Metabolismo de Nucleótidos

XVIII. Metabolismo de nucleótidos
Introducción. Dentro de las células, las bases, purinas y pirimidinas, se
encuentran casi siempre como constituyentes de nucleótidos y de sus derivados (una gran
variedad de vitaminas o polinucleótidos). En varias reacciones enzimáticas estos
compuestos actúan como coenzimas, ya sea cómo cosubstratos o cómo grupos prostéticos
firmemente unidos a la enzima.
Además, los nucleótidos participan en la célula de todas las rutas centrales de
biosíntesis de polímeros. Su función es el de transportar los monómeros de cada uno de los
polímeros. Por ejemplo los oligosacáridos y los polisacáridos (como el glucógeno o el
almidón), son sintetizados a partir de derivados de nucleótidos de azúcar (UDP-Glucosa,
ADP-Glucosa u otros). Además en la síntesis de lípidos intervienen derivados del CDP; en
la síntesis de polinucleótidos, obviamente intervienen todos los NTPs o los dNTPs; y en la
síntesis de proteínas es el tRNA (un oligonucleótido) el que transporta el aminoácido que
será incorporado en la proteína naciente. Además, los nucleótidos son los transportadores
más importantes de energía química entre rutas anabólicas y catabólicas, y los derivados
de nucleótidos son transportadores de poder reductor (NAD + o FAD) o de grupos acilo
(Coenzima A). Por último algunos nucleótidos poseen funciones diferentes dentro de
determinados tipos de célula, por ejemplo derivados del AMP funcionan en la ruta de
fijación del azufre inorgánico (APS o PAPS), como compuestos de regulación (AMP cíclico)
o en la conversión de algunas vitaminas B a sus formas de coenzima. De hecho, la mayor
parte de los organismos posee la capacidad para sintetizar nucleótidos de purina y de
pirimidina, lo que refleja la importancia central de estas moléculas para todas las células.
Un aspecto metabólico que refleja la importancia de estos compuestos dentro de la
célula es el hecho de que es posible observar al menos dos mecanismos diferentes para su
síntesis. Uno de estos mecanismos corresponde a lo que tradicionalmente consideramos
biosíntesis. Así, tal cual lo vimos en otras rutas metabólicas, es posible obtener estructuras
complejas (en este caso nucleótidos) a partir de compuestos sencillos. De hecho, utilizando
las reacciones que ya hemos analizado, como por ejemplo en el metabolismo de hidratos
de carbono (fotosíntesis incluida) podemos realizar estas síntesis partiendo únicamente de
compuestos inorgánicos.
Por otro lado, para la síntesis de estos compuestos existe una ruta cuya estrategia
es totalmente diferente a las otras rutas biosintéticas conocidas. Estas son rutas sencillas
por las cuales las purinas o pirimidinas preformadas, obtenidas de la degradación de los
ácidos nucleicos dentro de las células o del ambiente externo (por ejemplo del producto
intestinal durante la digestión de los alimentos), pueden ser incorporadas directamente en
los nucleótidos. Estas reacciones son denominadas rutas de recuperación. Como veremos
más adelante, el proceso de recuperación se aplica a las bases incluso hasta en la etapa
previa a la de su degradación total.
En los organismos pluricelulares, la capacidad para catalizar la formación de los
nucleótidos, mediante las vías de novo garantiza, en cierta medida, la independencia de la
dieta, y la vía de recuperación significa una economía al reciclar los productos de la
degradación de los ácidos nucleicos.
Más adelante veremos que la ruta metabólica para la biosíntesis de novo de los
nucleótidos de pirimidina, posee una secuencia de reacciones muy sencilla y fácil de
deducir a diferencia de la ruta de biosíntesis de las purinas. Además, las rutas de síntesis
de los dos tipos de bases difiere en sus estrategias químicas ya que los nucleótidos de
pirimidina son sintetizados primero como bases y luego son incorporados a un nucleótido
(utilizando una reacción análoga a una ruta de recuperación) mientras que los nucleótidos
de purina se sintetizan paso a paso modificando en primer lugar a la ribosa, de manera que
se sintetizan directamente como nucleótidos. Además, las estrategias químicas para la
degradación de los compuestos de purina y de pirimidina también difieren. La degradación
de las purinas lleva a la formación de compuestos potencialmente tóxicos, mientras que la
degradación de las pirimidinas forma productos fácilmente metabolizables.
Reacciones de recuperación de nucleótidos. Durante el
metabolismo celular y durante el proceso digestivo de los animales, los ácidos nucleicos
son degradados a mononucleótidos, nucleósidos, y eventualmente a bases heterocíclicas.
Estas reacciones catabólicas son catalizadas por enzimas de la familia de las hidrolasas,
que incluyen ribonucleasas, desoxirribonucleasas, y una diversidad de nucleótidasas y
nucleósidasas. Algunas de las purinas que se forman en esta forma son degradadas
posteriormente a ácido úrico, pero una fracción considerable normalmente es economizada
por conversión directa a ribonucleótidos de purina. A esto es lo que denominamos
recuperación. Las purinas formadas por reacciones de degradación intracelulares son
economizadas en un grado mayor que las que se forman durante la digestión debido a que
estas últimas se pierden en parte en las excreciones sin absorverse.
NH2
NH2
N
N
H
reducción
HO
dATP
Nucleótidos
difosfato
dADP
Nucleósidos
Bases
Productos de
degradación
N
N
N
O
N
CH2 OH H O
O
Transaminación
OH
N
HN
oxidación
HO
OH
HO
O
O
N
HN
H2 N
N
N
CH2 OH
N
HN
H2 N
N
N
CH2 OH
O
Transaminación
OH
HO
ATP
Nucleótidos
trifosfato
Nucleótidos
monofosfato
N
CH2 OH
O
O
HN
N
N
CH2OH
O
HO
N
N
N
N
CH2 OH
O
O
reducción
OH
HO
H
GTP
dGTP
Síntesis de novo
ADP
GDP
dGDP
AdeniloSuccinato
AMP
dAMP
IMP
XMP
GMP
dGMP
Adenosina
dAdenosina
d Inosina
Adenina
Urea
Inosina
Hipoxantina
Acido alantoico
Alantoína
Xantosina
Xantina
Guanosina
dGuanosina
Guanina
Ácido úrico
En el esquema de arriba se muestra un resumen de las reacciones de
interconversión entre los nucleótidos de purinas. Las reacciones involucradas en la síntesis
de novo están marcadas con flechas azules, las que involucran (síntesis o degradación) a
los deoxinucleótidos, con flechas en naranja y las de las rutas degradativas finales, en rojo.
Las reacciones de recuperación están marcadas en violeta. Las principales rutas de
este tipo en la mayoría de las células son las que convierten las bases libres directamente
en nucleótidos monofosfato. Estas reacciones están marcadas con una flecha violeta más
gruesa. El sustrato que reacciona con las bases libres para su recuperación es el 5'-fosforibosil-1'-pirofosfato (PRPP), que funciona como donador de la unidad de fosforibosa
(ribosa-5-fosfato) para la síntesis de los nucleótidos. Además de su participación en las
rutas de recuperación de bases purínicas o pirimidínicas el PRPP también funciona como
donador de ribosa 5-fosfato en una serie de reacciones como en la formación del primer
nucleótido (orotidin-monofosfato u OMP) en la vía de síntesis de novo de los nucleótidos de
pirimidinas, en la primer reacción de la síntesis de novo de los nucleótidos de purinas y en
las biosíntesis de histidina y de triptofano.
El PRPP en sí, se sintetiza a partir de la ribosa 5-fosfato y ATP en una reacción
catalizada por la enzima PRPP sintetasa. Esta enzima es una kinasa atípica en el
metabolismo ya que en lugar de catalizar la transferencia de grupos fosfato, interviene en la
transferencia de un grupo pirofosfato entre el ATP y la ribosa.
O
HO
O
P
O
P
OH
NH2
OH
O
OH
O
O
CH2 O
N
N
HO
P O
O
N
P
OH
HO
HO
N
OH
N
P
O
O
CH2 O
N
N
HO
ATP
CH2 O
NH2
OH
N
OH
OH
HO
AMP
P O
O
O CH2 O
OH
O
PRPP sintetasa
HO
OH
HO
O
P O
P
OH
OH
OH
OH
Ribosa-5-fosfato
PRPP
En la ruta de recuperación de la base adenina, la adenina fosforribosiltransferasa
cataliza la reacción de adenina con PRPP para formar AMP y PPi. La hidrólisis de PPi,
catalizada por pirofosfatasa inorgánica hace que la reacción se convierta en
metabólicamente irreversible. La hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa cataliza
reacciones similares (la conversión de hipoxantina a IMP y de guanina a GMP, con la
formación simultánea de PPi; ya veremos más adelante la estructura de estas bases).
OH
HO
P O
O
O CH2 O
O
P O
OH
HO
NH2
O
P
N
OH
+
OH
N
N
H
Adenina fosforibosil
transferasa
HO
P
N
O
O CH2 O
N
N
N
N
OH
HO
Adenina
PRPP
+
HO
O
O
P O
P
OH
OH
OH
OH
AMP
OH
HO
NH2
OH
Pirofosfato
OH
P O
O CH2 O
O
O
O
P O
P
OH
HO
OH
PRPP
OH
HO
BASE
OH
+
fosforibosil transferasa
P
O
O CH2 O
BASE
H
+
HO
NMP
HO
O
O
P O
P
OH
OH
OH
Pirofosfato
Las pirimidinas también son recuperadas. Sin embargo, este tipo de reacciones no
son tan importantes para la mayoría de las células como en el caso de las reacciones de
recuperación de purinas. Esto se debe fundamentalmente a la baja toxicidad de los
productos intermedios en la degradación de las pirimidinas. Como anteriormente, el
reciclado de estas bases ahorra energía celular.
En el esquema de abajo se muestra un resumen de las reacciones de
interconversión entre los nucleótidos de pirimidinas. De forma similar que en el esquema de
OH
las purinas, las reacciones involucradas en la síntesis de novo de estos nucleótidos están
marcadas en azul, las que involucran (síntesis o degradación) a los deoxinucleótidos, en
naranja, las de las rutas degradativas finales, en rojo y las reacciones de recuperación en
violeta.
O
O
O
CH3
HN
O
HN
HN
O
N
O
CH2OH
O
Metilación
HO
H
N
HO
dTTP
Nucleótidos
difosfato
dTDP
dUDP
Nucleótidos
monofosfato
dTMP
dUMP
Nucleósidos
dTimidina
dUridina
Timina
dUTP
CH2 OH
N
N
O
CH2OH
Descarboxilación
HO
OH
N
HO
UTP
UDP
CDP
OMP
Citidina
Uridina
Uracilo
CMP
Orotato
N
O
reducción
OH
HO
CTP
UMP
O
CH2 OH
O
OH
Transaminación
N
COOH
O
O
reducción
H
HO
Nucleótidos
trifosfato
Bases
O
CH2 OH
O
NH2
N
O
CH2 OH
NH2
HN
H
dCTP
dCDP
dCMP
dCitidina
Citosina
Síntesis de novo
Productos de
degradación β-amino-isobutirato
β-alanina
Como puede verse en ambos esquemas, la biosíntesis de deoxinucleótidos
comienza en el precursor difosforilado (NDP). Un detalle interesante que diferencia las rutas
de síntesis de purinas y pirimidinas, es que en las primeras la síntesis de novo llega a un
nucleótido (IMP) y después se divide en dos ramas una para sintetizar ATP y otra para el
GTP. Por el contrario en las pirimidinas, después de llegar al primer nucleótido de esta vía
(OMP), se obtiene el UTP y a partir de este se sintetiza el CTP. Esta vía por lo mismo,
puede verse como una ruta lineal que termina en CTP. Como veremos más adelante en
este teórico esta organización de ambas rutas tiene implicancia en el modo de regulación
de las mismas.
Un detalle a resaltar en el caso de las pirimidinas, tiene que ver con la síntesis del
dTTP. Los derivados de la timina se obtienen por metilación de uno de los derivados del
uracilo. Este derivado es el dUMP. Aparentemente, la metilación se realiza sobre el
derivado monofosforilado como consecuencia de que la célula evita el aumento de
concentración del derivado trifosforilado correspondiente (dUTP). Muchas enzimas que
actuan sobre una gran variedad de nucleótidos pueden convertir los derivados
monofosforilados en difosforilados y a estos en los trifosforilados. De esta manera el dUMP
y el dUDP pueden convertirse en dUTP. La presencia de este último en altas
concentraciones podría impulsar su incorporación errónea en el DNA (en lugar del dTTP).
Para evitar esta acumulación, casi todas las células poseen una pirofosforilasa específica
de dUTP que lo convierte rápidamente en dUMP evitando su acumulación. Como puede
verse en el esquema, esta tipo de pirofosforilasa no existe para los otros nucleótidos.
Gracias a la acción de esta enzima, el dUMP es el derivado reducido del UNP de mayor
concentración y por lo mismo es el más adecuado para funcionar como sustrato en la
metilación.
Biosíntesis de pirimidina s. La vía de novo para la síntesis de pirimidina es
una reacción lineal cuyo producto final es el CTP. Sin embargo otros nucleótidos son
sintetizados en esta vía antes que el CTP, entre ellos el UMP. Esta vía es más sencilla que
la vía para las purinas y requiere de un consumo menor de ATP. Existen sólo dos
precursores metabólicos del anillo de la pirimidina, el carbamoil-fosfato y el aspartato. El
primero es sintetizado a partir del bicarbonato y del grupo amida de la glutamina, mientras
que el segundo se produce a partir del oxalacetato como vimos anteriormente.
Para la biosíntesis de los nucleótidos de pirimidina se requiere PRPP, pero el azúcar
fosfato sólo es donado después de que el anillo completo de la base ha sido sintetizado. Un
compuesto con un anillo de pirimidina completo (orotato o 6-carboxiuracilo), reacciona con
PRPP para formar un ribonucleótido (OMP) en la cuarta etapa de una vía de cinco etapas.
Las cinco reacciones de la vía para la síntesis de novo de la pirimidina se ilustran en
la figura.
El aspartato y el carbamoil-fosfato son sintetizados por rutas ya conocidas que vimos
en las etapas de biosíntesis de aminoácidos (familias del aspartato y glutamato,
respectivamente). Así, como vimos en la biosíntesis de arginina, la formación de carbamoil
fosfato se realiza a partir de CO2, del nitrógeno amídico de la glutamina y ATP. Esta
reacción, catalizada por la carbamoil fosfato sintetasa, requiere de dos moléculas de ATP,
una para dirigir la formación del enlace C-N y la otra para donar el grupo fosforilo al
producto.
HO
H2 N
C
C
H
CH2
O
C
Aspartato-transcarbamilasa
O
O
NH2
+
O
C
O
C
OH
P
OH
OH
O
Carbamil-fosfato
Aspartato
P
HO
OH
C
O
Dihidroorotasa
C
HN
H2O
C
C
C
O
O
HO
H
N
O
N C H
H
CH2
H2 N
O
OH
HO
C
C
O
H
CH2
Dihidro
O
NH
H2C
H C
C
O C
N
O
H
Orotato OH
Carbamil-aspartato
OH
Q
Dihidroorotato
Deshidrogenasa
O
O
HC
HC
OH
HO
P
C
N
NH
C
OMP descarboxilasa
HO
CO2
HO
UMP
OH
HC
HO
OH
O
O CH2 O
O
QH2
P
O
C
C
C
N
O
NH
C
C
Orotato-fosforibosil transferasa
HC
O
O C
O CH2 O
O
C
NH
N
H
C
O
OH
HO
O
OH
OMP
HO
P
OH
O
P
OH
Orotato
OH
O
OH
HO
P
O
O
CH2 O
O
O
P
OH
HO
O
O
P
OH
OH
PRPP
En los procariotes, la misma carbamoil-fosfato sintetasa es utilizada en ambas vías
biosintéticas, de la pirimidina y de la arginina. Esta enzima es inhibida alostéricamente por
los ribonucleótidos de pirimidina, por ejemplo el UMP, el producto de esta ruta biosintética.
Además, es activada por la L-ornitina, un precursor de la citrulina.
OH
En cambio, en las células eucarióticas, hay dos carbamoil fosfato sintetasas. Una
sintetasa en las mitocondrias recibe el nombre de carbamoil fosfato sintetasa 1, ya que fue
la que se descubrió primero, y la cual cataliza una reacción en la que se emplea amoniaco
con origen de la amida del carbamoil fosfato. En el hígado de mamíferos, el carbamoil
fosfato generado en las mitocondrias es utilizado para la síntesis de la urea. La sintetasa
citosólica, la carbamoil fosfato sintetasa 2, es la que cataliza la síntesis del precursor de las
pirimidinas. Como antes se hizo notar, en esta reacción, la amida del carbamoil fosfato
proviene de la glutamina. La carbamoil fosfato sintetasa 2 es regulada alostéricamente. Es
activada por PRPP e IMP e inhibida por varios nucleótidos de pirimidina. La división de las
reacciones en compartimientos, entre las mitocondrias y el citosol permiten un control por
separado de cada enzima y de la vía en la que actúan.
En la primer etapa de la biosíntesis de UMP, el grupo carbamoil activado del
carbamoil fosfato es transferido a aspartato para formar carbamoil aspartato. Es lógico
suponer que el grupo fosfato del carbamil-fosfato es un buen grupo saliente para que la
reacción se realice, por lo que el carbono con el que está unido debería ser el átomo
atacado por un nucleófilo. De los átomos del aspartato, el mejor dador (o atacante)
nucleofílico es el átomo de nitrógeno α del aminoácido. Por ello, en esta reacción,
catalizada por aspartato transcarbomilasa (ATCasa), el nitrógeno nucleofílico ataca al grupo
carbonilo del carbamoil fosfato desplazando un fosfato inorgánico.
La ATCasa procariótica (específicamente la ATCasa de E. coli) fue la primera
enzima alostérica en ser por caracterizada completamente. En E. coli, en donde la
carbamoil fosfato sintetasa genera un intercambio que entra en las vías que conducen a las
pirimidinas o a la arginina, es esta ATCasa la que cataliza la primera etapa comprometida
de la biosíntesis de la pirimidina. Esta enzima es inhibida por los nucleótidos de pirimidina y
es activada, in vitro, por el ATP. Aunque la ATCasa en E. coli es inhibida sólo parcialmente
por CTP (50% a 70%), la inhibición puede ser casi total cuando ambos están presentes,
CTP y UTP. El UTP sólo no inhibe la enzima. Los controles alostéricos, la inhibición por los
nucleótidos de pirimidina y activación por el nucleótido de purina ATP, proporcionan un
medio para que se equilibren las proporciones de nucleótidos de pirimidina y purina en E.
coli, mediante la carbamoil fosfato sintetasa y la ATCasa. La proporción de la concentración
de cada uno de los efectores alostéricos determina el nivel de actividad de la ATCasa.
La ATCasa eucariótica no es inhibida por retroalimentación. Esta regulación
mediante inhibición por retroalimentación no es necesaria debido a que el sustrato de
ATCasa en los eucariotes no es un metabolito en una ramificación —la vía que conduce a la
arginina y la urea en la mitocondria está separada de la vía biosintética de pirimidina, en la
cual, en este caso son seis las etapas que tienen lugar en el citosol comenzando por la
síntesis del carbamoil-fosfato. En consecuencia, la vía de las pirimidinas en eucariotes se
puede controlar por regulación de la enzima ATCasa precedente, la carbamoil fosfato
sintetasa 2.
La dihidroorotasa cataliza la segunda etapa de la biosíntesis de UMP, el cerrado
reversible del anillo de la pirimidina. El producto dihidroorotato, ya contiene todos los
átomos que van a formar parte finalmente del UMP. En la figura se muestran dos moléculas
de dihidroorotato rotadas alrededor de un punto central para resaltar la posición que ocupan
cada uno de los átomos de la molécula obtenida por condensación, en el producto final de
la ruta (la flecha roja indica la rotación). Este compuesto necesita ser deshidrogenado,
descarboxilado y transferido a un azúcar fosfato para convertirse en UMP. En la siguiente
etapa el dihidroorotato es oxidado después mediante la acción de dihidroorotato
deshidrogenasa para formar orotato. En los eucariotes, la dihidroorotato deshidrogenasa
está asociada con la membrana interior de la mitoncondria. Es una flavoproteína que
contiene hierro, la cual cataliza la transferencia de electrones a la ubiquinona y después al
O2 por la cadena de transporte de electrones.
Una vez formado, el orotato desplaza el grupo pirofosfato de PRPP, produciendo
orotidina 5’-monofosfato (OMP, u orotidilato), en una reacción que es catalizada por orotato
fosforribosiltransferasa. Esta reacción es del mismo tipo que las reacciones de recuperación
de nucleótidos que analizamos antes, en las que el pirofosfato producido es hidrolizado,
haciendo irreversible la etapa. El OMP es así el primer nucleótido sintetizado por la vía de
las pirimidinas. Finalmente, el OMP es descarboxilado para formar UMP.
Aunque las cinco etapas enzimáticas que conducen a UMP son las mismas en los
procariotes y los eucariotes, la organización estructural de las enzimas (libres versus
asociadas) varía entre los organismos. Por ejemplo, en E. coli, cada una de las reacciones
es catalizada por una enzima separada. En los mamíferos, una proteína multifuncional del
citosol, conocida como dihidroorotato sintasa, contiene sitios catalíticos separados
(carbamoilfosfato sintetasa 2, ATCasa, y dihidroorotasa) para las tres primeras etapas de la
vía. El dihidroorotato producido en el citosol pasa a través de la membrana externa de la
mitocondria antes de ser oxidado a orotato por la dihidroorotato deshidrogenasa. El sitio de
fijación al sustrato de esta enzima está localizado en la superficie externa de la membrana
interna de la mitocondria. Entonces el orotato se mueve al citosol, en donde se efectúa su
conversión a UMP. Una enzima bifuncional, conocida como UMP sintasa, cataliza ambas
reacciones, como PRPP para formar OMP y la descarboxilación rápida de OMP a UMP.
Los intermediarios formados en las sub-etapas (carbamoil fosfato, carbamoil
aspartato y OMP) normalmente no son liberados a la solución, sino que permanecen fijos a
la enzima y son canalizados de un centro catalítico al siguiente. En algunos organismos
también se encuentran en la vía de la biosíntesis de los nucleótidos de purina diversas
proteínas multifuncionales que catalizan varias etapas cada una. Este secuestro de los
intermediarios lábiles dentro de enzimas con multifuncionales evita la degradación
improductiva de los intermediarios, conservando en consecuencia la energía.
El CTP se sintetiza en tres etapas a partir del UMP. Primero, la uridilato kinasa (UMP
kinasa) cataliza la transferencia del grupo γ-fosforilo de ATP a UMP para generar UDP, y
entonces, la nucleósido difosfato kinasa cataliza la transferencia del grupo γ-fosforilo de una
segunda molécula de ATP a UDP para formar UTP. En estas dos reacciones, dos
moléculas de ATP son convertidas a dos moléculas de ADP. Entonces la CTP sintetasa
cataliza la transferencia dependiente de ATP del nitrógeno amídico de la glutamina al C-4
de UTP, formando CTP.
O
HC
HC
OH
HO
P O
C
Kinasas
NH
N
C
OH
O
CTP sintasa
O
HO
CH2 O
OH
P O
P
O
O
HC
OH
O
P O
O
C
HC
N
NH2
NH
C
OH
O
CH2 O
HO
P
O
OH
O
P
O
HC
OH
O
P
O
O
CH2 O
C
HC
N
O
HO
UMP
OH
2 ATP
HO
2 ADP
UTP
OH
Glutamina
+ ATP
Glutamato
+ ADP + Pi
HO
OH
CTP
La CTP sintetasa es inhibida alosténicamente por su producto, CTP, y en E. coli, es
activada alostéricamente por GTP. La activación comprende tanto un incremento en la
Vmáx y como una disminución en el Km de la enzima para la glutamina.
El timidilato (dTMP) también es un derivado de UMP, pero antes de que se pueda
formar el timidilato, el UMP debe experimentar una reducción para formar dUMP. En
seguida examinaremos la formación de los desoxirribonucleótidos y después la formación
de dTMP a partir de dUMP.
N
C
O
Síntesis de deo xi ribonucleótidos. Los 2’-desoxirribonucleótidos, cuya
principal (y probablemente única) función es servir, en la forma de trifosfatos, como
sustratos para la DNA polimerasa, se sintetizan por medio de una reducción enzimática de
los ribonucleótidos correspondientes. En la mayor parte de los organismos esta reducción
se efectúa a nivel de los nucleósido difosfatos (NDPs). Los cuatro ribonucleósidos difosfatos
(ADP, GDP, CDP, y UDP) son sustratos de una sola ribonucleósido difosfato reductasa, la
que se encuantra regulada estrictamente. No obstante, en algunos microorganismos,
incluyendo especies de Lactobacillus, Clostridium, y Rhizobium, la reducción enzimática,
realizada por una reductasa que depende de una cobalamina, utiliza a los ribonucleótidos
trifosfatos como sustratos. Ambos tipos de enzimas se conocen como ribonucleótido
reductasa, aunque los nombres más precisos son ribonucleótido difosfato reductasa y
ribonucleótido trifosfato reductasa, respectivamente.
El NADPH proporciona la energía de reducción para la síntesis de los
desoxirribonucleósido difosfatos. Un enlace disulfuro en el sitio activo de la ribonucleótido
reductasa es reducido a dos grupos tiol, los cuales a su vez, reducen el C-2’ de la ribosa del
nucleótido, mediante un mecanismo complejo que incluye la frormación de radicales libres.
Los electrones son transferidos del NADPH a la ribonucleótido reductasa, a través de la
flavoproteína-tiorredoxina-reductasa y por la coenzima tiorredoxina. En ausencia de
tiorredoxina (por ejemplo en mutantes de E. Coli que carecen de tiorredoxina), otra proteína
pequeña que contiene grupos SH libres, denominada glutarredoxina, puede sustituir a la
tiorredoxina en la formación del desoxirribonucleótido. La glutarredoxina transfiere
electrones desde el sustrato glutatión reducido hacia la ribonucleótido reductasa. Una vez
formados, los desoxirribonucleótidos dADP, dGDP y dCDP son fosforilados al nivel de
trifosfato por la acción de nucleósido difosfato kinasa. En cambio el dUDP, es
desfosforilado, como vamos a ver en la sección siguiente, antes de convertirse en dTMP.
Bajo ciertas circunstancias, la reducción de los ribonucleótidos puede ser la etapa
limitante de la velocidad en la síntesis de DNA. Las ribonucleótido reductasas son reguladas
estrictamente por interacciones alostéricas. Hay dos sitios alostéricos diferentes por medio
de los cuales se regulan tanto la especificidad de la unión al sustrato (KM), como la
velocidad catalítica de la enzima (VMAX). Los moduladores alostéricos son ATP, dATP,
dTTP, y dGTP y ejercen sus efectos fijándose a las ribonucleótido reductasa en cualquiera
de los dos sitios reguladores. Un sitio alostérico, que se denomina sitio de actividad,
controla la actividad de la enzima. Un segundo sitio alostérico, llamado el sitio de
especificidad, determina la especificidad del sustrato del sitio catalítico. La fijación del ATP,
al sitio de actividad, activa la reductasa; la unión de dATP inhibe toda la actividad
enzimática. Cuando ATP esta fijo en el sitio de actividad y ATP o dATP se han fijado en el
sitio de especificidad, la reductasa se convierte en pirimidina específica, catalizando la
reducción de CDP y UDP; la fijación de dTTP al sitio de especificidad activa la reducción de
GDP, y la fijación de dGTP activa la reducción de ADP. Este sistema de regulaciones
cruzadas asegura una concentración equilibrada de todos los desoxirribonucleótidos para la
síntesis del DNA.
Síntesis de timidilato.
Una reacción única de metilación produce dTMP a
partir de dUMP. El timidilato (dTMP) que se requiere para la síntesis del DNA se forma a
partir de UMP en cuatro etapas. UMP se fosfonila a UDP, el cual se reduce a dUDP, y el
dUDP es desfosfonilado a dUMP, el cual entonces puede sen metilado:
La conversión de dUDP a dUMP se puede efectuar por dos rutas. El dUDP puede
reaccionar con ADP en presencia de una nucleósido monofosfato kinasa para formar dUMP
y ATP. Alternativamente, el dUDP también se puede fosforilar a dUTP a expensas de ATP
pon medio de la acción de nucleósido difosfato kinasas, más bien no específicas. Entonces
dUTP es rápidamente hidrolizado a dUMP + PPi, por la acción de desoxiuridina trifosfato
difosfohidrolasa (dUTPasa). Esta hidrólisis rápida de dUTP evita que accidentalmente sea
incorporado en el DNA en lugar de dTTP. El dCMP también puede servir como una fuente
de dUMP vía hidrólisis de su grupo amino, catalizada por la dCMP desaminasa.
La conversión de dUMP es catalizada por la timidalato sintasa. En esta reacción el
donador del grupo de un carbono es el 5,10-metilentetrahidrofolato. En este caso, el grupo
metilo (—CH3) en el producto, dTMP, está más reducido que el grupo metileno (—CH2—) en
el 5,10-metilenotetrahidrofolato, cuyo estado de oxidación es equivalente al del grupo
formilo del formaldehido. De esta forma, el metilentetrahidrofolato no solamente dona una
unidad de un carbono, sino que también sirve como el agente reductor para la reacción,
proporcionando un ion hidruro y siendo oxidado a 7,8-dihidrofolato en el proceso.
Solamente el tetrahidrofolato puede aceptar otra unidad de un carbono para reacciones
posteriores en el metabolismo de un carbono. Por consiguiente, el doble enlace 5,6 del
dihidrofolato debe ser reducido por NADPH en la reacción catalizada por dihidrofolato
reductasa para completar el proceso. Finalmente, como ya vimos, la unidad de un carbono
es incorporada en el tetrahidrofolato mediante la reacción catalizada por la serina
hidroximetiltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo hidroximetilo (-CH2OH) de
la serina para regenerar el 5,10-metilentetrahidrofolato.
O
HC
P O
CH2
HC
O
C
N
O
F
NH
C
C
P O
O
HC
CH2
O
C
N
NH
C
O
O
HO
H
HO
P O
5-fluoro-dUMP
dUMP
CH2
CH2
C H
N
CH2
HN
10
O
H
C
N
HO
X
5
R
H
dTMP
Glicina
H
N
N
H 2N
HN
Serina-hidroximetil
Transferasa
5
N
CH2
C
6
CH2
10
O
N R
H
7,8-dihidrofolato
Serina
H 2N
H
N
N
CH2
C H
N
CH2
H 10
O
N R
H
Tetrahidrofolato
HN
O
R=
O
Timidilato
Sintetasa
H
N5,N10-metilen-Tetrahidrofolato
5
O
C
Dihidrofolato
Reductasa
NADPH + H +
X
H 2N
OH
O
C NH CH CH2 CH2 C
OH
H
N
N
NADP+
N
CH2
5
N
NH2
CH2
10
N R
H3C
Metotrexato
C
HC
H
N
N
H 2N
H
H3 C
C
N
NH
C
O
La conversión de dUMP en dTMP es la única reacción conocida en la cual la
transferencia de una unidad de un carbono del tetrahidrofolato da como resultado la
oxidación en N-5 y C-6 de la coenzima para producir dihidrofolato. Debido a que dTMP sirve
como un precursor indispensable del DNA, cualquier agente que haga disminuir los niveles
de dTMP afecta drásticamente la división celular. Debido a que las células en división
rápida son particularmente dependientes de las actividades de la timidalato sintasa y de la
dihidrofolato reductasa, estas enzimas han sido los marcadores principales para los
fármacos anticáncer. La inhibición de cualquiera de estas enzimas, o de ambas, bloquea la
síntesis de dTMP y por consiguiente la síntesis de DNA.
El 5-fluorouracilo y el metotrexato han probado ser efectivos para combatir algunos
tipos de cáncer. Los dos actúan en la ruta que se utiliza para sintetizar el dTMP. El 5fluorouracilo es convertido a su desoxirribonucleótido, 5-fluorodesoxiuridilato, mediante una
vía de recuperación de nucleótidos. El 5-fluorodesoxiuridilato se fija firmemente a la
timidalato sintasa, inhibiendo a la enzima. El metotrexato, el fármaco anticáncer utilizado
más comúnmente, es un análogo del folato con un grupo amino en lugar del átomo de
oxígeno en C-4 y un sustituyente metilo en N-10. El metotrexato es un inhibidor potente y
relativamente específico de la hidrofolato reductasa. El análogo del folato se fija a la
reductasa de modo extremadamente firme solamente por interacciones no covalentes. La
disminución resultante en los niveles de tetrahidrofolato disminuye marcadamente la
formación de dTMP, debido a que la síntesis de dTMP es dependiente de concentraciones
adecuadas de metilentetrahidrofolato. La mayor parte de las células normales experimentan
la división celular con mayor lentitud que las células cancerosas, y en consecuencia son
menos sensibles al metotrexato. No obstante, debido a que el metotrexato es tóxico para
todas las células, debe ser usado con precaución. Con frecuencia, el 5formiltetrahidrofolato, el cual puede ser convertido en metilentetrahidrofolato, se da a los
pacientes durante un periodo breve después de que se les ha administrado una dosis de
metotrexato que de otra forma podría ser letal. Este método de rescate de dosis altas
refuerza el uso terapéutico del fármaco.