Análisis por endonucleasas de restricción del ADN de cepas

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1989, 8 (3), 719-725.
Análisis por endonucleasas de restricción del ADN
de cepas locales de Leptospira interrogans
pertenecientes al serogrupo Pomona
J.L. BARRIOLA y M.A. SARAVI *
Resumen: La leptospirosis es una enfermedad de etiología microbiana causada
por la Leptospira interrogans. La especie interrogans esta constituida por más
de 200 serovares cuya clasificación por la técnica serológica convencional es
a menudo dificultosa.
Aunque la distribución de L. interrogans es mundial, la de sus serovares
sólo tiene importancia regional. En Argentina, los serovares de mayor
importancia epidemiológica pertenecen al serogrupo Pomona.
En 1981 fue introducido el análisis del ADN cromosómico por endonucleasas
de restricción (AER) con fines taxonómicos en el género Leptospira. En el
presente trabajo se aplica AER a cinco aislamientos de distinto origen geográfico
y obtenidos a partir de diferentes especies que han sido clasificados en nuestro
laboratorio, como pertenecientes al serogrupo Pomona y a los serovares pomona
y kennewicki como cepas de referencia.
Los resultados permiten destacar que los aislamientos presentan igual perfil
de restricción entre sí cuando se usan «Eco RI» y «Hha I + Bgl II», este es
similar al del serovar kennewicki y distinto al del serovar pomona. Estos
resultados podrían tener gran importancia epidemiológica,
fundamentalmente
en lo referente a profilaxis.
PALABRAS CLAVE: Biología molecular - Cepas vacunales - Leptospira
interrogans - Serovares - Taxonomía.
INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es u n a enfermedad infectocontagiosa que ataca al h o m b r e y los
animales, cuyo agente etiológico es la Leptospira
interrogans.
La especie interrogans esta constituida p o r más de 200 serovares agrupados
convencionalmente en 25 serogrupos.
La distribución de L. interrogans es mundial, a u n q u e las características de su
presentación pueden variar ligeramente de un lugar a otro debido al carácter regional
de la presencia de sus serovares y a su interacción con ese ambiente en particular (9).
* Instituto de Bacteriología CICV-INTA, Casilla de Correo 77, 1708 Morón, Provincia de Buenos
Aires, Argentina.
720
En Argentina, los datos serológicos señalan como serogrupos prevalentes a Sejroe
y P o m o n a , mientras que desde el p u n t o de vista de los aislamientos, los serovares
obtenidos con mayor frecuencia a partir de casos clínicos han sido los del serogrupo
P o m o n a (3).
La clasificación serológica convencional se basa en la determinación de títulos
mediante el test de microaglutinación (MAT), antes y después de la absorción del
suero hiperinmune convenientemente diluido con la cepa homologa y heteróloga, de
referencia e incógnita, siendo de fácil interpretación cuando se intenta tipificar a nivel
de serogrupo, pero mucho más compleja cuando se trata de hacerlo a nivel de serovar.
Muchas otras técnicas se han intentado usar p a r a clasificar taxonómicamente a
L. interrogans: análisis de lipasas ( 1 , 5), determinación de composición de bases y
estudios de homología del A D N (2, 6), análisis por inmunodifusión de antígeno del
filamento axial (4). E n 1967 Kmety (7) propuso u n m é t o d o serológico que es u n a
variación del original, pero presenta dificultades en la estandarización de los reactivos.
La aparición de diversas técnicas de biología molecular h a permitido otro enfoque
de la clasificación de leptospiras. Terpstra y col. han producido y utilizado anticuerpos
monoclonales para la clasificación de serovares pertenecientes al serogrupo Sejroe (10).
E n 1981 Marshall y col. propusieron la utilización de análisis por endonucleasas
de restricción (AER) del A D N cromosómico de L. interrogans con fines taxonómicos
(8), y posteriormente Thiermann y col. modificaron ligeramente la técnica original
y demostraron la correlación entre sus resultados y sus hallazgos epidemiológicos (11,
12).
E n la presente comunicación se muestran los resultados de la utilización de A E R
p a r a comparar cepas de referencia y cinco aislamientos hechos en Argentina,
pertenecientes al serogrupo P o m o n a , y se discuten los mismos con relación a algunos
hechos epidemiológicos observados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas de referencia
Las cepas de L. interrogans serovar pomona y serovar kennewicki,
suministradas por el C D C (Atlanta, Georgia, E E U U ) .
fueron
Cepas locales
Las cepas locales corresponden a aislamientos hechos por la Unidad de
Leptospirosis del Instituto de Bacteriología del CICV-INTA de Castelar, en diferentes
brotes de enfermedad y fueron obtenidos de distintas especies animales a saber:
Longchamps (origen h u m a n o ) , Cañuelas I y San Alfredo I (origen porcino), Fulton
(origen bovino).
La cepa Corrientes 266 fue aislada por profesionales de la E E A - I N T A de MercedesCorrientes a partir de un bovino infectado.
Todas las cepas locales h a n sido clasificadas en nuestro laboratorio por pruebas
serológicas de absorción cruzada, como pertenecientes al serogrupo P o m o n a .
721
Purificación del A D N de leptospiras
Fue realizado de acuerdo con lo señalado por Thiermann y col. (11).
Digestión con enzimas de restricción
Fueron digeridos aproximadamente 3 µg de A D N en las condiciones especificadas
por los productores de endonucleasas de restricción. Las enzimas utilizadas fueron
«Eco R I » , « H h a I» y «Bgl II» de B R L (Bethesda Research Laboratory, E E U U ) .
Electroforesis del A D N digerido
Fue realizada en u n gel de agarosa 0 , 7 % , usando buffer T B E , y las condiciones
de corrida fueron las indicadas por Thiermann y col. (11). La visualización fue hecha
por exposición del gel a la luz ultravioleta en u n transiluminador, previa coloración
con b r o m u r o de etidio.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos se muestran en las fotografías de las Figuras 1 y 2. E n
la digestión con «Eco RI» y en la digestión doble por « H h a I» y «Bgl II», se observa
que las cepas locales, independientemente de su origen, muestran idénticos perfiles
de corrida. Estos perfiles son similares al del serovar kennewicki, pero diferentes al
del serovar pomona (cepas de referencia).
E n la digestión con « H h a I», se observan diferencias entre los aislamientos y
también con la cepa de referencia serovar pomona.
DISCUSIÓN
El análisis de los resultados permite destacar la identidad de los perfiles de
restricción (con «Eco RI» y « H h a I + Bgl II») que muestran las cepas locales entre
sí, independientemente de su origen y lugar geográfico de aislamiento. Estos perfiles
observados son muy similares al serovar kennewicki y diferentes del serovar pomona.
Estos hallazgos coinciden con los observados por Thiermann y col., c u a n d o analizan
por esta técnica aislamientos realizados en E E U U , C a n a d á y Nueva Zelanda,
clasificados serológicamente como pertenecientes al serogrupo P o m o n a (11).
Las pequeñas diferencias observadas entre las cepas locales c u a n d o se utiliza
« H h a I», no pueden ser interpretadas y serán motivo de análisis posteriores, sin
embargo el perfil de las mismas sigue siendo diferente del serovar pomona.
Existen hechos epidemiológicos frecuentemente observados, como: nivel enzoótico
relativamente elevado en zonas sometidas a vacunación rutinaria, brotes agudos de
infección con aislamiento del agente causal en piaras y rodeos vacunados contra
leptospirosis.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo sumados a los hechos
epidemiológicos antes mencionados, indican la necesidad de reconsiderar el criterio
utilizado para seleccionar la cepa utilizada p a r a la elaboración de bacterinas.
Probablemente la utilización de cepas de importancia epidemiológica en la región
para la preparación de las mismas, daría mejores resultados.
722
FIG.
1
Perfil electroforético del A D N cromosómico
de L. interrogans serovares pomona y kennewicki
y aislamientos locales digeridos con «Eco RI» y «Hhal + Bgl II»
723
FIG.
2
Perfil electroforético del A D N cromosómico
de L. interrogans serovar pomona y aislamientos locales
digeridos con «Hha I» y «Bgl II»
724
AGRADECIMIENTOS
Los autores dan las gracias al Dr A . B . Thiermann por su participación en la
discusión de la metodología de trabajo; a los Dres R. de Torres y O. Rossetti por
su asesoramiento científico; a la Srta G . N . R o m e r o por su colaboración en la
elaboración del presente d o c u m e n t o .
*
* *
ANALYSE PAR LES ENDONUCLÉASES DE RESTRICTION DE L'ADN DE SOUCHES
LOCALES DE LEPTOSPIRA INTERROGANS
DU SÉROGROUPE POMONA. - J.L.
Barriola et M.A. Saravi.
Résumé : La leptospirose est une maladie bactérienne causée par Leptospira
interrogans. L'espèce interrogans comprend plus de 200 sérovars qui sont souvent
difficiles à classer par les techniques sérologiques conventionnelles.
Alors que la répartition de L. interrogans est mondiale, celle de ses sérovars
est régionale. En Argentine, les sérovars les plus importants du point de vue
épidémiologique appartiennent au sérogroupe Pomona.
L'analyse de l'ADN chromosomique par les endonucléases de restriction
a été appliquée pour la première fois en 1981 à la taxonomie du genre Leptospira.
Les auteurs ont employé cette technique sur cinq souches d'origines
géographiques diverses, isolées sur des animaux d'espèces différentes et classées
dans leur laboratoire comme appartenant au sérogroupe Pomona. Les sérovars
pomona et kennewicki ont été utilisés comme souches de référence.
Ces souches ont présenté un profil de restriction identique lorsque les enzymes
«Eco RI» et «Hha I + Bgl II» ont été utilisées, à savoir similaire à celui du
sérovar kennewicki et distinct de celui du sérovar pomona. Ces résultats
pourraient avoir une grande importance épidémiologique, notamment pour la
prophylaxie de la leptospirose.
MOTS-CLÉS : Biologie moléculaire - Leptospira interrogans - Sérovars Souches vaccinales - Taxonomie.
*
* *
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