genotipado
de
C.
trachomatis,
no
solo
con
fines
epidemiológicos, sino también por su interés desde
el punto de vista de la duración de tratamiento
antibimicrobiano.
Las diferentes serovariedades de C. trachomatis
descritas se han basado en una diferente respuesta
serológica frente a la proteína de membrana externa
MOMP. Sin embargo, no existe correlación entre
cuadro clínico y serovariante. Por lo tanto la mejor y
mas rápida estrategia para el genotipado de C.
trachomatis son las técnicas moleculares, basadas
en la amplificación de genes que guarden un alto
grado de correlación con la patogénesis. Los genes
mas comúnmente empleados son los genes pmp.
La deleción interna de 36 pb del gen pmpH se ha
empleado como marcador molecular específico de
los patotipos L1, L2 y L3 del LGV.
El procedimiento propuesto es una PCR en tiempo
real usando sondas TaqMan, siguiendo el protocolo
propuesto por Morré y cols. en 2005 y
posteriormente revisado por Schaeffer y cols. en
2008.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Loza E (Coordinador), Alomar P, Bernal A, Harto
A, Pérez JL, Picazo JJ, Sarazá ML. Seguridad en el
laboratorio de microbiología clínica. Procedimientos
en Microbiología Clínica nº 10, 1ª edición. SEIMC
2000.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbi
ologia
- Sánchez C (Coordinador). Guerrero C, Sánchez C.
Recogida, transporte, y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de microbiología.
Procedimientos en Microbiología nº 1a, 2ª edición.
SEIMC 2003.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbi
ologia
PNT-DC-01
Edición Nº 01
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4. MUESTRAS
Las muestras adecuadas son exudados uretrales,
cervicales, faríngeos o rectales tomados con
torundas de dacron. Las condiciones para la
recogida y el transporte deben contemplar:
- Respetar las normas descritas en el procedimiento
de recogida y procesamiento de las muestras en el
laboratorio de Microbiología.
- En el caso de muestras recogidas con torunda,
garantizar la recogida suficiente de células
epiteliales. Una vez tomada la muestra introducir la
torunda en un medio de transporte adecuado.
- Identificar correctamente el tubo (código
empleado) y los tubos que se deriven de los
procesos subsiguientes: extracción de ácidos
nucleicos y PCR.
- Si no se puede procesar inmediatamente, se
recomienda no prolongar la conservación a 4ºC más
de 24 horas. En caso necesario conservar las
muestras a -70ºC para períodos más prolongados.
- El material genético una vez extraído debe
procesarse. En caso contrario se puede conservar a
temperatura de -20ºC.
5. REACTIVOS Y PRODUCTOS
a) Sistema de extracción de ácidos nucleicos
(automática o manual).
b) Master mix: TaqMan Fast Universal PCR Master
Mix (2x) (Applied Biosystems).
c) Control interno de amplificación: se amplificará
mediante sonda Taqman específica un fragmento
del gen que codifica para la proteína GAPDH de
origen humano.
Primer F: 5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’
Primer R: 5’-ATGGGATTTCCATTGATGAC AAG-3’
Sonda: FAM-5’-TGGCACCGTCAAGGCTGA
GAACG-3’ TAMRA
(Adaptado de Schaeffer y col. 2008)
d) Reactivos específicos para amplificar el gen
pmpH de LGV: las secuencias de primers y sonda
específicos para los genotipos L1-L2-L3 de C.
trachomatis estan basados en la deleción interna de
36 bp y proceden de la publicación de Schaeffer y
cols. en 2008.
Primer F: 5’-CTGTGCCAACCTCATCAT CAA-3’
Primer R: 5’AGACCCTTTCCGAGCATCACT-3’
Sonda: FAM-5’-CCGCCTGCTCCAACAGTT
AGTGATG- 3’-TAMRA
6. APARATOS Y MATERIAL
- Agitador orbital tipo vórtex.
- Termociclador: la técnica está validada para el
sistema ABI 7500 Fast de Applied Biosystems. En
caso necesario se puede adaptar a otros sistemas
teniendo en cuenta las modificaciones oportunas en
el marcaje de las sondas adaptándolas a los
sistemas ópticos de cada termociclador.
- Cabina de seguridad.
- Pipetas automáticas de volumen variable.
2
Servicio de Microbiología
Hospital…………………………
…………………..
Detección molecular de Chlamydia trachomatis
PNT-DC-01
genotipo linfogranuloma venéreo mediante PCR
en tiempo real
- Tubos de plástico de fondo cónico tipo Eppendorf
de 1,5 ml.
- Puntas con filtro de diferentes calibres.
- MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO
El procesamiento de las muestras se hará en
campana de bioseguridad.
Las
muestras
tomadas
en
torunda
se
homogeneizarán utilizando un vortex en 1-2 ml de
medio de transporte.
La extracción de ácidos nucleicos se realizará a
partir de alícuotas de 500 µL del medio de
transporte, según se indique en el procedimiento
habitual de trabajo del laboratorio correspondiente.
Se puede emplear como sistema de extracción
automática el EasyMag de BioMérieux y como
sistema manual el Quiamp Mini kit de Quiagen.
Pueden ser igualmente eficientes otros sistemas de
extracción manual y automática y cada laboratorio
puede utilizarlos según su conveniencia.
7.2. AMPLIFICACIÓN
La reacción se hace en un volumen final de 25 µL,
con 12,5 µL de TaqMan Fast Universal PCR Master
MIX (2x), 0,15 µM de cada primer, 0,1 µM de la
sonda (tanto para la reacción de genotipado como
para el control), y 5 µL de ADN extraído de la
muestra.
El protocolo de amplificación es de 2 minutos a
50ºC, 1 minuto a 95ºC, 40 ciclos de 5 segundos a
95ºC y 1 minuto a 60ºC (programar la lectura del
termociclador en este paso).
Controles:
- Además de una reacción del control de extracción
y amplificación por muestra, incluir en cada tanda un
control negativo de la master mix añadiendo 5 µL de
agua en lugar de muestra y un control positivo que
garantice la calidad óptima de los reactivos y del
material genético eluido.
- Al estar marcadas las sondas del control interno y
de la diana de amplificación con la misma sonda
FAM, no se pueden emplear en un mismo tubo de
amplificación.
8.
OBTENCIÓN,
INTERPRETACIÓN
Y
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresarán en
términos
cualitativos de positivo o negativo.
Si no amplifica ni la diana ni el control, la reacción
no es válida y se debe repetir el procedimiento.
La amplificación del control negativo indicaría una
contaminación. Esta circunstancia invalida el
resultado obtenido. Repetir el procedimiento desde
la extracción del material genético.
Edición Nº 01
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9. RESPONSABILIDADES
Deben estar descritas en el manual general de
organización del Laboratorio o Unidad de
Microbiología y en las fichas de descripción de los
puestos de trabajo.
El procedimiento deberá llevarse a cabo por
personal técnico cualificado con un entrenamiento
específico. La supervisión de la técnica y de los
resultados emitidos deberá realizarla el Facultativo
Especialista Responsable del Laboratorio o Unidad
de Microbiología que los emite.
10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Todo el personal del laboratorio de microbiología
deberá conocer las normas generales de seguridad
e higiene. Estas recomendaciones deberán estar
recogidas en un documento establecido por el
Laboratorio de Microbiología.
11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- La sensibilidad de la técnica depende en gran
medida de una correcta toma de muestra y de una
buena extracción de ácidos nucleicos.
- Al no tratarse de una técnica comercial aprobada
para diagnóstico in vitro, este procedimiento debe
ser validado y sometido a los controles adecuados
en cada Laboratorio de Microbiología. Los
resultados obtenidos deben ser interpretados junto
con la información clínica del paciente.
12. BIBLIOGRAFÍA
1. Chen CY, Chi KH, Alexander S, Martin IM, Liu H, Ison
CA, Ballard RC. The molecular diagnosis of
lymphogranuloma venereum: evaluation of a real-time
multiplex polymerase chain reaction test using rectal and
urethral specimens. Sex Transm Dis. 2007; 34:451-455.
2. Chen CY, Chi KH, Alexander S, Ison CA, Ballard RC. A
real-time quadriplex PCR assay for the diagnosis of rectal
lymphogranuloma venereum and non-lymphogranuloma
venereum Chlamydia trachomatis infections. Sex Transm
Infect. 2008;84:273-276.
3. Jalal H, Stephen H, Alexander S, Carne C, Sonnex C.
Development of real-time PCR assays for genotyping of
Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol. 2007; 45:26492653.
4. Morré SA, Spaargaren J, Fennema JS, de Vries HJ,
Coutinho RA, Peña AS. Real-time polymerase chain
reaction to diagnose lymphogranuloma venereum. Emerg
Infect Dis. 2005;11:1311-1312.
5. Schaeffer A, Henrich B. Rapid detection of Chlamydia
trachomatis and typing of the lymphogranuloma venereum
associated L-serovars by TaqMan PCR. BMC Infect Dis.
2008; 8:56.
3
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-DC-02
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA NEUMONÍA POR Chlamydia pneumoniae
MEDIANTE MICROINMUNOFLUORESCENCIA
ELABORADO
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
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ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES
Edición inicial
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de su elaboración. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.
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Diagnóstico serológico de la neumonía por
Chlamydia pneumoniae mediante
microinmunofluorescencia
1. PROPÓSITO Y ALCANCE
Definir la metodología básica para la determinación de
anticuerpos frente a Chlamydia pneumoniae mediante
la técnica de referencia de microinmunofluorescencia.
2. FUNDAMENTO
C. pneumoniae es un patógeno respiratorio causante
de hasta el 10% de las neumonías adquiridas en la
comunidad y 5% de bronquitis y faringitis. Es una
bacteria intracelular de difícil cultivo, por lo que éste
no se recomienda como método de diagnóstico
clínico. La microinmunofluorescencia es el método de
referencia para el diagnóstico de las infecciones por
C. pneumoniae. Los anticuerpos específicos
presentes en el suero a estudiar reaccionan con los
antígenos de C. pneumoniae (cuerpos elementales
purificados) fijados en un portaobjetos. Tras un lavado
se eliminan todos los anticuerpos que no se han unido
y en un segundo paso se añaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con isotiocianato
de fluoresceína que formarán un complejo con los
anticuerpos que hayan quedado fijados en los pocillos.
Al examinar las preparaciones al microscopio de
fluorescencia, los pocillos en los que se observe el
patrón típico de fluorescencia indicarán presencia de
anticuerpos específicos de C. pneumoniae en la
muestra.
Para poder interpretar los resultados de la serología
mediante inmunofluorescencia es importante conocer
la cinética de la respuesta inmunológica.
Infección primaria: la IgM se detecta entre las 2-3
semanas tras la aparición de los síntomas, hasta 2-6
meses después. La IgG puede tardar en alcanzar
títulos elevados hasta 6-8 semanas tras el comienzo
de la enfermedad.
Reinfección: la presencia de IgM es variable. La
concentración de IgG se eleva en suero con mayor
rapidez que en la infección primaria y en 1-2 semanas
puede alcanzar títulos elevados.
Infección crónica: no hay ningún marcador
serológico que se pueda asociar inequívocamente con
infección crónica.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Loza E (Coordinador), Alomar P, Bernal A, Harto A,
Pérez JL, Picazo JJ, Sarazá ML. Seguridad en el
laboratorio de microbiología clínica. Procedimientos en
Microbiología Clínica nº 10, 1ª edición. SEIMC 2000.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiol
ogia
- Sánchez C (Coordinador). Guerrero C, Sánchez C.
Recogida, transporte, y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de microbiología.
Procedimientos en Microbiología nº 1a, 2ª edición.
SEIMC 2003.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiol
ogia
- Ficha técnica de Chlamydia pneumoniae IFA IgG e
IgM® (Laboratorios Vircell, Santa Fe, Granada).
PNT-DC-02
Edición Nº 01
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4. MUESTRAS
La muestra de elección para el diagnóstico serológico
de la infección por C. pneumoniae es el suero. Para
su obtención se recomienda realizar venopunción
guardando las medidas generales de asepsia,
utilizando jeringa estéril o dispositivo para tubo
primario
con
vacío
(ej.
vacutainerTM).
Es
recomendable utilizar un tubo seco para obtener suero
por centrifugación después de formado el coágulo.
Tratará de evitarse la utilización de tubos con
anticoagulante (obteniéndose así plasma) con el fin de
evitar posibles interferencias. La sangre debe
extraerse en condiciones asépticas para evitar
contaminación de la muestra. Las recomendaciones
son las generales para cualquier suero que se envíe al
laboratorio para su estudio. La sangre debe llegar al
laboratorio en el mínimo tiempo posible (máximo 2-3
horas), donde será centrifugada, separada y
conservada en refrigeración. Se puede mantener el
suero refrigerado a 4ºC hasta 72 horas. Si el ensayo
no se va a realizar antes de ese tiempo hay que
congelar la muestra a -20ºC. Si la muestra se quiere
conservar largos periodos de tiempo, se recomienda
su congelación a -80ºC. Hay que evitar congelaciones
y descongelaciones sucesivas.
Para determinación de IgG se recomienda analizar
sueros pareados obtenidos con 4-8 semanas de
diferencia.
La centrifugación del tubo de sangre se realiza a
1000-1500 g durante 10 minutos. No utilizar sueros
hiperlipémicos o contaminados.
5. REACTIVOS Y PRODUCTOS
5.1. DESCRIPCIÓN
a) Chlamydia pneumoniae IFA IgG, REF: PCHPNG
(Vircell):
- Vircell Anti-human IgG FITC conjugate: solución de
globulina anti-IgG humana marcada con fluoresceína
- Vircell Chlamydia IgG Positive control: suero
control positivo
- Vircell Chlamydia Negative control: suero control
negativo
b) Chlamydia pneumoniae IFA IgM, REF PCHPNM
(Vircell):
- Vircell Anti-human IgM FITC conjugate: solución de
globulina anti-IgM humana marcada con fluoresceína
- Vircell Anti-human IgG globulin (sorbent): sorbente,
suero de cabra anti-IgG humana.
- Vircell Chlamydia IgM Positive control: suero
control positivo.
- Vircell Chlamydia Negative control: suero control
negativo.
c) Reactivos comunes:
- Vircell Chlamydia slide (REF: SCHPN):
portaobjetos de 30 pocillos cada uno con 10 pocillos
para cada especie: C. pneumoniae, C. trachomatis y
C. psittaci.
- Vircell PBS: Tampón fosfato salino pH 7,2.
- Medio de montaje: glicerol tamponado.
- Agua destilada.
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Diagnóstico serológico de la neumonía por
Chlamydia pneumoniae mediante
microinmunofluorescencia
5.2. PREPARACIÓN
PBS: Agregar el contenido del vial Vircell PBS a 1L de
agua destilada. Agitar hasta su completa disolución.
Alternativamente puede usarse PBS pH 7,2 de
cualquier otra marca.
El resto de los reactivos y productos vienen listos
para su uso.
5.3. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Conservar entre 2-8ºC. No utilizar los componentes
del kit después de la fecha de caducidad.
El PBS una vez reconstituido es estable durante 4
meses a 2-8ºC. No debe emplearse si presenta
turbidez.
Usar todos los reactivos en condiciones asépticas
para evitar contaminaciones microbianas.
6. APARATOS Y MATERIAL
- Incubador 37ºC
- Microscopio de fluorescencia
- Pipetas automáticas
- Puntas de pipeta
- Placa de microtitulación
- Tubos de dilución
- Cubreobjetos 24 x 60 mm
- Cámara húmeda
- Cubeta de lavado
PNT-DC-02
Edición Nº 01
7. PROCEDIMIENTO
- Sacar los reactivos del frigorífico y dejar atemperar a
temperatura ambiente. No sacar los portaobjetos de
su envase hasta que se hayan atemperado.
- Realizar las determinaciones de IgG e IgM en
portaobjetos separados.
7.1. DETERMINACIÓN DE IgG
En caso de que se disponga de suero de fase aguda y
de fase convaleciente se analizarán las dos muestras
simultáneamente.
1.a. Para determinación de IgG, realizar un screening
de los sueros a diluciones iniciales de 1:8. Se titularán
los sueros positivos con diluciones dobles seriadas
hasta punto final. En una placa de microtitulación
preparar la dilución inicial de los sueros 1:8. Poner 10
µL de suero en 70 µL de PBS pH 7,2.
1.b. Para la titulación de los sueros positivos realizar
diluciones dobles seriadas con 50 µL de PBS pH 7,2 y
50 µL de la dilución anterior como se indica en la
figura 1, hasta la dilución 1:2048. Mezclar bien con la
pipeta y cambiar de punta entre cada dilución (figura
1).
2.a. Screening: añadir 5 µL de la dilución 1:8 del suero
en cada uno de los tres pocillos de una columna.
Repetir esta operación para cada uno de los sueros a
analizar (figura 2).
Figura 1. Diluciones dobles seriadas
SUERO
PBS
Figura 2. Distribución de los antígenos y sueros en el portaobjetos.
CP: C. pneumoniae; CT: C. trachomatis; CPs: C. psittaci; C-: control negativo; C+: control positivo
SUERO /
DILUCIONES
CP
CT
CPs
1ª 2ª
3ª
4ª
5ª…
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C- C+
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Diagnóstico serológico de la neumonía por
Chlamydia pneumoniae mediante
microinmunofluorescencia
2.b. Titulación: añadir 5 µL de la dilución mayor del
suero en cada uno de los tres pocillos de una
columna. Repetir esta operación para cada una de las
diluciones a analizar hasta 1:16 (figura 2). No es
necesario cambiar de punta de pipeta si se comienza
de la dilución mayor a la menor
3. Incluir en cada análisis controles negativo y
positivo. No diluir los controles. Añadir 5 µL de Vircell
Chlamydia IgG Negative control a cada uno de los tres
pocillos de una columna. Proceder de igual manera
con el reactivo Vircell Chlamydia IgG Positive control
(figura 2).
4. Incubar en cámara húmeda 30 minutos a 37ºC.
5. Enjuagar el portaobjetos con PBS pH 7,2 sin
verterlo directamente sobre los pocillos. Sumergir el
portaobjetos durante 10 minutos en una cubeta de
lavado con PBS.
6. Lavar ligeramente con agua destilada.
7. Dejar que los portaobjetos se sequen.
8. Añadir 5 µL de solución anti-IgG humana (Vircell
Anti-human IgG FITC conjugate) a cada pocillo.
9. Repetir los pasos 4 al 7.
10. Depositar una gota de medio de montaje en cada
pocillo y tapar con un cubreobjetos.
11. Examinar el portaobjetos en el microscopio de
fluorescencia con el ocular de 10x y objetivo de 40x.
Si no se va a realizar la lectura inmediatamente,
guardar la preparación en oscuridad a 2-8ºC durante
un máximo de 24 horas.
7.2. DETERMINACIÓN DE IgM
Para la determinación de IgM es recomendable preadsorber las muestras de suero para eliminar IgG que
podrían interferir en el ensayo. El precipitado que se
forma
tras
la
adsorción
puede
eliminarse
centrifugando el suero, aunque no es necesario ya
que no afecta al desarrollo de la prueba.
1. Diluir los sueros a analizar 1:2 añadiendo 25 µL de
suero y 25 µL de PBS pH 7,2 en un tubo.
2. Añadir 5 µL de sorbente de IgG (Vircell Anti-human
IgGglobulin) y agitar vigorosamente.
3.a. Screening: añadir 5 µL de la dilución 1:2 del suero
pretratado en cada uno de los tres pocillos de una
columna. Repetir esta operación para cada uno de los
sueros a analizar (figura 2).
3.b. Titulación: para la titulación de los sueros
positivos realizar diluciones dobles seriadas en PBS
pH 7,2 a partir del suero pretratado como se indica en
la figura 1, hasta dilución 1:16. En el caso de que
aparezcan resultados positivos frente a más de una
especie de clamidia, seguir diluyendo hasta que sólo
aparezca reacción positiva a una de ellas.
Añadir 5 µL de la dilución mayor del suero en cada
uno de los tres pocillos de una columna. Repetir esta
operación para cada una de las diluciones a analizar
(figura 2). No es necesario cambiar de punta de pipeta
si se comienza de lo más diluido a lo más
concentrado.
4. Incluir en cada análisis controles negativo y
positivo. No diluir los controles. Añadir 5 µL de Vircell
Chlamydia IgM Negative control a cada uno de los tres
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Edición Nº 01
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pocillos de una columna. Proceder de igual manera
con el reactivo Vircell Chlamydia IgM Positive control
(figura 2).
5. Incubar en cámara húmeda 30 minutos a 37ºC.
6. Enjuagar el portaobjetos con PBS pH 7,2 sin
verterlo directamente sobre los pocillos. Sumergir el
portaobjetos durante 10 minutos en una cubeta de
lavado con PBS pH 7,2.
7. Lavar ligeramente con agua destilada.
8. Dejar que los portaobjetos se sequen.
9. Añadir 5 µL de solución anti-IgM humana (Vircell
Anti-human IgM FITC conjugate) a cada pocillo.
10. Repetir los pasos 5 al 8.
11. Depositar una gota de medio de montaje en cada
pocillo y tapar con un cubreobjetos.
12. Examinar el portaobjetos en el microscopio de
fluorescencia con ocular de 10x y objetivo de 40x. Si
no se va a realizar la lectura inmediatamente, guardar
la preparación en oscuridad a 2-8ºC durante un
máximo de 24 horas.
8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN
DE LOS RESULTADOS
8.1. LECTURA DE LOS RESULTADOS
- La reacción es positiva si presenta fluorescencia
color verde manzana de morfología coco-bacilar.
- La reacción es negativa si no se observa
fluorescencia. Patrones de fluorescencia diferentes al
definido para la reacción positiva deben interpretarse
como negativos.
- El título de anticuerpos corresponde a la máxima
dilución en la que se observa una reacción positiva.
8.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
- La identificación de la respuesta específica de
especie se realiza en función de las diferencias de los
títulos obtenidos cuando se enfrenta el suero con los
antígenos de las distintas especies de clamidias.
- Infección aguda: IgM ≥ 1:16 o incremento de 4 veces
el título de IgG entre suero de fase aguda y suero de
fase convaleciente.
- Infección posible: un único suero con título IgG ≥
1:512.
- Probable infección pasada o exposición: un único
suero con título IgG ≥ 1:16.
8.3. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
- Los resultados se informan expresando el título de
anticuerpos, máxima dilución con la que se obtiene
una reacción positiva, para cada una de las especies,
C. pneumoniae, C, trachomatis y C. psittaci.
a) Microinmunofluorescencia IgG:
- Prueba Positiva, título IgG.
- Prueba Negativa, IgG< 1:8
b) Microinmunofluorescencia IgM:
- Prueba Positiva, título IgM.
- Prueba Negativa, IgM< 1:2
Añadir un comentario con la interpretación de los
resultados según se expone en el apartado 8.2.
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Diagnóstico serológico de la neumonía por
Chlamydia pneumoniae mediante
microinmunofluorescencia
9. RESPONSABILIDADES
Deben estar descritas en el manual general de
organización del Laboratorio o Unidad de
Microbiología y en las fichas de descripción de los
puestos de trabajo.
El procedimiento deberá llevarse a cabo por
personal técnico cualificado con un entrenamiento
específico. La supervisión de la técnica y de los
resultados emitidos deberá realizarla el Facultativo
Especialista Responsable del Laboratorio o Unidad de
Microbiología que los emite.
10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Todo el personal del laboratorio de microbiología
deberá conocer las normas generales de seguridad e
higiene. Estas recomendaciones deberán estar
recogidas en un documento establecido por el
laboratorio de Microbiología.
PNT-DC-02
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- El momento de la toma de muestra puede determinar
la obtención de resultados falsamente negativos
(niveles de anticuerpos indetectables si se toma la
muestra demasiado pronto en el transcurso de una
infección o demasiado tarde para observar
seroconversión).
- La ausencia de aumento significativo de anticuerpos
o negatividad de la prueba no excluye la posibilidad de
infección.
- Los resultados deben ser valorados junto con la
sintomatología clínica y otros procedimientos
diagnósticos.
- El rendimiento de esta técnica para el diagnóstico de
enfermedades producidas por C. pneumoniae distintas
de neumonía no se ha evaluado.
- La validez de esta técnica para seguimiento del
tratamiento no se ha evaluado.
12. BIBLIOGRAFÍA
11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- Se ha demostrado la presencia de títulos elevados
de anticuerpos IgM e IgG en individuos asintomáticos.
En personas mayores y pacientes con EPOC pueden
existir títulos de IgG persistentemente elevados en
ausencia de enfermedad aparente.
- La presencia de títulos elevados de anticuerpos en
una muestra única no deben ser usados para el
diagnóstico de infección reciente. Se recomienda
analizar muestras pareadas para determinar
seroconversión.
- La presencia de anticuerpos IgG en neonatos debe
ser interpretada con precaución por la posible
transferencia de anticuerpos maternos al feto. La
determinación de IgM es mejor indicador de infección
en niños menores de 6 meses.
1. De Ory F, Guisasola ME, Eirós JM. Detection of
Chlamydophila pneumoniae IgG in paired serum samples:
comparison of serological technique in pneumonia cases.
APMIS 2006;114:279-284.
2. Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields
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3. Fernández F, Gutiérrez J, Mendoza J, Linares J, Soto MJ.
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Microbiol 2004;44:275-279.
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-DC-03
AISLAMIENTO DE Chlamydia psittaci EN LA LÍNEA CELULAR McCOY
ELABORADO
REVISADO Y APROBADO
Jefe de Servicio
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01
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Aislamiento de Chlamydia psittaci en la línea
celular McCoy
1. PROPÓSITO Y ALCANCE
Definir y establecer la metodología básica para el
cultivo y aislamiento de Chlamydia psittaci a partir
de muestras patológicas de pacientes sospechosos
de padecer una infección por este patógeno. Este
protocolo puede ser empleado por todos los centros
que dispongan de un laboratorio de bioseguridad de
nivel 3 y que estén especializados en realizar
diagnóstico de laboratorio de infecciones por
microorganismos del género Chlamydia, y en el
empleo de cultivos celulares para el aislamiento de
virus y bacterias intracelulares obligadas. Su
aplicación se puede efectuar sobre muestras
clínicas obtenidas del tracto respiratorio que sean
remitidas al laboratorio de microbiología, con la
solicitud de detección por cultivo de este patógeno.
2. FUNDAMENTO
Los microorganismos del género Chlamydia son
bacterias intracelulares obligadas por lo que se
requiere del empleo de líneas celulares para su
cultivo y aislamiento. Chlamydia psittaci es un
agente zoonótico que se transmite desde múltiples
especies de aves al hombre, causando
principalmente un cuadro neumónico (psitacosis),
pero que puede derivar en diversas complicaciones,
originando
otros
cuadros
extrapulmonares,
habiéndose
aislado
el
microorganismo
especialmente a partir de las secreciones
respiratorias.
El cultivo de este microorganismo es complejo ya
que requiere la presencia de células vivas,
proporcionadas por los cultivos de diversas líneas
celulares susceptibles, como las células McCoy. La
identificación definitiva se realiza mediante una
técnica de inmunofluorescencia indirecta, que
emplea un anticuerpo monoclonal específico de C.
psittaci como anticuerpo primario, y un anticuerpo
conjugado con isotiocianato de fluoresceína como
anticuerpo secundario, o con técnicas moleculares
como la PCR, que además permiten el genotipado.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Loza E (Coordinador), Alomar P, Bernal A, Harto
A, Pérez JL, Picazo JJ, Sarazá ML. Seguridad en el
laboratorio de microbiología clínica. Procedimientos
en Microbiología Clínica nº 10, 1ª edición. SEIMC
2000.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbi
ologia
- Sánchez C (Coordinador). Guerrero C, Sánchez C.
Recogida, transporte, y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de microbiología.
Procedimientos en Microbiología nº 1a, 2ª edición.
SEIMC
2003.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbi
ologia
- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2004). Se
puede
consultar
en:
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosaf
ety/Biosafety7.pdf
PNT-DC-03
Edición Nº 01
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- Manuales de instrucciones de los diferentes
sistemas comerciales y aparatos utilizados.
- Procedimiento del laboratorio sobre gestión de
residuos.
4. MUESTRAS
Tipo de muestra, recogida, transporte y
conservación
Las muestras más adecuadas para el cultivo de C.
psittaci incluyen exudado faríngeo, esputo o lavado
broncoalveolar, que se recogerán según se indica
en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la
SEIMC nº 1a, 2ª edición (PNT-RTP-01, 2003). Se
recomienda que el paciente se enjuague la boca
con agua estéril o solución salina y que produzca
tos profunda para recoger muestras procedentes de
vías bajas. Las muestras se deben recoger en
contenedores estériles de un solo uso con cierres
con tapón de rosca y perfectamente etiquetados
antes de su envío al laboratorio. Si las muestras son
espesas, se añadirán 2 ml del medio de transporte
SPG. Los frotis faríngeos se recogerán con torunda
estéril en medio de transporte para Chlamydia (del
tipo "Escobillón para Chlamydia", Deltalab) que
contengan glutamato y un 1% de albúmina sérica
bovina, además de antibióticos que no afecten a
estos
microorganismos,
y
antifúngicos.
El
procesamiento de las muestras se realizará
inmediatamente o éstas se conservarán a -80ºC
hasta su envío. Si el cultivo se va a realizar en un
laboratorio perteneciente a un centro con diferente
localización del centro donde se ha tomado la
muestra, el envío debe llevarse a cabo en hielo seco
para prevenir la descongelación. Dadas las
características de este microorganismo, las
muestras deben manejarse como potencialmente
peligrosas, siguiendo las medidas de bioprotección
apropiadas.
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS
Todos los reactivos empleados pueden ser
suministrados por diferentes proveedores.
Medio de transporte SPG (Sucrose Phosphate
Glutamate)
Composición: sacarosa (150 g) + KH2PO4 (1,04 g) +
Na2HPO4.12H2O (6,15 g) + Acido glutámico (1,44 g)
+ Agua destilada (2 l). Se ajusta a un pH de 7,6 y se
esteriliza por filtración (0,22 µm). Para la
conservación de muestras que presumiblemente
contengan una alta contaminación bacteriana se
añaden antibióticos: gentamicina (50 µg/ml) y
anfotericina B (2,5 µg/ml).
Medio de cultivo para las células McCoy
Composición: se utiliza el medio esencial mínimo de
Eagle (EMEM) suplementado con suero fetal bovino
(al 10% para la infección del tapiz celular, y al 5%
para el mantenimiento de la línea celular McCoy) +
L-glutamina (200 mM) + glucosa (3,7 g/L) + piruvato
de sodio (0,01%) + extracto de levadura (1 g/L) +
hidrolizado de lactoalbúmina (5 g/L) + gentamicina
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Aislamiento de Chlamydia psittaci en la línea
celular McCoy
(50 µg/ml) + anfotericina B (2,5 µg/ml). Se esteriliza
mediante filtración (filtro de 0,22 µm).
Solución de tripsina
Composición: PBS (1 L) + tripsina (2,5 g) + EDTA
(etilen-diamino-tretra-acético, 0,25 g). Se ajusta el
pH a 7,2 y se esteriliza por filtración (filtro de 0,22
µm).
Tampón PBS-dietil-aminoetil-dextrano (PBSDEAE-D)
El tampón PBS se prepara según la siguiente
composición: NaCl (7,65 g) + Na2HPO4.12H2O
(0,724 g) + KH2PO4 (0,27 g) + agua destilada (1 l).
Su pH se ajusta a 7,2 y se esteriliza en autoclave a
121ºC durante 15 minutos. Posteriormente se
prepara una solución concentrada 100X del tampón
PBS-DEAE-D: PBS (100 ml) + DEAE-D (1 g). El pH
se ajusta a 7,2 y se esteriza por filtración (filtro de
0,22 µm).
Cultivos celulares
En los laboratorios especializados en cultivos
celulares se pueden utilizar viales de vidrio de fondo
plano de 15 mm de diámetro externo con tapón, que
contienen una laminilla de cristal redonda, de 12
mm de diámetro, sobre la que se cultiva una
monocapa confluente de células McCoy (ATCC CRL
1696). Estos viales estériles se preparan en el
laboratorio 24 horas antes de ser empleados,
colocando 2 ml de una suspensión celular ajustada
a 5 x 104 células por ml. También pueden utilizarse
viales de plástico desechables que contienen un
cubreobjetos de 13 mm de diámetro sobre los que
se preparan las monocapas de células, y que se
comercializan por varios laboratorios bajo el nombre
de "shell-vial".
6. APARATOS Y MATERIAL
6.1. APARATOS
- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de
bioseguridad tipo 2.
- Centrífuga con adaptadores para viales que
alcance una velocidad de 4.000 g.
- Estufa de CO2, programada para proporcionar una
atmósfera con un 5% de CO2.
- Micropipetas de varios volúmenes.
- Microscopio invertido, dotado de objetivos 10X,
20X y 40X.
- Microscopio de fuorescencia con filtros para
isotiocianato de fluoresceína, provisto de objetivos
de 20X y 40X.
- Pipeteadores automáticos.
- Bomba de vacío para aspiración.
- Agitador orbital tipo vórtex.
6.2. MATERIAL
- Guantes y bata de trabajo.
- Pipetas estériles de diferentes volúmenes.
- Puntas de micropipeta.
- Viales estériles de shell vial
- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm2.
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7. PROCEDIMIENTO
7.1. CULTIVOS CELULARES: MANTENIMIENTO
DE LA LÍNEA McCOY Y PREPARACIÓN DE LOS
VIALES SHELL VIAL
Las células de la línea celular McCoy se dejan
multiplicar hasta obtener la cantidad suficiente para
llevar a cabo el aislamiento. No obstante, cada vez
que el tapiz celular sea confluente, y en el caso de
no necesitar células para un aislamiento, éste se
somete a un pase. Para ello, se procede a disgregar
el tapiz mediante un tratamiento enzimático,
añadiendo al frasco de 25 cm2 un volumen de 2 ml
de una solución de tripsina después de retirar el
medio de cultivo, y dejándola actuar durante 1,5-2
minutos. Posteriormente, la solución enzimática se
elimina por aspiración, y las células, que se
terminan de despegar con ligeros golpes sobre el
frasco, se recogen en 5 ml de EMEM suplementado.
De este volumen, se transfiere 1 ml a un nuevo
frasco de 25 cm2 y se completa hasta 6 ml con
EMEM suplementado (medio de mantenimiento).
Transcurridos 3 ó 4 días de incubación del cultivo a
37ºC con un 5% de CO2, se tripsinizan de nuevo en
las condiciones ya referidas. En el momento de
disponer muestras patológicas para realizar un
aislamiento, las células se tripsinizan de nuevo y,
tras un recuento de las células viables mediante una
tinción con azul tripán (son viables las células
refringentes, que no permiten la entrada del
colorante) con una cámara hematocimétrica, se
transfieren a los shell vial a razón de 5 x 104
células/ml, con un total de 2 ml por vial (105 células
por vial). Los viales se incuban en las mismas
condiciones, hasta que el tapiz sea confluente y, por
tanto,
preparado
para
la
infección,
que
generalmente se realiza a las 24 h.
7.2. INOCULACIÓN DE LOS VIALES
Las muestras patológicas se diluyen al 1/5 en una
solución de PBS-DEAE-D preparada al 1/10.000 (a
partir de la solución madre previamente preparada
al 1/100). A continuación, especialmente si las
muestras son sólidas o semisólidas, tras una
homogenización con vórtex, se centrifugan a 300 g
durante 10 minutos a 4ºC, con el fin de eliminar los
restos más groseros. Se recoge el sobrenadante y
se realiza la inoculación de cada muestra sobre dos
viales simultáneamente. Para ello, se retira el medio
de cultivo de mantenimiento por aspiración y se
depositan 200 µL de muestra. Se incuba durante 90
minutos a 37ºC en una estufa de cultivos celulares,
con atmósfera húmeda y 5% de CO2. A
continuación, los viales se centrifugan a 2.200 g
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se elimina el sobrenadante y se
procede a un lavado con PBS (1 mL por vial). Una
vez eliminado este tampón por aspiración, se
añaden 2 mL por pocillo de EMEM suplementado
(medio de infección) y se incuban en la estufa de
CO2 a 37ºC, durante 40-48 horas. Transcurrido este
tiempo, uno de los viales, tras la eliminación del
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Aislamiento de Chlamydia psittaci en la línea
celular McCoy
medio de cultivo por aspiración, se lava una vez con
PBS (1 mL) y, tras su eliminación, se fijan las
células adicionando a cada pocillo 300 µL de
acetona al 80% en PBS (v/v), enfriada a -20ºC,
durante al menos una hora. Los shell vial se pueden
conservar a -20ºC hasta su lectura. El otro vial se
mantiene 72-96 h en incubación en las mismas
condiciones indicadas, al objeto de repetir los
mismos métodos si el resultado del primero es
negativo, o para conservar la cepa viable tras
congelación a -80ºC, para posteriores estudios, si el
resultado del primer vial es positivo.
7.3.
REVELADO
Y
OBSERVACIÓN
AL
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Para la visualización de las inclusiones clamidiales
que se forman en los cultivos de células McCoy
(casos positivos), se utiliza un método de
inmunofluorescencia indirecta, recurriendo a un
anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-LPS (género) o
anti-MOMP (específico de la especie C. psittaci)
comercializados por diferentes proveedores. Tras
retirar la acetona de las placas, se efectúa un
lavado con 500 µL de PBS y, tras su eliminación, se
añaden 300 µL por vial del AcMo a la dilución
recomendada por el proveedor, que se incuba
durante 45 minutos a 37ºC. Seguidamente, se lava
dos veces con PBS. Como anticuerpo secundario,
se utiliza un anticuerpo anti-IgG de ratón obtenido
en cabra, conjugado con fluoresceína (diferentes
proveedores), a la dilución recomendada por el
fabricante; como colorante de contraste, se emplea
el azul de Evans a una dilución 1/5.000. Se colocan
300 µL de esta mezcla en cada vial y se incuba
durante 45 minutos a 37ºC. La técnica finaliza con
tres lavados con PBS y un cuarto con agua
destilada, tras lo cual se elimina el agua sobrante y,
con el fin de favorecer la visualización de la
fluorescencia, una vez extraídas las laminillas de los
shell vial, se montan sobre una mezcla de PBSglicerol (1:9, con un pH ajustado a 8,6).
8.
OBTENCIÓN,
INTERPRETACIÓN
Y
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Una vez concluido el cultivo de las muestras
patológicas sobre las células McCoy al objeto de
aislar C. psittaci, se realizan las técnicas de
revelado mediante una inmunofluorescencia. Si, con
el empleo del microscopio de fluorescencia se
detectan inclusiones intracitoplasmáticas a las 42-48
horas de incubación, se considera que la muestra
es positiva. En caso negativo, hay que realizar la
misma técnica con el segundo vial a las 72-96 horas
para confirmar este resultado. Los resultados de la
inmunofluorescencia indirecta en el cultivo se
expresan en términos cualitativos de positivo o
negativo. Por otro lado, hay que considerar que con
el empleo de un anticuerpo monoclonal de género
(anti-LPS) no es posible diferenciar entre especies,
por lo que en el proceso respiratorio podría estar
implicada tanto Chamydia pneumoniae como C.
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psittaci. Por ello, es preferible emplear un AcMo
específico de esta última especie, o confirmar
mediante métodos moleculares, como la PCR, la
especie de Chlamydia aislada.
9. RESPONSABILIDADES
- Personal del área de recogida y procesamiento de
muestras: recepción, identificación y procesamiento
de las muestras, rechazo de las muestras remitidas
en condiciones defectuosas y adopción de medidas
correctoras.
- Personal técnico: control de las muestras,
solicitudes y hojas de trabajo, realización de la
técnica, lectura y registro de resultados, archivo de
hojas de trabajo.
- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y
de los resultados, resolución de dudas técnicas,
adopción de medidas correctoras en el caso de que
se hayan cometido errores, firma del informe de
resultados.
10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Un aislamiento positivo de C. psittaci indica la
presencia del microorganismo en la muestra y, por
tanto, si este resultado se asocia con otros datos
clínicos y epidemiológicos, es posible demostrar que
el paciente sufre una infección activa.
11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La principal limitación de esta metodología es su
dificultad, ya que se requiere un personal
especializado y la utilización de instalaciones de
nivel 3 de bioseguridad, por lo que su empleo queda
limitado a los laboratorios que cumplan estos
requisitos. Otro problema adicional es la
contaminación de las muestras patológicas por otras
bacterias, pese al empleo de antibióticos, lo que
dificulta la interpretación de los resultados.
Igualmente, no se recomienda el empleo de esta
metodología en aquellos pacientes que ya están
siendo sometidos a un tratamiento antibiótico, lo que
podría originar falsos negativos. Estos hechos
hacen que este procedimiento resulte poco viable
en la aplicación rutinaria en los laboratorios de
microbiología clínica hospitalarios, y sólo se deben
practicar en casos seleccionados y por los centros
debidamente equipados, tanto en infraestructura
como en personal especializado
12. BIBLIOGRAFÍA
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bacteria from clinical specimens: 13 years of experience. J
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Chlamydia trachomatis in shell vial centrifugation culture.
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3. Salinas J, Caro MR, Cuello F. Antibody prevalence and
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