Estructura Genoma Eucariota Estructura Genoma Procariota

Estructura Genoma
Procariota
• Organización compacta (poco espacio
entre genes)
•Información adicional en plásmidos
• DNA no codificante en pequeños
segmentos dispersos en el genoma
(<11%)
• No hay intrones
• Organización en operones (E.coli aprox
600 operones con 2 o más genes)
Estructura Genoma
Eucariota
•Genoma Nuclear
• Genoma compuesto por 2 o más
moléculas de ADN linear (cromosomas)
• Organización menos compacta
• DNA repetitivo (disperso y en tandem)
• Intrones
•Genoma organelas
•Generalmente DNA circular
•Nº elevado de copias por organela
•Numerosas organelas por célula
1
Estructura Genoma Procariota
• DNA genómico  Nucleoide : empaquetamiento en forma organizada
Molécula de DNA circular única (80%)
+ Proteínas básicas asociadas
Super-enrollamiento
(agregado de giros al DNA)
•DNA girasa (topoisomerasa II)
•DNA topoisomerasa I
2
Nucleoide
• Organización de dominios : 40-50 Loops super-enrollados (100kb)
•DNA genómico unido a un “core” proteico a partir del cual radian los loops
•Proteínas asociadas: DNA girasa, DNA topoisomerasa I, más al menos 4 proteínas  HU
la más abundante (Tetrámeros)
3
Variaciones en Procariotas
•Algunos genoma linear Ej: Borrelia burgdorferi
•Algunos genomas de tamaño mayor Ej. B.megaterium (30 x 106pb)
•DNA circular o linear subgenómico  genoma multipartito (Brivio cholera (2
cromosomas circulares, uno genes involucrados en metabolismo y virulencia), Borrelia
(hasta 11 copias de 1 único cromosoma linear)
•Archae empaquetamiento con proteínas similares a Histonas
4
Genoma eucariota nuclear
•
Moléculas de DNA linear  Cromosomas
5
Características de los cromosomas
•
Centrómero:
–
DNA centromérico: secuencias repetitivas
• humanos DNA alfoide: repeticiones de 171pb
(1x106pb) (1500-30000 copias)
• Arabidopsis: repeticiones de 180pb (0.9 a
1.5MB)
• Levaduras (S. cereviciae) : secuencia mínima
125pb
–
Proteínas unidas al centrómero
• humanos al menos 7 proteínas, una de ellas
CENP-A reemplaza a histona H3, formando
nucleosomas más compactos
–
Cinetocoro: unión de microtúbulos
6
7
•Telómeros
– Indica el extremo de los cromosomas y los protege
• Evita recombinación entre cromosomas
• Evita la unión de extremos de cromosomas
– Replicación completa de los cromosomas
– Organización funcional de cromosomas en el Núcleo
–DNA repetitivo
•Humanos: cientos de copias de la secuencia
– 5’-TTAGGG-3’
–Extensión del extremo 3’ como simple cadena
–Proteínas teloméricas:
•TRF1 (regula el largo de los telómeros)
•TRF2 (mantiene la extensión de DNA simple cadena,
T loop)
8
Copyright 2004 Nature Publishing Group, DeLange, T., T-loops
and the origin of telomeres, Nature Reviews Molecular Cell
Biology 5, 323-329
9
Cromatina : 50% DNA + 50% Proteínas básicas (Histonas)
1er nivel de organización: NUCLEOSOMAS
ADN:
aprox 200pb
• ADN asociado al core 147 pb
• ADN linker 10-90 pb
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Histonas core:
H2A H2B H3 H4
Histonas linker:
H1 a-e, H1º, H1t y H5
11
12
Histonas: dominio carboxilo terminal globular +
cola amino terminal desestructurada
Modificaciones de Histonas
Metilación y Acetilación: grupo amino
libre de Lisina
Metilación: en Arginina
Fosforilación: grupos OH de Serina y
Treonina
13
Modificaciones de Histonas
•
Modificaciones:
–
Acetilación/ Deacetilación de residuos Lys (HAT / HDAC) Accesibilidad transcripcional de
la cromatina
•
–
Metilación de Lys y Arg Depende del nº de grupos metilo y del residuo modificado
•
•
•
–
H3K4  genes activos
H3K9 y H3K27  genes inactivos
Metilación R  marca activa o represiva
Fosforilación de Ser y Thr
•
•
Acetilación de H3 y H4: neutralización de cargas positivas de Histonas  genes activos
mitosis y meiosis: condensación/ decondensación de cromatina
–
Ubiquitinación de K
–
Sumoilación de K
–
ADP ribosilación
Variantes de Histonas
–
Reemplazan a H3 o H2A en algunos nucleosomas
• CENP-A en centrómeros
14
Nucleosomas y fibra de 30nm
15
•Unión del DNA a la matriz nuclear : MAR (sec. ricas en AT)
•Dominios estructurales y funcionales
Dominios estructurales
•Loops de ADN
Dominios funcionales
Loops de ADN 40100kb
•Regiones sensibles a
DNasa
•Límites: regiones
aislantes, 1-2kb
(insulator)
16
Empaquetamiento en
cromosomas
Mitóticos
17
18
Heterocromatina /Eucromatina
Heterocromatina
•Principalmente DNA
repetitivo (Centrómeros,
Telómeros, Transposones)
•Baja densidad génica
•Densamente empaquetada
•Sin sitios HS
•Ordenamiento regular de
nucleosomas
•Replicación tardía en fase S
Eucromatina
•Sensibilidad a nucleasas
•Alta densidad génica
•DNA potencialmente activo
transcripcionalmente
•Histonas acetiladas
•Metilación Lys-4 H3
•DNA no metilado
•Crossing-over reducidos
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• Heterocromatina: Modificaciones covalentes características
– Histonas desacetiladas
– Metilación Lys-9 H3 (unión prot HP-1) (H3 K9)
– Metilación DNA (CpG)
•
Heterocromatina constitutiva
– Grandes regiones principalmente secuencias repetitivas
• Telómeros, centrómeros, transposones
•
Heterocromatina Facultativa
– Regiones genómicas empaquetadas en algunos grupos de células o en 1 solo
cromosoma homólogo
• Cromosoma X
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Mecanismos Epigenéticos en mamíferos
MECANISMO EPIGENETICO: cualquier mecanismo que provee información
regulatoria a un genoma sin alterar su secuencia primaria de nucleótidos
•Las modificaciones enzimáticas del DNA y de las histonas que forman el core del
nucleosoma proveen información epigenética heredable, no codificada en la secuencia
de nucleótidos de la célula.
21
Modificación enzimática del DNA Metilación de citosinas (C)
Modificación enzimática del C5 de la base Citosina, en su mayoría en dinucleótidos CpG
(islas CpG)
Establecimiento y mantenimiento de patrones de metilación del ADN requiere 3 enzimas
catalíticamente activas: DNA metiltransferasa 1 (Dnmt1), Dnmt3a y Dnmt3b.
Dnmt2 y Dnmt3L (sin subunidad catalítica) se expresan en algunos tipos celulares y en
células embrionarias.
•Patrón de metilación de una célula  Resultado de un proceso dinámico de
metilación/demetilación
•El patrón de metilación de una célula somática diferenciada es estable y heredable
(DNMT1)
22
•Reprogramación del patrón de metilación (demetilación /remetilación) en 2
etapas del desarrollo:
•células germinales
•preimplantación del embrión
 Demetilación global del genoma y remetilación “de novo” (DNMT3 A y B)
•Células espermáticas y óvulos altamente metilados y con metilación
diferencial de algunos genes en ambas células (genes “imprinted”)
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Modificación enzimática del Histonas  Código de Histonas
•Metilación de Lisinas (K) y Argininas (R): Distintos efectos
dependiendo del número de grupos metilo y la posición del residuo.
- Genes inactivos, heterocromatina  H3K9 y H3K27
- Genes activos, eucromatina  H3K4 + acetilación de H3 y H4
•Acetilación / deacetilación (K): correlaciona con accesibilidad de la
cromatina para la transcripción (HAT, HDAC)
•Ubiquitinación (K)
•Sumoilación (K)
•Fosforilación Treoninas (T) y Serinas (S)
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Modificación enzimática DNA y de Histonas
•Modificación de la estructura de la cromatina
•Activación / Inactivación de genes
•Rol en respuesta al daño celular: modificación de Histonas
(fosforilación) en respuesta a ruptura de doble cadena  señal para
mecanismo de reparación
•Inactivación de elementos transponibles
25
•REGULACIÓN EPIGENÉTICA DE LOS GENOMAS DE MAMIFEROS
•PROMOTORES
•REGIONES REGULATORIAS DISTALES
•IMPRINTING
•INACTIVACION CROMOSOMA X
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Cromosomas sexuales
Cromosoma Y
Cromosoma X
•Pequeña región de homología con
cromosoma X
•1000-2000 genes (distrofina, proteínas de
coagulación sanguínea)
•95% no autosomal (seq transpuestas de
X, seq de X degeneradas, Amplicon (8
bloques palindrómicos)
•La mayor parte de los genes sin
contraparte en el Y (solo 9 genes
descriptos)
•Pocos genes (aprox 156, la mitad
pseudogenes)
•Inactivación de un cromosoma
(compensación de dosis)
•60 genes específicos de macho que se
expresan en testículo (gen SRY)
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Heterocromatina Facultativa
Inactivación del cromosoma X
28
•Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals
•Wolf Reik & Annabelle Lewis
•Nature Reviews Genetics 6, 403-410 (May 2005)
29
Copyright 2005, Nature Publishing Group, Huynh, K. D., et. al., X-chromosome inactivation: a
hypothesis linking ontogeny and phylogeny, Nature Reviews Genetics 6, 410-418
30
Inactivación del cromosoma X
Modificación del estado de la cromatina (actividad de acetilasas, metilasas).
Metilación del ADN
Bajos niveles de acetilación de Histonas (H4)
Bajos niveles de metilación de H3K4
Altos niveles de metilación de H3K9 y H3K27 asociados a silenciamiento
génico.
Nucleosomas del Xi presentan una variante de histona llamada macroH2A.
Inicio de la Inactivación
Inicio en un locus específico Xic y progresión a todo el cromosoma.
Sitio de iniciación Xic: Gen Xist  ARN no codificante ARN Xist.
31
X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation
Philip Avner & Edith Heard
Nature Reviews Genetics 2, 59-67 (January 2001)
32
X-chromosome inactivation:
counting, choice and initiation
Philip Avner & Edith Heard
Nature Reviews Genetics 2, 59-67
(January 2001)
ARN Xist: permanece unido al ADN, recubrimiento del cromosoma Xi.
 Señal para el inicio de modificaciones de la cromatina (hipoacetilación,
metilación del ADN)
Gen Tsix: Transcripto antisentido Tsix
 Regulador negativo de Xist: Regula la elección del cromosoma X que
permanece activo
Región Xpr: sensado del número de cromosomas X.
Coordina la expresión reciproca de Xist/ Tsix
33
34
Células embrionarias no
diferenciadas  ambos
cromosomas X activos
expresión de ARN Xist
transiente en ambos
cromosomas.
Células embrionarias
diferenciadas 
cromosoma X inactivo
recubierto por ARN Xist
X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation
Philip Avner & Edith Heard
Nature Reviews Genetics 2, 59-67 (January 2001)
35
Modelo de inactivación del
cromosoma X
X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation
Philip Avner & Edith Heard
Nature Reviews Genetics 2, 59-67 (January 2001)
36
Imprinting
Genes cuya expresión está determinada por su origen parental.
La característica de los genes “imprinted” es expresión monoalélica y patrón de
metilación del DNA específico de acuerdo a su origen parental.
Asimetría en la función de los genomas
parentales
Expresión exclusiva del alelo materno por imprinting del paterno o viceversa
Primeros genes “imprinted” descubiertos:
Factor de crecimiento insulínico tipo 2 (Igf2) y su receptor (Igf2r)
37
Mecanismo de imprinting:
•
Iniciado durante gametogénesis, metilación en forma diferencial en
espermatogénesis y ovogénesis (Dnmt3a y Dnmt3bL).
•
Genes “imprinted” (ratones: aprox 100 genes identificados).
Funciones distintas: crecimiento y desarrollo fetal y placentario
•
En general genes “imprinted” agrupados en “clusters”: genes de
expresión materna o paterna y al menos un ARN no codificante (nc
RNA).
•
Región de control del “imprinting” ICR (ICE o DMR) con metilación
del ADN y modificaciones de histonas alelo específicas de acuerdo
al origen parental.
Formación de células germinales primordiales: Remoción de todo imprinting
Los patrones de metilación genómica de ovocitos y espermatozoides
depende de la actividad de ADN metiltransferasas Dnmt
38
Genes Dev. 2009 September 15; 23(18): 2124–2133.
39
Trends Genet. 2007 June; 23(6): 284–292.
40
Genoma de Organelas
•
Herencia “no medeliana”, segregación somática
•
Origen endosimbiótico
•
Moléculas de DNA circular, en general
•
Número de copias por organela elevado (10- 100)
•
Tamaño variable
– Mitocondrias: 16,5kb mamífero – 366 kb en plantas (hasta 2400 kb en algunas
plantas)
– Cloroplastos: 100-200kb
•
Contenido genético
– Proteínas involucradas en procesos de la organela
– RNA ribosomales y de transferencia
•
Acumulación de mutaciones diferente a DNA genómico
– En mamíferos tasa de mutación mayor, en plantas menor.
41
• Genoma mitocondria
•Genoma cloroplastos
– Tamaño variable
–
• Mamíferos 16,5 kb
•100- 200kb
• Levaduras 84 kb
•Aprox 200genes
• Plantas superiores: de 100 a
2400kb (Maiz 570kb)
•20 a 40 copias/ organela
5 a 90 genes (37 genes en
•20 a 40 organelas /célula
•Intrones
mamíferos)
– Intrones
– Sec.intergénica
– Duplicaciones
– Círculos subgenómicos
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Comparación del genoma mitocondrial de levadura y
mamífero
Mamífero
16kb Extremadamente compacto
Sin Intrones
Algunos genes superpuestos
13 genes codifican proteínas (cad
respiratoria)
Levadura
84kb
Intrones
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Genoma mitocondria (levadura)
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Genoma cloroplasto (arroz)
Cloroplasto
120-190kb
 Intrones
87-183 genes
4 RNA rib
30-32 ARNt
 genes codifican proteínas aprox 50
Prot ribosomales
RNA polimerasa
Fotosíntesis
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