(hormona estimulante de la tiroides) IRMA kit

RK-1CT1ECE040701 2. CALIBRADORES (S0-S100), 8 frascos listos Opción A: Método “económico”
TurboTSH IRMA KIT
RK-1CT1. Estuche para 100 determinaciones
Ensayo
inmunoradiométrico
para
la
determinación cuantitativa in vitro de la hormona
estimulante de la glándula tiroides (tirotropina,
hTSH) en suero humano, en el rango de 0-100
µIU/mL.
Introducción
La hormona estimulante de la glándula tiroides
(hTSH, tirotropina) es una glicoproteína de 28000
Da segregada por la hipófisis anterior. Al igual
que otras hormonas glicoproteicas (hFSH, hLH,
HCG) la hTSH está compuesta por dos
subunidades: α y β, unidas por enlaces no
covalentes. La estructura de la subunidad α es
prácticamente igual para las cuatro hormonas
mencionadas, mientras que las unidades β se
diferencian y son responsables por la actividad
biológica de cada molécula.
La síntesis y secreción de la TSH es estimulada
por la hormona liberadora de tirotropina (TRH),
producida en el hipotálamo y además está
regulada por los niveles circulatorios de las
hormonas tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina
(T3) a través de un mecanismo de
retroalimentación negativa. Las concentraciones
elevadas de las hormonas tiroideas producen un
descenso en la secreción de TSH, mientras que las
concentraciones bajas llevan a un aumento en su
secreción. El incremento de la concentración de
TSH es el mejor y más temprano indicador del
hipotiroidismo primario.
La determinación de las concentraciones séricas
de TSH juega un papel fundamental en el
diagnóstico y monitorización terapéutica de las
enfermedades tiroideas y en la evaluación de la
integridad funcional del eje hipotálamo-hipófisisgonadal.
La extraordinaria sensibilidad del presente ensayo
permite la medición de niveles subnormales de
TSH, factor clave para el diagnóstico y
seguimiento de los pacientes hipertiroideos.
Principio del ensayo
Este ensayo utiliza el principio del análisis
inmunoradiométrico (IRMA) en fase sólida. Para
ello emplea dos anticuerpos monoclonales que
reconocen dos epítopes diferentes de la molécula.
Uno de ellos está marcado con radioyodo
(anticuerpo “señal”) y el otro, no marcado,
funciona como anticuerpo “captura”.
El inmunocomplejo formado por el antígeno con
los dos anticuerpos ("sándwich") se inmoviliza en
la superficie de los tubos de ensayo durante un
período de incubación de 1 hora. Después se
decantan los tubos y se mide la radiactividad
enlazada en un contador gamma. La radiactividad
presente en los tubos es directamente
proporcional a la concentración de la hormona
presente en el sistema. Utilizando calibradores de
concentración conocida de hTSH se prepara una
curva de calibración a partir de la cual se
determina por interpolación la concentración de
hTSH presente en las muestras
para usar con 1 mL de suero equino con
0,1% NaN3. Los calibradores contienen: 0, 0,06;
0,15; 0,6; 2,5; 15; 50 y 100 µIU/mL de hTSH y
han sido calibrados contra el estándar de
referencia WHO 2nd IRP 80/558.
3. SUERO CONTROL (CI-CII), 2 frascos listos
para usar con 1 mL de suero humano con 0,1%
NaN3. La concentración de los controles está
especificada en el certificado de calidad incluído.
4. TUBOS RECUBIERTOS: 2x50 tubos de
12x75 mm, empaquetados en cajas plásticas,
listos para usar.
5. SOLUCIÓN DE LAVADO, 1 frasco, contiene
20 mL. Diluir con 1000 mL de agua destilada.
Contiene 0,1 % NaN3.
Si el volúmen de la muestra no es un factor
crítico, recomendamos la opción B.
Solo se necesitan 100 µL de muestra. La
sensibilidad alcanzable es de 0,011 µIU/mL. A
medida que nos acercamos a la fecha de
vencimiento del kit la sensibilidad cambia a 0,03
µIU/mL. Si quedan menos de tres semanas antes
del vencimiento, puede omitirse el calibrador 0.06
µIU/mL. El calibrador de 50 µIU/mL también
puede ser omitido si lo permite el algoritmo de
ajuste de la curva. Debe verificarse si el programa
da resultados semejantes utilizando o no este
punto.
Opción B: Método de 3ra. generación
Funciona de la misma manera que la opción A,
excepto que utiliza 200 µL de muestra. La
sensibilidad que se alcanza con este método es de
Gradilla para tubos de ensayo, pipetas de 0,005 µIU/mL.
precisión con puntas desechables (100, 200 y
2000 µL), agitador horizontal u orbital, lámina de Opción C: Método del baño de agua
polietileno, papel absorbente, contador gamma.
Utilize este método si tiene problemas con su
Materiales y equipos recomendados:
Pipetas de repetición (200 y 2000 µL). Jeringa agitador y necesita pronto los resultados! Este
método emplea también 200 µL de muestra y se
automática (dispensador) para el lavado.
alcanza una sensibilidad de 0,020 µIU/mL. A
Opcional: termostato de baño de agua.
medida que nos acercamos a la fecha de
vencimiento del kit la sensibilidad cambia a 0,05
Recolección y almacenamiento de las µIU/mL. Si quedan menos de tres semanas antes
muestras
del vencimiento, puede omitirse el calibrador 0,06
Las muestras de suero deben colectarse de µIU/mL.
Materiales y equipos necesarios
acuerdo a los procedimientos habituales que se
Opción A
practican en los laboratorios clínicos. Las
muestras pueden conservarse entre 2 y 8 °C si el
análisis se efectuará dentro de las 24 horas Procedimiento para el ensayo
siguientes a su recolección, de lo contrario deben
1. Marcar los tubos recubiertos por
conservarse congeladas a una temperatura igual o
duplicado
para
los
totales
(T),
menor que -20 °C. Las muestras congeladas
calibradores
(S0-S100),
controles
(CI-CII)
deben descongelarse y mezclarse completamente
y muestras (M).
antes de su uso. Evitar la congelación y
descongelación repetida de las muestras.
2. Añadir por duplicado 100 µL de
calibrador, controles y muestras en los
Preparación y conservación de los
tubos apropiados, cuidando de no arañar
reactivos
el fondo del tubo.
Conservar los reactivos entre 2 y 8 °C después de
3. Añadir 200 µL de trazador en cada tubo.
abiertos. A esta temperatura cada componente es
4. Fijar la gradilla con los tubos de ensayo
estable hasta la fecha de vencimiento del juego.
firmemente en el agitador horizontal.
La fecha de caducidad exacta se especifica en la
Cubrir los tubos con una lámina de
etiqueta del estuche y en el certificado de calidad.
polietileno. Encender el agitador y ajustar
La solución concentrada de lavado debe diluirse
la velocidad de manera tal que el líquido
con 1000 mL de agua destilada. Así diluida esta
en los tubos esté rotando o agitándose
solución se conserva entre 2 y 8 °C hasta la fecha
constantemente. Incubar los tubos 1 hora
de vencimiento del juego.
en el agitador a temperatura ambiente (20
– 30 ˚C) .
PRECAUCIÓN!
Permitir que todos los reactivos y muestras
5. Añadir 2 mL de solución de lavado a cada
alcancen la temperatura ambiente. Homogenizar
tubo (excepto T). Aspirar o decantar el
completamente todos los reactivos y muestras
líquido de todos los tubos (excepto T)
antes de su uso, evitando la formación de espuma.
mediante la inversión de la gradilla.
Colocar la gradilla sobre un papel
Modos de empleo
absorbente por 2 minutos manteniendo la
posición
invertida.
El ensayo puede realizarse de tres maneras
diferentes, denominadas opciones A, B y C. Con
las opciones A y B se necesita un buen agitador
horizontal y con la opción C un termostato de
baño de agua a 37 ˚C (los tubos deben estar en
contacto con el agua, no utilize un termostato
seco). Los valores obtenidos para las muestras y
Contenido del juego
los rangos de referencia son iguales para las tres
1. TRAZADOR, 1 frasco con 21 mL, listo para opciones.
usar, contiene < 900 kBq de anti-hTSH marcado
con 125I y anti-hTSH biotinilado en solución
tampón con 0,1 % NaN3 y colorante rojo.
6.
Repetir dos veces el procedimiento de
lavado según el punto 5.
7.
Medir la radiactividad de cada tubo por
60 segundos en un contador gamma y
calcular la concentración de hTSH en las
muestras
como
se
describe
a
continuación.
Tabla 1.Opción A: protocolo del ensayo (volúmenes midieron por duplicado 7 muestras, en 20 series
en microlitros)
independientes. Los valores obtenidos se
T
S
C
M
muestran a continuación.
Calibrador
100
Control
Intra-ensayo
Inter-ensayo
100
Media
CV
Media
CV
Muestra
100
(µIU/mL)
(µIU/mL)
%
%
Trazador
(200) 200 200 200
0,179
3,8
0,174
9,6
Agitar 1 hora a temperatura ambiente
0,738
3,5
0,711
3,4
Solución de lavado
2000 2000 2000
1,01
1,7
1,00
3,0
Decantar y secar en papel absorbente
1,22
1,4
1,18
3,6
1,86
2,4
1,82
3,0
Solución de lavado
2000 2000 2000
3,04
2,1
6,13
4,3
Decantar y secar en papel absorbente
6,25
4,2
19,84
3,3
Solución de lavado
2000 2000 2000
Decantar y secar en papel absorbente
Medir la radiactividad (60 sec/tubo)
Prueba de dilución (linealidad)
Procesar los datos
Tabla 2. Opción A: resultados característicos
Tubos
Conteos
Media
B/T%
cpm
cpm
Total
406194
405297
404399
S0
58
63
0,015
(NSB)
67
S0,06
265
281
0,069
297
S0,15
615
601
0,148
587
S0,6
2158
2188
0,54
2218
S2,5
8377
8434
2,08
8490
S15
48394
49304
12,16
50214
S50
146568
146955
36,26
147342
S100
243184
241904
59,68
(Bmax)
240624
CI
1144
1173
0,31
1201
CII
62189
63073
19,4
63957
1000000
Se diluyeron serialmente 5 muestras con
calibrador cero y se sometieron a ensayo. Se
obtuvo una recuperación entre 94,8% y 113% (n
= 15)
Prueba de recuperación
La recuperación se determinó como la diferencia
porcentual entre el incremento observado y el
incremento
esperado,
luego
de
añadir
concentaciones conocidas de hTSH a 5 muestras
de suero diferentes. Se obtuvo una recuperación
entre 94,9% y 103%.
Opción B
Procedimiento para el ensayo
1.
Marcar los tubos recubiertos por
duplicado para la actividad total (T),
calibradores (S0-S100), controles (CICII) y muestras (M).
2.
Añadir por duplicado 200 µL de
calibrador, controles y muestras en los
tubos apropiados, cuidando de no
arañar el fondo del tubo.
100000
c
p
m
3.
Añadir 200 µL de trazador en cada
tubo.
4.
Fijar la gradilla con los tubos de
ensayo firmemente en el agitador
horizontal. Cubrir los tubos con una
lámina de polietileno. Encender el
agitador y ajustar la velocidad de
manera tal que el líquido en los tubos
esté
rotando
o
agitándose
constantemente. Incubar los tubos 1
hora en el agitador a temperatura
ambiente (20 – 30 ˚C).
10000
1000
100
0,01
0,1
1
10
100
1000
hTSH (µIU/ml)
Figura 1: Curva estándar típica (No utilizar para calcular
concentraciones de las muestras!)
Características del ensayo (Opción A)
Sensibilidad
La sensibilidad analítica utilizando trazador
fresco es de 0,011 µIU/mL, calculada como la
concentración correspondiente al valor de enlace
medio más dos desviaciones estándar, para 20
réplicas del calibrador cero y utilizando trazador
fresco (con menos de 3 semanas).
La sensibilidad funcional es de 0,07 µIU/mL,
determinada por extrapolación del 22% del perfil
de precisión inter-ensayo.
Precisión
La precisión intra-ensayo se determinó a partir de
15 réplicas de 7 muestras, medidas en una serie.
Para determinar la precisión inter-ensayo se
5.
Añadir 2 mL de solución de lavado a
cada tubo (excepto T). Aspirar o
decantar el líquido de todos los tubos
(excepto T) mediante la inversión de la
gradilla. Colocar la gradilla sobre un
papel absorbente por 2 minutos
manteniendo la posición invertida.
6.
Repetir dos veces el procedimiento de
lavado según el punto 5.
7.
Medir la radiactividad de cada tubo por
60 segundos en un contador gamma y
calcular la concentración de hTSH en
las muestras como se describe a
continuación.
Tabla 3. Opción B: protocolo del ensyo (volúmenes
en microlitros)
T
S
C
M
Calibrador
200
Control
200
Muestra
200
Trazador
(200)
200
200
200
Agitar 1 hora a temperatura ambiente
Solución
2000
2000
2000
de lavado
Decantar y secar en papel absorbente
Solución
2000
2000
2000
de lavado
Decantar y secar en papel absorbente
Solución
2000
2000
2000
de lavado
Decantar y secar en papel absorbente
Medir la radiactividad (60 sec/tubo)
Procesar los datos
Tabla 4. Opción B: resultados característicos
Tubos
Conteos
Media
B/T%
cpm
cpm
Total
405254 403724
402194
S0
57
53
0,013
(NSB)
49
S0,06
468
452
0,069
435
S0,15
1095
1065
0,264
1035
S0,6
3936
4044
1,00
4151
15724
3,89
S2,5
16214
15233
87718
21,73
S15
86741
88695
57,22
S50
232356 231005
229654
77,27
S100
311395 311957
(Bmax) 312518
CI
2256
2177
0,33
2099
CII
115658 117124
19,9
118590
1000000
100000
c
p
m
10000
1000
100
0,01
0,1
1
10
100
1000
hTSH (µIU/ml)
Figura 2: Curva estándar típica (No utilizar para calcular
concentraciones de las muestras!)
Características del ensayo (Opción B)
Sensibilidad
La sensibilidad analítica utilizando trazador
fresco es de 0,005 µIU/mL, calculada como la
concentración correspondiente al valor de enlace
medio más dos desviaciones estándar, para 20
réplicas del calibrador cero y utilizando trazador
fresco (con menos de 3 semanas).
La sensibilidad funcional es de 0,03 µIU/mL,
determinada por extrapolación del 22% del perfil
de precisión inter-ensayo.
Precisión
La precisión intra-ensayo se determinó a partir de
15 réplicas de 10 muestras, medidas en una serie.
Para determinar la precisión inter-ensayo se
midieron por duplicado 10 muestras, en 20 series
independientes. Los valores obtenidos se
muestran a continuación.
Intra-ensayo
CV
Media
(µIU/mL)
%
0,091
0,168
0,249
0,527
0,900
1,66
5,99
18,55
8,3
7,7
4,0
3,2
3,1
2,6
3,6
2,1
Inter-ensayo
Media
CV
(µIU/mL)
%
0,079
0,165
0,236
0,525
0,964
1,78
5,67
18,83
6,5
7,4
6,3
5,6
4,8
3,1
4,9
2,6
Prueba de dilución (linealidad)
Se diluyeron serialmente 5 muestras con
calibrador cero y se sometieron a ensayo. Se
obtuvo una recuperación entre 89,2% y 106,6% (n
= 15)
Prueba de recuperación
La recuperación se determinó como la diferencia
porcentual entre el incremento observado y el
incremento
esperado,
luego
de
añadir
concentaciones conocidas de hTSH a 5 muestras
de suero diferentes. Se obtuvo una recuperación
entre 95,5% y 102,9%.
Opción C
Procedimiento para el ensayo
1.
Marcar los tubos recubiertos por
duplicado para la actividad total (T),
calibradores (S0-S100), controles (CICII) y muestras (M).
Tabla 5. Opción C: protocolo del ensayo (volúmenes Precisión
en microlitros)
La precisión intra-ensayo se determinó a partir de
T
S
C
M
15 réplicas de 5 muestras, medidas en una serie.
Calibrador
200
Para determinar la precisión inter-ensayo se
Control
midieron por duplicado 5 muestras, en 20 series
200
independientes. Los valores obtenidos se
Muestra
200
muestran a continuación.
Trazador
(200)
200
200
200
Mezclar, incubar 1 hora en baño de agua a 37˚C
Intra-ensayo
Inter-ensayo
Solución
2000
2000
2000
CV
Media
CV
Media
de lavado
(µIU/mL)
(µIU/mL)
%
%
Decantar y secar en papel absorbente
0,170
7,3
0,177
12,6
Solución
2000
2000
2000
0,694
7,0
0,673
6,4
de lavado
1,09
2,9
1,12
5,4
Decantar y secar en papel absorbente
3,15
3,0
5,72
4,4
Solución
2000
2000
2000
6,27
3,2
17,49
6,6
de lavado
Decantar y secar en papel absorbente
Prueba de dilución (linealidad)
Medir la radiactividad (60 sec/tubo)
Procesar los datos
Se diluyeron serialmente 4 muestras con
Tabla 6. Opción C: resultados característicos
Tubos
Conteos
Media
B/T%
cpm
cpm
Total
402020 400292
398564
S0
71
66
0,017
(NSB)
60
S0,06
197
183
0,046
168
S0,15
347
368
0,092
388
S0,6
1361
1333
0,333
1305
S2,5
5339
5230
1,307
5120
S15
27317
26986
6,74
26655
69570
17,38
S50
70967
68173
86506
21,61
S100
87101
85910
(Bmax)
CI
754
726
0,32
698
34967
19,5
CII
34536
35398
1000000
100000
2.
3.
4.
5.
Añadir por duplicado 200 µL de
calibrador, controles y muestras en los
tubos apropiados, cuidando de no
arañar el fondo del tubo.
Añadir 200 µL de trazador en cada
tubo. Agite suavemente los tubos en
vortex.
Incubar los tubos 1 hora en un
termostato de baño de agua entre 36 ˚C
y 38 ˚C
Añadir 2 mL de solución de lavado a
cada tubo (excepto T). Aspirar o
decantar el líquido de todos los tubos
(excepto T) mediante la inversión de la
gradilla. Colocar la gradilla sobre un
papel absorbente por 2 minutos
manteniendo la posición invertida.
6.
Repetir dos veces el procedimiento de
lavado según el punto 5.
7.
Medir la radiactividad de cada tubo por
60 segundos en un contador gamma y
calcular la concentración de hTSH en
las muestras como se describe a
continuación.
c
p
m
10000
calibrador cero y se sometieron a ensayo. Se
obtuvo una recuperación entre 92,4% y 109,8% (n
= 15)
Característcas comunes para las
tres opciones (A, B y C)
Especificidad
No se observa reacción cruzada detectable con las
hormonas hLH, hCG y hFSH en concentaciones
fisiológicas normales.
Valores de referencia
Se recomienda que cada laboratorio establezca
sus propios intervalos de referencia. Los valores
que se proporcionan a continuación deben
considerarse solo como informativos.
Rango de referencia eutiroideo:
0,27 µIU/mL – 3,75 µIU/mL.
Cálculo de los resultados
Hallar la media de los conteos por minuto (cpm)
para cada par de tubos. Restar de cada media el
promedio de cpm obtenido para el calibrador de
concentración cero (S0 = enlace no específico,
NSB). Los valores así corregidos se dividen por la
actividad total (T) como se muestra a
continuación:
Sx/C/Mx/ (cpm) -S1(cpm)
B/T (%) = ___________________________ x 100
T (cpm)
1000
100
0,01
0,1
1
10
100
1000
hTSH (µIU/ml)
Figura3: Curva estándar típica (No utilizar para calcular
concentraciones de las muestras!)
Características del ensayo (Opción C)
Sensibilidad
La sensibilidad analítica utilizando trazador
fresco es de 0,02 µIU/mL, calculada como la
concentración correspondiente al valor de enlace
medio más dos desviaciones estándar, para 20
réplicas del calibrador cero y utilizando trazador
fresco (con menos de 3 semanas).
La sensibilidad funcional es de 0,11 µIU/mL,
determinada por extrapolación del 22% del perfil
de precisión inter-ensayo.
Construir una curva estándar ploteando las
medias de cpm o, alternativamente, los valores
B/T% contra la concentración de hTSH de cada
estándar en un papel log-log.
Determinar la concentración de hTSH en las
muestras basándose en las respectivas medias de
cpm o en los valores B/T%, por interpolación de
la curva estándar. No extrapolar valores fuera del
rango de la curva.
Para el procesamiento automatizado de los datos,
recomendamos el uso del programa de ajuste tipo
spline, desarrollado especialmente para el análisis
inmunoradiométrico. Existen programas que
interpolan los valores que se encuentran entre el
calibrador de concentración cero y el primer
calibrador. Entre las concentraciones así
calculadas, solo aquellas mayores que el límite de
detección del ensayo pueden considerarse como
reales (ver sensibilidad).
Limitaciones del procedimiento
debe diluir con grandes cantidades de agua, para
evitar la acumulación de azidas metálicas
• Los reactivos provistos en este juego están explosivas en las tuberías de plomo y cobre. Este
optimizados para la medición del hTSH en suero producto contiene en total 51 mg de azida sódica.
humano.
• Los resultados de este análisis deben ser
utilizados conjuntamente a la información clínica
Fecha de
Número de lote
pertinente.
vencimiento
• Las muestras hemolizadas, turbias o lipémicas
Almacenar entre
pueden dar resultados falsos, evite su uso.
Suero Control
2 y 8 ˚C
• No se observa efecto Hook con el uso del
presente producto en concentraciones de hTSH
Precaución
Calibrador
hasta 500 µIU/mL. Para cualquier muestra con
una concentración en el intervalo entre 100-500
µIU/mL se obtendrán valores superiores a 100
Peligro biológico
Tubos recubiertos
µIU/mL
Notas acerca del procedimiento
1) Fuente de error! Los tubos recubiertos no
están marcados individualmente. Se debe evitar la
mezcla con tubos de ensayo comunes. Para
minimizar este riesgo, no se deben sacar de la
caja más tubos de los necesarios, de igual manera
los tubos no utilizados en una serie deben ser
guardados de nuevo en su caja. Se recomienda
rotular los tubos con marcador permanente.
Consulte las
instrucciones
Trazador
Dispositivo para
diagnóstico in vitro
Tampón de lavado
Fabricante
Material radiactivo
Número de
referencia
Sitio WEB: http://www.izotop.hu
2) Fuente de error! Para asegurar la agitación E-mail técnico: [email protected]
eficiente de los tubos se debe utilizar una gradilla E-mail comercial: [email protected]
que los ajuste firmemente. Una agitación
inadecuada puede provocar un rendimiento
deficiente del ensayo y falsos resultados.
INSTITUTE OF ISOTOPES Ltd.
3) Dosificación de la solución de lavado. Para la 1535 Budapest. Pf.: 851.
adición de la solución de lavado se recomienda Tel.: +36 1 392-2577, Fax: +36 1 395-9247
una jeringa automática o dispensador, equipado
con un recipiente de 1 litro y un tubo flexible para Edición: Septiembre/2008
la dosificación. En su ausencia puede utilizarse
una pipeta automática apropiada. Al decantar
prestar cuidado de no contaminar el exterior de
los tubos. Cualquier contaminación por pequeña
que sea puede resultar en una sobre-estimación de
la concentración. Este error es particularmente
alto en el rango de concentraciones bajas, que es
de importancia vital para la determinación de
valores sub-normales de TSH.
Atención! No mezclar componentes de lotes
diferentes o con productos de otro fabricante!
Precauciones
Material radiactivo
Este producto contiene material radiactivo. Es
responsabilidad de cada laboratorio cumplir con
las regulaciones locales referentes a la
manipulación, conservación y desecho de
materiales radiactivos.
Material potencialmente infeccioso
El suero humano utilizado en este producto ha
sido analizado con métodos aprobados y no ha
presentado positividad para anticuerpos frente al
Virus de Inmunodeficiencia Humana (Anti-HIV1) y el antígeno de superficie de la Hepatitis-B
(HBsAg). Ninguno de los métodos analíticos
disponibles actualmente puede garantizar por
completo la eliminación de posibles riesgos
biológicos. Se deben manipular todos los
reactivos y muestras de sangre como material
potencialmente infeccioso.
Peligro químico
Algunos componentes de este juego contienen
azida sódica como preservante. Al verter los
desechos no radiactivos al sistema de desagüe se