D. TORNERO, ET AL REVISIONES EN NEUROCIENCIA. EDITOR: J.V. SÁNCHEZ-ANDRÉS Papel del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial en los procesos neurodegenerativos D. Tornero, V. Ceña, C. González-García, J. Jordán THE ROLE OF THE MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE IN NEURODEGENERATIVE PROCESSES Summary. Aims. To review the role played by the mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in different physiological and pathological processes. Method. Both genetic and functional alterations in mitochondria can lead to errors that trigger programmed cell death, which in turn give rise to a number of diseases that affect the nervous system. Over the last few years the mitochondrion has been seen as the link between the different signalling pathways involved in some degenerative processes. The mitochondrion seems to play an important part in the cellular decision-making that leads, irreversibly, toward the execution phase in cellular death processes. This being the case, the action would be mediated by the permeability of its membranes, through the formation of the mitochondrial permeability transition pore, and would involve phenomena such as the dissipation of the mitochondrial electrochemical potential and the release of substances from within it. These substances include apoptosis-inducing factor (AIF), apoptosis protease activating factor-1 (apaf-1), cytochrome c and members of the protease family: the caspases. These alterations have been described in neurodegenerative pathologies such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis and transmissible spongiform encephalopaties. Conclusions. Designing pharmaceutical products capable of interfering with the functions of MPTP would allow a better therapeutic approach in neurological pathologies. [REV NEUROL 2002; 35: 354-61] Key words. Apoptosis. Bcl-2. Calcium. Caspase. Cytochrome c. Oxygen reactive species. INTRODUCCIÓN Las mitocondrias, del griego mito (hilo) y chondros (cartílago), son organelas citoplasmáticas de aspecto filiforme, con un diámetro comprendido entre 0,5 y 1 µm, con funciones que engloban desde el abastecimiento energético –en forma de ATP– a la célula, hasta la regulación citoplasmática de los niveles de segundos mensajeros, como el ión Ca2+ y las especies reactivas del oxígeno (ERO). Su capacidad de asociación a microtúbulos las convierte en orgánulos móviles y plásticos, capaces de desplazarse por el citoplasma y adquirir la morfología y localización celular más adecuadas, para que el aporte energético celular sea lo más eficiente posible [1]. En los últimos años, esta organela se está considerando como el lugar donde convergen diferentes vías de señalización apoptótica [2,3] y que, gracias a la capacidad de regulación de la permeabilidad de sus membranas, controla la liberación al citoplasma de señales capaces de activar cascadas proteicas que conducen a la muerte celular. El objetivo de este trabajo consiste en revisar el papel de la mitocondria y de la regulación de la permeabilidad de sus mem- Recibido: 23.07.02. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones:26.08.02. Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Departamento de Ciencias Médicas. Facultad de Medicina. Universidad de Castilla-La Mancha. Albacete, España. Correspondencia: Dr. Joaquín Jordán..Departamento de Ciencias Médicas. Facultad de Medicina. Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Universidad de Castilla-La Mancha. E-02071 Albacete. Fax: +34 967 599 327. E-mail: [email protected] Agradecimientos. La realización de este trabajo se ha llevado a cabo gracias a las ayudas SAF99-0060 y 1FD97-0500, de la CICYT; BFI2001-1565, del Ministerio de Ciencia y Tecnología; 01050, de la Consejería de Sanidad de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha (JCCM); PAI-02-031, de la Consejería de Ciencia y Tecnología de la JCCM, y de la Fundación CampollanoBSCH, otorgadas al Dr. Valentín Ceña, y a las ayudas BFI2001-1058 y GC-0299, de la Consejería de Ciencia y Tecnología de la JCCM, otorgadas a la Dra. Carmen González-García. Daniel Tornero es becario predoctoral de la JCCM. 2002, REVISTA DE NEUROLOGÍA 354 branas mediante la formación de un complejo multiproteico, conocido como poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM), en los procesos de muerte neuronal. Este trabajo se divide en tres apartados: en primer lugar, revisaremos algunos conceptos generales sobre la mitocondria; en segundo lugar, abordaremos los aspectos de estructura y regulación de la formación del PPTM, y terminaremos con un tercer apartado en el que la mitocondria y este poro se expondrán como centros reguladores de la cascada de procesos neurodegenerativos. CONCEPTOS GENERALES Estructura mitocondrial Las mitocondrias presentan una estructura con dos compartimentos bien definidos, matriz y espacio intermembranal, delimitados por dos membranas, interna y externa, con características morfológicas y funcionales muy diferentes. En la matriz se localizan varias copias del genoma circular mitocondrial, los ribosomas y numerosos complejos enzimáticos necesarios tanto para las funciones energéticas, como para la expresión y la replicación de genes [4]. En el espacio intermembranal se localizan las enzimas que median el tránsito de sustancias entre la matriz mitocondrial y el citosol, y alguno de estos complejos presenta actividad cinasa. Del mismo modo, sus membranas ofrecen también diferencias significativas. La membrana interna se caracteriza morfológicamente por presentar unas invaginaciones denominadas ‘crestas’, con multitud de complejos enzimáticos (los componentes de la cadena transportadora de electrones –CTE–, la ATP sintasa) y proteínas que regulan el paso de metabolitos, como el traslocador de nucleótidos de adenina (ANT, del inglés adenine nucleotide translocator). La membrana mitocondrial interna resulta especialmente impermeable a iones gracias a su alto contenido en el fosfolípido cardiolipina, característica esencial que le permite soportar un gradiente electroquímico necesario para el desempeño de la función energética. Por el contrario, la membrana externa carece de crestas mitocondriales y, en condiciones fisio- REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 PPTM EN PROCESOS NEURODEGENERATIVOS mite el paso regulado de proteínas mediante procesos controlados por unos complejos proteicos transmembranales –TIM (del inglés, translocase of the inner membrane) en la membrana interna y TOM (del inglés, translocase of the outer membrane) en la externa– que son capaces de discriminar entre aquellas proteínas que deben dirigirse a la matriz y las que lo harán hasta el espacio intermembranal [6]; en este proceso intervienen algunos miembros de la familia de las chaperonas que se inducen por calor (HSP, del inglés heat shock proteins), como la HSP 70 y la HSP 60 [7]. Existen zonas de contacto entre las membranas mitocondriales, las denominadas ‘zonas densas’, cuyos componentes proteicos son capaces de interaccionar y dar lugar a la formación de un canal, el PPTM, del que también forman parte proteínas del citoplasma y de la matriz mitocondrial [8] y el cual constituye una parte esencial del objetivo de la presente revisión. Función energética de la mitocondria La mitocondria es el escenario donde tiene lugar la fosforilación oxidativa, proceso en el que se genera poder reductor –en forma de NADH y FADH2–, que se utiliza en la cadena respiratoria. Acoplado al transporte de los electrones por diferentes niveles Figura 1. Mecanismos de entrada y salida de Ca2+ en la mitocondria. La redox, y gracias a la energía liberada, tiene lugar la salida de tres membrana externa mitocondrial es permeable a los cationes calcio debido protones desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermema la presencia en ella del VDAC. La membrana interna resulta impermeable branal, lo que origina un gradiente electroquímico entre los dos a los iones y, en el caso del calcio, contiene sistemas transportadores que regulan su entrada, el uniporte de Ca2+ (1), o su salida, como los antiportes compartimentos [9]; ello se traduce en una diferencia de pH de de Ca2+/Na+ (2) o de Ca2+/H + (3). La CTE (4) y el sistema antiporte Na+/H + una unidad y en una diferencia de potencial eléctrico de 140 mV, (5) colaboran en la formación del gradiente de H +, necesario para el correclo que supone un incremento de energía libre ( ∆G) de aproximato funcionamiento de alguno de los sistemas antes mencionados. damente -5 Kcal. Esta energía la utiliza la Tabla I. Componentes de la cadena transportadora de electrones mitocondrial. Fármacos inhibidores ATP sintasa (complejo V), localizada en la y alteraciones derivadas de su disfunción. membrana interna, para fosforilar moléculas de ADP, dando lugar a ATP, a la vez Complejo de la cadena transportadora de electrones que los protones vuelven a la matriz a favor I II III IV V de gradiente [10]. El funcionamiento correcto de este Enzima NADH-Co Q Succinato-Co Q Co QCitocromo c ATP sintetasa reductasa reductasa citocromo c oxidasa complejo enzimático es esencial para la reductasa vida de la célula, de forma que cualquier alteración en las enzimas que lo compoInhibidor Rotenona TTFA malonato Antimicina A Cianida Oligomicina Amital monóxido nen se puede traducir en enfermedades dede carbono generativas (Tabla I). Son muchos los acida inhibidores que se conocen de los distinSubunidad tos componentes de la CTE mitocondrial, ~36 4 10 10 ~14 de ADN nuclear los cuales se utilizan en estudios sobre su Subunidad 7 0 1 3 2 funcionamiento. de ADN mitocondrial ND1-6, ND4L Alteraciones descritas en: Enfermedad de Alzheimer Parkinson Cardiomiopatía Enf. de Leber Miopatías Enf. de Leigh Citocromo b Citocromo oxidasa I, II, III ATPasa 6 ATPasa 8 Regulación de segundos mensajeros Las mitocondrias, gracias a su capacidad de precipitar Ca2+ en su interior en forma de fosfatos, participan –junto con el retículo endoplasmático y las bombas iónicas y canales localizados en la membrana celular– en la regulación de los niveles citoplasmáticos del catión calcio libre ([Ca2+]c) [11]. Hasta el momento se han descrito tres sistemas de transportadores que controlan la entrada y la salida de este catión en la mitocondria: el uniporte de Ca2+, el antiporte 2Na +/Ca2+ y el antiporte Ca2+/2H+ (Fig. 1). El uniporte de Ca2+ es un transportador electrogénico y el único que se encarga de internalizar Ca2+, presenta baja afinidad por el Ca2+ y puede ser inhibido por rutenio rojo y Mg2+. Por otro lado, el antiporte Na +/Ca2+, inhibido por Enf. de Leigh Cardiomiopatía Ataxia Enf. de Leigh Miopatías Enf. de Leber Enf. de Alper Enf. de Leber Paraganglioma Miopatías Enf. de Leber Feocromocitoma Enf. de Leigh Miopatías Rabdomiolisis lógicas, es permeable al paso de iones y de metabolitos con pesos moleculares inferiores a 6.000 Da debido a la presencia de la proteína porina [5], conocida en la actualidad como canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC, del inglés voltage dependent anion channel). A pesar de la existencia de estos compartimentos, que a primera vista parecen estancos, la estructura mitocondrial per- REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 355 D. TORNERO, ET AL fármacos bloqueadores de los canales de Ca2+ del subtipo L –como el diltiacén–, y el sistema de antiporte dependiente de energía Ca2+/2H+, localizado en las mitocondrias de algunas células, realizan la liberación del Ca2+ en respuesta a determinados estímulos [12]. En algunas situaciones de carácter patológico puede darse un mecanismo alternativo de salida del Ca2+ desde la mitocondria, a través del PPTM. Como veremos más adelante, esta vía se perfila como un proceso crucial en los programas de muerte celular y desencadena, además, la disipación del potencial electroquímico y la liberación de muchas otras sustancias, tanto de la matriz como del espacio intermembranal. La conjunción de estos sistemas permite a la mitocondria responder a fluctuaciones de [Ca2+]c con una variación en sus niveles de [Ca2+]m de forma lenta. Debido a las propiedades cinéticas y termodinámicas de los sistemas de transporte y a los valores de las [Ca2+]c en condiciones de reposo (0,1-0,2 µM) o estimuladas (0,5-3 µM), la predicción es que, en condiciones fisiológicas, la acumulación de Ca2+ en la mitocondria resulte despreciable, debido, quizás, a la baja afinidad del sistema de uniporte por el Ca2+. Sin embargo, experimentos donde la [Ca2+]m se determinó gracias al uso de acuorinas [13] han demostrado que los cambios rápidos en la [Ca2+]c producidos, por ejemplo, por la estimulación de la célula nerviosa, sí tienen su representación en la mitocondria [14], y con una amplitud muy elevada (>10 µM) aunque de una duración muy corta (<5 s) [15,16] y es equilibrado por la salida de Ca2+. La respuesta al incremento de la [Ca2+]m tendría como resultado la activación de rutas metabólicas, generando más cantidad de energía para la célula, sin llegar a desencadenar los programas de muerte. Sin embargo, en condiciones patológicas, donde las [Ca2+]c se encuentran elevadas de forma sostenida, la entrada de Ca2+ en la mitocondria resulta desmesurada y conduce a efectos muy diferentes, como son la activación de forma rotunda del sistema uniporte de Ca2+ mitocondrial, con la consiguiente saturación de los sistemas de salida de calcio, obteniendo como resultado cambios drásticos en el interior de la mitocondria. Se ha propuesto a la mitocondria como la fuente de ERO más importante en células del sistema nervioso [17,18]. En ella, paralelamente a la reducción ‘enzimática’ del O 2 hasta H 2O por la citocromo oxidasa en la CTE, tiene lugar la reducción eventual, no enzimática, de un electrón del O 2, generando el anión superóxido, O2-. Esta reacción ‘parasitaria’ resulta inevitable debido a que los transportadores de electrones que intervienen en la cadena son muy reactivos y con un potencial redox negativo, como es el caso de la flavina (complejo I) y la ubiquinona (complejo III) [19]. En algunos casos, hasta un 2 % del O 2 total consumido por la CTE puede ser transformado hasta O 2- por la coenzima Q. Es más, en condiciones donde los niveles de ADP se encuentran disminuidos –como sucede con el tratamiento con inhibidores de los diferentes complejos de la CTE como la antimicina A (Tabla I)–, la producción del ión superóxido se ve aumentada. Vías de señalización de apoptosis La primera indicación de que la mitocondria desempeña un papel importante en la inducción de los procesos de apoptosis proviene de observarse, en sistemas in vitro, la necesidad de la presencia de esta organela para inducir apoptosis [20]. Este proceso tiene gran importancia en las enfermedades neurodegenerativas donde se ha descrito una pérdida neuronal. Los estímulos de muerte por apoptosis pueden ser de diferente origen, aunque todos ellos 356 Figura 2. La mitocondria como centro integrador de las rutas proapoptóticas. Esquema de las diferentes vías de inducción de apoptosis: a través de los receptores relacionados con Fas y el factor de necrosis tumoral (TNF), que originan la activación de la caspasa-8, la cual hidroliza la proteína Bid; mediante el daño en el ADN y la estabilización de p53 y traslocación de Bax a la mitocondria; y a través de la entrada de Ca2+. También se observa la modulación a través de los miembros antiapoptóticos de la familia de Bcl-2 (Bcl2 y Bcl-xL). Finalmente, el resultado de la apertura del PPTM, la liberación de citocromo c (Cit c) y la formación del apoptosoma promueven la apoptosis. convergen de algún modo en la mitocondria, utilizando para ello diferentes vías (Fig. 2). Cuando el sistema nervioso es sometido a sobreexcitación por glutamato, como ocurre en los procesos isquémicos, se ha observado una entrada masiva y prolongada del ión Ca2+ al citoplasma [21] que es ‘detectada’ por la mitocondria, como ya se ha comentado. Además, existen receptores específicos de muerte celular, como TNF-R1 o Fas, que cuando se estimulan, inducen la activación de la caspasa 8 que proteoliza a Bid, produciendo su activación y traslocación a la mitocondria [22,23]. Por otro lado, los factores tróficos y las citocinas son capaces, a través de sus receptores, de activar la fosfoinosilol-3-cinasa intracelular. Esto da lugar a la generación de dos productos lipídicos (PI-3,4-P2 y PI-3,4,5-P3) que actúan como segundos mensajeros y activan las serina/treonina cinasas Akt y PDK1 a través de sus dominios PH [24]. Cuando se priva a una célula de factores tróficos y citocinas, estas vías no se activan y Bcl-xL se encuentra secuestrado por Bad. Por último, el daño en el genoma celular puede ser detectado por el factor de transcripción p53, que es capaz de inducir un incremento en los niveles citoplasmáticos de la proteína Bax, la cual se transloca a la mitocondria. REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 PPTM EN PROCESOS NEURODEGENERATIVOS Se han caracterizado un total de 79 componentes de naturaleza peptídica que se liberan durante la apertura del PPTM [29]. Entre estos componentes se incluyen enzimas catabólicos, endocepina y multitud de iones y moléculas con conocida actividad proapoptótica, como el citocromo c (Cit c), Smac/DIABLO [30], apaf-1, factor inductor de apoptosis (AIF, del inglés apoptosis-inducing factor) [31] y algunos miembros de la familia de las caspasas, como caspasa-2 y caspasa-9 [32,33]. Una vez liberados al citoplasma, estos agentes pueden activar diferentes rutas de ejecución apoptóticas. Así, mientras que el Cit c entra a formar parte como cofactor de un complejo multiproteico, apoptosoma, requerido para la activación de la caspasa-9, el AIF desencadena procesos de condensación de la cromatina y fragmentación del ADN, de una forma independiente a la activación de miembros de la familia de caspasas [31]. Regulación del PPTM Figura 3. Estructura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. ANT localizado en la membrana interna mitocondrial, y VDAC, en la membrana externa. Con ellos interaccionan, para su modulación, hexoquinasa (citoplasma), receptor de benzodiacepinas (membrana externa), creatina cinasa (espacio intermembranal) y ciclofilina D (matriz mitocondrial). PORO DE PERMEABILIDAD TRANSITORIA MITOCONDRIAL (PPTM) El PPTM es un complejo multiproteico que se forma en las zonas de unión entre las membranas interna y externa de la mitocondria. En él participan proteínas de localización citoplasmática (hexocinasa), de la membrana externa (VDAC), de la membrana interna (ANT) y de la matriz mitocondrial (ciclofilina D) [8]. En condiciones fisiológicas, los diferentes componentes del PPTM se encuentran disgregados [25]. De esta forma, el VDAC contribuye a la permeabilización de la membrana externa, el ANT controla el paso de manera específica de las distintas formas –fosforiladas y no fosforiladas– de nucleótidos de adenina a través de la membrana interna, y la ciclofilina D presenta una actividad peptidil-propil isomerasa, la cual resulta crucial para el plegamiento de proteínas [26]. Algunos de estos componentes pueden encontrarse unidos a otras proteínas. Es el caso del VDAC, que se une al receptor de benzodiacepinas mitocondrial y, de esta manera, regula la transferencia de colesterol extramitocondrial al espacio intermembranal [27]. Además, al complejo de unión se le une la fosfocinasa de creatina, asociación que facilita el transporte de energía mediado por creatina-fosfato de creatina [28] (Fig. 3). Cuando un estímulo apoptótico alcanza la mitocondria, los diferentes componentes proteicos pueden ensamblarse formando un poro –de un radio de 1,0 a 1,3 nm– que permite el paso de moléculas de un tamaño inferior a 1.500 Da de forma no selectiva. Su apertura produce la permabilización de las membranas mitocondriales, contribuyendo, por lo tanto, a: – La disipación del gradiente proteico entre citoplasma y matriz, que se encuentra decantado en condiciones fisiológicas hacia esta última. – La disminución del potencial electroquímico, con la consecuente bajada en los niveles de ATP. – El hinchamiento de la mitocondria, debido a la entrada de agua, que producirá la rotura de la membrana externa, liberando moléculas del espacio intermembranal al citoplasma. REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 Los factores que regulan la formación y apertura del PPTM son muchos y variados (Tabla II); entre ellos destacan el calcio, las ERO y miembros de la familia de proteínas de Bcl-2 que se han relacionado con procesos de muerte neuronal. En condiciones donde las [Ca2+]c se encuentran elevadas de una forma sostenida, como ocurre en los procesos neurodegenerativos producidos por isquemia o excitotoxicidad, el sistema de captación uniporte se mantiene activo debido a su baja afinidad, permitiendo la entrada de Ca2+ a la mitocondria, mientras que los sistemas responsables de la extrusión del Ca2+ mitocondrial se saturan. En dichas situaciones, la mitocondria no es capaz de incrementar la [Ca2+]m indefinidamente y ésta se libera. El mecanismo responsable de esta liberación implica el aumento de la permeabilidad de la membrana interna mitocondrial mediante la formación del PPTM. Condiciones de estrés oxidativo y sustratos como fosfato, acetoacetato y oxalacetato son factores que estimulan la liberación de Ca2+ de la mitocondria a través de la formación del PPTM. Las ERO son capaces de inducir la apertura del PPTM [34,35]. La exposición de mitocondrias a ERO provoca una disminución de su contenido en residuos tiol de la membrana y el colapso del potencial de membrana mitocondrial (∆ϕm) [36], hecho que se previene mediante la presencia de agentes antioxidantes como la vitamina E o de glutatión. Aumentos en la [Ca2+]m o en los niveles de ERO son capaces de eliminar la especificidad del ANT y modular positivamente su unión a la ciclofilina D (CyP-D) para que entre a formar parte del PPTM. Esta unión se encuentra, a su vez, modulada por diversos factores, como las ERO, que aumentan la sensibilidad de ANT a Ca2+. Por otro lado, los nucleótidos de adenina de la matriz y las disminuciones en el pH intracelular contribuyen a su insensibilización. Algunos miembros de la familia de proteínas de Bcl-2, quizás la más relevante en los procesos reguladores de muerte celular, se han relacionado con el PPTM. Así, el producto del gen Bcl-2 inhibe la formación del PPTM, produciendo la estabilización de la membrana mitocondrial, un aumento de la capacidad amortiguadora de Ca2+ [37,38] y la protección del ∆ϕm frente a diversos estímulos [39]. Son dos las hipótesis que se barajan para explicar su acción sobre el PPTM: – Su interacción directa con un residuo tiol de la secuencia de ANT [40]. – La capacidad de ocluir el VDAC a través de su dominio BH4 [41]. 357 D. TORNERO, ET AL Por todo ello, el producto del gen Bcl-2 se ha mostrado eficaz en el bloqueo de numerosos y variados mecanismos apoptóticos, entre los que destacan los procesos neurodegenerativos isquémicos, exposición a NMDA y esclerosis lateral amiotrófica, entre otros [42-44]. Bcl-xL, dependiendo de su estado de fosforilación, regula la apertura del VDAC. Así, Bcl-xL previene la salida de Cit c desde la mitocondria, inducida por agentes químicos [45]. Su región BH1 es requerida para establecer la unión al VDAC, mientras que la BH4 es necesaria y suficiente para ocluirlo [41]. Los miembros proapoptóticos como Bax, Bak, Bid y Bad [46] suelen presentar una localización citoplasmática y, sólo después de su traslocación a la mitocondria, son capaces de inducir la apertura del poro, liberando el Cit c [47], hecho que es prevenido por Bcl-2 [48] y Bcl-xL [49,50]. Parece ser que esta liberación inducida por este tipo de factores concierne únicamente a la membrana externa, por lo que no implica cambios en el potencial mitocondrial ni en el volumen de la mitocondria, aunque se ha demostrado que en algunos casos participan proteínas de la membrana interna. El mecanismo de acción de Bax parece relacionarse con su capacidad de formar canales en membranas lipídicas, debido a que su estructura presenta similitud con los dominios formadores de poros de algunas toxinas como la difteria y las colicinas [51]. Bax puede presentarse en forma monomérica u oligomérica, siendo esta última la única capaz de formar canales en membranas lipídicas y de inducir la liberación de Cit c [51]. Aunque este hecho pone en tela de juicio el papel del PPTM en los procesos de muerte celular donde Bax está implicado, se ha observado que la presencia de ANT resulta necesaria para inducir esta liberación de Cit c. Bid, al igual que Bax, presenta una localización citoplasmática; requiere ser hidrolizado parcialmente por proteasas, como la caspasa-8 o la granzima B [52], y sufrir una posterior N-miristoilación, para migrar hacia la mitocondria, donde induce la liberación de Cit c y de apaf-1. Su acción puede estar mediada por diferentes mecanismos, como la interacción con ANT [53], aumentando su actividad [54] o la inducción de la inserción mitocondrial de Bax [55]. Estos efectos son sensibles a la presencia de inhibidores del PPTM [56]. Aunque Bax, Bak y Bid inducen liberación de Cit c , lo realizan por mecanismos diferentes. Bax requiere la presencia de ANT [57], induciendo una caída en el ∆ϕm, y sus efectos sobre la permeabilización de la membrana son prevenidos por fármacos inhibidores de la CTE, como antimicina, protonóforos, KCN y oligomicina. Sin embargo, Bak necesita de VDAC para ejercer su función proapoptótica, y Bid no produce modificaciones del ∆ϕm y es insensible a estos fármacos [56]. Además de los factores anteriormente comentados, la mitocondria es diana de otras proteínas cinasas (la proteína cinasa C [58]), de factores de trascripción (p53 y Nur 77) y de proteínas víricas (proteína R, Vpr [59]). La proteína p53, en condiciones donde ésta induce apoptosis, sufre una translocación rápida y selectiva hacia la mitocondria, precediendo en el tiempo a cambios en el ∆ϕm, a la liberación de Cit c y a la activación de la procaspasa-3 [60]. Así mismo, el producto del gen Nur 77, también conocido como TR3, sufre una translocación desde el núcleo hasta la mitocondria, donde induce la liberación de Cit c [61]; y la proteína Vpr es capaz de interaccionar directamente con el ANT, originando una rápida disipación del ∆ϕm [62]. En la actualidad disponemos de fármacos con capacidad de modular la formación del PPTM [63]. Entre ellos destaca la ciclos- 358 Tabla II. Regulación de la función del PPTM en la muerte neuronal, alteraciones y consecuencias de la apertura del poro. Estímulos inductores Bax, Bid, Bad, Bak Nur77, GD3, P i Ceramida Ácidos grasos ↑ [Ca2+]c ↑ EROS ↓ pHi ↓ ∆ϕm Proteínas víricas Estímulos inhibidores Bcl-2, Bcl-xL SOD, catalasa GSH, ATP, ADP ↑ ∆ϕm Mg2+ Fármacos Ciclosporina A Ácido bongkrékico Trifluoroperacina Dibucaína Tamoxifeno Alteraciones intramitocondriales ↓ ∆ϕm ↓ Respiración ↓ ATP/ADP ↑ NADH (oxidada) ↑ NOS ↑ Ceramida sintasa Consecuencias Liberación de citocromo c Liberación de apaf-1 Liberación de caspasas Liberación de enzimas catabólicas Hinchazón mitocondrial ↑ ERO ↓ ATP Activación de caspasas [Ca2+]c : concentración de ion calcio citoplasmático;∆ϕm, potencial de membrana mitocondrial; ERO, especies reactivas del oxígeno; GD3, gliceraldehído 3 fosfato; GSH, glutatión;NADH, dinucleótido de nicotina y adenina en forma reducida; NOS, óxido nítrico sintasa; SOD, superóxido dismutasa. REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 PPTM EN PROCESOS NEURODEGENERATIVOS porina A (CsA) y el ácido bongkrékico, con dianas farmacológicas diferentes. Mientras que la CsA se une a CyP-D en el lugar de unión con ANT, impidiendo su unión a éste [64], el ácido bongkrékico inhibe directamente al translocador de nucleótidos de adenina [65]. LA MITOCONDRIA EN LOS PROCESOS NEURODEGENERATIVOS En los últimos años, algunas enfermedades neurodegenerativas se han relacionado con disfunciones mitocondriales de diferente tipo [66]. Por ejemplo, en la ataxia de Friedreich, la frataxina –proteína localizada en la mitocondria y requerida para el mantenimiento de la homeostasis del hierro y el contenido en ADN– se encuentra mutada [67]. Otro ejemplo es la paraplejía espástica hereditaria, donde se han observado mutaciones en la paraplegina, una metaloproteasa mitocondrial, que dan lugar a defectos en la fosforilación oxidativa [68]. Además, enfermedades hereditarias que afectan al sistema nervioso se asocian con mutaciones ocurridas en el ADN mitocondrial. En sistemas posmitóticos, como es el sistema nervioso, se acumulan mutaciones somáticas mitocondriales que, sumadas al descenso de la función mitocondrial, pueden ser la causa del envejecimiento y la senescencia [69]. La actividad de la CTE puede verse reducida o comprometida debido a un inadecuado aporte de oxígeno en las células, como ocurre en procesos de arteriosclerosis, anemia y situaciones de alcoholismo [70]. Pacientes con neuropatía óptica hereditaria de Leber presentan mutaciones en el complejo I mitocondrial [71] (Tabla I), y se ha observado una reducción de su actividad en sujetos que padecen la enfermedad de Parkinson [72]. En este sentido, algunas neurotoxinas o sus metabolitos pueden ser causa o contribuir a la enfermedad de Parkinson, como la 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y su metabolito MMP+, inhibidores de la CTE, fármacos utilizados como inductores de dicha enfermedad en modelos farmacológicos para el estudio de los mecanismos celulares que tienen lugar en dichas enfermedades degenerativas. MPP+ en cultivos neuronales es capaz de inducir la liberación de Cit c y la disminución de la viabilidad celular [73]. La pérdida del ∆ϕm, consecuencia de la formación y apertura del PPTM, se ha descrito tanto en células provenientes de individuos que padecen corea de Huntington o enfermedad de Alzheimer [74,75], como en modelos experimentales de estas dos enfermedades (tratamiento de cultivos neuronales con 3-nitropropiónico [76] o fragmentos de péptidos β-amiloideos [44]). El PPTM desempeña también un papel importante en los procesos de muerte celular inducidos por la activación de receptores localizados en la membrana celular, entre los que se encuentra la familia de Fas (FasR). La activación de dichos receptores implica la activación de la cascada de las caspasas, donde la mitocondria funciona como un amplificador de la señal [77]. La activación de FasR se produce por la trimerización del receptor, que recluta tanto la molécula adaptadora FADD (del inglés, Fas associated death domain), como la procaspasa- 8, que se activa y forma un complejo multimérico conocido como DISC (en inglés, death-inducing signal complex). La caspasa-8, así formada, puede a su vez hidrolizar Bid, que induce la liberación de Cit c desde la mitocondria. El bloqueo de la formación del PPTM protege los cultivos celulares frente a estímulos apoptóticos. Como hemos comentado anteriormente, en los procesos isquémicos ocurre una excesiva activación de los receptores de glutamato, que conduce a un aumento en [Ca2+]c, provocando su acumulación en la mitocondria y, con ello, la apertura del PPTM. En cultivos celulares donde se previene dicha acumulación mediante el uso de fármacos capaces de disipar el potencial eléctrico, como es el caso del protonóforo FCCP, se previenen los procesos de muerte celular, lo que indica que la formación del PPTM resulta crucial para la activación de la cascada de señalización que conduce a la muerte celular; ello deja en un segundo lugar los niveles de calcio citoplasmático [78]. El bloqueo de la producción de ERO mediante el uso de fármacos con actividad catalasa o superóxido dismutasa se ha mostrado eficaz para prevenir la formación del PPTM no sólo en mitocondrias aisladas, sino también en cultivos celulares. Así, EU-134, un fármaco con actividad superóxido dismutasa, bloquea procesos de muerte neuronal en diferentes modelos, entre los que destacan los inducidos por la exposición a NMDA o por el tratamiento con el fármaco inhibidor de la proteína cinasa c, estaurosporina, que se ha utilizado ampliamente como fármaco inductor de procesos apoptóticos en numerosos modelos celulares [79,80]. Por último, fármacos bloqueadores de la apertura del PPTM, como la CsA y el ácido bongkrékico, presentan también efectos neuroprotectores. Aunque la CsA tiene otras muchas acciones, parece que su capacidad de unirse a CyP-D es la responsable de los efectos citoprotectores, ya que otras inmunofilinas, como la FK506, que no resultan capaces de unirse a CyP-D, no los presentan. Así, la CsA previene las disminuciones en viabilidad celular descritas en modelos neurotóxicos, como aquellos que remedan la corea de Huntington [21,74,75,81-83], o en las zonas del hipocampo afectadas tras procesos isquémicos [84]. El ácido bongkrékico, con capacidad de unirse al ANT, impide la interacción del translocador con Bax, inhibiendo la liberación de la caspasa9 desde mitocondrias del cerebro. Dicho fármaco ofrece neuroprotección frente a los procesos de isquemia en el cerebro y resulta también eficaz para prevenir la muerte celular inducida por la exposición a NMDA de cultivos cerebrocorticales, a la vez que previene la caída en el ∆ϕm y promueve la recuperación de los niveles de ATP [65]. CONCLUSIONES A lo largo de esta revisión hemos considerado la mitocondria como organela clave en los procesos de muerte celular y, dentro de ella, el PPTM como regulador de dichos procesos. El hecho de que la formación y apertura del PPTM sea un proceso controlado por una gran variedad de estímulos lo convierten en una diana farmacológica ideal que podría implicarse en ciertos procesos neurodegenerativos, entre los que destacan las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y algunas encefalopatías espongiformes transmisibles, donde también se han descrito alteraciones mitocondriales. BIBLIOGRAFÍA 1. Bereiter-Hahn J. Behavior of mitochondria in the living cell. Int Rev Cytol 1990; 122: 1-63. 2. Kroemer G, Reed JC. Mitochondrial control of cell death. Nat Med 2000; 6: 513-9. REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 3. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309-12. 4. Gray MW, Burger G, Lang BF. Mitochondrial evolution. Science 1999; 283: 1476-81. 359 D. TORNERO, ET AL 5. DePierre JW, Ernster L. Enzyme topology of intracellular membranes. Annu Rev Biochem 1977; 46: 201-62. 6. Neupert W. Protein import into mitochondria. 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La mitocondria parece ocupar un lugar destacado en la toma de decisión celular que conlleva, irreversiblemente, hacia la fase de ejecución en los procesos de muerte celular. Esta acción estaría mediada por la regulación de la permeabilidad de sus membranas, a través de la formación del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial, e implicaría fenómenos como la disipación del potencial electroquímico mitocondrial y la liberación de sustancias desde su interior, entre las que se incluyen el factor inductor de apoptosis (AIF), apaf-1, el citocromo c y miembros de la familia de proteasas, las caspasas. Dichas alteraciones se han descrito en patologías neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y encefalopatías espongiformes transmisibles. Conclusiones. El diseño de fármacos que pudieran interferir con las funciones del PPTM permitiría un mejor abordaje terapéutico en patologías neurológicas. [REV NEUROL 2002; 35: 354-61] Palabras clave. Apoptosis. Bcl-2. Calcio. Caspasa. Citocromo c. Especies reactivas del oxígeno. PAPEL DO PORO DE PERMEABILIDADE TRANSITÓRIA MITOCONDRIAL NOS PROCESSOS NEURODEGENERATITIVOS Resumo. Objectivo. Rever o papel que desempenha o poro de permeabilidade transitória mitocondrial (PPTM) em diversos processos fisiológicos e patológicos. Desenvolvimento. Alterações mitocondriais, quer genética, quer funcionais, podem levar a erros que desencadeiam programas de morte celular, responsáveis por sua vez, por numerosas doenças do sistema nervoso. Durante os últimos anos, o mitocôndrio foi considerado o elo de união entre diferentes vias de sinalização envolvidas em alguns processos degenerativos. A mitocôndria parece ocupar um lugar de destaque na decisão celular que leva, irreversivelmente, à fase de execução dos processos de morte celular. Esta acção estaria mediada pela regulação da permeabilidade das suas membranas, através da formação do poro de permeabilidade transitória mitocondrial, e envolveria fenómenos como a dissipação do potencial electroquímico mitocondrial e a libertação de substâncias do seu interior, entre as quais estão o factor indutor de apoptose (AIF), apaf-1, o citocromo c e membros da família das proteases, as caspases. Estas alterações foram descritas em patologias neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, a de Parkinson, a esclerose lateral amiotrófica e encefalopatias espongiformes transmissíveis. Conclusões. O desenho de fármacos que puderam interferir com as funções do PPTM permitiram uma melhor abordagem terapêutica em patologias neurológicas. [REV NEUROL 2002; 35: 354-61] Palavras chave. Apoptose. Bcl-2. Cálcio. Caspase. Citocromo c. Espécies reactivas ao oxigeno. REV NEUROL 2002; 35 (4): 354-361 361