daniela-vectores virales

27/05/2009
SISTEMAS VIRALES PARA
EXPRESIÓN DE GENES
2009
daniela capiati
EXPRESIÓN DE GENES: APLICACIONES
* Producción de proteína pura
- Determinación de estructura
- Estudios bioquímicos (actividad enzimática)
- Producción de anticuerpos
- Usos terapéuticos (insulina rec.)
* Caracterización funcional de genes
- Sobreexpresión/silenciamiento (hairpin siRNA): fenotipos
- Estudios de localización subcelular, interacciones, etc.
…bacterias, levaduras, eucariontes sup (transfección)….
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27/05/2009
Vectores virales para expresión de genes
* En células de mamíferos
-Adenovirus
-Retrovirus
-Virus adeno-asociados
Análisis de la función de
un gen (sobreexpresión/
silenciamiento,
localización)
* En células de insectos
-Baculovirus
Principalmente: Obtener
cantidades de proteína
pura
Vectores virales para expresión de genes:
Genomas virales modificados convertidos en vectores
portadores del gen que se quiere expresar.
Modificaciones para que el virus sea no-replicativo y no
mate la célula donde se quiere expresar la proteína 
deleciones de genes necesarios para la replicación viral.
(Excepto Baculovirus)
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27/05/2009
Vectores virales
Ventajas :
-elevada eficiencia de “transfección” (infección) y expresión
-se pueden expresar genes en muchos tipos celulares
difíciles de transfectar con otros métodos (cultivos
primarios)
Desventajas :
- laborioso
- riesgo biológico
Mecanismo general (adeno-retro-AAV)
1. Clonado del gen de interés en el vector viral (PLÁSMIDO)
2. Producción de virus rec en céls empaquetadoras
3. Obtención de partículas virales
4. Infección de la célula target
Virus: no-replicativo
complementar genes
deficientes en la cél
empaquetadora (plásmido o
genoma)
Cél empaquetadora
Infectar cél
target
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ADENOVIRUS
Vectores basados en Adenovirus
* Expresar proteínas en una gran variedad de células humanas y de
mamíferos (mitóticas y no mitóticas).
* Expresión transitoria (virus rec no se integra al genoma). Altos
niveles de expresión.
Adenovirus:
-Virus sin envoltura
-Genoma: DNA doble cadena lineal
-Infecciones respiratorias benignas en
humanos
-Subgrupo C (serotipos 2 y 5): vectores
-No se integra al genoma del huésped (virus wt
se replica como episoma en el núcleo)
Ciclo de vida
ADENOVIRUS
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ADENOVIRUS
… se desensambla la
cápside y el DNA viral
entra al núcleo
Núcleo:
DNA viralepisoma
transcripción,
replicación y
ensamblado
Viriones hijos salen
de la célula
(la célula muere)
ADENOVIRUS
Genoma: 35 kb
ITR
ITR
ITR: origen replicación
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Construcción del vector viral
ADENOVIRUS
deleción E1 (A yB) y E3  espacio para clonar DNA/hacerlo no-replic
ITR
ITR
ITR
E1A y B: necesarios para replicación
viral. Deben ser aportado por la célula
empaquetadora
Promotor (CMV)
pA: señal de poliadenilación
E3: evación de la rta. inmune – no es
necesario para la replicación
ADENOVIRUS
Vectores virales basados en adenovirus
*AdEasy® XL (Stratagene)
*Adeno-X ™ (Clontech)
*ViraPower™ Ad Expression System
(Invitrogen)
Genoma Ad: grandegen se clona en
vector shuttle (MCS-pCMV) y se
transfiere al pADEasy (genoma Ad E1E3 por rec homóloga en E. coli.
pBR322 ori
pBR322 ori
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ADENOVIRUS
pShuttle
-pCMV: prom const fuerte para céls
eucariontes sup
-MCS
-SV40 polyA: sitio de poliadenilación
del virus SV40
-Tag (FLAG o HA)
-ES (enhancer)
- ITRs
IRES-GFP
IRES: Internal Ribosome Entry Site
mRNA bicistrónico: expresar la prot de
interés y GFP (verificar expresión)
-ori/Kana: clonado en Coli
-seq para rec homóloga (PmeI)
pBR322 ori
ADENOVIRUS
1. cDNA vector shuttle*
2. Linealizar con PmeI
PmeI
polyA
PmeI
3. Cotransformar E. coli (Rec+)
con vector shuttle lineal y
pAdEasy-1
4. Recombinación homóloga
5. Selección de bacterias con
vector recombinado por kana
(screening, secuenciación)
6. Plásmido adenoviral
recombinate  PacI
7. Transfectar HEK293 (gen E1A
Infectar cél y B) partículas virales
recombinantes
target
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ADENOVIRUS
Vector Ad + GOI
Sin E1  no hay
replicación ni lisis.
EXPRESIÓN DEL GOI
E1A y B  replicación viral
HEK293 (microcarriers) transfectadas con
vector adeno/GFP
AdenoX Expression System2 (Clontech)
ADENOVIRUS
ΔE1/ΔE3
ViraPower™ Ad (Invitrogen): Gateway recombinación att del fago 
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RETROVIRUS
Vectores basados en Retrovirus
* Expresar genes en células humanas, de mamíferos y otras
* Expresión estable (integración en el genoma).
Retrovirus:
-Virus con envoltura
-Genoma: RNA cadena simple
-Se integra al genoma de la célula (previa transcripción
reversa)
-Vectores retrovirales:
1. Moloney murine leukaemia virus (MMLV): células
mitóticas
2. HIV-1 (lentivirus): mitóticas y no mitóticas
3. MESV (Murine Embryonic Stem Cell Virus): stem
cells y cels hematopoyéticas
Ciclo de vida
RETROVIRUS
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RETROVIRUS
LTR
LTR
Genoma: aprox. 10kb
Genes  gag, pol y env
gag: proteínas de la cápside
pol: transcriptasa rev
env: proteínas de la envoltura
Long terminal repeats (LTRs): promotor/seq involucradas en la
integración/sitio de poliadenilación
: señal de empaquetamiento
Construcción del vector viral
Expresión del cDNA:
-promotor 5' LTR viral
(o pCMV)
Capacidad: 7.5 kb
RETROVIRUS
Vectores: gag, pol, env  
espacio para clonar
DNA/hacerlo no replicat.
Queda : seq de
empaquetamiento
gag, pol, env: plásmidos en
células empaquetadoras
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RETROVIRUS
Vectores virales basados en MMLV
* ViraPortTM (Stratagene)
* Retro-X™ (Clontech)
Ampr
3´LTR
env
pUC ori
Ampr

 gag-pol-env
5´LTR
pBR322ori
gag-pol
Transfección cél
empaq con los 3
vectores
Producción de
retrovirus
recombinante
Infección de
célula target
Ampi r
RETROVIRUS
3´LTR

 gag-pol-env
5´LTR
Ampi r
pBR322ori
pFB
-prom LTR 5´viral + señal de empaq 
(gag truncado: parte del )
- LTR 3´: señal de poliadenilación
-MCS para gen de interés
-Ampi r/ori de E Coli
-IRES-neo: selección x G418 (mRNA
bicistrónico): para generar líneas de
células empaq estables productoras de
virus / para seleccionar céls target que
expresan el gen de interés
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RETROVIRUS
env  prot de la env (sup del virus)
Infección: interacción env-receptores
específicos
Definir rango de células huésped del virus 
eligiendo el vector env para transformar la
célula empaquet.
Ecotropic, amphotropic y 10A1: MMLV.
Ampr
pUC ori
VSV-G: glicoprot G
del virus de la
estomatitis
vesicular.
RETROVIRUS
Vectores v-Pack -env y -GP:
-prom CMV para gag-pol/env
-IRES-gen de resistencia a drogas para
generar líneas estables de cel empaq
productoras de virus
-Ampi r
-ori replicación en E Coli
Ampr
pUC ori
Ampr
poliproteína Gag-Pol  cortado por
proteasa
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RETROVIRUS
NIH3T3 infectadas
con pFB-Neo-GFP
RNA
RT
RNAdsDNA
RETROVIRUS
Células empaquetadoras con gag y
pol integrados al genoma (GP2-293
cell line)
env: se cotransfecta con el vector
de expresión retroviral (gen de
interés)
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27/05/2009
RETROVIRUS
Vectores virales basados en HIV-1 (lentivirus): no mitóticas/mitóticas
* ViraPower Lentiviral Expression System™ (Invitrogen)
* Lenti-X™ (Clontech)
Vector lenti-X:
*5´LTR y 3´LTR del HIV-1
* Señal de empaq 
*RRE (HIV-1): Rev response element – se
une la proteína Rev: exportación del RNA
genómico del núcleo para empaquetamiento en cit ( virus rec)
*cPPT/CTS (HIV-1): tracto de Polypurina /Central Termination Seq –
importación del HIV al núcleo. Mejora la integración y transcripción
*pCMV-MCS (puromicina: líneas estables)
*WPRE: (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory
element): promueve el procesamiento y maduración del RNA, aumenta
la exportación nuclear del RNA viral:  expresión del gen de interés
RETROVIRUS
Para obtener virus rec:
transfectar céls empaq con el
lenti-X (gen de interés) +
Packaging mix
*Packaging mix: 3 vectores:
-gag-pol
-env (elegir el gen env)
-rev: codifica para la proteína
REV que se une al RRE
(exportación del RNA genómico
del núcleo)
Infectar cél target
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RETROVIRUS
Vector lentiviral para silenciamiento: pLVX-shRNA1 (Clontech)
Se clona el shRNA (small hairpin) bajo el
promotor U6 (promotor para RNA pol III)
Infectar cél target
AAV
Vectores basados en virus adeno-asociados (AAV)
Expresar proteínas en células humanas y de mamíferos (mitóticas y no
mitóticas).
Virus adeno-asociados:
-Son parvovirus humanos no patogénicos
-Sin envoltura
-Genoma: DNA de cadena simple
-Infecta gran variedad cél (mitótica y nomitóticas)
-Ausencia de virus “helper” (adenovirus o
herpes simple): integra al genoma (no produce
viriones: latencia)
-Dependen de un virus helper para hacer ciclo
lítico y replicar
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AAV
Genoma
DNA cadena simple, aprox. 4.7 kb
rep: proteínas para la replicación (Rep 78-68-52-40)
cap: proteínas de la cápside (VP1-2-3)
ITRs: Inverted terminal repeats: origen de replicación, señal de
empaquetamiento, integración
Infección
Unión del
virus a la MP
AAV
Internalización
del virus por
endocitosis
Transferencia del
virus desde el
endosoma al
núcleo
Desensamblado:
ssDNA viral 
síntesis de la 2•
hebra de DNA 
dsDNA (forma
replicativa)
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27/05/2009
En el núcleo…
AAV
Ausencia de v helper:
AAV se integra
Rep78/68
AAV + v helper 
replicación del
genoma viral
(episoma) 
viriones
Latencia…
…Infección con v
helper: “rescate”
 genoma viral
se replica 
producción de
viriones
Construcción del vector viral
AAV
ITR
ITR
rep y cap deletados – espacio para el gen de
interés/hecerlo no replic
+ promotor + señal de pA
ITR
ITR
Para la producción de AAV recombinantes
La cél empaquetadora tiene que aportar:
-rep y cap
-genes del adenovirus (helper) (E1a, E1b, E2a, E4 y VA RNA)
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Vectores virales basados en AAV
* AAV helper-free System® (Stratagene)
AAV
-pCMV-MCS: clonar en pCMV-MCS  pAAV (Not1) (ITRs: recombinan)
-pAAV-RC: rep-cap (genes deletados en AAVrec)
-pHelper: genes adenovirus (fase lítica y producir AAVrec en cél emp)
Vector viral pAAV-Gen de interés:
-ITR del virus
-Gen de interés bajo pCMV/intrón
bglobina: + eficiente (expresiónestabilidad del mRNA)
-sitio de poliA
-Ampi r
-ori de rep en EColi
AAV
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Producción de AAVrec en cél empaquetadora:
AAV
pAAV-gen de interés se co-transfecta en célula
empaquetadora HEK293 con pAAV-RC y pHelper
pAAV-RC: rep y cap
deletados
pHelper: genes de
adenovirus 
producción de virus
AAV en HEK293
HEK293: genes de
adenovirus E1A y E1B
(integrados)
empaquetamiento de
viriones
Infección de cél target con AAVrec:
AAV
En condiciones noreplicativas y  título
de virus: integración
(expresión estable)
HT1080/ pAAV-GFP
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Adenovirus-Retrovirus-AAV
Vectores basados en adenovirus, retrovirus y AAV  Expresar genes
(proteínas) en:
-células en cultivo (analizar la función de un gen)
-in vivo: análisis funcional en animales
fines terapéuticos (terapia génica)
Baculovirus
Expresión de Proteínas en células de Insectos
Baculovirus
Baculovirus  obtener grandes cantidades
de una proteína pura
Ventajas del sistema Baculovirus
* Modificaciones postraduccionales
-puentes disulfuro
-fosforilación
-glicosilación
-oligomerización
-folding correcto
-clivaje proteolítico
* Alto nivel de expresión (25-50% del total de prot)
* Capacidad para insertos largos (15 kb)
* Sitema escalable de mL a L
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27/05/2009
Baculovirus
Baculovirus
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)
-Con envoltua
-Virus que infecta insectos
-Genoma: 135 Kb - DNA doble cadena – circular ccc
-154 ORFs
Baculovirus (AcMNPV)  2 formas:
* Virus ocluído: en
* Virus
budded
Ciclo de vida
estructura proteica
 polihedrina
(cuerpos de oclusión)
Polihedrina 
proteje
Baculovirus
larva ingiere CO
Virus entran en céls del intestino
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Baculovirus
Sistema de expresión de proteínas basado en Baculovirus
* AcNPV  vector para expresar el gen de interés
* Líneas celulares: Sf9-Sf21
(Spodoptera frugiperda)
Sf9 infectadas con
baculovirus
Sistemas de Baculovirus
* BaculoGold™ (BD Biosciences)
* BacPak (Stratagene): similar al BaculoGold
* BaculoDirect™ (Invitrogen): Gateway
BaculoGold™ (BD Biosciences)
Baculovirus
Genoma de baculovirus: muy
grande para clonar directamente.
gentransfer vector entre seq
homólogas al genoma de
baculovirus para transferirlo al
genoma de Baculovirus
(BaculoGold) x rec hom.
Cotransfectar Sf9 con BaculoGold
y tranfer vector+gen.
Rec hom  genoma baculo + gen
de interés
-Producción de prot rec.
-Producción de partículas virales que pueden re-infectar e infectar
otras céls y producir más virus recombinantes (y proteína rec)
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Baculovirus
Baculovirus
BaculoGold:
Gen de polihedrina
deletado, incluso su
promotor (lineal): no
forma cuerpos de oclusión
gen de interés: se clona en
el transfer vector bajo el
promotor de la polihedrina
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Baculovirus
Transfer Vectors:
-Ampi r
-Ori EColi
-Promotor de polihedrina
upstream MCS
-Prom/MCS: flanqueado
por regiones homólogas al
BaculoGold para
recombinar
Existen otras versiones
con otros promotores y
tags para purificación
(GST-6xHis)
Baculovirus
Cells infectadas con
baculo wt  CO
Cells que expresan
XylE recombinante 
amarillas
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BaculoDirect™ (Invitrogen)
Baculovirus
BaculoDirect: genoma
del Baculovirus
(lineal) sitio dentro de
lacZ
His-V5 en N-term
(también en C-term;
señal para secreción)
Gateway entry
clone: clonar gen
de interés (rec att
fago)
BaculoDirect + gen
de interés
*Prom polyhedrin
(PPH)
*Timidina kinasa (TK):
selección neg de virus
no-recombinantes
(ganciclovir)
*Epitope V5 + (6xHis)
para detección y
purificación
*Sitio para Proteasa
de TEV
Baculovirus
Transfección de Sf9
Seleccionar con ganciclovir (nucleósido análogo): TK lo P e
incorpora al DNA viral: no puede replicar (Tb se incorpora al
DNA celular: letal)
Colectar virus, infectar para amplificar (ganciclovir): test para
ver expresión de proteína de interés
Scaling up
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