SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Materiales • Mortero. • Tijeras. • Espinacas u hojas verdes. • Embudo con papel de filtro. • Tubo de ensayo en gradilla. • Alcohol etílico. • Éter • Hexano • Cápsula de Petri o vaso de precipitados. • Capilar o micropipeta (cuentagotas en su defecto). • Papel de filtro Introducción Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-α (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones. Fundamento Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares. Esto permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía o de filtro) dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico (etanol). Las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende, mientras que las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de filtro. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la línea base según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución. Los pigmentos se reconocen según su color. Técnica 1. Se trituran en un mortero 2 g de hojas de espinacas frescas, previamente secadas con papel absorbente, exentas de nervaduras y cortadas con tijera, junto a 2g de MgSO4 y 4 g de arena durante unos pocos minutos. La pasta obtenida se transfiere a un vaso y se añaden 8 mL de acetona, se envuelve en papel de aluminio (evitar la luz que transforma las clorofilas en feofitinas) y se agita suavemente durante unos 10 minutos. Una vez obtenido el extracto, se filtra (lo ideal es una centrifugadora) para eliminar los sólidos recogiéndolo en un tubo de ensayo protegido con papel de aluminio. 2. Se aplica el extracto, a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior del papel, tres toques con capilar de diámetro no mayor de 2 mm, hasta formar una mancha nítida de 0,5 cm de diámetro, dejando evaporar el disolvente entre cada aplicación. 3. El papel se suspende dentro de la probeta de 100 mL teniendo la precaución de que el eluyente solo alcance la zona de aplicación por capilaridad. Se cubre una vez más con papel de aluminio y se deja desarrollar hasta que el eluyente alcance hasta aproximadamente 1 cm del borde superior. Una vez retirado se marca hasta donde ha alcanzado el frente, se seca al aire, se marcan las distintas manchas y se determinan los correspondientes Rfs. 4. Como eluyentes se emplean mezclas hexano-acetato de etilo en proporciones desde 8-1 hasta 12-1. OBTENCIÓN DE UN COMPLEJO DE Cu DE LA CLOROFILA Introducción Cuando los vegetales se someten a cocción prolongada el magnesio del complejo de clorofila se pierde, siendo sustituido por un hidrógeno. Así la molécula de clorofila se transforma en feofitina y los vegetales pierden su color verde brillante para pasar a tener un color verde-oliva pálido. Este experimento lo que hace es transformar la molécula de clorofila en otra más estable que no se altere con la cocción. Parte Experimental Materiales 2 Vasos de precipitados de 100 ml Espátula Agitador magnético con calefacción Reactivos Guisantes CuSO4.5H2O Procedimiento Se colocan 5 g de guisantes en cada uno de los vasos de precipitados y se mezclan con 50 ml de agua y unas gotas de jabón líquido. A continuación se añade a uno de los vasos de precipitados una espátula de CuSO4 · 5H2O y se disuelve. Se calientan a ebullición los dos vasos de precipitados durante 10 minutos. Posteriormente se colocan los guisantes respectivos en dos vidrios de reloj y se observa la diferencia. Fundamento El complejo de Mg+2 de la molécula de clorofila es transformado en otro complejo donde el Cu+2 ha sustituido al Mg+2. Este último complejo tiene un color verde intense y puede ser usado como colorante de la comida.