conclusiones

CONCLUSIONES
Juan Casado Vela
CONCLUSIONES
Del trabajo que se ha realizado se pueden extraer las siguientes
conclusiones:
1) Nuestro protocolo de extracción ha permitido determinar la presencia de PPO
en dos extractos protéicos diferentes (soluble y particulada) en todas las
variedades de tomate analizadas, evaluar la evolución de su actividad a lo
largo del desarrollo del fruto, comprobar su implicación en la aparición de
podredumbre apical en frutos de tomate, determinar sus constantes
cinéticas y evaluar la efectividad de diferentes inhibidores químicos.
2) El protocolo de extracción enzimática utilizado permite purificar la enzima
polifenol oxidasa hasta cuatro veces la PPO de la fracción soluble (E1) y
más de tres veces la enzima presente en la fracción particulada (E2). Esto
supone un punto de partida para futuros trabajos de purificación a
homogeneidad y determinación de su función biológica.
3) Los niveles de PPO son altos en frutos jóvenes y en frutos afectados por
podredumbre
apical,
mientras
que
desaparece
en
frutos
sanos
desarrollados y/o maduros.
4) La caracterización enzimática de ambas fracciones, el ratio variable E1/E2 en
numerosas variedades y la inducción diferencial de sus niveles en frutos
afectados por podredumbre apical aportan evidencias a favor de que E1 y
E2 son isoenzimas diferentes.
5) Los cebadores diseñados permiten amplificar por RT-PCR secuencias de
RNAm de PPO de fruto de tomate. El RNAm mayoritariamente expresado
en frutos de 8-10 días de desarrollo post-antesis corresponde a transcrito
de los genes A/A´, si bien no se puede descartar que en frutos más jóvenes
se puedan expresar otros genes de PPO.
6) La estrategia diseñada para la de detección de tipos de RNAm de PPO en
tomate abre una posibilidad para poder analizar la expresión en otros
tejidos y un acercamiento a la explicación de la función fisiológica de cada
una de las seis isoenzimas que es posible encontrar en tomate.
7) El Triton X-114 permite una extracción de PPO en forma activa e incrementa la
solubilización de un número elevado de proteínas y en zimas de tejidos
vegetales, en comparación con extracciones que utilizan únicamente
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Juan Casado Vela
medios tamponados. La utilización de Triton X-114 es mucho más ventajosa
que la utilización de Triton X-100 para extraer y solubilizar proteínas
particuladas, y se ha mostrado como una herramienta importante para
estudios de proteómica.
8) La puesta a punto de las técnicas de proteómica (preparación de muestras de
fruto de tomate, electroforesis bidimensional, espectrometría de masas y
búsquedas en bases de datos) han supuesto un avance significativo para la
separación e identificación de proteínas de nuestras muestras, el análisis
del proteoma de fruto de tomate y la comparación de perfiles proteómicos
de frutos sanos y afectados por podredumbre apical.
9) Los sistemas antioxidantes de la planta, representado por el ciclo ascórbicoglutatión tanto en su faceta soluble (DHAR) como en su faceta de
membrana (GPX, TPX), enzimas neutralizadoras de especies altamente
reactivas (SOD, QOR/ALH), y la ruta de las pentosas fosfato como
generadora de poder reductor (FK, RPI, TIM) están incrementadas en frutos
afectados por podredumbre apical y pueden jugar un papel clave en detener
la progresión de la necrotización al resto del fruto, evitando así la
propagación de infecciones al resto de la planta.
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