Análisis mediante LC-MS/MS de hormonas y pesticidas en el agua

••• TRATAMIENTO DE AGUAS
Análisis mediante LC-MS/MS de hormonas
y pesticidas en el agua de laboratorio antes
y después de la purificación
En los últimos años, se ha utilizado la unión de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
o la cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UHPLC) con la espectrometría de masas para
el análisis de trazas y de ultratrazas de compuestos orgánicos para abordar las preocupaciones
sobre salud y seguridad humana y ambiental. Por ejemplo, se han detectado contaminantes
emergentes, como las hormonas, los compuestos farmacéuticos y los pesticidas polares, en las
aguas ambientales y potables de todo el mundo, aunque a nivel de trazas.1,2
Anastasia Khvataeva1, Mikael
Tilli2, Jevgeni Parshintsev2,
Josep Lluis Lliberia3, Anne
Chartogne4, Stephane Mabic1
Los contaminantes emergentes podrían ejercer efectos
ecotoxicológicos, incluso a
concentraciones muy bajas.3
Para afrontar los peligros de
los contaminantes emergentes,
la Agencia de protección ambiental (APA)4 y la Comisión
Europea5 han publicado varios
cambios en las nuevas normativas y métodos reguladores.
Otra área afectada por la seguridad humana y ambiental es el
sector agroalimentario, que recientemente ha sido obligado
a realizar una caracterización
más profunda de la cadena alimentaria, desde la materia prima hasta el producto acabado,
en respuesta a las demandas de
los consumidores de una mayor garantía de calidad, seguridad y origen de los productos
que consumen. Esto implica
la medición de componentes a
nivel de trazas, que pueden ser
beneficiosos (como los polifenoles), indeseables (los pesticidas) o prohibitivos (como las
toxinas).6
En el campo de la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), los
avances en los equipos y las
columnas dieron lugar a sis68
MAYO/JUNIO15
temas seguros que producen
resultados constantes y fiables.7 Además, los avances en
los equipos, junto con el rápido progreso en el desarrollo
de métodos analíticos, han
hecho posible detectar compuestos al nivel de trazas y de
ultratrazas.8 Por consiguiente,
es importante que los científicos que trabajan en el campo
de los análisis orgánicos de
ultratrazas recuerden que la
contaminación a concentraciones muy bajas es crítica y
debe evitarse o, por lo menos,
minimizarse. Los componentes del equipo de HPLC o
UHPLC, el espectrómetro de
masas,9 el manejo y la manipulación de la muestra1 y los
reactivos y disolventes utilizados en los análisis contribuyen a la contaminación.
El agua desempeña un papel importante en la HPLC y
la UHPLC, donde se utiliza
ampliamente en el procedi-
miento de trabajo. Los análisis de trazas y de ultratrazas
realizados usando esas técnicas requieren el menor ruido basal.10 Por consiguiente,
es importante examinar la
idoneidad del agua ultrapura utilizada en estos tipos de
análisis. Los contaminantes
orgánicos ionizables del agua
aumentarán el ruido de fondo, lo que disminuirá la sensibilidad. En separaciones de
gradiente usando columnas
de fase inversa, la etapa de
equilibrado normalmente requiere de 5 a 10 volúmenes de
columna de la fase móvil inicial,11,12 que contiene un elevado porcentaje de agua. Los
contaminantes orgánicos presentes en la fase móvil acuosa
se absorberán en la cabeza de
la columna y eluirán en forma de picos en los ulteriores
análisis de gradiente. La aparición de picos extraños en un
cromatograma es crítica para
1 Merck Millipore, Lab Solutions, Lab Water, rue Jacques Monod,
78280 St.-Quentin-en-Yvelines, Francia
2 University of Helsinki, Faculty of Science, Department of Chemistry,
Laboratory of Analytical Chemistry, P.O.Box 55, 00014 University of
Helsinki, Finlandia
3 Waters Cromatografia, S.A., Ronda de Can Fatjó, 7-A, 08290
Cerdanyola del Valles, Barcelona, España
4 Waters S.A.S, BP 608, 78280 St.-Quentin-en-Yvelines, Francia
quienes quieren identificar
compuestos
desconocidos
presentes en una muestra. El
pico extraño podría interpretarse erróneamente como un
componente de la muestra.13
Dados los bajos límites de
detección que son posibles
con los modernos equipos de
HPLC/UHPLC y MS, y las muy
bajas concentraciones involucradas en los análisis de trazas
y de ultratrazas, es importante
poder establecer que los analitos detectados proceden de
verdad de las muestras y no
del agua utilizada en las diversas etapas del experimento. En
este estudio, demostramos que
un sistema de purificación de
agua de laboratorio elimina
los contaminantes emergentes
(hormonas y pesticidas) encontrados en el agua corriente,
produciendo agua ultrapura
exenta de contaminantes que
podrían influir en la precisión y
la sensibilidad de los análisis de
trazas y de ultratrazas.
Parte experimental
Equipos, condiciones
cromatográficas y de MS
Para la investigación de las
hormonas, se utilizó un sistema de HPLC Agilent 1290
Infinity® acoplado a un sistema
de LC-MS Agilent® 6420 triple
cuadrupolo. La columna era
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••• tratamiento de aguas
Condiciones de la HPLC
Condiciones de la MS
Columna
Purospher STAR RP-18e (2 µm) 50 - 2,1
Modo de ionización para análisis hormonal
ESI+, MRM
Caudal
0,5 ml/min
Modo de ionización para análisis de pesticidas
ESI+ 0-6 min, ESI- 6-13
min; scan
Volumen de inyección
40 µl de muestra, 10 µl de patrones
Capilar
4000 V
Eluente A
Ácido acético al 1 % en agua Milli-Q
Nebulizador
37 psi
Eluente B
Acetonitrilo (LiChrosolv® Hipergrado)
Gas secante
N2, 7,5 l/min, 300 °C
Gradiente (tiempo,
minutos; %B)
0, 0%; 2, 0%; 5, 100%; 6, 100%; 9, 0%;
13, 0%
®
®
Tabla 1. Parámetros de HPLC y MS para LC-MS/MS (análisis de hormonas) y LC-MS (investigación preliminar de pesticidas) usando los sistemas de triple cuadrupolo (QQQ) Agilent® 1290 HPLC
y Agilent® 6420
Ion precursor (m/z)
Fragmentos (m/z)
Androstenodiona
Compuesto
287
97, 269, 109
(a) LC-MS (QQQ)
Atrazina
Androsterona
291
273, 255, 174
Dietilatrazina
Corticosterona
347
329, 311, 293
Cortisona
361
343, 163, 325
Estradiol
273
Estrona
Progesterona
(b) UHPLC-MS (QTOF)
Metamidofos
Monolinuron
Acefato
Clortoluron
Simazina
Metomilo
Metobromuron
Propazina
Dicrotofos
Atrazina
255, 159, 135
Cianazina
Atrazina-desetil
Linuron
271
253, 157, 197
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Metoxuron
Sebutilazina
315
297, 97, 279
Ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético
Cianazina
Terbutilazina
OH-Progesterona
331
313, 295, 271
Paraquat
Simazina
Metolaclor
Testosterona
289
96, 253, 271
Glifosato
Hexazinona
Buprofezin
Tabla 2. Transiciones de monitorización de reacciones múltiples (MRM) en la ionización por
electrospray (ESI+) para las hormonas (el fragmento más intenso aparece en negrita, el
orden de los fragmentos aparece por intensidad relativa).
Tabla 3. Lista de pesticidas que se analizaron mediante LC-MS (a) usando los sistemas de
triple cuadrupolo Agilent® 1290 HPLC y Agilent® 6420, y mediante UHPLC-MS (b) usando un
sistema de UPLC ACQUITY® acoplado a un espectrómetro de masas Xevo® G2-S QTof.
Condiciones de la UHPLC
Condiciones de la MS
Columna
ACQUITY® BEH C18 2.1x100mm
Modo de ionización
ESI+, MSE
Caudal
0,450 ml/min
Voltaje capilar
1,00 kV
Volumen de inyección
100 µl
Cono
20 V
Eluente A
10 ml de acetato de amonio (pH 5) en 990 ml de agua
Milli-Q®
Temperatura fuente
120 o C
Eluente B
10 ml de acetato de amonio (pH 5) en 990 ml de MeOH
Gas de desolvatación (nitrógeno)
1000 l/hr, 550 o C
Gradiente (tiempo, minutos;
%B)
0, 2%; 0,25, 2%; 12,25, 99%; 13, 99%; 13,01, 2%; 17,
2%
Tabla 4. Parámetros de UHPLC-MS para el cribado de pesticidas usando el sistema ACQUITY® UPLC y el espectrómetro de masas Xevo® G2-S QTof.
una Purospher® STAR RP-18
desactivada (2 µm) Hibar® HR
50–2,1 mm (Merck Millipore).
Para la detección de las hormonas se utilizó LC-MS/MS.
En la Tabla 1 se presentan los
parámetros instrumentales de
la HPLC y la MS para LC-MS/
MS. En la Tabla 2 se muestran
las transiciones de monitorización de reacciones múltiples
(MRM). Se midieron las concentraciones de nueve hormonas mediante el método de
adición de patrón.
Se realizó una investigación
preliminar de la presencia de
FARMESPAÑA INDUSTRIAL
pesticidas en muestras de agua
usando LC-MS. Los pesticidas
se identificaron provisionalmente emparejando los valores m/z.
En un conjunto separado de
análisis, se llevó a cabo un procedimiento de cribado de pesticidas establecido por Waters
Corporation usando una mezcla de 18 patrones de pesticidas (Tabla 3(b)). Se utilizó un
sistema de UPLC ACQUITY®
acoplado a un espectrómetro
de masas Xevo® G2-S QT; los
parámetros se muestran en la
Tabla 4.
Muestras y patrones
Para los análisis de hormonas
mediante LC-MS/MS y la investigación preliminar de los
pesticidas mediante LC-MS,
las muestras procedían de laboratorios de Finlandia, Francia, España, China e India. Había dos conjuntos de muestras:
(1) agua corriente y (2) agua
ultrapura procedente de unidades de purificación de agua
Milli-Q®. Se desecharon dos
litros de muestras de agua antes de la recogida de las muestras en botellas de borosilicato
que se enjuagaron tres veces
con agua ultrapura inmediatamente antes de su uso. Estas
botellas se limpiaron meticulosamente con agua ultrapura
y ultrasonidos, y se enjuagaron
con acetona y agua ultrapura,
antes de secarlas y cerrarlas
herméticamente, listas para su
uso. Se enriquecieron muestras de un litro mediante extracción en fase sólida antes
de los análisis de LC-MS/MS.
Para las muestras de Francia,
Finlandia, China e India se utilizó Merck Millipore LiChrolut® EN (polímero de divinilbenceno) y para la muestra del
MAYO/JUNIO15
69
••• tratamiento de aguas
Experimento
Sistema de purificación de agua utilizado
Finlandia
Milli-Q® Integral
Francia
Milli-Q® Integral con filtro LC-Pak®
España
Elix® + Milli-Q® Advantage A10® con filtro Millipak®
China
Elix® + Milli-Q® Advantage A10® con filtro Millipak®
India
Milli-Q® Integral
Hormona
del vertido municipal de aguas
residuales o residuos agrícolas.16 La concentración de androsterona en el agua corriente
del laboratorio francés fue de
515,3 ng/l y en el español de
1635 ng/l. Se detectó corticosterona en el agua corriente del
laboratorio de China (14,91
ng/l).
Concentración (ng/l)
Muestras de agua corriente
Después de la purificación
Estradiol
Androsterona
Corticosterona
265,4
ND
297,9
ND
515,3
ND
1635
ND
14,9
ND
Tabla 5. Concentraciones de hormonas en el agua corriente del laboratorio y el agua ultrapura producida a partir del sistema de purificación de
agua*. Límite de detección del instrumento (LDI): 10–50 ng/l. Límite de detección el método (LDM): 10–50 pg/l. *Todos los datos comunicados
son datos de un lugar y un momento concretos, no son representativos del agua en los diversos países en los que se obtuvieron las muestras.
laboratorio español se utilizó
Phenomenex® Strata-X™ (polímero de divinilbenceno).
En el experimento de cribado de pesticidas, se prepararon
seis conjuntos de mezclas de
pesticidas usando patrones;
cada pesticida tenía concentraciones finales de 1, 5, 10, 50,
100 y 1000 ng/l. Se utilizó agua
Milli-Q® recién producida para
preparar los blancos, los patrones y la fase móvil para investigar cualquier interferencia que
pudiera proceder del agua.
Sistemas de purificación de
agua
Los sistemas Milli-Q® producen agua ultrapura con resistividad de 18,2 MΩ·cm y una
concentración de carbono oxidable total (TOC) inferior a 5
µg/l (excepto en India, donde
el valor de TOC era de 48 ppb).
Discusión de resultados
El agua utilizada para análisis
de trazas y de ultratrazas mediante HPLC (UHPLC)-MS/
MS debe contener la menor
concentración posible de contaminantes orgánicos para
asegurar precisión y obtener
la sensibilidad óptima ofrecida
por el instrumento.
Detección mediante LC-MS/
MS de hormonas en el agua
corriente y el agua ultrapura
de laboratorio
De las cinco muestras de agua
corriente analizadas (de los laboratorios de Finlandia, Francia, España, China e India), se
detectaron estradiol y androsterona en el agua corriente de
los laboratorios de Francia y de
España, mientras que se detectó corticosterona en la muestra
de agua de China (Figura 1).
Concentración de hormonas
en las muestras de agua
corriente
El estradiol es un estrógeno
(esteroide) natural y sus fuentes son la excreción humana
(orina) y las medicinas de
prescripción.14 Se ha detectado en varios sistemas acuáticos, entre ellos algunos que
se usan como fuentes de agua
potable.15 Las muestras de
agua corriente se analizaron
por triplicado para detectar
la presencia de hormonas. Se
encontraron concentraciones
de estradiol en el agua corriente de la muestra francesa de
265,4 ng/l, mientras que en las
muestras españolas fueron de
297,9 ng/l. La androsterona es
una hormona esteroide andrógena excretada por humanos y
animales que acaba llegando a
las aguas superficiales a través
Concentraciones de hormonas
en las muestras de agua
ultrapura
Los laboratorios de Finlandia,
Francia, España, China e India tenían sistemas de purificación de agua que producían
agua ultrapura a partir del
agua corriente. El agua ultrapura se analizó por triplicado
para detectar la presencia de
hormonas. En Francia, España y China, donde se detectaron trazas de hormonas en el
agua corriente del laboratorio,
no se detectaron hormonas en
el agua ultrapura producida.
Los sistemas de purificación
de agua de los laboratorios
eliminaron eficazmente las
trazas de hormonas que estaban presentes en el agua del
grifo.
En la Tabla 5 se resumen los
resultados de la investigación
de hormonas.
Investigación preliminar
mediante LC-MS/MS de
pesticidas en el agua
corriente y el agua ultrapura
de laboratorio
Se utilizó LC-MS para hacer
una investigación preliminar
sobre la presencia de pesticidas en el agua corriente y en el
agua ultrapura producida des-
Figura 1A, 1B y 1C: Cromatogramas MRM de hormonas en el agua corriente del laboratorio y después de pasar por la purificación. (A) estradiol (B) androsterona (C) corticosterona.
70
MAYO/JUNIO15
FARMESPAÑA INDUSTRIAL
••• tratamiento de aguas
Figura 2. Cromatograma de iones extraídos del ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético en agua corriente y agua
ultrapura producida en el laboratorio español.
pués de la purificación. En la
Figura 2 se muestra el cromatograma de iones extraídos del
ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético en el agua del grifo (trazo
azul oscuro) que alimentaba
al sistema de purificación de
agua en un laboratorio de España. Los picos aparecidos a
los minutos 9,6 y 10,5 indican
la probable presencia de ácido
2,4,5-triclorofenoxiacético en
el agua corriente. Los picos
no aparecen después de que
se purificara el agua (Figura 2,
trazo azul claro). Este estudio
preliminar sugiere que el sistema de purificación de agua del
laboratorio podría eliminar
eficazmente los restos de compuestos orgánicos con valores
script que corresponden a los
pesticidas seleccionados para
análisis. Los resultados obtenidos justifican más investigación ya que no hay interferencias causadas por pesticidas u
otros compuestos que puedan
poseer la misma masa.
Detección de pesticidas
La detección de pesticidas mediante UHPLC-MS (QTOF)
requiere el uso de agua ultrapura en la preparación de la
fase móvil, los patrones, los
blancos y las muestras. Durante los análisis de laboratorio, los analitos suelen estar
presentes en las muestras en
concentraciones de ng/l e incluso en concentraciones menores, de 10 ng/l. La mezcla de
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Figura 3. Diagrama de calibrado para simazina.
La magnitud de la contaminación
orgánica es extremadamente importante
en los análisis LC-MS/MS de trazas
porque los contaminantes orgánicos
presentes en el agua afectan al
rendimiento del equipo, influyendo así en
la calidad de los datos generados
patrones puede utilizarse para
evaluar la idoneidad del agua
ultrapura, así como el rendimiento de la técnica de UHPLC-MS (QTOF) para el análisis de bajas concentraciones
de pesticidas. Aparentemente
el efecto de la contaminación
del agua será más pronunciado cuando se analizan patrones de concentraciones bajas
de pesticidas. Por tanto, se
analizó la idoneidad del agua
ultrapura para un método de
detección de pesticidas, usándola para preparar mezclas de
concentraciones conocidas de
pesticidas al nivel de ng/l, en
concreto, a 1, 5, 10, 50, 100 y
1000 ng/l, así como para preparar el blanco (muestra cero)
y la fase móvil acuosa. El resultado fue que no se detectaron
pesticidas en el blanco de agua
ultrapura. Además, se detectaron satisfactoriamente en
sus concentraciones iniciales
los patrones a bajos niveles de
concentración sin interferencias del agua ultrapura. En general, el uso del agua ultrapura
de gran calidad contribuyó al
excelente rendimiento de la
técnica UHPLC-MS (QTOF)
y, por tanto, al éxito del análisis. En la Figura 3 se representa
un ejemplo de una gráfica de
calibrado del experimento de
detección de pesticidas.
La importancia de la
concentración de carbono
oxidable total (TOC) en el agua
La magnitud de la contaminación orgánica es extremadamente importante en los
análisis LC-MS/MS de trazas
porque los contaminantes orgánicos presentes en el agua
afectan al rendimiento del
equipo, influyendo así en la
calidad de los datos generados.
La contaminación orgánica en
el agua utilizada para preparar
la fase móvil podría aumentar
el ruido basal, lo que produce una disminución en S/N
y dificulta la detección de las
concentraciones pequeñas de
los analitos. También podría
mostrarse como picos fantasma, lo que hace más difícil la
interpretación de los datos.
La concentración de carbono oxidable total (TOC) es una
indicación general de la contaminación orgánica del agua.
Se recomienda una concentración de TOC por debajo de 5
ppb para la LC-MS/MS. Los
sistemas de purificación de
agua de laboratorio, como los
utilizados en los experimentos
descritos en este artículo, están
equipados con monitores de
TOC incorporados de forma
que los usuarios conozcan el
valor de TOC del agua ultrapura que están utilizando. El
agua ultrapura o de tipo 1 procedente de un sistema Milli-Q®
adecuadamente instalado y
con buen mantenimiento tiene
un valor de TOC de 5 ppb. Hay
casos en los que el monitor de
TOC registra valores superiores a la especificación de 5
ppb; esas situaciones deberían
abordarse de inmediato.
Eliminación de trazas
orgánicas en el agua
corriente por los sistemas de
purificación de agua
Los sistemas de purificación de
agua de laboratorio utilizados
en este estudio combinan las tecMAYO/JUNIO15
71
••• tratamiento de aguas
Tabla 6. Tecnologías de purificación del agua usadas en la producción de agua ultrapura a partir del agua corriente.
nologías mostradas en la Tabla
6 para eliminar con eficacia
los contaminantes del agua corriente que los abastecen. Debe
tenerse en cuenta que, para
asegurar la calidad óptima del
agua, deben utilizarse y mantenerse adecuadamente sistemas
de purificación de agua.
Conclusiones
Utilizando LC-MS/MS se detectaron trazas de hormonas
en muestras de agua corriente
del laboratorio. Una vez purificada el agua corriente usando
un sistema de purificación de
agua de laboratorio, ya no se
detectaron las hormonas. La
investigación inicial indica que
el sistema elimina con eficacia
las trazas de pesticidas encontradas en el agua corriente
que lo abastece. Un sistema de
purificación de agua similar
produjo agua ultrapura para
72
MAYO/JUNIO15
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patrones en un protocolo de
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UHPLC- MS de alta resolución
(QTOF). En el análisis de mezclas que contienen concentraciones conocidas de pesticidas,
el agua ultrapura no introdujo
interferencia alguna, y las gráficas de calibrado exhibieron
una excelente linealidad. Los
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datos presentados en este artículo demostraron la idoneidad
de un sistema de purificación
de agua de laboratorio para la
producción de agua ultrapura
destinada al análisis de trazas
y de ultratrazas mediante LCMS/MS. Una fuente fiable de
agua ultrapura contribuye a
asegurar la obtención de datos
gran calidad 
Reconocimientos
Merck Millipore quiere hacer constar su
sincero agradecimiento al Laboratorio
de Química Analítica de la Universidad
de Helsinki, Finlandia, donde se realizó
el estudio de LC-MS/MS y, en concreto,
a Mikael Tilli, Raymundo Lizcano y
a la directora del laboratorio, MarjaLiisa Riekkola. Los autores agradecen
también a Maricar Tarun-Dube y a
nuestros colegas de Merck Millipore, en
particular a Cecilia Devaux y a Patricia
Renard, sus contribuciones.
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