Esporulación

Esporulación
http://diverge.hunter.cuny.edu/
~weigang/Lecture-syllabus.html
Esporulación
Algunas especies de bacterias Gram
positivas (principalmente de los géneros
Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y
Thermoactinomyces), disponen de una
serie de estrategias adaptativas
cuando se ven sometidas a privación
de nutrientes en su medio ambiente.
•Alcanzar un ambiente más propicio:
síntesis de flagelos, quiomitaxis,
inducción de enzimas intracelulares y
extracelulares, producción de
antibióticos.
•Esporulación (estado criptobiótico).
Partes de la endospora
•Protoplasto o núcleo, con la
membrana citoplásmica de la
espora (membrana esporal interna).
•Pared de la espora (Germen de la
pared de la futura célula
vegetativa).
•Corteza o córtex, rodeado
externamente de la membrana
esporal externa.
•Cubiertas.
•Exosporio (no universal, las esporas
de algunas especies carecen de él).
Nota: revisar notas de Microbiología General
Propiedades biológicas
de las endosporas
•Hipometabolia. La más baja tasa metabólica.
•Dormancia. Gran inercia a los sustratos
exógenos, la espora sólo perderá la dormancia
cuando se haya activado para la
germinación.
•Resistencia al calor. Es un subproducto de los
cambios que llevan a la deshidratación como
medio de lograr la hipometabolia y la
dormancia.
•Deshidratación. Refrigencia al microscopio
óptico.
•Resistencia a los rayos UV.
•Resistencia a los agentes químicos.
Esporulación
Fase I. Formación del filamento.
Fase II. Formación del septo
acéntrico.
Fase III. Formación de la
forespora.
Fase IV. Formación de la
corteza.
Fase V. Síntesis de las cubiertas.
Fase VI. Maduración de la
preespora a endospora.
Fase VII. Liberación de la
espora.
Nature Reviews Microbiology 1, 117-126 (November 2003)
Genes de la esporulación
•Participan más de 113 genes en
el proceso de esporulación.
Bacillus subtilis esporula cuando se
expresan los genes spo.
•Los genes se clasifican de
acuerdo a la fase de esporulación
(O, I, II, etc.) y se diferencian por
una letra.
-Mutantes de spo0A fallan en el
inicio de la esporulación y no
procede la fase I.
-Mutantes de spoIIA completan la
fase II (septación) pero fallan para
proceder a la fase III (formación
de la doble membrana)
http://www.invitrogen.com/site/us/en/
home/References/Molecular-ProbesThe-Handbook/Technical-Notes-andProduct-Highlights/Fluorescent-Probesfor-Use-with-GFP.html
Genes de la esporulación y
factores que regulan su expresión
•Factores sigma. Factor de
inicio de la transcripción en
procariontes que permite la
unión específica de la ARN
polimerasa al promotor de
un gen.
σH
σE
σF
σG
σK
Sistema de dos componentes
El estímulo es detectado
por un sensor a nivel de
membrana (o a nivel
citoplasmático), el cual
transduce el estímulo hacia
una proteína citoplásmica
produciendo un cambio
(–P) que inicia una cascada
de señales, que provoca la
interacción con secuencias
determinadas de ADN,
generando así la respuesta
adaptativa
correspondiente a la señal
ambiental.
Inicio de la esporulación
Estímulos:
•Carencia de nutrientes
•Alta densidad celular
Nature Reviews Microbiology 1, 117-126 (November 2003)
Proteínas involucradas
FtsZ. Polimeriza y forman una anillo en el centro de la célula durante
la división celular. Durante el estado II de la esporulación las células
forman dos anillos en los polos para la formación del septo
asimétrico.
Spo0J. Reconoce el origen de la replicación OriC en el cromosoma
de la célula vegetativa y en la esporulación se une a los polos de la
célula.
RacA. Remodeling and Anchorinin of Chromosome A. Participan en
la formación del filamento durante la esporulación.
DivIVA. Proteína de anclaje en los polos de la bacteria, une directa o
indirectamente a Spo0J y a RacA. Se ha propuesto que une a
MinCD durante la división celular.
SpoIIIE. ADN translocasa de pendiente de ATP. Transloca la copia del
ADN en la forespora después de la formación del septo.
Segregación del cromosoma
(fase I y II)
DivIVA. (OriC MinCD) Spo0J.
RacA.
SpoIIIE.
Nature Reviews Microbiology 1, 117-126 (November 2003)
σF activa la presencia de
SpoIIE necesaria para la
trasferencia de ADN durante
la fase II.
Factor σF
SpoIIAB es una proteína
inestable y funciona como
anti-σF.
spoIIAB está localizado en la
parte distal de OriC.
Durante el periodo
inmediato a la formación del
septo solo bajas
concentraciones de SpoIIAB
pasan a la preespora lo que
permite la expresión de
spoIIE.
Nature Reviews Microbiology 1, 117-126 (November 2003)
Fases II y III. Envoltura de la
preespora
SpoIID, SpoIIM SpoIIP (también probablemente SpoIIQ) son
necesarias en las fases 2 y 3. SpoIID, SpoIIM y SpoIIP (σE) conducen
la regresión del segundo tabique polar, así como para la
envoltura. SpoIIIE es implicado en el paso final de fusión de la
membrana. SpoIIB probablemente regulen este proceso.
Nature Reviews Microbiology 1, 117-126 (November 2003)
Factores σG y σK
La síntesis σG es regulada por σF, el
producto del gen spoIIIG es
inactivado por el anti-σ SpoIIAB (u
otro anti-σ) y activado por σE. Esta
asociado con la activación de
proteínas de formación de la
forespora.
La síntesis de SpoIVFB es estimulada
por σG y tiene actividad de
proteasa y junto con otras SpoIV
activan de pro-σK a σK, que
estimula la transcripción de genes
importantes para la síntesis de la
corteza y las cubiertas, así como
para la maduración y liberación de
la espora.
σE
Nature Reviews Microbiology 3, 969-978 (December 2005)
The sporulation cascade in
Bacillus subtilis and selected
clostridia.
Partes de la endospora
Pared
Corteza
Protoplasto o núcleo
Cubiertas
Protoplasto
(núcleo de la endospora)
DPA
DPC
Sus componentes están inmovilizados en una matriz de quelatos
de ácido dipicolínico (DPA) con iones Ca2+ (dipicolinato de
calcio, DPC), que llega a representar el 15% del peso.
Protoplasto
(núcleo de la endospora)
•Citoplasma muy deshidratado (10 - 30%)
•Contiene el cromosoma, pocos ribosomas,
ARNt, ARN polimerasa, mono y di nucleótidos
pero no tri nucleótidos (no ATP).
•Carece de componentes inestables:
~No ARNm
~No enzimas biosintéticas
~No aminoácidos ni bases nitrogenadas
~No cofactores reducidos (NADH, CoA, etc.)
Espora de Bacillus cereus
http://www.shef.ac.uk/mbb/staff/moir-a
Protoplasto
(núcleo de la endospora)
•Gran cantidad de pequeñas
proteínas especiales, las pequeñas,
ácidas, solubles (SASP) que
mantienen le pH más bajo que en
la célula vegetativa.
~Durante la germinación se
usarán como fuente de amino
ácidos.
~Acomplejan el ADN: protegen
de las radiaciones UV.
•Fuente de energía:
3-fosfoglicerato→PEP
Membrana interna de la espora.
Rodea al protoplasto, membrana citoplásmica que carece de
fluidez (estructura policristalina).
http://sitemaker.umich.edu/hanna_lab/home. A Bacillus anthracis endospore (False colored
transmission electron micrograph, 92,000X, as shown on the cover of the Jan. 1, 2004 issue of the
Journal of Bacteriology)
Pared de la endospora
•A base de un Peptidoglucano similar al de la célula vegetativa.
•Estructura muy delgada.
•Constituye lo que será la pared de la futura célula vegetativa.
•Origen: se sintetiza a partir de la preespora
Pared
Corteza o córtex
Córtex
• Al microscopio electrónico: gruesa, transparente a electrones,
láminas concéntricas, formado de un Peptidoglucano especial:
~ 30% del NAM con tetrapéptidos, pero con bajo grado de
entrecruzamiento
~ 15% del NAM tiene solo L-ala
~ 55% lactama del ácido murámico
Corteza o córtex
• Origen: a partir de la célula
madre.
• Tiene un bajo grado de
entrecruzamiento:
~ Estructura más laxa, floja y
flexible que el PG normal es
capaz de expandirse o
contraerse.
~ Rápida autolísis durante la
germinación.
• La lactama del murámico
presenta gran resistencia a la
lisozima.
Cubiertas
Aspecto muy
voluminoso, distinto
según especies.
Partes densas a los
electrones.
Formada de una o más
proteínas de tipo
queratina, ricas en
cisteína y amino ácidos
hidrófobos.
Bacterial endospores. Panel A shows endospores from B. subtilis
one of which is still retained within the rod shaped 'mother cell'. In
B. subtilis, spores are approximately 1.2 µm in length and are
ellipsoidal. Released spores have a clear protective shell known
as the spore coat and is comprised of as many as 25 different
protomeric components assembled into discrete layers. Panel B
shows a typical SDS-PAGE (12.5%) fractionation of solubilised
spore coat proteins revealing predominant species. Ricca and
Cutting Journal of Nanobiotechnology 2003
1:6 doi:10.1186/1477-3155-1-6
Estructura insoluble e
impermeable que
impide la entrada de
numerosos agentes
químicos agresivos,
incluyendo tóxicos.
Exosporio
• Estructura membranosa
transparente, a modo de
saco delgado y flojo a
base de proteínas,
polisacáridos complejos y
lípidos
• Muy resistente a enzimas
proteolíticas
Esporulación
• Estímulo desencadenante de la
esporulación: estado de inanición
(carencia de nutrientes)
• Dura 7-8 horas en Bacillus subtilis o en
B. megaterium.
• Las fases se nombran con un número
romano (I, II,....VII). Se suele indicar los
límites de tiempo en los que
transcurre la fase (ej: t2-t3 significa
que la fase transcurre entre la 2ª y la
3ª hora)
Fase I (t0-t1)
•Los dos cromosomas se condensan
formando un filamento.
•Se inician dos tabiques, cada uno
cerca de un polo (espículas de PC
hacia el interior).
•Se degradan proteínas viejas y los
aminoácios se emplean en fabricar
proteínas específicas de la
esporulación.
•Se sintetizan y liberan al medio:
antibióticos y exoenzimas
(proteasas, amilasas, ribonucleasas,
etc.).
Fase II (t1-t2)
•Se termina el septo acéntrico en uno de los
polos (el otro septo no se completa, aborta).
•Cada nucleoide queda en un:
~Compartimiento pequeño, la prespora.
~Compartimiento grande la célula
madre.
•Sigue síntesis de antibióticos y exoenzimas
(proteasas, amilasas, ribonucleasas, etc.).
Fase III (t2-t3)
•Formación del protoplasto de la
espora debido a:
~Degradación selectiva del PG
del septo
~La membrana citoplásmica
de la célula madre va
avanzando hacia el polo,
envolviendo a la prespora
•Resultado: prespora posee dos
membranas, con polaridad
opuesta.
•La síntesis de proteínas sigue en la
célula madre, pero se detiene en
la prespora
Fase IV (t3-t4)
•Formación de la corteza:
deposición de PG de la célula
madre entre las dos membranas
de la prespora. Deposición del
PG de la pared, procedente de
la prespora
•La espora puede verse ya
refráctil en fresco
•Comienza síntesis de DPA y
acumulación de Ca2+
•Comienza la síntesis del
exosporio
Fase V (t4-t5.5)
•Deposición de materiales de las
cubiertas por fuera de la membrana
externa de la espora.
•Continúa la acumulación de DPA,
que secuestra iones Ca2+ para formar
el DPC en el protoplasto.
Fase VI (t5.5-t7)
•Maduración de prespora a endospora.
•Maduración de la corteza (PG especial, más
laxo, con pocos entrecruzamientos).
•Maduración de las
cubiertas.
•Citoplasma se hace
más homogéneo y
denso a los
electrones.
•Resistencia al calor
y al cloroformo.
•Resistencia a las
radiaciones UV.
•Resistencia a la
lisozima.
Fase VII (t7-t8)
•Autolísis de la célula madre y liberación de la espora.
•El exosporio pierde agua y se pega a las cubiertas.
Ciclo de vida en Bacillus subtilis
Nature Reviews Microbiology 3, 214-224 (March 2005)