PARTE III Métodos para generar variabilidad

PARTE III
Métodos
para generar variabilidad
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana
III.-Capítulo 1
Variación somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofía;
Echenique, Viviana
1 Introducción
El comportamiento celular normal es el
resultado de una compleja cascada de programas genéticos que son sensibles a la
disrupción por estreses bióticos y abióticos.
El cultivo in vitro per se puede ser muy
estresante para las células vegetales e
involucra procesos mutagénicos durante el
establecimiento del explanto, la inducción de
callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o
citoplasmática, que podría ser utilizada para
el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variación somaclonal por Larkin
y Scowcroft (1981), involucra cambios en las
plantas regeneradas que son transmitidos a
la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no específicas que
no generan variación estable y transmisible,
pero que conducen a cambios en la expresión génica. Dichos cambios, denominados
«epigenéticos», son también considerados
por algunos autores como variación
somaclonal mientras que otros sólo incluyen
en la misma los cambios estables.
Los mecanismos por los cuales ocurre la
variación somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se
mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática
e intercambio de cromátidas hermanas,
rearreglos génicos somáticos, elementos
genéticos transponibles, amplificación y/o
metilación del ADN y cambios en el ADN de
las organelas. Por ello, aunque los caracteres
morfológicos (como por ejemplo el hábito de
crecimiento, la morfología floral, etc.) son
fáciles de evaluar, muchos aspectos de la variación suceden sin manifestarse en cambios
morfológicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto génico puede no
alterar su actividad biológica lo suficiente
como para producir un fenotipo modificado.
Por ello, la variación debe analizarse a varios
niveles.
Esta variación depende del genotipo, de
la fuente de explanto, del tiempo en que el
material ha estado sometido al cultivo in
vitro, de las condiciones y composición del
medio de cultivo y de la vía de regeneración,
donde la embriogénesis somática generaría
menores alteraciones que la organogénesis.
Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición ocasional de
caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronómico permite utilizar este fenómeno en programas de
mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos
casos para conferir caracteres deseables a
cultivares de importancia económica, entre
los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad.
El desarrollo de nuevos cultivares por esta
técnica involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del cultivar.
Como ejemplo puede citarse el caso de
somaclones de pasto bermuda, Cynodon
dactylon, donde se encontró resistencia a la
oruga militar en un cultivar que reunía otras
buenas características, dando origen al cultivar Brazos-R3.
Si bien desde el punto de vista práctico
no resulta una técnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible
predecir ni dirigir el tipo de variación y se hace
menester trabajar con grandes poblaciones
de plantas, es necesaria la compresión del
mecanismo para evitarlo en casos donde se
quiere fidelidad genética, como en la
micropropagación, la conservación de
germoplasma y la transformación de plantas.
También, en algunos casos, puede representar una fuente rápida y fácilmente accesible
de variación para ser utilizada en programas
de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos limitados y/o de
base genética estrecha, como en el caso de
la apomixis, donde la variabilidad dentro de
las poblaciones naturales o cultivadas es limitada.
Los primeros casos de variación
somaclonal fueron registrados en plantas de
reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido ob-
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servado en monocotiledóneas como trigo,
maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum
dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula)
y en dicotiledóneas como tabaco, tomate,
zanahoria y col, entre muchas otras especies.
2 Factores relacionados con la aparición
de variación somaclonal
La aparición de la variación somaclonal
depende de varios factores, entre los que se
han citado: el genotipo, el tipo de explanto,
la vía de regeneración, la composición del
medio de cultivo utilizado, los reguladores de
crecimiento y la duración del período de cultivo.
Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las
interacciones que surgen entre el genotipo y
el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación
que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que
en otras, consideradas inestables, oscilan
entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie
ornamental, la variación somaclonal es
genotipo dependiente y se la utiliza como
una herramienta para la obtención de variedades.
El nivel de ploidía es otro factor a tener
en cuenta. Por ejemplo en raigrás (Lolium
multiflorum) y en papa se observó que las
variedades diploides muestran estabilidad,
mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías durante el cultivo de tejidos. La explicación más razonable es que los
poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están «tamponados»,
y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida
de cromosomas, pudiendo así cumplir con los
requisitos impuestos por la regeneración. En
los diploides, la pérdida o la alteración de
cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando
con éxito a esta etapa sólo aquellos
explantos que tengan su complemento
cromosómico completo.
Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados
in vitro, si se los compara con las especies
parentales. Como ejemplo puede citarse el
caso de los híbridos obtenidos de la cruza de
Hordeum vulgare x Hordeum jubatum,
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donde el cultivo in vitro generó entre un 5%
y un 10% de regenerantes haploides que contenían sólo el genoma de Hordeum vulgare.
Por esta causa ciertos cruzamientos
interespecíficos suelen utilizarse como metodología para la obtención de haploides.
Explanto. La variación también puede ser
una consecuencia de quimerismo en el
explanto original. Las quimeras son mosaicos
genéticos. Esto significa que dentro de una
misma planta existen células con diferente
constitución genética, lo cual se debe a una
serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos
celulares. Si estos tejidos se utilizan como
explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas
celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto,
la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una
fuente extra de variación. Sin embargo, la
recuperación de quimeras a partir de
explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organogénicos.
La utilización de explantos con tejidos
organizados como esquejes radicales o
caulinares sería una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes
genotipos reaccionan de manera distinta,
aún con explantos «seguros». Parecería que
el cultivo de meristemas aislados sería la mejor opción para minimizar el riesgo de variación somaclonal. Sin embargo, esto no debería tomarse como regla. Utilizando técnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variación en plantas de frutilla y
paraíso obtenidas a partir de meristemas.
El cultivo de protoplastos parecería inducir, en ocasiones, inestabilidad genética, como
fue observado en papa y Nicotiana. Esto,
en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos
tan pequeños.
La vía de regeneración también tiene un
rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los géneros Pennisetum, Panicum, y
Lolium la variación observada en cultivos
embriogénicos es relativamente menor que
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la que aparece en cultivos organogénicos.
Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación
de los embriones, mayor que la requerida
en la formación de vástagos. Se postula que
el gran número de genes requeridos para la
iniciación y maduración de embriones
cigóticos y somáticos impediría la acumulación
de mutaciones deletéreas. Sin embargo, se
observaron variantes en plantas de café, apio
y caña de azúcar regeneradas a través de
embriogénesis somática. En estos casos se
observó que algunos fenotipos anormales de
embriones somáticos se asemejan a los
mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz.
La mayor parte de la variación obtenida
in vitro parece provenir de la fase de callo.
La iniciación de un callo puede ser análoga a
la respuesta de las plantas a heridas, que se
sabe que activan elementos transponibles y
estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en
situaciones de estrés. Cuando comienza la
división celular a partir de tejidos diferenciados, que dará origen a un callo, se incrementa
el riesgo de inestabilidad cromosómica. La
variación que ocurre en los números
cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis
normal de los núcleos intactos (núcleos
euploides).
La naturaleza del callo también puede
afectar el nivel de variación obtenida. Un callo verdadero es una masa de células
desdiferenciadas
que
proliferan
desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación. En varias
monocotiledóneas, el callo representa, a
menudo, una masa de órganos suprimidos o
proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo
mantiene un alto grado de estabilidad
genética, como se ha observado en espárrago. En un estudio realizado en Cymbopogon
se observó que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron
anormales, mientras que las obtenidas por
callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenían los
explantos. En ocasiones también fue posible
observar variación en plantas obtenidas por
regeneración directa, es decir, sin que medie
un proceso previo de desdiferenciación celular y formación de callo.
Medio de cultivo. El estado físico del
medio de cultivo también influye en el nivel
de variación obtenida. Un mismo explanto
puede tener diferente comportamiento si se
lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica
o puede incrementar el número de plantas
albinas.
Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) han sido señalados como inductores
de inestabilidad. Ejercen profundos efectos
sobre la respiración celular, el consumo de
azúcares y en el control de la división celular.
Por ello se especula acerca de su rol indirecto
en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in
vitro. Si bien el modo de acción herbicida del
2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripción que puede alterar la
estructura de la cromatina, siendo utilizado
en gramíneas como inductor de
aneuploidías. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciación
y este proceso sería el generador de los cambios.
La fragmentación nuclear amitótica citada anteriormente observada en algunas
plantas regeneradas también se reconoce
como causa de aneuploidía. Este fenómeno
es causado por una relación especial
auxina:citocinina.
El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el
ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene
lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores
en el ADN, donde la citosina se encuentra
metilada en posición 5 son considerados puntos calientes de mutación, ya que la
desaminación de una 5-metil citocina resulta
en un cambio de la base de citocina a timina.
Las auxinas naturales y sintéticas tienen una
elevada correlación con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.
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Estudios tendientes a analizar los efectos
de los reguladores de crecimiento sobre la
regeneración de plantas a partir de
protoplastos, realizados en papa, indicaron
que la variación en el tipo y concentración
de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generaría variación
genética. Sin embargo, si el cambio en la composición de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la
iniciación de los vástagos, se generan elevados niveles de variación genética. Estos datos sugieren que la fase de callo sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas
regeneradas, de manera que las hormonas
inducirían la inestabilidad genética sin ser,
necesariamente, el origen de la misma.
Otro factor a considerar es la deficiencia
de oxígeno que se genera durante el curso
del cultivo. La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la
de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo.
La anaerobiosis resultaría en la producción de
etanol, el cual podría comportarse como un
mutágeno.
También existen especies de plantas que
producen compuestos mutagénicos durante
el cultivo. Un efecto similar podría tener la
acumulación de metabolitos producidos por
las propias células durante el proceso. Se ha
mencionado que las condiciones de cultivo
in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que
normalmente se encuentran presentes en los
tejidos en bajas concentraciones.
La edad del cultivo es otro factor que
afecta el nivel de variación, aumentando la
proporción de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través
de varios subcultivos. Esto se ha observado
en ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrás
triploide. La variación puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos
no envejecidos. El número óptimo de
subcultivos podría estimarse empíricamente
luego de realizar pruebas de fidelidad
genética en las plantas regeneradas a través
de subcultivos subsecuentes. Una observación
común es que en los períodos prolongados
de cultivo hay una pérdida de totipotencia y
que esto sucedería debido a la acumulación
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de mutaciones y a la alteración de los genes
que son responsables de la regeneración. Sin
embargo, un estudio realizado por nuestro
grupo de trabajo en la UNS, en colaboración
con el IBONE, demostró que las variaciones
se producen al azar en los diferentes
subcultivos, no habiendo una relación lineal
entre el número de subcultivos y la cantidad
de variación obtenida en plantas
micropropagadas de paraíso gigante. La variación en este caso se detectó mediante la
ténica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos
(Olmos y col., 2002).
La deficiencia o exceso de minerales también podría afectar la estabilidad genética in
vitro. Se ha observado que las deficiencias o
excesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcio
y magnesio pueden resultar en cambios
genómicos. En la variedad de lino «Stortmont
Cyrrus» se detectaron cambios genéticos estables y heredables inducidos por una alta
fertilización del suelo con fósforo o con nitrógeno. Varias líneas estables obtenidas,
fundamentalmente una llamada «L» y otra
llamada «S», denominadas genotrofos, se
caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y
diferencias a nivel del ADN ribosomal.
3 Cambios genómicos producidos
durante el cultivo de tejidos
Las plantas poseen una amplia capacidad
de acomodarse a las situaciones cambiantes
de su entorno, pero en algún momento esa
capacidad de amortiguación se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado
de crecimiento subóptimo que podría inducir a mecanismos generadores de cambios
genómicos. Las bases metabólicas de la
interacción entre el estrés y estos cambios
son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales,
dependiendo de la intensidad del estrés y
del estado de diferenciación de las células en
el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un
mecanismo de respuesta al estrés que comprende la pérdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciación
que se produce durante la inducción del mis-
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mo provoca en las células una serie de procesos metabólicos que resultan en
reordenamientos genómicos que podrían
dar lugar a fenotipos alterados.
Entre las alteraciones genéticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse
mutaciones génicas, cambios cromosómicos que involucren la estructura o el número de los cromosomas y activación de
elementos genéticos transponibles. También existen anomalías, como el intercambio
entre cromátidas hermanas o el «crossing
over» somático, que pueden alterar su frecuencia de aparición en plantas regeneradas
respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro.
Varias hipótesis han intentado explicar y
relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las
aberraciones estructurales y numéricas, los
cambios en la metilación y las mutaciones
génicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular común para todos estos eventos mutagénicos. Tal mecanismo podría afectar la expresión génica y la
estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteración en los patrones de
metilación. Esta hipótesis establece que el
estrés inducido por el proceso de cultivo in
vitro, al involucrar efectos hormonales y
desbalance en el conjunto de nucleótidos,
provoca alteraciones en los patrones de
metilación del ADN. Estas alteraciones podrían afectar la expresión de genes específicos, incluyendo elementos transponibles y/
o podrían afectar la estructura de la
cromatina de una manera más global,
involucrando, por lo tanto, a un gran número de genes. Los cambios en la metilación del
ADN podrían estar relacionados con la
replicación tardía de la heterocromatina, que,
en definitiva resulta en eventos de ruptura
cromosómica.
El mecanismo por el cual se producen los
cambios en metilación no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrés severo de
nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilación encontrados en los
regenerantes de cultivo in vitro. Esto podría
indicar que la variación en metilación no es
una respuesta general a todos los estreses.
El cultivo de tejidos podría representar, por
lo tanto, un tipo muy particular de estrés que
podría inducir una respuesta única y un perfil
particular de mutación. Un posible efector de
esta variación en la metilación sería la alta
concentración de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las células a crecer
en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en ápices de raíz de
echalote y también en cultivos de células humanas. Las auxinas podrían ejercer el mismo
efecto durante el cultivo de tejidos vegetales.
Se cree, además, que los cambios en los
modelos de metilación causados por el cultivo de tejidos no serían aleatorios. En este
sentido, en raigrás se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad
en el ADN genómico.
Los puntos de ruptura de muchas de las
alteraciones estructurales presentes en las
plantas regeneradas se hallan en zonas
heterocromáticas, de manera que parecería
que la variación somaclonal no es al azar y
que habría loci específicos que tendrían mayor tendencia a la mutación. Los cambios
estructurales que no están asociados a cambios en el dosaje génico o a cambios en la
regulación suelen pasar desapercibidos
fenotípicamente, pero pueden causar infertilidad.
Por otra parte ocurren también cambios
genómicos que involucran alteraciones en el
número de cromosomas, como aneuploidías
y poliploidías. La poliploidía es el más común
de estos fenómenos y estaría relacionada con
fallas en la mitosis, mientras que la
aneuploidía puede surgir por segregación
desigual en la mitosis o por fragmentación
nuclear, seguida de mitosis. A veces estos
cambios en el número cromosómico pueden
afectar el fenotipo a través de dosajes
génicos alterados. En papa, por ejemplo, se
observaron fenotipos aberrantes por
aneuploidía o por duplicación cromosómica;
sin embargo, no todos los regenerantes
aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotípico.
Los cambios pueden ocurrir también en
el genoma de los plástidos y las
mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauración parcial de la fertilidad
en plantas de sorgo androestériles obteni-
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das in vitro. También puede citarse el caso
del cultivo in vitro de plantas androestériles
de maíz con citoplasma «T» (susceptibles a
Helminthosporium maydis), que condujo a
la reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderían con mutaciones en el ADN mitocondrial.
Otro caso de variación debida al cultivo
in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de
anteras en las Gramíneas. El análisis de los
genomas de cloroplastos de plantas albinas
de trigo obtenidas a partir del cultivo de
anteras reveló la presencia de deleciones y
rearreglos. Si bien parecería que los tejidos
somáticos son menos sensibles a la variación,
también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos.
Como puede apreciarse a través de los
casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variación somaclonal.
Como se mencionara anteriormente existen,
además, variaciones epigenéticas, que no
son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilación del ADN y
de amplificaciones génicas, provocados por
las condiciones microambientales del cultivo
de tejidos. Características tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia
a heladas pueden citarse como ejemplos de
este tipo de variación.
La comprensión de los mecanismos por
los cuales ocurre la variación somaclonal ayudaría a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrés y permitiría definir cómo los mismos actúan en los procesos
de evolución (Kaeppler et al., 2000).
4 Niveles de detección de la variación
somaclonal
Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variación son numerosos y
diversos, y probablemente actúan simultáneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones
genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico, ya que las mismas podrían ser potentes
fuentes de material para seleccionar caracteres de interés y, desde un punto de vista teórico, ya que posibilitarían realizar estudios
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básicos acerca de la variación y el posible control de la misma.
La ocurrencia de variación somaclonal
puede detectarse con marcadores
fenotípicos, bioquímicos y moleculares. La
correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante
para su implementación en los programas de
mejoramiento. Se citan a continuación algunos ejemplos de la utilización de marcadores
de varios tipos en la evaluación de la variación somaclonal..
La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales
ha sido exitosa y citada en varios trabajos de
investigación. El examen visual y la utilización
de un analizador de imágenes posibilitaron
la diferenciación entre fenotipos normales y
aberrantes de plantas regeneradas de
Pelargonium x hortorum ¨Río¨. Plantas de
(maní) presentaron variaciones epigenéticas
en altura, tamaño de hojas, número y peso
de semillas. El cultivo in vitro de yemas de
ananá dio como resultado plantas que exhibían cambios estables en el tamaño de frutos, tasa de proliferación de vástagos y color
y textura de las hojas; el cultivo de tejidos
de violeta africana, variedad «Crimson Frost»,
resultó en un 67% de variación en el color de
las flores de las plantas regeneradas.
A nivel fisiológico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de células
y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs
variables, entre otros, tanto para cereales
como para plantas frutales. La mayoría de
estos estudios se basaron en la
implementación de una alta presión de selección durante la etapa de regeneración celular mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración, tales como inóculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas.
El estudio del cariotipo permite detectar
cambios en el número y estructura de los
cromosomas. De esta manera podrían detectarse translocaciones, inversiones, deleciones
y duplicaciones. Los cambios cariotípicos constituyen una fuente importante de variación
que muchas veces es subestimada cuando se
realizan recuentos cromosómicos. Por esto
CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana
mismo existen otras técnicas que estiman
cambios cariotípicos con mayor eficiencia,
como por ejemplo el bandeo cromosómico.
Esta técnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica
(2n = 4), donde permitió detectar rearreglos
importantes en individuos donde el número
cromosómico permaneció estable. La hibridación in situ es otra de las técnicas que podría aportar información útil para detectar
cambios genéticos estructurales.
Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las
isoenzimas, que permitieron detectar entre
un 24 a 35% de variación en plantas de
Populus tremuloides regeneradas a través
de callos. Esta variación fue detectada mediante electroforesis en geles de almidón utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa
(SKDH), malato deshidrogenasa (MDH),
fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones
electroforéticos permitieron caracterizar a las
plantas fenotípicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron
polimorfismos en los loci estudiados.
En otros casos el análisis isoenzimático no
permitió detectar variación. El estudio de líneas de callos derivadas de embriones
cigóticos y de embriones somáticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando
15 sistemas isoenzimáticos no evidenció la
presencia de variación somaclonal en 25 loci
analizados. Los patrones isoenzimáticos de
líneas isogénicas de Trifolium pratense L. que
diferían en su capacidad de regeneración, resultaron idénticos para los sistemas de
peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas.
Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer información útil acerca de la variación
generada in vitro. Sin embargo, se están analizando los productos de genes expresados,
cuya regulación puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiológicos. Por otro lado, sólo se transcribe y traduce una pequeña proporción del genoma.
Por ello, los métodos de análisis a nivel
molecular pueden proporcionar mucha información, ya que las secuencias de ADN son
esencialmente las mismas en todas las células vivas de la planta, independientemente
del estado fisiológico o de desarrollo de las
mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar
inestabilidad genética debido a su amplia
cobertura del genoma y a que no son
influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de las plantas.
Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de
Triticum tauschii obtenidas mediante
callogénesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad genética en plantas regeneradas por
cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus
mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies, Quercus suber L.y Panax
notoginseng.
En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfológicas y
moleculares, pudiéndose discriminar plantas
normales de variantes morfológicas mediante la combinación de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha
sido posible realizar esta asociación, probablemente debido a la necesidad del empleo
de un mayor número de cebadores. En
Pelargonium x hortorum «Río» el empleo de
un conjunto de 13 cebadores permitieron la
detección de polimorfismos en solamente el
50% de las plantas con fenotipos aberrantes.
En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles
RAPD polimórficos con 12 cebadores en las 6
plantas fenotípicamente diferentes obtenidas por micropropagación.
En otro estudio se observó que no todas
las plantas de Musa de fenotipo anormal
(enanas) obtenidas presentaban el mismo
patrón de bandas. En este mismo género, la
técnica permitió detectar polimorfismos en
plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicaría que la variación molecular
no siempre se expresa a nivel fenotípico y viceversa.
Existen otros ejemplos que corroborarían
esta afirmación, tal es el caso de la palmera
datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no
se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que habían presentado fenotipos
florales anormales o el de plántulas
micropropagadas de Populus deltoides, donde a través de la utilización de microsatélites
se detectaron polimorfismos en plantas
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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fenotípicamente normales.
Otros marcadores moleculares utilizados
con éxito para la evaluación de variación
somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias
a nivel molecular entre plantas regeneradas
de fenotipo normal y aberrantes.
A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas específicas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon
dactylon en laboratorio, invernáculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un
somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col.,
1994), tenía un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero además
era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que producía menores niveles de un
estimulante para la alimentación del insecto. Es decir que mantenía los caracteres
agronómicos positivos del cultivar parental,
pero tenía un cambio en la producción de un
metabolito secundario que confería resistencia a la oruga.
5 La variación somaclonal y su aplicación
en el mejoramiento genético de las
plantas
La base del mejoramiento genético es la
optimización de interacciones génicas. Para
lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética.
Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles
o retrotrasposones), hibridación somática y
transformación genética. La variación
somaclonal proveería una fuente adicional de
variabilidad genética, utilizable en programas
convencionales de mejoramiento.
Algunas de las ventajas que presenta la
variación somaclonal pueden resumirse de la
siguiente manera:
√ Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo.
√ Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente
para cultivos con base genética estrecha y
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que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales.
√ Es exitosa para eliminar uno o pocos
defectos en cultivares bien adaptados.
√ Puede utilizarse para mejorar especies
de propagación sexual y vegetativa.
√ Las tasas de mutación son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación
somaclonal ocurre con una frecuencia de 1
mutación cada 100 plantas regeneradas, en
contraste con la tasa esperada de mutación
espontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por par
de nucleótidos por generación.
√ El conocimiento de las condiciones que
generan inestabilidad genética durante el
cultivo in vitro permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se
requiera estabilidad genética, como en la
micropropagación, la conservación de
germoplasma y la transformación genética.
√ El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría de los cambios
deletéreos producidos son eliminados por el
filtro que representa la regeneración de plantas.
Entre las desventajas cabe mencionar:
√ En algunos casos, las variantes
somaclonales no han avanzado de la etapa
de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica.
√ La escasa regeneración de plantas en
cultivos de largo término. Generalmente en
estos casos existe pérdida de la capacidad
morfogénica.
√ La regeneración está limitada a
genotipos específicos que pueden no ser de
mucho interés para los mejoradores.
√ Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética).
√ Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería
cumplir los siguientes requerimientos:
CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana
√ Involucrar caracteres agronómicamente
útiles.
√ El nivel de expresión del carácter debe
superar al de sus progenitores.
√ El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres
agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo.
√ La variación debe ser heredable (o bien
estable) en las generaciones subsiguientes.
En general, los mejoradores buscan en los
somaclones caracteres de importancia práctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar
unos pocos caracteres, ya que resulta
más
sencillo
mejorar
selectivamente una variedad corriente que crear una nueva.
etapa de multiplicación de semillas, que permitirá realizar pruebas agronómicas en diferentes ambientes, al menos en dos años distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresión del carácter. El programa finaliza con la etapa de multiplicación de semillas para el lanzamiento de
la variedad nueva al mercado.
Una modificación para la producción de
nuevas variedades está basada en el empleo
de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se
utilizan células haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan
variantes gametoclonales. Los gametoclones
5.1 Estrategias para la selección
de variantes útiles
Las estrategias que se han utilizado para obtener variación
somaclonal comprenden:
a) La obtención de plantas por
cultivo de células o tejidos, que luego son analizadas para el carácter
deseado.
La Figura 1 resume los pasos a
seguir para la obtención de un cultivar por variación somaclonal. Para
este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la producción comercial de variantes
disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz.
plantas regeneradas, aquellas que
expresen el carácter de interés. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generación R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta
progenies sexuales (en el caso de plantas con metodología tendría la ventaja de permitir
este tipo de reproducción), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes además
se vuelve a realizar la selección para el carác- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronómico buscado, tratando de man- tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las características favora- diante la exposición al alcaloide colchicina. Las
bles de la variedad. En plantas autógamas, evaluaciones a campo se realizan en forma
como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluación de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de
carácter hasta la generación R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales.
tos de las plantas R4 selectas con las líneas
b) La selección a nivel celular, selección
parentales a fin de determinar, mediante el
análisis de segregación, la base genética del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarácter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses bióticos o
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
91
abióticos y se utiliza generalmente para caracteres tales
como resistencia a toxinas
fúngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y
temperaturas extremas.
Mediante esta estrategia
pueden cultivarse explantos
de distintos genotipos y observarse el comportamiento
de los callos frente al agente
selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes
se procede a la regeneración
de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la
resistencia a campo y luego
son introducidas en el programa de mejoramiento.
La selección efectuada sobre cultivos celulares in vitro
puede llevarse a cabo mediante dos modalidades:
- Selección directa en un
solo paso, donde el agente de
selección es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas
de la MIC (concentración mí- concentraciones de aluminio
nima que produce un 100 %
ración de callo en el medio de cultivo al que
de inhibición).
- Selección en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de
centración del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tión. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a
frecuentes.
El primero es un método simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las células sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la torirían, permitiéndo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les.
A continuación se citan ejemplos donde
estrés serían deletéreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combinó la selección in vitro con la subsinivel de diferenciación tisular hubiesen sido guiente regeneración de plantas:
capaces de regenerar plantas tolerantes. La
- Producción in vitro de plantas de arroz
elección de un método u otro dependerá de
un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones tóxicas de aluuna indicación acerca de la reacción del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se
subletales del agente selectivo.
En la Figura 2 se representan las etapas observó la aparición de plantas resistentes a
de la selección in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles
rentes líneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La inducción y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicarían que
92
CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana
el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones útiles en el genoma de arroz.
- Obtención de resistencia a Fusarium
oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel
susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp.
dianthi permitió, luego de dos ciclos de selección, la obtención de callos resistentes que
se utilizaron para regenerar plantas. El 32%
de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenció considerable resistencia al patógeno en experimentos de campo.
La búsqueda de variantes a nivel celular
permitiría verificar y seleccionar fenotipos
adecuados entre millones de células, con una
inversión menor en tiempo, espacio y dinero
y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garantía de que la resistencia manifestada in
vitro se expresará a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenómeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios
epigenéticos, a la naturaleza quimérica del
material, al uso de toxinas no específicas (en
el caso de resistencia a enfermedades), a la
complejidad del carácter a ser seleccionado
(como por ejemplo la resistencia a salinidad
o sequía) o a la falla de las células para expresar el carácter cuando se diferencian.
En ambos casos (a y b) la obtención de
resistencia sólo será posible si ésta existe en
la población original (entonces el cultivo serviría sólo para recuperar los genotipos útiles)
o bien si surge por variación somaclonal durante el proceso de cultivo.
6 Variantes somaclonales liberadas
comercialmente
La variación somaclonal fue utilizada para
la producción de variedades comerciales con
caracteres agronómicos superiores en diferentes especies. A continuación se enumera,
para cada especie, el carácter agronómico seleccionado y el centro de investigación responsable de dicho logro: en geranio,
aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en
batata: calidad de raíces y arquitectura de la
canopia (North Carolina Research Service,
USA); en caña de azúcar: resistencia a estrés
y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-
tre, Fiji); en maíz: contenido de triptófano
(Molecular Genetic, USA); en tomate y apio:
contenido de materia seca y rendimiento,
respectivamente (DNA Plant technology of
New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute,
Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary);
en mostaza: rendimiento (ICAR, India).
Las primeras observaciones de variación
en caracteres morfológicos fueron realizadas
en arroz y otras especies a partir de 1968.
Diez años más tarde se informó en detalle la
variación obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. También se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del
tallo y otras características en alfalfa.
En arroz, la variación somaclonal resultó
en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parámetros morfológicos, caracteres agronómicos y tolerancia a
estreses bióticos y abióticos.
Pueden mencionarse además otros ejemplos de variación somaclonal en cultivos agrícolas de interés, como por ejemplo caña de
azúcar, donde se obtuvieron somaclones
provenientes del cultivar Pindar resistentes a
una virosis transmitida por áfidos. Paralelamente, también por variación somaclonal, se
seleccionó el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por
Sclerospora sacchari.
En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosómicamente variables produjo gran cantidad de
variantes somaclonales del cultivar «Russet
Burbano», que presentaron resistencia a
Phytophthora infestans, a Alternaria solana
y a la colonización por áfidos que transmitían el virus Y de la papa (PVY) y el virus del
enrrollamiento de la hoja (PLRV).
Se encontró también tolerancia a
glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida.
En sorgo se encontró variación somaclonal
estable para altura, número de macollos,
mayor producción de granos y mayor número de semillas y tolerancia a suelos ácidos y a
sequía.
La incidencia de variación somaclonal en
banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwán se obtu-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
93
vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium
oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares
no habían podido ser mejorados por métodos tradicionales. No obstante, para lograr
una variedad con rendimiento equiparable a
las variedades no resistentes se necesitaron
varios ciclos de micropropagación adicionales, que permitieron combinar ambas características en un somaclon.
Otros ejemplos donde se han obtenido
cultivares por variación somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium
sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium
oxysporum).
Se han detectado también caracteres interesantes modificados por esta técnica para
su explotación comercial en ornamentales,
como por ejemplo variación en el color de
las flores en gerbera, clavel y crisantemo.
En gramíneas forrajeras puede citarse
variación cromosómica en Festuca
arundinacea y pasto llorón (Eragrostis
curvula), albinismo en Lolium perenne y
Festuca pratense, cambios en la morfología
de planta, forma y tamaño de hoja y espiga,
desarrollo floral, vigor, y supervivencia en
somaclones de Lolium y Festuca
arundinacea, variación isoenzimática en
Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon).
En el laboratorio de Genética del Dpto.
Figura 3: Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo
de inflorescencias A) Formación de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfogénesis.
C) Estudio histológico de los mismos callos mostrando células embriogénicas y D) embriones somáticos. E) En el
mismo callo se observaron embriones bipolares y también F) organogénesis. G) Plántula completa en el momento
de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron fértiles (I). J) Cromosomas en el ápice radical de
la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomíctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a
partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando
variación, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.
94
CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana
de Agronomía de la UNS se llevó a cabo un
proyecto para obtener somaclones de pasto llorón (Fig.3). Se trabajó con varios
cultivares de esta gramínea apomíctica y luego de la evaluación de gran número de plantas se seleccionaron los siguientes materiales:
- Una planta diploide sexual, obtenida a
partir de un cultivar tetraploide apomíctico.
Dicho material está en proceso de
registración, y está siendo utilizado en estudios de apomixis.
- Dos plantas hexaploides apomícticas a
partir de un cultivar tetraploide apomíctico.
Dichas plantas dieron origen a dos nuevos
cultivares de Eragrostis curvula, muy
promisorios por sus características forrajeras,
que están en proceso de registro.
La variación in vitro en trigo y en otros
cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas
de triticale y trigo se informaron variaciones
a nivel del ADN mitocondrial y de proteínas
de la semilla, como las gliadinas. A nivel
fenotípico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, número de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de proteína en grano sin reducción del
rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, número de macollos, color del grano,
tiempo de espigazón, dureza, sensibilidad al
ácido abcísico, color de las glumas, entre otros
caracteres morfológicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas
y viceversa. El único antecedente en nuestro
país de búsqueda de variación somaclonal en
trigo es un estudio acerca de la estabilidad in
vitro de tres cultivares de trigo con elevados
niveles de inestabilidad cariotípica espontánea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosómica, patrón de gliadinas,
color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfología de la
planta, detectándose sólo una translocación
no descripta previamente y un patrón diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta técnica no
es efectiva para inducir variación que pueda
ser utilizada en programas de mejoramiento
(Franzone y col., 1996).
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