Microtúbulos

El citoesqueleto es un sistema subcelular formado
por filamentos y proteínas accesorias
Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto. Microfilamentos
microvellosidades
fibras de estrés
sarcómeros
Alberts et al., MBC2002
Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto. Microtúbulos
axonemas
MTs de interfase
MTs del huso
vesícula
moléculas
motoras
microtúbulos
Alberts et al., MBC2002
Hirokawa´s lab
Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto.
Filamentos intermedios
IFs de procesos gliales
IFs de células epiteliales
malla de laminas
Alberts et al., MBC2002
Los filamentos del citoesqueleto son polímeros dinámicos
La polimerización/depolimerización
de los filamentos permite rápidos
ajustes de la estructura del
citoesqueleto y de la forma celular
actina  microfilamentos
tubulina   microtúbulos
varias sub   filam. intermedios
Alberts et al., MBC2002
Múltiples uniones no covalentes entre los monómeros proporciona
estabilidad interna a los filamentos, y restringe el
intercambio de subunidades a los extremos
En los filamentos intermedios interacciones
laterales múltiples entre sus subunidades
confieren una alta resistencia a deformaciones
Alberts et al., MBC2002
Estudios in vitro revelan las propiedades cinéticas de la polimerización
La cinética de polimerización de actina y tubulina monomérica puede ser monitoreada in vitro por turbidimetría, empleando un
espectrofotómetro. Durante una fase inicial se forman pequeños núcleos (fase de nucleación) y luego la polimerización incrementa
linealmente en función del tiempo (fase de elongación) hasta alcanzar un estado estacionario donde la masa del polímero
permanece constante. La concentración de monómeros en el estado estacionario es la concentración crítica o Cc; concentraciones
de monómero mayores o menores a la Cc determinan el aumento o disminución de la masa del polímero, respectivamente.
La fase de lag se reduce o elimina si se agregan
núcleos pre-ensamblados al comienzo de la reacción.
Lodish et al MCB2004
Los polímeros de tubulina y actina exhiben polaridad funcional
La incubación de fragmentos de polímero (ej. axonemas) con concentraciones de monómero (ej. tubulina) varias veces
mayor a la Cc resulta en la elongación de los polímeros por ambos extremos, aunque uno crece ~ 5 veces mas rápido
que el otro. Al extremo de mayor crecimiento se lo denomina extremo (+) y al de crecimiento lento extremo (-). Cuando
la concentración de monómero se diluye por debajo de la Cc, los polímeros se desensamblan por ambos extremos,
aunque se acortan mas rápido por el extremo (+).
polimerización de tubulina
polimerización de actina
tubulina/actina > Cc
dilución
mayor elongación del
extremo (+)
tubulina/actina < Cc
desensamble preferencial
del extremo (+)
La diferente cinética de los extremos obedece a una
polaridad estructural de los polímeros de actina y tubulina
La polaridad de los polímeros de tubulina y actina puede determinarse mediante microscopía electrónica después de incubar
los polímeros en condiciones especiales con tubulina o fragmentos de miosina, respectivamente.
Análisis al microscopio electrónico de la polaridad de
microfilamentos empleando fragmentos S1 de miosina.
Análisis al microscopio electrónico
de la polaridad de microtúbulos
seccionados transversalmente.
la orientación de
los ganchos de
tubulina en dirección
horaria indican que
el extremo (+) apunta
hacia el observador.
¨pointed end¨ (-)
extremo (-)
hacia el frente
¨barbed end¨(+)
Los monómeros de actina y tubulina unen nucleósidos trifosfatos
El monómero de actina se une a una molécula de ATP. El dímero de tubulina se une a dos moléculas de GTP; una
molécula de GTP se une a la subunidad de tubulina beta y puede hidrolizarse e intercambiarse. En el estado monomérico
la actina y tubulina estan unidas a nucleósidos trifosfatos y en este estado se incorporan a los polímeros.
GTP
GTP
actina
dímero αβ de tubulina
La presencia de ATP en actina y GTP en tubulina no es requerida para la polimerización
Alberts et al., MBC2002
La hidrólisis del nucleótido unido ocurre después de la polimerización
y desestabiliza la estructura
La actina-ATP y la tubulina-GTP (forma T) se adicionan en ambos extremos de los polímeros, sin embargo la
constante de asociación kon es mayor en el extremo (+). La hidrólisis del nucleótido (forma D) incrementa
la constante de disociación koff . La Cc(D) es mayor que Cc(T). A concentraciones de monómero
intermedias entre CcT y CcD la longitud del polímero permanece constante (“treadmilling”).
Cc = koff/kon
Para la actina, la Cc- es 0.6 μM y la Cc+ 0.1μM
Alberts et al., MBC2002
En el estado dinámico de "treadmilling“ el polímero se elonga
por el extremo (+) y se acorta por el extremo (-)
En el estado de "treadmilling" la adición de monómeros en el extremo (+) y la pérdida de subunidades
del extremo (-) estan balanceadas de modo que la longitud del polímero permanece invariable.
Cc (+) < Cc (-)
actina-ADP
actina-ATP
En ciertas condiciones, microtúbulos y microfilamentos experimentan ¨treadmilling¨
in vivo. Ej. los microfilamentos del lamelipodio, y los microtúbulos de metafase.
Los microtúbulos además exhiben un comportamiento dinámico
conocido como inestabilidad dinámica
La inestabilidad dinámica de los microtúbulos puede visualizarse en células vivas.
tiempo 0
tiempo 2 min
tiempo 5 min
tiempo 11 min
10 μm
A diferencia del treadmilling, la
inestabilidad dinámica se caracteriza
por la alternancia entre fases de
crecimiento lento y de acortamiento
rápido en los extremos (+). La transición
de la fase de crecimiento a la de
acortamiento se denomina catástrofe y
la transición de acortamiento a
crecimiento rescate.
Lodish et al MCB2004
La inestabilidad dinámica es una consecuencia de la presencia de
tubulina-GDP/GTP en los extremos (+) de los MTs
La inestabilidad dinámica de los
microtúbulos depende de la
presencia de tubulina-GDP o
tubulina-GTP en los extremos (+).
En una población de microtúbulos,
existe una mezcla de ambos estados.
Cuando la velocidad de adición de
monómeros supera a la de la hidrólisis
del GTP se acumula tubulina-GTP
("GTP cap"), condición que favorece
la elongación. Cuando el cap
de GTP se pierde, la velocidad de
disociación de monómeros incrementa
dramáticamente, causando
el acortamiento rápido del MT.
extremo
estable
tub-GDP
extremo
inestable
Alberts et al., MBC2002
El estado de polimerización de la actina y tubulina
puede afectarse con diversas drogas
Algunas drogas se unen y secuestran a los monómeros
no ensamblados, provocando la depolimerización de los
filamentos. Otras drogas se unen a los filamentos y los
estabilizan. El efecto de las drogas revela el rápido y
continuo intercambio de subunidades en los polímeros.
Inmunofluorescencia de MTs.
ACTIN -SPECIFIC DRUGS
centrosoma
Phalloidin
binds and stabilizes filaments
Cytochalasin
caps filament plus ends
Swinholide
severs filaments
Latrunculin
binds subunits and prevents their polymerization
Depolimerización de MTs. Células
incubadas 30 min con nocodazol.
MICROTUBULE -SPECIFIC DRUGS
Taxol
binds and stabilizes microtubules
Colchicine, colcemid
binds subunits and prevents their polymerization
Vinblastine, vincristine
binds subunits and prevents their polymerization
Nocodazole
binds subunits and prevents their polymerization
centrosoma
En las mayoría de las células animales los microtúbulos se
organizan a partir de los centrosomas
El centrosoma esta formado por un par de centríolos. El material pericentriolar contiene numerosos
complejos de tubulina gama donde se nuclean los microtúbulos y se anclan los extremos (-).
dímero α/β
inmunofluorescencia
proteínas accesorias
Microscopía electrónica de un MT nucleado en un anillo de tubulina γ
γ-Turc
γ -Turc: gama Tubulin ring complex
Los complejos ARP2/3 se associan lateralmente a
microfilamentos preformados y nuclean monómeros de actina
Los complejos Arp2/3
generan filamentos
ramificados. Otras
proteínas, denominadas
forminas, nuclean actina
y dan origen a fillamentos
no ramificados.
dímero de
formina
Microscopía electrónica
Alberts et al., MBC2002
En las células el estado de polimerización de la actina y
tubulina es regulado por diversas proteínas asociadas
proteínas que se unen a las
subunidades no ensambladas *
tubulina
actina
proteínas que causan la fragmentación
de los polímeros
microtúbulos
katanin
stathmin
thymosin
stathmin-P
profilin
*las proteínas promueven la depolimerizacion (↓)o
polimerizacion (↑) de los respectivos polímeros
proteínas que se unen a los
extremos de los polímeros
microtúbulos
microfilamentos
γ-TuRC (-), nucleación
CapZ (+), capping
+ TIPs (CLIP170, Op18) Arp2/3 (-), nucleación
microfilamentos
gelsolin
proteínas que se asocian a las paredes
de los polímeros y los estabilizan
microtúbulos
microfilamentos
MAP2, Tau
XMAP215
tropomyosin
proteínas que se asocian a las paredes
de los polímeros y los desestabilizan
microtúbulos
XMAP215-P
KIF2
microfilamentos
cofilin
Ciertas MAPs (+TIPs) se unen a los extremos (+) de los
microtúbulos y afectan su dinamismo
ej. CLIP170
ej. Op18, XKCM1, XKIF2
Alberts et al., MBC2002
Otras MAPs se unen a los monómeros y promueven
la depolimerización de los MTs
stathmin secuestra tubulina no ensamblada, favoreciendo la frecuencia de catastrofes de los extremos (+)
Alberts et al., MBC2002
MAP2 y Tau se unen a la pared de los MTs y contribuyen a su
estabilización y espaciamiento
MAP2 y tau regulan el espaciamiento entre MTs.
Microscopía electrónica de células transfectadas con MAP2 o Tau.
MAP2
Tau
Alberts et al., MBC2002
En neuronas MAP2 se localiza principalmente en dendritas y Tau en axones
Neurona de hipocampo. La inmunofluorescencia
revela la localización de MAP2 en dendritas
(anaranjado) y de la tau en axones (verde).
Microscopía electrónica de un axón (A) y de una
dendrita (B). Observe el diferente espaciamiento
de los microtúbulos.
A
B
tau
MAP2
Los microtúbulos y las moléculas motoras son esenciales
para el transporte intracelular
El transporte axonal de proteínas puede estudiarse bioquímicamente
empleando precursores radioactivos
La breve incorporación (pulso) de un aminoácido radioactivo en proteínas del soma de las neuronas del ganglio de la
raiz dorsal permite determinar su movimiento a lo largo de los axones (por ej. del nervio ciático).
se observa que las proteínas
se transportan a distintas
velocidades en los axones:
transporte rápido (bandas
rojas); transporte intermedio
(en celeste) y lento (en gris)
extraer las proteínas y
analizarlas en geles
transporte axonal anterógrado  desde el soma al terminal axonal
transporte axonal retrógrado  desde el terminal al soma
- transporte rápido: vesículas, 250 mm/día
- transporte lento: citoesqueleto, <1 mm/d
- intermedio: mitocondrias
Análisis por videomicroscopía revela el transporte bi-direccional
y saltatorio de las vesículas
El transporte axonal ha sido visualizado en extractos de axon gigante de calamar incubados en presencia de ATP. En el
panel de la izquierda se muestra una serie de imágenes adquiridas a distintos tiempos por una cámara de video acoplada a
un microscopio óptico. Las flechas negra y amarilla señalan vesículas moviéndose en dirección opuesta sobre los MTs. (B):
Una región similar a (A) fue procesada para microscopía electrónica. Se observan 2 vesículas unidas a un MT
A
videos disponibles
B
En los melanóforos, los microtúbulos son requeridos para
la redistribución de vesículas con pigmentos
El movimiento de los gránulos de pigmento sobre
los MTs es regulado por señales extracelulares.
movimiento centrífugo
dependiente de kinesinas
movimiento centrípeto
dependiente de dineínas
El sistema de microtúbulos es fundamental para mantener
la organización estructural y funcional del sistema secretor
Diferentes combinaciones de proteínas motoras especifican el movimiento de organelas y vesículas
colocalización
MTs (rojo) y
ER (verde).
Waterman-Storer & Salmon
CB 1998
Los MTs contribuyen a polarizar las células durante la migración
Señales extracelulares que estimulan receptores de membrana inducen la polarización de la célula
reorientando el centro organizador de microtúbulos (MTOC) hacia el margen de avance o ¨leading edge¨ (a).
Los extremos (+) de los microtúbulos dinámicos, que alternan entre estados de crecimiento y acortamiento,
son capturados y estabilizados en el citoesqueleto cortical de la membrana de avance. Material necesario
para el avance de las células, y moléculas recicladas, emplean los microtúbulos para su transporte.
membrana
de avance
La presencia de MTs en proximidad de la membrana puede ser visualizada
por microscopía de campo evanescente o TIRFM
En TIRFM la luz de un láser es proyectada en forma oblicua sobre el cubreobjeto, con un ángulo de incidencia
mayor a un valor crítico (θc), lo cual permite reflejar la totalidad de la luz en la interfase del vidrio (álto índice de
refracción) y la célula (bajo índice de refracción), generar un campo de excitación evanescente que decae
exponencialmente con la distancia de la interface (~ 100-200 nm) y excitar las moléculas fluorescentes.
B
A
200 nm
láser
complejo de
adhesión
campo
evanescente
(~ 100 nm)
(mas sobre TIRF en el
tema de vía secretora)
En la periferia celular los extremos (+) de los microtúbulos contactan y
regulan a los focos de adhesión a la matriz extracelular
contactos repetidos
de MTs con focos
de adhesión
microscopía de campo evanescente o TIRF
Fibroblastos transfectados con una proteína que se localiza en focos de adhesión fusionada a la
GFP (verde). Las células transfectadas fueron microinyectadas con tubulina conjugada a rodamina
(en rojo) y examinadas por microscopía de campo evanescente.
Secuencia que muestra el contacto de un microtúbulo
(en rojo) con un foco de adhesión (en verde)
video disponible
Los focos contactados por los MTs se desensamblan.
Krylyshkina et al JCB 2003
Proteínas fluorescentes que se unen al extremo (+) de los microtúbulos
también permiten visualizar los contactos con los focos de adhesión
CLIP170 es una proteína que solo se asocia al extremo (+) de microtúbulos
con cap de tubulina-GTP (en estado de crecimiento).
GFP-CLIP170 / zixina-DsRed
Se muestra una célula co-transfectada con
zyxina-DsRed (para marcar focos de adhesión)
y GFP-CLIP170. Las flechas señalan los
extremos (+) de 3 extremos de MTs (verde)
que se elongan en dirección de focos de
adhesión (rojo).
video disponible
Krylyshkina et al JCB2003
El contacto de microtúbulos con focos de adhesión provoca su desensamble
Secuencia que muestra la desaparición de un foco de adhesión marcado con
GFP-β1-integrina (rojo) después de ser contactado por MTs (en verde).
Ezratty et al NCB2005
complejos focales
En una célula migratoria se forman pequeños
complejos focales en el márgen de avance
(Front) independiente de microtúbulos. A medida
que estos crecen y la célula avanza, el contacto
de los microtúbulos cerca de la región perinuclear
y en la región posterior de la célula provocan su
desensamble. El desensamble de los focos de
adhesión y la contracción mediada por actina y
miosina permiten que la célula avance.
Las dineínas y kinesinas son moléculas motoras que emplean energía
de la hidrólisis de ATP para translocarse sobre microtúbulos
Lodish et al MCB2004
Las dineínas forman complejos multimoleculares que transportan diversos
cargos hacia los extremos (-) de los microtúbulos
Las dineínas son proteínas multiméricas compuestas de 2-3 cadenas pesadas y varias subunidades
intermedias y livianas. Las subunidades pesadas son ATPasas que interaccionan con, y se translocan
sobre el microtúbulo. Las cadenas livianas interaccionan con el complejo dinactina. Dos subunidades
del complejo dinactina, Glued y Arp1 participan en la unión de la dineína al cargo.
microscopía electrónica.
"freeze-etch"
cabezas globulares
de las cadenas
pesadas
Glued
Las dineínas citosólicas son responsables del transporte
axonal retrógrado, transporte de vesículas endocíticas
hacia lisosomas, posicionamiento perinuclear del Golgi,
elongación y posicionamiento del huso mitótico, movimiento
de cromosomas, movimiento radial centrípeto de pigmentos
en melanóforos, etc. La velocidad de transporte varía entre
1-2 μm/seg. Las numerosas subunidades que componen al
complejo dineína-dinactina explicaría la amplia diversidad
de cargos transportados por las dineínas.
Las kinesinas constituyen una superfamilia de proteínas diversas
que transportan cargos sobre microtúbulos
La mayoría de las kinesinas están compuestas de cadenas pesadas y livianas. El dominio motor de las
kinesinas se encuentra en las cadenas pesadas. De acuerdo a la posición del dominio motor las kinesinas se
clasifican en kinesinas-N (con el dominio motor en el terminal amino); kinesinas-C (en el terminal carboxilo) y
kinesinas-M (en una posición interna). KIN-N y KIN-M se translocan hacia el extremo (+) de los MTs y las
KIN-C hacia el extremo (-). Desde un punto de vista funcional las kinesinas se clasifican en citosólicas y
mitóticas.
KIN-N
microscopía electrónica.
"freeze-etch"
KIN-C
KIN-M
De las 45 kinesinas descriptas, 3 pertenecen a las KIN-C; 3 a las KIN-M y el resto a las KIN-N.
Estructura de las kinesinas convencionales
La kinesina I o convencional consiste en dos cadenas pesadas, cada una de las cuales se asocia a una cadena
liviana. El dominio globular (cabeza) de las cadenas pesadas unen el ATP e interaccionan con la tubulina en el
microtúbulo. Mediante una region flexible (cuello) las cabezas se conectan a un dominio ¨coiled coil¨ o tallo. El
cuello flexible acopla los ciclos de hidrólisis de ATP con cambios conformacionales que se trasladan al tallo. Las
cadenas livianas se asocian al extremo del tallo y contribuyen a las interacciones con el cargo.
Las kinesinas I son responsables
del transporte axonal anterógrado,
el transporte de vesículas
secretoras hacia la membrana
plasmática y el movimiento radial
centrífugo de gránulos con
pigmentos en melanóforos.
Lodish et al MCB2004
El transporte mediado por kinesinas puede ser visualizado
en ensayos in vitro
El movimiento direccional mediado por kinesinas ha sido estudiado fijando microtúbulos (a) o
kinesinas (b) a cubreobjetos. Se observó que el movimiento de esferas cubiertas con kinesinas
(a) o microtúbulos (b) ocurre en presencia de ATP en el buffer de incubación.
las vesículas siempre
se mueven hacia
el extremo (+)
MT pegado al cubreobjeto
kinesinas pegadas
al cubreobjeto
La fuerza de torque generada por la hidrólisis del ATP puede medirse
empleando trampas láser
Empleando trampas ópticas láser se determinó que la miosina II se mueve en pasos discretos de ~10
nm de largo y genera 3-5 picoNewton (pN) de fuerza. Las kinesinas diméricas (ej. kinesina I) se mueven
en pasos de 8 nm y generan fuerzas de 6 pN. Los pasos discretos indican que durante su movimiento la
miosina II y la kinesina I se unen a monómeros sucesivos en los protofilamentos. Las fuerzas
determinadas son suficientes para mover cargos (ej. vesículas) en el citoplasma.
haz de láser
esfera en el
centro de la
trampa
La luz de un láser infrarojo se enfoca, a través del microscopio,
sobre una partícula de látex, reteniéndola en el centro del haz de
luz. La fuerza ejercida por la molécula motora provoca un
desplazamiento de la partícula respecto del centro de la trampa
que puede ser medido y relacionado con la fuerza ejercida.
Las vesículas pueden translocarse en direcciones opuestas
sobre el mismo microtúbulo
Vesícula unida a un microtúbulo.
Microscopía electrónica. "freeze etch"
Modelo del movimiento
de la kinesina sobre
el microtúbulo
extremo (+)
1
2
Las cabezas motoras (en azul) interaccionan con
la beta tubulina de dímeros sucesivos (1 y 2) de
un protofilamento. La unión del ATP a la cabeza
delantera (2) aumenta la afinidad por la
tubulina e induce un movimiento del cuello
hacia el extremo (+) (en rojo) que tracciona la
cabeza trasera (1) hacia el extremo (+) del
microtúbulo (línea de puntos).
3
La cabeza trasera unida a ADP da un paso total
de ~16 nm (desde la subunidad 1 a la 3). El
avance neto del cargo unido al extremo del tallo
es de ~ 8 nm (de 2 a 3).
n ciclos
1
2
3
La interacción de la cabeza translocada unida
a ADP con la tubulina β induce la liberación
del ADP. La cabeza trasera hidroliza el ATP
pero no libera el Pi. La hidrólisis disminuye la
afinidad por la tubulina.
hidrólisis
1
2
3
video disponible
La liberación del Pi de la cabeza trasera
debilita aun más la unión al microtúbulo y
adopta la conformación apropiada para dar un
nuevo paso cuando la cabeza delantera
intercambia el ADP por ATP.
1
2
3
Vale & Milligan, Science 2000