DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) INFORME FINAL PRUEBAS BIOLÓGICAS PARA LA EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE LAS SUSTANCIAS QUÍMICAS TERCERA ETAPA DESARROLLO DE PRUEBAS BIOLÓGICAS CON ESPECIES NATIVAS Y EJERCICIO DE INTERCALIBRACIÓN DICIEMBRE, 2007 Elaboró: Dra. Patricia Ramírez Romero, Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa. M. en C. Yolanda Pica Granados, Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, (IMTA). Dr. Fernando Martínez Jerónimo, Escuela Superior de Ciencias Biológicas, IPN Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) CONTENIDO 1. Resumen Ejecutivo 2. Antecedentes 3. Justificación 4. Objetivos 5. Metodología 6. Resultados 7. Propuesta de estudios y/o investigaciones de seguimiento 8. Recomendaciones 9. Conclusiones 10. Referencias 11. Anexos I. II. III. IV. V. VI. Programa de Trabajo del Taller de Transferencia de Tecnología para el Proyecto “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas, Tercera Etapa” Instructivo para el manejo de muestras ciegas Instructivo para el manejo de muestras ciegas sólidas Cartas Control Resultados del ejercicio de intercalibración Resultados de las pruebas con muestras sólidas Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 1. RESUMEN EJECUTIVO Los bioensayos de toxicidad permiten medir las respuestas de los organismos ante los contaminantes y complementan los análisis fisicoquímicos para tener una visión integral de los daños que se ocasionan sobre los ecosistemas, adicionalmente se pueden utilizar como instrumentos de control para la descargas de sustancias tóxicas en los cuerpos de agua o en el ambiente en general. En este contexto, el Instituto Nacional de Ecología inició en 2005 un proyecto con la finalidad de formular una batería de bioensayos para la evaluación ecotoxicológica de las sustancias que fuera aplicable en México. En 2006 se comenzó a trabajar con dos especies estándar de agua dulce con buenos resultados. En esta tercera etapa se incorporaron dos especies presentes en los ecosistemas mexicanos (Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus) y se comparó su sensibilidad con respecto a las especies subrogadas utilizadas en la etapa anterior (Daphnia magna y Selenastrum capricornutum ), asimismo se evaluó la variabilidad de los resultados entre laboratorios así como al interior de los mismos a través de una intercalibración con muestras ciegas. Adicionalmente el Laboratorio de Bioensayos del CENICA se capacitó en la generación de extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos para su análisis en ensayos de toxicidad Los resultados demostraron que tanto D. exilis como A. falcatus son adecuadas para su uso en pruebas de toxicidad, ya que su sensibilidad a las sustancias probadas es comparable o incluso mayor que la de D. magna y S. capricornutum respectivamente. Los laboratorios participantes se encuentran en un proceso de avance para lograr la óptima capacidad analítica, ya que estos son capaces de generar resultados reproducibles, especialmente para el protocolo de D. magna, D. exilis y en menor medida para S. capricornutum, procedimiento que aún requiere de ajustes metodológicos y de continuidad en su uso para el mejoramiento de las capacidades analíticas de los laboratorios participantes. Las pruebas con muestras ciegas sólidas demostraron que la capacidad adquirida por el CENICA para procesar muestras no tóxicas es adecuada, sin embargo es necesario extender estas pruebas a muestras tóxicas. Los resultados de este proyecto en sus tres fases (2005, 2006 y 2007) demuestran que es factible desarrollar las capacidades necesarias para contar con laboratorios competentes en la evaluación toxicológica de muestra ambientales y sustancias específicas en México, si se cuenta con cepas de organismos y se trabaja en el control de calidad de las pruebas. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EXECUTIVE SUMMARY Toxicity bioassays are tools to evaluate the response of organisms to contaminants, they also provide information, that in conjunction with physical and chemical analysis, result in an integral view of the damage caused to ecosystems; moreover, this assays can be used to control the discharge of toxic substances to aquatic bodies or he environmental in general. In this context, the National Institute of Ecology (INE by its acronym in Spanish) started a project in 2005 to put together a bioassay battery for the ecotoxicological evaluation of substances applicable to Mexico. Work with two fresh water standardized species started in 2006 with good results. In this third phase two species present in Mexico’s ecosystems were included (Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus) and their sensibility was compared to that of the species used in the previous phase (Daphnia magna y Selenastrum capricornutum ), at the same time the variability within and among laboratories was assessed through an intercalibration with blind samples. In addition CENICA’s Bioassays Laboratory learned a technique to obtain organic extracts and elutriates from soils and sediments for their analysis in toxicity assays. Results showed that D. exilis and A. falcatus are adequate for use in toxicity tests because their sensibility to the used substances was comparable or even higher than that of D. magna y S. capricornutum respectively. Participant laboratories are making progress toward an optimal analytical capacity, since they are capable of generating reproducible results, specially with D. magna, D. exilis and a little bit less with S. capricornutum; this last protocol requires methodological adjustments as well as continued used to better the analytical capabilities of the laboratories. Tests with blind non-toxic samples showed CENICA’s solid samples analytical capacities are adequate, however a run with toxic samples in necessary. The results of the three phases of this project demonstrate that it’s feasible to develop the necessary analytical capacities to have competent laboratories for the toxicological evaluation of environmental samples and specific substances in Mexico, as long as organisms strains are available and work is done under a quality control regime. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2. ANTECEDENTES La protección del medio ambiente es una tarea que requiere conocer cuál es el estado en el que se encuentran los diferentes ecosistemas, así como las medidas pertinentes para evitar su contaminación o degradación y para promover su remediación y conservación. Para ello es necesario contar con instrumentos que permitan medir los efectos de las diferentes actividades humanas sobre los elementos bióticos y abióticos de los ecosistemas. Para los elementos abióticos como el agua, el aire y el suelo, existen numerosas herramientas analíticas que permiten medir las concentraciones de agentes contaminantes y las alteraciones que producen en estos medios. Sin embargo, para el caso de los componentes bióticos, es decir los organismos, poblaciones o comunidades, existen menos herramientas de evaluación. Una alternativa viable para determinar los efectos biológicos son los bioensayos de toxicidad. Estas pruebas permiten medir las respuestas de los organismos ante los contaminantes y complementan los análisis fisicoquímicos para tener una visión integral de los daños que se ocasionan sobre los ecosistemas. En este contexto, el Instituto Nacional de Ecología inició en 2005 un proyecto con la finalidad de formular una batería de bioensayos para la evaluación ecotoxicológica de las sustancias que fuera aplicable en México. Para ello se contó con la participación de investigadores expertos en el tema, tanto de instituciones académicas como del gobierno. Después de una amplia discusión de los criterios de selección y de las posibles especies candidatas, se propuso un listado final de bioensayos tanto para ambientes acuáticos como terrestres, cuyos protocolos de prueba detallados se han integrado para su publicación. Como segunda etapa de este proyecto, durante 2006 se llevó a cabo la capacitación de laboratorios académicos y de gobierno para el manejo de bioensayos seleccionados así como un ejercicio de intercalibración con dos especies de agua dulce, el cladócero Daphnia magna y el alga Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata). Los resultados de dicho ejercicio evidenciaron el logro de la generación de capacidades analíticas de los laboratorios participantes. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Las especies empleadas para los fines de la segunda fase del proyecto seleccionadas por ser especies subrogadas cuya aplicación en la evaluación de toxicidad es ampliamente aceptada a nivel internacional. Respecto a la experiencia nacional, es suficientemente basta en los grupos de trabajo que fueron involucrados como corresponsables en este proyecto, razón por la que su misión fue orientar y conducir adecuadamente el desarrollo de capacidades en los grupos asociados como participantes. No obstante el buen desempeño logrado hasta el momento en el manejo de la estas especies de prueba antes mencionadas, es importante hacer notar que estas especies no se distribuyen naturalmente en México y por ello su empleo en el análisis ambiental de nuestro país debe ser reforzado con especies representativas de los ecosistemas mexicanos las cuales podrían resultar ser de mayor sensibilidad a los tóxicos. Considerando lo anterior, como tercera etapa de este proyecto, se propuso la realización de un nuevo ejercicio de intercalibración encaminado a involucrar el uso de especies de prueba de distribución en México, y la estandarización de un procedimiento de extracción de constituyentes tóxicos de suelos y sedimentos, con el fin de poder solubilizarlos y efectuar su análisis a través de las pruebas ya intercalibradas. 3. JUSTIFICACIÓN En México el deterioro de los ecosistemas acuáticos ha estado relacionado a la falta de políticas económicas consistentes que impulsen la conservación del agua, así como a la carencia de programas educativos y de apoyo tecnológico orientados al ahorro, tratamiento y reuso del agua entre los sectores urbano, agrícola e industrial. De acuerdo a estadísticas recientes de la Comisión Nacional del Agua, tan sólo 8% del agua que utiliza la industria es tratada o reusada y el resto es descargada en ríos, lagos y mares. En ese mismo sentido, en nuestro país también enfrentamos la falta de programas permanentes de monitoreo de la calidad del agua y de sistemas de control de la contaminación que operen bajo un estricto marco regulatorio enfocado a proteger los recursos hídricos y a garantizar el abasto de agua. Las actuales Normas Oficiales Mexicanas que regulan las descargas de aguas residuales consideran únicamente la evaluación de 7 metales y algunos parámetros físico-químicos básicos (pH, demanda bioquímica de oxígeno, contenido orgánico, de gradas y aceites y de sólidos suspendidos, disuelto y sedimentables) excluyendo la Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) detección de contaminantes de naturaleza orgánica, que constituyen todo un universo de sustancias tóxicas nocivas para la salud humana y para los ecosistemas (Pica et, al , 2000). Por lo anterior, avocarse al desarrollo de herramientas analíticas para evaluar la contaminación química del agua, basada en pruebas de toxicidad, contribuye al establecimiento de instrumentos de control para la descargas de sustancias tóxicas en los cuerpos de agua o en el ambiente en general. Bajo esta perspectiva, se ha vislumbrado la importancia de contar con una serie de pruebas biológicas estandarizadas que incluya especies representativas de los ecosistemas mexicanos, las cuales a su vez, sean aplicables a la evaluación de extractos de suelos y sedimentos contaminados. 4. OBJETIVOS Objetivo General Efectuar un ejercicio de intercalibración entre laboratorios universitarios y de gobierno para el desarrollo de pruebas de toxicidad con especies estándar como Daphnia magna y Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata), y calibrar los métodos de análisis para su empleo con especies de algas y cladóceros de distribución en los sistemas acuáticos de México Objetivos Particulares • Seleccionar, entre las especies de algas y cladóceros de distribución en México, identificadas como organismos con potencialidades para su empleo en pruebas de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) toxicidad, durante las etapas anteriores del proyecto, las más convenientes para su calibración. • • • Realizar un taller de discusión y de transferencia de tecnología para ampliar la capacitación de los laboratorios participantes Llevar a cabo el ejercicio de intercalibración con los organismos seleccionados. Calibrar un protocolo para la generación de extractos y elutriados de suelos y sedimentos de utilidad para el desarrollo de pruebas de toxicidad. 5. METODOLOGÍA 1. Selección de especies de pruebas y laboratorios participantes 1.1 Especies Para la selección de especies de prueba de distribución en México, se analizaron los listados de cladóceros y algas preseleccionados en la 1ª Etapa de este proyecto, en el año 2005. Entre los aspectos que se tomaron en cuenta para dicha preselección se encuentran: • Conocimiento amplio de su biología • Representatividad ecológica • Conocimiento de las condiciones de cultivo y manejo • Disponibilidad de cepas, caracterizadas y controladas • Existencia de un protocolo de ensayo de toxicidad aguda que pueda apegarse a las nuevas especies En el caso de los Daphnidos las especies preseleccionadas fueron Daphnia exilis, Daphnia pulex, Simocephalus mixtus, Ceriodaphnia dubia y Moina macrocopa, y para las microalgas dulceacuícolas, se consideraron a las especies: Scenedesmus acutus, Chlorella vulgaris y Ankistrodesmus falcatus. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Durante la segunda etapa del proyecto, realizada en 2006, se efectuaron pruebas con la mayoría de los organismos mencionados a fin de determinar sus atributos analíticos y evaluar la conveniencia técnica y metodológicas de su empleo, a fin de discernir cuales especies de distribución en México resultarían las más adecuadas para su aplicación y para el consecuente desarrollo de una intercalibración. A partir de dicho análisis, se definió que las especies propuestas serían Daphnia exilis (cladócero) y Ankistrodesmus falcatus (microalga), considerando, para esta última, la necesidad de que los grupos participantes mejoraran el desempeño y aplicación del protocolo de prueba para microalgas con S. capricornutum. En función de ese avance, se evaluaría la posibilidad de proceder con el trabajo de intercalibración empleando también a Ankistrodesmus falcatus. 1.2 Laboratorios Se contactó a todos los laboratorios participantes que concluyeron exitosamente la fase anterior de intercalibración, realizada en el año 2006, con el fin de conocer su disponibilidad de tiempo, recursos humanos, y financieros. Y así mismo, a aquellos que fungen como corresponsables y colaboradores de este proyecto en las fases previas. Y que representan a las siguientes instituciones: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tabla 1. Instituciones y personas participantes en el ejercicio de Intercalibración. Colaboradores y corresponsables Instituciones M.C. Yolanda Pica Granados Instituto Mexicano de Tecnología del Agua Dr. Fernando Martínez Jerónimo Escuela Nacional de Ciencias Biológicas IPN. Participantes I.I.Q. Gissel Trujillo Domínguez Biól. Homero Hernandez Salgado Instituto Mexicano de Tecnología del Agua M.C. Sandra Luz Guerra Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Biól. Isabel Romero Terán Biól. Sonia González Rebollar Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA) M. en C. Juan Cayetano Cid Núñez Biól. Lucia Salazar Coria Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) M. en C. Ivonne J. Cuesta Zarco Sonia Rangel Villafranco Gerencia de Saneamiento y Calidad del Agua. Comisión Nacional del Agua (CNA) Dra. Alma Socorro Sobrino Figueroa Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa (UAM-I) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2) Taller de transferencia y capacitación en los protocolos de prueba Los días 14 y 15 de junio del presente año se llevó a cabo un Taller de Transferencia de Tecnología coordinado por el personal del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua (IMTA). Este taller se realizó en el Centro de Capacitación del IMTA y fue instruido por especialistas de este mismo Instituto así como de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN). Al inicio del taller, les fue proporcionado a los participantes una carpeta informativa conteniendo los manuales de procedimientos para la realización de los ensayos con Daphnia magna y Pseudokirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum) cuya aplicación se haría extensiva para Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus, respectivamente. Así mismo, se incluyó la información adecuada para el mantenimiento óptimo del cultivo de las especies mencionadas y el procedimiento de control de calidad (ver Anexo I). Adicionalmente, y solo para el personal del CENICA, la carpeta incluyó también el procedimiento para la Generación de Extractos Orgánicos y Elutriados de Suelos y Sedimentos para su Análisis en Ensayos de Toxicidad, mismo que durante su instrucción en las instalaciones del IMTA, fue llevado a cabo por los participantes de CENICA durante un día adicional agendado para tal fin (ver Programa de Trabajo en Anexo I). El Taller se enfocó principalmente al manejo de las pruebas con Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata) y su posible aplicación para Ankistrodesmus falcatus, haciendo énfasis en la detección de los pasos metodológicos que requieren un mayor control a fin de reducir la variabilidad analítica observada en fase previas del proyecto. En forma paralela también se instruyó sobre las particularidades del cultivo para D. exilis y A. falcatus, esta última con fines de realizar una calibración inicial entre el laboratorio del IMTA y el de la ENCB (IPN). Al término del taller, a cada laboratorio le fueron entregados materiales de utilidad en el desarrollo de pruebas, así como cepas de D. magna y S. capricornutum (cepa pura en Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) agar, cepa pura en medio líquido propio para resiembra y en medio líquido para alimentación de cladóceros). El IPN, por su parte, efectuó la entrega de la cepa de Ankistrodesmus falcatus y posteriormente, hizo llegar un lote de hembras adultas de D. exilis a cada uno de los distintos participantes. 3) Intercalibración Desarrollo de cultivos y pruebas de auto entrenamiento (calibración interna) Con los materiales y cepas proporcionados por el IMTA y ENCB, cada laboratorio reinició de forma inmediata, después del taller de transferencia, las actividades de mantenimiento y optimización del desarrollo de los cultivos. Una vez lograda la adecuada proliferación de los cladóceros y de las algas, los laboratorios retomaron la tarea de ampliar las cartas control para las especies ya en uso, e iniciaron la realización de la correspondiente carta para D. exilis empleando como tóxico de referencia Cr+6 a partir de K2Cr2O7 El registro de los resultados de las cartas control es la principal evidencia a partir del cual es posible demostrar el manejo óptimo de los métodos de prueba dentro de un contexto de aseguramiento y gestión de la calidad, y asimismo sirve de evidencia para discernir la posibilidad de la aplicación del procedimiento de prueba desarrollado para Daphnia magna, en el empleo de otros cladócero de distribución en México, como es Daphnia exilis. Análisis de muestras ciegas líquidas El IMTA efectuó la preparación del paquete de cuatro muestras ciegas de esta fase del proyecto denominado “tercer grupo” ya que en la fase previa (2006) se manejaron dos grupos más de muestras ciegas. Las muestras fueron enviadas a cada uno los laboratorios, acompañadas de un instructivo detallado para su manejo (ver Anexo II) hasta la obtención de una solución patrón inicial. A Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) partir de ella, se dejó en manos del laboratorio la decisión de las concentraciones que procedían para el cálculo de la CE50 de cada muestra. Durante este evento de intercalibración, la identidad de los compuestos tóxicos presentes en las muestras no fue revelada a los laboratorios participantes, por ello los resultados de la CE50 fueron reportados en porcentaje en los registros del análisis Probit. Estos datos fueron posteriormente transformados para obtener los valores de las concentraciones correspondientes, los cuales pueden observarse acompañados del nombre del compuesto tóxico en la tabla 2. Tabla 2. Características de las muestras ciegas empleadas en el primer ejercicio de intercalibración. Identificación de la Muestra Muestra 10 Muestra 11 Muestra 12 Muestra 13 0.4 mg/L Cr +6 1 mg/L Hg+2 8 mg/L As+5 0.4 mg/L Cu+2 Para la conversión de los resultados de porcentaje a concentración se empleó el valor de la concentración inicial de cada solución de prueba, la que sería equivalente al 100%. A partir de ella se calculó el valor correspondiente en términos de concentración (mg/L) de acuerdo al siguiente ejemplo: CE50 (mg/L) =_________0.2 mg(L X 100%________ 22.15 (CE50 reportada en por ciento) Los compuestos tóxicos seleccionados fueron preparados con reactivos de pureza ≥ 99.5 % (certificados). El Cr+6 se obtuvo a partir de K2Cr2O7, el Hg+2 a partir del HgCl2, el Cu+2 a partir de CuSO4 y el As+5 a partir de Na2HAsO4. En todos los casos se prepararon las soluciones pesando los reactivos en una balanza semi-microanalítica calibrada y posteriormente se disolvieron en agua desionizada en volúmenes de 500 mL, aforando en matraces clase A. Con ello se obtuvieron soluciones con una concentración de 100 mg/L Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) de Cr+6, 250 mg/L de Hg+2, 100 mg/l de Cu+2 y 2000mg/L de As+5, las cuales fueron transferidas a viales cromatográficos de vidrio borosilicato en volúmenes de 2 mL. Tapadas herméticamente fueron enviadas los distintos laboratorios. En cada laboratorio los 2 mL de cada solución fueron llevados a un volumen de 500 mL, diluyendo con agua dura hasta el volumen de aforo, logrando así las concentraciones iniciales que se señalan en la tabla 2. La muestra 11, conteniendo mercurio, se empleó como muestra replicada con el objetivo de verificar la evolución de la precisión de los análisis efectuados por los laboratorios participantes, comparándose su respuesta con aquellos resultados obtenidos en las fases previas del proyecto. Las muestras 10 y 13 corresponden a la comparación y verificación de consistencia analítica en relación a los registros de CE50 obtenidos para las cartas control. Muestras para calibración de protocolo para la generación de extractos y elutriados El laboratorio de CENICA fue el único grupo involucrado en esta tarea, la cual consistió en aplicar el procedimiento para la generación de extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos, para su análisis en ensayos de toxicidad. Para ello les fue enviado un paquete con dos muestras de material sedimentario acompañado de su instructivo (ver Anexo III), para su procesamiento y posterior análisis en pruebas de toxicidad empleando a las especies D. magna, D. exilis y S. capricornutum. En este procedimiento una de las mayores preocupaciones en su manejo, es evitar la generación de falsos positivos o la interferencia ocasionada por el uso de solventes. Si bien el método indica cómo evitar estas situaciones, es indispensable demostrar que en su aplicación efectivamente no se incurre en esta clase de errores. Por las causas antes mencionadas, el laboratorio recibió, junto con el lote de muestras ciegas líquidas, dos paquetes de sedimento que correspondían a una muestra previamente evaluada por el IMTA y cuyos extractos y elutriados resultaban inocuos para las especies antes mencionadas, de modo que para este primer ensayo del método de generación de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) extractos y elutriados el laboratorio de CENICA recibió un material apto para considerarse control negativo. El objetivo de este lote fue que el laboratorio ejercitara el protocolo y afinara los detalles técnicos correspondientes. 6. RESULTADOS 1. Selección de especies y laboratorios participantes. 1.1. Especies De acuerdo con los resultados obtenidos en la segunda fase de este proyecto (Ramírez Romero P , et al , 2006), y presentados en una reunión de iniciación de este proyecto con los laboratorios participantes el 13 de abril del presente año, las especies de distribución en México, Daphnia exilis, Simocephalus mixtus, Ceriodaphnia dubia y Moina macrocopa, en ese orden de importancia, presentaron características de sensibilidad y consistencia analítica muy similares a la de la especie de referencia Daphnia magna, atributos que las definieron como posibles especies candidatas para su empleo en pruebas de toxicidad. Actualmente se cuenta con cepas aisladas y adecuadamente identificadas por la ENCB (IPN); asimismo, su manejo en cultivo se conoce y está descrito a detalle, aún más el protocolo para el desarrollo del método de prueba con Daphnia magna es apto para su aplicación extensiva con las demás especies Con base en los resultados mencionados, se seleccionó a la especie, Daphnia exilis, para el desarrollo de esta tercera etapa ya que los análisis de toxicidad para el cromo hexavalente, empleado como compuesto de referencia, mostró una CL50 de 0.098 mg/L, la cual es menor a la que caracteriza a Daphnia magna (LC50 = 0.1567 mg/L), lo que la califica como una especie de mayor sensibilidad respecto a la de referencia. Este dato resalta la importancia que tiene el ampliar el estudio de esta especie para reconocer el ámbito de su sensibilidad y sustentar su empleo con fines de monitoreo ambiental y de análisis de sustancias y productos sintéticos de aplicación en México. Respecto a la selección de una especie de microalga dulceacuícola, también de distribución en México, diferente de Selenastrum capricornutum, se analizó la posibilidad Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) del empleo de tres especies: Scenedesmus acutus, Chlorella vulgaris y Ankistrodesmus falcatus. De estas, A falcatus fue seleccionada por ser una especie cuyo cultivo puede también realizarse en el medio AAP, empleado para S. capricornutum, lo cual ofrece la posibilidad de la aplicación del protocolo de prueba ya calibrado, para ambas especies. De otra forma, el método de prueba tendría que ser radicalmente transformado y se requeriría reiniciar un nuevo y largo proceso de calibración, ajeno a los posibles alcances de este proyecto. Otras bondades de la especie que la ubicaron como candidata son sus características morfológicas gracias a las cuales se facilitan su cultivo y la lectura de su densidad, al no constituirse en agregados celulares o presentar polimorfismo. En relación al segundo punto, fue necesario que los laboratorios corresponsables probaran las alternativas técnicas para lograr niveles de densidad algal del orden de 3 x 106 cel /mL, para la preparación del inóculo requerido para el desarrollo de pruebas, antes de poder dar cualquier instrucción al resto de los laboratorios participantes, a fin de poder efectuar algunos ejercicios de intercomparación. Debido a lo anterior, solo los laboratorios corresponsables trabajaron en la definición de la solución metodológica a esta limitante. Como parte de este proyecto fue necesario trabajar en la definición de dos aspectos del procedimiento de prueba con S. capricornutum, a fin de poder ser aplicado para A. falcatus. El principal de ellos fue competencia de los laboratorios corresponsables (IPN e IMTA), quienes probaron alternativas técnicas para lograr los niveles de densidad algal requerido para el desarrollo de pruebas, sin que los cambios metodológicos influyeran en el método de prueba, generando un aumento de la variabilidad analítica. Solo hasta después de lograr dicho ajuste o solución técnica sería posible dar cualquier instrucción al resto de los laboratorios participantes, a fin de poder efectuar algunos ejercicios de intercomparación. La ENCB (IPN) instrumentó la generación del cultivo de A. falcatus empleando medio Bold Basal para su proliferación, el cual se mantuvo hasta alcanzar la fase máxima de crecimiento. Con este medio se logran densidades algales superiores al mínimo necesario, ya que es un medio de cultivo eutrófico útil para proveer densidades algales elevadas; esta formulación ocupa nutrientes en forma de sulfatos en niveles superiores al medio AAP. Sin embargo, el medio AAP ha sido empleado para la proliferación de algas para pruebas de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) toxicidad debido a su formulación basada en cargas limitadas de nutrientes en forma de cloruros, en lugar de sulfatos, ya que de esta forma se evita la interferencia que estos pudieran tener con los contaminantes tóxicos presentes en las muestras por evaluar. Asimismo, permite el desarrollo de protocolos miniaturizados, los cuales no serian posibles si se emplearan medios eutróficos, ya que a consecuencia de un rápido crecimiento, se agotaría rápidamente el medio y generaría la necesidad de espacios aéreos de mayor volumen para evitar la acidificación del medio líquido por la producción de CO2, lo cual provocaría interferencias en las pruebas. Es por esto que, si bien las algas fueron proliferadas por el IPN en medio Bold Basal, este medio, al momento del desarrollo de las pruebas, se sustituyó por el medio AAP 18x como se indica en el procedimiento de rutina definido para S: capricornutum .Los resultados de este experimento se muestran en la figura 1 Por su parte, el IMTA proliferó a A. falcatus haciendo uso del medio de cultivo AAP, de la misma manera que se procede para S. capricornutum. La densidad algal lograda fue de entre 2.5 a 3 x 106 cel. /mL, de forma que en algunas ocasiones el inoculo pudo ser preparado de forma directa mientras que en otras, cuando el número de células era menor a 2.6 x 106 cel. /mL, se empleó como alternativa mantener el cultivo en refrigeración y en oscuridad para su sedimentación; posteriormente se eliminó parte del volumen del medio lográndose de esa manera densidades del orden de 5 x 106 cel. /mL. Cantidades suficientes para la preparación del inoculo algal y para proceder con el desarrollo de rutina del método de prueba sin hacer uso de ningún medio o sustancia adicional. Los resultados obtenidos por el IMTA a partir de este manejo se presentan en la figura 2. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h inhibición Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral AAP 0.14 Promedio +2Π.= 0.1293 0.13 CL 50 (mg/L) 0.12 0.11 0.1 0.09 Promedio = 0.0985 0.08 0.07 Promedio -2Π.= 0.0676 0.06 0.05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Número de experimento Media 0.0985 D.E. 0.0187 C.V. 15.6833 Media + 2 D.E. 0.1293 Media – 2 D.E. 0.0676 Figura 1. Resultados de las pruebas de toxicidad aguda con Cobre a 72 hrs de Ankistrodesmus falcatus proliferada en medio Bold Basal. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h inhibición de crecimiento. Tóxico de referencia: Cu II CL 50 (mg/L) 0.04 Promedio +2σ.= 0.0391 0.035 Promedio = 0.0339 0.03 Promedio -2σ= 0.0286 0.025 1 2 3 4 5 6 7 Número de experimento Media 0.0339 D.E. 0.00261 C.V. 7..71 Media + 2 D.E. 0.0391 Media – 2 D.E. 0.0286 Figura 2. Resultados de las pruebas de toxicidad aguda con Cobre a 72 hrs de Ankistrodesmus falcatus proliferada en medio AAP. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Con base en estos resultados, se observa una gran consistencia interna para cada uno de los laboratorios, sin embargo existen diferencias significativas entre los valores de la CE50 obtenidos por cada institución, indicando la posibilidad de que el empleo del medio Bold Basal para el cultivo pueda causar cambios en la sensibilidad de la especie, haciéndola menos sensible que S. capricornutum, cuya CE50 para el Cu+2 empleado como tóxico de referencia, es de 0.0317 mg/L, de acuerdo con la carta global de los diversos laboratorios participantes de la fase dos de este proyecto en el año 2006 (figura 3). Sin embargo, en relación a los resultados obtenidos por el IMTA se observa que la sensibilidad al Cu+2 de A. falcatus no presentan diferencias significativas respecto a la observada para S. capricornutum El segundo aspecto por resolver referente al procedimiento de prueba, fue la definición de un sistema de iluminación alternativo distinto al propuesto inicialmente. El protocolo base propone el diseño de una cámara de iluminación piramidal cuyo montaje garantiza la homogeneidad de la luz en el campo de exposición de pruebas con 4000 luxes; asimismo se ahorra en el consumo de energía al emplear solo un foco de luz fría. El objetivo de presentar esta propuesta de diseño de cámara de iluminación fue el ofrecer a los laboratorios participantes un prototipo calibrado, apto para el desarrollo de pruebas, el cual brinda la estabilidad de iluminación necesaria para minimizar la variabilidad en los crecimientos algales producto de una posible heterogeneidad del campo iluminado. Este prototipo es de utilidad, sobre todo, para laboratorios que no cuentan con equipamiento adecuado para medir la intensidad de luz, de forma que al construirlo se garantiza el logro de los niveles en luxes, y la homogeneidad de iluminación conveniente para el desarrollo experimental. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Media D.E. C.V. Media +2 D.E. Media – 2 D.E. 0.0317 0.00754 23.78 0.0468 0.0166 Figura 3. Carta control integrada para S. capricornutum con los resultados de los cinco laboratorios participantes en el ejercicio de intercalibración del año 2006. Sin embargo, en casos donde la medición de la intensidad de luz puede efectuarse y en consecuencia controlarse, puede ser empleado cualquier sistema de iluminación alternativo como el de iluminación horizontal propuesto por la ENCB (IPN). Una demostración técnica a este respecto fue efectuada por la ENCB (IPN), quién desarrolló experimentos comparativos entre ambos diseños de cámaras de iluminación. Para ello se Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) empleó el montaje de pruebas con Ankistrodesmus falcatus en ambos sistemas y se demostró que la CE50, LOEC, NOEC y MATC obtenida para la evaluación del tóxico de referencia, Cu+2, no presentaban diferencias significativas (Fig. 4). De modo que cualquiera de los sistemas de iluminación propuestos puede ser elegido para el desarrollo de pruebas con este organismo o con S. capricornutum. Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h inhibición 0.14 Promedio +2σ.= 0.1293 0.13 0.12 CL 50 (mg/L) 0.11 0.1 0.09 Promedio = 0.08 0.07 0.06 Promedio -2σ.= 0.05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Número de experimento Media D.E. C.V. Media +2 D.E. Media – 2 D.E. 0.0985 0.01544 15.68 0.1293 0.0676 Figura 4. Resultados de pruebas de toxicidad con A. falcatus en de dos sistemas de iluminación (◊ horizontal; pirámide) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 1.2. Capacitación en los protocolos de prueba y logística del ejercicio de intercalibración Durante el Taller de Transferencia de Tecnología (14 y 15 de junio) realizado en las instalaciones del Centro de Capacitación del IMTA), se reunieron los representantes de todos los laboratorios participantes en este proyecto (Figura 5) para efectuar mesas de discusión y desarrollos prácticos para afinar detalles metodológicos, con el fin de lograr la optimización del procedimiento de evaluación de toxicidad con el alga S. capricornutum y de aprender los detalles del mantenimiento, cultivo y manejo de la especie Daphnia exilis para su uso en pruebas de toxicidad. Con estos objetivos, en este taller se atendieron algunas problemáticas detectadas en el manejo de la prueba con S. capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata). Se hicieron algunas prácticas de conteo de células, se calibraron las pipetas utilizadas en la prueba y se dieron algunas otras recomendaciones para un mejor manejo de la técnica de análisis (figuras 6 y 7). Asimismo, se hizo una amplia discusión de la nueva especie a probar: Ankistrodesmus falcatus, de sus similitudes y diferencias y se acordó que habría que trabajar la segunda con un medio de cultivo diferente, ya que el utilizado con S. capricornutum no es suficientemente nutritivo para la segunda especie. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 5. Grupo de trabajo del Taller “Pruebas biológicas para la evaluación de sustancias químicas”, Tercera Etapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 6. Lectura de prueba con S. capricornutum por personal de la CNA Figura 7. Calibrando pipetas Personal del IMP. En cuanto a las pruebas con Cladóceros, el Dr. Fernando Martínez Jerónimo explicó todos los detalles del cultivo y de la prueba con Daphnia exilis (Fig. 8). Los participantes tuvieron también la oportunidad de intercambiar las pocas experiencias que hasta ese día habían tenido en el manejo de esta cepa, ya que ésta se les hizo llegar a sus laboratorios con anterioridad. Despejaron sus dudas con respecto al instructivo previamente entregado y se comentaron los detalles en el manejo de estos organismos que no se describen en el protocolo, pero que son de importancia para lograr un manejo óptimo. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 8. Explicación del protocolo para la determinación de toxicidad con Daphnia exilis Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) En forma simultánea, personal del CENICA fue entrenado en el manejo del procedimiento de extracción para la generación de extractos y elutriados para el análisis de toxicidad de suelos (Figuras 9 y 10) Figura 9 Uso del rotovaporador para concentración del extracto orgánico Figura 10. Trasvasado de extractos orgánicos de suelos Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2. Resultados de la intercalibración. 2.1 Elaboración de cartas control Las cartas control de las pruebas con D. magna, D. exilis y S. capricornutum fueron las primeras informaciones generadas por los laboratorios. Para los casos de D. magna y S. capricornutum los participantes ya contaban con un número superior a 10 datos, los cuales fueron generados a lo largo de la segunda fase de este proyecto, durante el año 2006. Respecto a las cartas control de D. exilis, estas contienen menos dato ya que esta prueba se incorporó a partir del desarrollo de esta tercera fase. Las cartas control de cada institución puede consultarse en el Anexo IV y los resultados generales de las mismas se presentan en la Figura 11. En ella se observa que los resultados obtenidos para los tóxicos de referencia Cr+6, empleado para los cladóceros, y Cu+2 de utilidad para las microalgas, presentan valores de CE50 cuya variación entre laboratorios es, por lo general, menor al 20%, definido por los valores de coeficiente de variación (CV), con valores de entre 1.18 y 1.75 para D. magna, de 0.076 a 1.48 para D. exilis y de 0.025 a 0.048 para S. capricornutum. Esto indica que la reproducibilidad de los análisis obtenida por los laboratorios participantes es aceptable. Carta control de D. magna Al integrar los resultados individuales, obtenidos durante el 2007 por los seis laboratorios, en una sola carta control para cada organismo de prueba (fig. 12-14), se puede observar que la CE50 para D. magna presentó un valor de 0.149 mg/L, con un coeficiente de variación del 14.97%. Estos valores son ligeramente menores a los obtenidos durante el año 2006 en que la CE50 fue de 0.189 mg/L y el coeficiente de variación de 19.61. D. magna comparativo CC 0,200 0,180 POLI 0,160 IMP 0,140 0,120 CNA UAM-I IMTA CENIICA 0,100 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y 0 1 2 3 4 5 6 Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Carta control D. magna CENIICA IMP CNA UAM-I ENCB (POLI) IMTA CE50 Cr+6 0,118 0,150 0,156 0,148 0,175 0,156 C.V 23,00 5,91 4,73 7,96 13,18 6,19 Carta control D. exilis +6 CENIICA IMP CNA UAM-I ENCB (POLI) IMTA CE50 Cr 0,085 0,148 0,138 0,076 0,121 0,107 D. exilis comparativo CC C.V 22,00 5,50 10,27 8,18 20,00 10,00 0,160 IMP 0,140 0,120 POLI 0,100 0,080 CENIICA CENIICA IMP CNA UAM-I ENCB (POLI) IMTA CE50 Cu 0,031 0,038 0,025 0,037 0,048 0,035 IMTA UAM-I 0,060 0,040 0 1 2 Carta control S. capricornutum +2 CNA 3 4 5 6 7 Selenastrum, comparativo CC C.V 14,74 16,87 31,77 10,43 12,00 11,31 Organismo: .D . 0,040 IMP UAM-I 0,035 IMTA CENIICA 0,030 0,025 CNA 0,020 0 1 2 3 4 5 6 m agna 48h Toxic idad A guda. Interlaboratorio Tóxic o de refer enc ia: C r( IV ) CL 50 (mg/L) Figura 11. Resumen de los valores de CE50 de las Cartas Control de los tres organismos P ro m e d io + 2 .= 0 .1 9 4 2 0 ,1 8 de prueba intercalibrados. 2007 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. de la Ciencia y P ro09340 m e d ioUAM-I = 0 .1 4Edificio 94 Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 0 ,1 3 Correo electrónico [email protected] P ro m e d io -2 .= 0 .1 4 7 7 0 ,0 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N úm e ro d e e ns ayo 11 12 13 14 15 16 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2006 14.97 Media + 2 DE 0.1942 Media – 2 DE 0.1477 19.61 0.26 0.12 Media D.E. C.V. 2007 0.1494 0.0224 2006 0.189 0.037 Figura 12. Comparativo de las cartas control integradas para D. magna con los resultados de los laboratorios participantes en los ejercicios de intercalibración de 2006 y 2007. Los valores de CL50 fueron calculados a partir de los datos de mortalidad a las 48 h, usando Cr+6 en agua dura como tóxico de referencia Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2007 Organismo: P. s ubc apitata 72h Toxic idad Aguda. Interlaboratorio Tóxic o de referenc ia: Cu(II) 0,0600 CL 50 (mg/L) P ro m ed io +2⎯ .= 0.056 P ro m ed io = 0.0367 P ro m ed io -2⎝ .= 0.0172 0,0100 0 5 10 15 Núm e ro d e e ns ayo O rg a n i s m o : S . c a p ri c o rn u tu m 7 2 h i n h i b i c i ó n d e c re c i m i e n to T ó xi c o d e re fe re n c i a : C u + 2 e n m e d i o m i n e ra l 2006 0,05 P r o m e d io + 2 s .= 0 .0 4 7 2 0,045 0,04 CL 50 (mg/L) 0,035 0,03 P r o m e d io = 0 .0 3 1 5 0,025 0,02 0,015 P r o m e d io -2 s .= 0 .0 1 5 8 0,01 0,005 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 N ú m e ro d e e xp e ri m e n to 26.55 Media + 2 DE 0.056 Media – 2 DE 0.0172 24.92 0.0472 0.0158 Media D.E. C.V. 2007 0.0367 0.0097 2006 0.0317 0.0078 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 13. Comparativo de las cartas control integradas para S. capricornutum con los resultados de los laboratorios participantes en los ejercicios de intercalibración de 2006 y 2007. Los valores de CL50 fueron calculados a partir de los datos de mortalidad a las 72h, usando Cu+2 en agua dura como tóxico de referencia Carta control de S. capricornutum Con relación a la microalga S. capricornutum (P. subcapitata), y la integración de los resultados de los seis laboratorios en una sola carta control (fig. 13) se observa que la CE50 para el Cu +2 es del orden de 0.0367 mg/L con un coeficiente de variación interlaboratorios de 26.55%. Este valor es superior a los mostrados de manera individual por los laboratorios, los cuales no exceden del 16% (fig. 11). Los valores que describen a la carta control para S. capricorrnutum, son muy similares a los obtenidos durante el año de 2006, en el que la CE50 fue de 0.0317 mg/L y el coeficiente de variación de 24.92% Carta control D. exilis Con relación a la carta control general (fig. 14), que se deriva de la integración de los resultados de todos los laboratorios participantes, se observa que la CE50 para el Cr+6 es de 0.1043 mg/L con un C.V. de 28.20 %. Al igual que en el caso de S. capricornutum, el coeficiente de variación se incrementa ligeramente respecto a los valores individuales de cada laboratorio (fig. 11), los cuales no exceden del 22%; este tipo de incrementos en la variabilidad interlaboratorios es un resultado común en este tipo de ejercicios, y se encuentra dentro del rango de lo aceptable. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Organismo: .D. exilis 48h Toxicidad Aguda. Interlaboratorio Tóxico de referencia: Cr(IV) Promedio +2 .= 0.1631 CL 50 (mg/L) 0,17 0,12 Promedio = 0.1043 0,07 Promedio -2¬.= 0.0455 0,02 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Número de ensayo 11 12 13 14 15 Media D.E. C.V. Media + 2 D.E. Media – 2 D.E. 0.1043 0.02941 28.20 0.1631 0.00455 16 Figura 14. Carta control integrada para D. exilis con los resultados de los laboratorios participantes en el ejercicio de intercalibración del año 2007. Los valores de CL50 fueron calculados a partir de los datos de mortalidad a las 48 h, usando Cr+6 en agua dura como tóxico de referencia Los resultados logrados durante esta tercera fase, no solo muestran una reducción de la variabilidad interlaboratorio para las pruebas de D. magna y S. capricornutum, también indican una mejor distribución de los valores, la cual es aleatoria y no agregada, como lo que se evidenció durante el 2006, año en el que los datos de cada laboratorio constituían pequeños cúmulos aislados unos de otros. Esta mejora en la distribución de los valores de la CE50 en conjunto con el coeficiente de variación, nos sugiere que los participantes han mejorado, en general, en el desempeño de la metodología de análisis para pruebas de toxicidad intercalibradas. Los Coeficientes de Variabilidad logrados por el grupo de trabajo, son bastante aceptables y tienden a ser similares a los valores obtenidos como antecedentes en el año 2006 por el Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) propio grupo de trabajo, así como a aquellos reportados por laboratorios miembros de la red Watertox, como Ronco et ál. (2000), Castillo y Schafer (2000) y Pica-Granados et ál. (2000), quienes obtuvieron valores de CE50 para Cr+6 de 0.155 a 0.17 mg/L y C.V. de 10 a 17% para D. magna y CE50 para Cu+2 de 0.029 a 0.35 mg/L y C.V. de 13 a 23% para S. capricornutum 2.2 Análisis de muestras ciegas Los resultados del tercer grupo de muestras ciegas se emplearon para evaluar la evolución de la precisión intralaboratorio de las pruebas efectuadas, a través del análisis de la consistencia de los resultados de las muestras ciegas, conteniendo a los tóxicos de referencia, respecto a las cartas control elaboradas; y de la comparación de los resultados obtenidos para el Hg (muestra 11), que es la sustancia de seguimiento, respecto a los registros logrados durante el año 2006. Asimismo se analizó la consistencia interlaboratorio mediante el análisis de los CV obtenidos para cada muestra y para cada organismo de prueba. 2.2.1 Precisión intralaboratorio Cartas control vs. Muestra ciega (tóxico de referencia) Para el desarrollo de las cartas control se emplean como tóxicos de referencia: Cr+6 para los cladóceros y Cu+2 para las microalgas; compuestos con los que cada laboratorio efectuó pruebas de forma continua, a fin de lograr un número de datos suficiente para determinar la variabilidad de la respuesta de los organismos manejados y controlados bajo las condiciones de cada institución, pero en apego a los procedimientos de prueba en los que han sido instruidos. Los resultados individuales de las cartas control han sido discutidos y presentados en la figura 11, con resultados muy consistentes; sin embargo es importante verificar que esta consistencia se mantiene, a través de la evaluación de muestras ciegas. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) El empleo de un tóxico de referencia como contenido de una muestra adicionada o ciega es de enorme utilidad para lograr incluir en la evaluación del desempeño de los protocolos a fase que compete al manejo de muestra, situación que queda excluida del campo experimental cuando se emplea una solución patrón que contiene al tóxico de referencia y que es el que se utiliza para la construcción de la carta control. Es en este sentido, se decidió incluir en el grupo de muestras ciegas, a los metales mencionados que constituyen las muestras 10 y 13. Los resultados comparativos entre el valor de la CE50 promedio de las cartas control y el obtenido para las muestras adicionadas se presentan en las figuras 15 y16; en esta última se observa que la prueba con Daphnia magna fue la que mayor consistencia presentó ya que las diferencias porcentuales entre el valor de la CE50 para la muestra ciega y la obtenida para la carta control fue menor al 25%, variación que fue similar para los distintos laboratorios. Con relación a las pruebas con D. exilis y S. capricornutum, las diferencias porcentuales son muy variables entre los laboratorios, el IMP y la UAM-I presentan los mayores valores de variación de entre 60 y 80%, respecto a la CE50 de las cartas control, mientras que CENICA, CNA, IMTA y la ENCB (POLI) presentan diferencias menores al 37%. Una excepción es la de la ENCB (POLI) para la prueba con S. capricornutum para la que presenta una diferencia elevada de 68%. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) CE50 Cr +6 mg/L D. exilis. Com parativo Carta Control vs M uestra ciega con Cr +6 0.2 0.15 0.1 0.05 0 CENIIC IMP CNA UAM-I POLI IMTA Carta control 0.085 0.148 0.138 0.076 0.121 0.107 CE50 CrVI 0.06 0.026 0.086 0.133 0.093 0.145 CE50 Cr +6 mg/L D. magna. Com parativo Carta Control vs M uestra ciega con Cr +6 0.2 0.15 0.1 0.05 0 CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA Carta control 0.118 0.15 0.156 0.148 0.175 0.156 CE50 CrVI 0.088 0.112 0.128 0.13 0.156 0.168 S. capricortunum. Com parativo Carta Control vs Muestra CE50 Cu +2 mg/L ciega con Cu +2 0.06 0.04 0.02 0 CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA Carta control 0.031 0.038 0.025 0.037 0.048 0.035 CE50 Cu II 0.02 0.01 0.025 0.014 0.015 0.037 Figura 15. Comparativo de los valores de la CE50 promedio de cartas control con la muestras ciegas adicionadas con tóxicos de referencia. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) D. exilis. Diferencia porcentual del resultado de Muestra ciega con Cr+6 respecto a la CE 50 de la Carta Control 100.000 % 50.000 0.000 -50.000 -100.000 Diferencia porcentual CENIIC IMP CNA UAM-I POLI IMTA 29.412 82.432 37.681 -75.000 23.140 -35.514 D. magna. Diferencia porcentual del resultado de Muestra ciega con Cr +6 respecto a la CE 50 de la Carta Control 100.000 % 50.000 0.000 -50.000 -100.000 Diferencia porcentual CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA 25.424 25.333 17.949 12.162 10.857 -7.692 S. capricornutum. Diferencia porcentual del resultado de Muestra ciega con Cu+2 respecto a la CE 50 de la Carta Control 100.000 % 50.000 0.000 -50.000 -100.000 Diferencia porcentual CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA 35.484 73.684 0.000 62.162 68.750 -5.714 Figura 16Diferencias porcentuales de muestras ciegas respecto a las CE50 de las cartas control. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Comparativo de muestra de seguimiento Las muestras de mercurio (Hg+2) preparadas como solución de seguimiento nos brindó otro elemento analítico para evaluar la replicabilidad inter e intralaboratorios. Los resultados para D. magna y S. capricornutum se presentan en las tablas 3 y 4 en las que se pueden observar valores de C.V intralaboratorio < 40%, los cuales en general son menores a aquellos observados en la comparación interlaboratorios, que en promedio es del 50% para ambas especies. Algunos datos que, sin duda, se identificaron como anómalos, fueron sustraídos del análisis estadístico, al igual que los correspondientes al primer ejercicio de intercalibración, a fin de evitar una sobreestimación de la variabilidad inter e intralaboratorio. Tabla 3. Análisis de la variabilidad de la muestra ciega en los ejercicios de intercalibración 2006-2007, empleada para seguimiento. Resultados de la CE50 de Hg+2 para Daphnia magna 2006 CENIICA IMP CNA UAM-I ENCB (POLI) IMTA Hg 1 0.015a 0.039 a 0.009 a 0.1 ab Hg 2 0.019 0.033 0.013 0.047b 2007 Hg 3 0.017 0.045 0.04 0.026 Hg 4 0.006 b 0.031 0.02 0.079b 0.025 0.022 Intralaboratorio Media 0.018 0.0363 0.0243 0.0365 0.025 0.022 Dst C.V. 0.0014 0.0076 0.0140 0.0148 7.86 20.84 57.58 40.68 Interlaboratorios Media Dst C.V. 0.04075 0.0217 0.032 0.0255 0.0416 0.0152 0.0128 0.0078 b 102.02 70.10 40.10 30.50 Dato no considerado para la estadística intralaboratorio b Dato no considerado para la estadística interlaboratorio a Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tabla 4. Análisis de la variabilidad de la muestra ciega en los ejercicios de intercalibración 2006-2007, empleada para seguimiento. Resultados de la CE50 de Hg+2 para Selenastrum capricornutum 2006 CENIICA IMP CNA UAM-I ENCB (POLI) IMTA Hg 1 0.06 a 0.059 a 0.022 0.092 a Hg 2 0.011 0.042 0.055 ab 0.039 2007 Hg 3 0.016 0.048 0.012 0.02 Hg 4 0.002 ab 0.042 0.03 0.023 0.169 b 0.043 Intralaboratorio Media 0.0135 0.044 0.0213 0.0273 0.169 0.043 Dst C.V. 0.0035 0.0035 0.0090 0.0102 26.19 7.87 42.27 37.37 Interlaboratorios Media Dst C.V. 0.0583 0.0307 0.0240 0.0317 0.0286 0.0171 0.0163 0.0097 49.1274 55.7536 68.0414 30.5626 Dato no considerado para la estadística intralaboratorio b Dato no considerado para la estadística interlaboratorio a Este ámbito de variación interlaboratorio es propio de esta clase de ejercicios de intercalibración (Lewis et al., 1994; De Graeve et al., 1990) respecto a lo cual sirven como ejemplo algunos valores presentados por Forget et al (2000), quién para los resultados de intercalibración de la red WaterTox, señala para el mercurio II, coeficientes de variación interlaboratorio del 64 %; sin embargo la variabilidad intralaboratorio observada para ambas especies es elevada, ya que para algunos laboratorios es mayor al 40%, por lo que se hace necesario fomentar un mejor desempeño de estos grupos, a fin de que logren una replicabilidad aceptable con niveles de CV por debajo del 25%. El comportamiento de los C.V interlaboratorio señalan una tendencia en el tiempo a su reducción. En la medida en que se resuelvan los detalles técnicos, para ambos métodos de prueba, que persisten e inciden en la variabilidad intralaboratorio, se mejorará la confiabilidad analítica de algunos de los laboratorios participantes. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 2.2.2 Consistencia interlaboratorio, Para el análisis de la variabilidad interlaboratorio de los resultados analíticos de las pruebas con D. magna, D. exilis y S. capricornutum, se emplearon los datos globales de la CE50 de las cuatro muestras ciegas, que constituyeron el tercer ejercicio de intercalibración y que se presentan en las figuras 17, 18 y 19, respectivamente. Daphnia magna Para la prueba con D. magna, los laboratorios en su conjunto manifiestan, para todas las muestras, C.V muy similares, los cuales en promedio refieren un valor de 23.04% lo cual indica un buen desempeño analítico de éste protocolo de prueba, con una variabilidad bien controlada y homogénea para la población de datos analizados, sustentando la confiabilidad analítica de los mismos. Daphnia exilis Los resultados interlaboratorio para la especie D. exilis, de distribución en México, presenta un valor de C.V. igualmente aceptable, con un promedio de 38.4%, que describe la variación analítica de la mayoría de las determinaciones efectuadas por los laboratorios participantes, con la excepción del mercurio, en el que el C.V. es mayor, con 47.03%. Estos resultados muestran el potencial analítico de la especie D. exilis y la posibilidad técnica de hacer extensivo el empleo del protocolo de prueba ensayado para ambas especies (D. magna y D. exilis). Los resultados analíticos refieren un manejo adecuado del protocolo y de su aplicación con D. exilis, ya que se observa una variabilidad interlaboratorio aceptable que tenderá a reducirse en la medida en que el manejo del método se intensifique, tarea que es especialmente importante para los laboratorios del IMP y de la UAM en donde se requiere fortalecer su reproducibilidad analítica a través de mejorar el desempeño del protocolo de prueba y de cultivo para D. exilis (fig. 16). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Daphnia magna Cr 0,2 IMTA POLI 0,15 0,1 IMP CENIICA UAM-I CNA 0,05 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Daphnia magna As 10 8 6 4 2 0 Daphnia magna Cu UAM-I 0.050 0.040 0.030 IMTA CNA POLI IMP 1 2 CENIICA 0.020 0.010 0.000 CENIICA 0 IMTA 3 4 5 6 7 POLI UAM-I IMP CNA 0 1 2 3 4 5 Daphnia magna Institución CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA a Cr 0.088 0.112 0.128 0.130 0.156 0.168 Hg 0.006 0.031 0.020 0.079 a 0.025 0.022 As ND 4.548 7.378 9.230 7.044 9.271 Cu 0.026 0.011 ND 0.018 0.021 0.046 Dato no considerado para la estadística intralaboratorio Media Dst C.V. 0.130 0.029 22.343 0.021 0.005 22.036 7.494 1.941 25.898 0.024 0.006 25.108 Figura. 17. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para Daphnia magna. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 6 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) D. exilis Cr D. exilis Hg 0,2000 0,1500 IMTA UAM-I 0,1000 0,0350 0,0300 0,0250 0,0200 0,0150 0,0100 0,0050 0,0000 POLI CNA CENIICA 0,0500 IMP 0,0000 0 1 2 3 4 5 6 7 UAM-I IMP IMTA CNA POLI CENIICA 0 1 2 3 4 5 6 7 D. exilis Cu D. exilis As 5,0000 0.0300 CNA 4,0000 0.0250 POLI UAM-I UAM-I CENIICA IMP 2,0000 0.0150 0.0100 IMTA 1,0000 CENIICA 0.0050 0,0000 0 1 2 3 4 5 6 7 POLI CNA 0.0200 3,0000 IMTA IMP 0.0000 0 1 2 3 4 5 6 Daphnia exilis Institución CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA Cr 0.060 0.026 a 0.086 0.133 0.093 0.145 a Media Dst C.V. Hg 0.003 a 0.024 0.021 0.033 0.012 0.021 As 2.291 2.331 4.002 3.731 3.810 1.721 Cu 0.006 a 0.009 0.021 0.025 0.022 0.012 Dato no considerado para la estadística intralaboratorio 0.103 0.035 33.89 0.022 0.010 47.03 2.981 0.978 32.80 0.018 0.007 39.92 Figura. 18. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para Daphnia exilis. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Selenastrum capricornutum Respecto a los resultados obtenidos para la microalga S. capricornutum, la variabilidad interlaboratorio promedio fue del 47.66 % para la mayoría de las determinaciones efectuadas en este ejercicio. Para el caso del Cr.VI., si bien el C.V no aumenta exageradamente, es importante hacer notar que los resultados para este compuesto presentaron un comportamiento muy errático, registrándose CE50 desde concentraciones tan pequeñas como 0.033 mg/L hasta incluso verificarse registro de toxicidad No Detectable (ND), sin tendencia definida, por lo que el Cr VI puede ser un compuesto inadecuado para el desarrollo de intercalibraciones con especies algales, ya que es posible que su biodisponibilidad se vea alterada como resultado del uso de medio mineral en el protocolo de prueba. A pesar de la aparente consistencia de la variabilidad para la mayoría de las muestras en un valor de alrededor del 50%, se considera conveniente continuar en la búsqueda de los aspectos metodológicos que puedan reducirla a niveles del orden de un 30%, tomando como base el C.V observado en las cartas control de S. capricornutum (fig. 13), en el Selenastrum As análisis de la consistencia intralaboratorio 3 (tabla 4).y en los resultados para mercurio POLI 2,5 indicados en la figura 19, o en su defecto 2 1,5 continuar con el desarrollo de experimentos 1 que permitan establecer ese valor como el UAM-I 0,5 ámbito de variación aceptable para este CNA IMTA CENIICA 0 protocolo de prueba. 0 1 2 3 4 5 6 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Selenastrum Cr 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 UAM-I CNA SelenastrumCu IMTA 0.040 CENIICA 0 1 2 3 4 5 6 7 IMTA 0.030 CNA 0.020 Selenastrum As 3 2,5 CENIICA 0.000 POLI 2 1,5 1 POLI UAM-I IMP 0.010 0 1 2 3 4 5 UAM-I 0,5 0 CNA CENIICA 0 1 2 3 IMTA 4 5 6 7 Selenastrum capricornutum Institución CENIICA IMP CNA UAM-I POLI IMTA Cr 0.003 a ND a 0.062 0.131 ND a 0.047 a Media Dst C.V. Hg 0.0002 a 0.042 0.030 0.023 0.169* 0.043 As 0.026 ND a 0.086 0.789 a 2.592 a 0.087 Cu 0.002 a 0.010 0.025 0.014 0.015 0.037 Dato no considerado para la estadística intralaboratorio 0.0800 0.035 0.066 0.020 0.0448 55.9994 0.010 28.053 0.035 52.663 0.011 53.935 Figura. 19. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para S. capricornutum. 2.3 Intercalibración con especies nativas Cladóceros Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 6 7 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Los resultados logrados hasta el momento para las especies de cladóceros D. magna y D. exilis, refieren un buen manejo del procedimiento y confiabilidad analítica, por lo anterior, los valores de toxicidad obtenidos para los compuestos involucrados en esta intercalibración, pueden ser de utilidad para la definición de los ámbitos de sensibilidad de estas especies, lo cual es de especial importancia para poder determinar si además de la consistencia analítica del protocolo, la especie es lo suficientemente sensible para su empleo en el monitoreo ambiental y en la evaluación de contaminantes químicos de interés para nuestro país. Con este fin se efectuó el análisis comparativo de la sensibilidad entre ambas especies de daphnias empleando los valores promedio de los resultados interlaboratorio obtenidos para cada compuesto, cuyos resultados pueden ser observados en la figura 20. El análisis comparativo de la sensibilidad indica diferencias insignificantes entre ambas especies, sobre todo para el cromo, mercurio y cobre; sin embargo, con relación a la CE50 del arsénico, D. exilis resulta significativamente más sensible a sus efectos. Los valores de toxicidad (CE50 mg/L) obtenidos para ambas especies definen el siguiente gradiente de sensibilidad. D. magna D. exilis Hg > Cu > Cr >>>>As Cu > Hg >Cr >>As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Análisis comparativo de la sensibilidad entre de cladóceros. 10.000 1.000 0.100 0.010 Cr+6 Hg+2 As+5 Cu+2 Daphnia magna 0.130 0.021 7.494 0.024 Daphnia exilis 0.103 0.022 2.981 0.018 Figura 20. Análisis comparativo de la sensibilidad de D. magna y D. exilis para cuatro metales pesados. La sensibilidad equivalente o incluso mayor de D. exilis y D. magna, aunada a la consistencia analítica que ha sido evaluada en este estudio, sugiere que D. exilis puede ser una especie adecuada para pruebas de toxicidad con fines de análisis ambiental o para el control de contaminantes químicos solubles de interés para México, sin embargo aún es necesario ampliar la variedad de compuestos tóxicos probados, para así determinar si su potencial de detección o sensibilidad comprende incluso a compuestos orgánicos solubles. Microalgas El análisis de muestras ciegas con A. falcatus fue realizado por el IMTA, con algas proliferadas en medio AAP, como ya se explicó en la sección de selección de especies, para evitar la interferencia de los componentes del medio Bold Basal. Estos resultados fueron comparados con los obtenidos con S. capricornutum. Los resultados obtenidos para ambas especies de microalgas, refieren un buen manejo del procedimiento por parte de dicha institución y una amplia confiabilidad analítica, por lo anterior, los valores de toxicidad obtenidos para los metales involucrados en esta Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) intercalibración fueron de utilidad para la definición de los ámbitos de sensibilidad y la comparación de estas especies. Estos resultados se presentan en la figura 21. El análisis comparativo de la sensibilidad entre ambas especies indica diferencias significativas para el cromo, el mercurio y el cobre, señalando que S. capricornutum es más sensible a estos metales. En el caso del arsénico ambas especies tienen una sensibilidad equivalente que no refiere diferencias significativas. Los valores de toxicidad (CE50 mg/L) obtenidos para ambas especies definen el mismo gradiente de sensibilidad en el que el Cu es el metal que refiere mayor toxicidad, especialmente para A. falcatus cuya CE50 es de solo 0.001mg/L, S. capricornutum A. falcatus Cu > Hg > Cr>As Cu >>> Hg > Cr >As Los resultados anteriores permiten recomendar el uso de A. falcatus en pruebas de toxicidad con fines de análisis ambiental o para el control de contaminantes químicos solubles. Sin embargo, es necesario robustecer el manejo metodológico de forma que un mayor número de laboratorios logren un buen desempeño del protocolo de prueba para poder proceder a la intercalibración del protocolo de prueba con A. falcatus. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Análisis comparativo de la sensibilidad entre de microalgas. 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 Cr+6 Hg+2 As+5 Cu+2 S. capriconutum 0.061 0.034 0.066 0.020 A. falcatus 0.082 0.057 0.059 0.001 Figura 21. Análisis comparativo de la sensibilidad de S. capricornutum y A. falcatus para cuatro metales. Muestras para calibración de protocolo para la generación de extractos y elutriados. Los resultados obtenidos en el análisis de las muestras ciegas sólidas por el CENICA demostró la capacidad de este laboratorio en la generación de extractos y elutriados, ya que en las pruebas de toxicidad con D. magna, D. exilis y S. capricornutum, la muestra resultó no tóxica (ver anexo IV); sin embargo será necesario probar la capacidad de este laboratorio para el manejo de muestras tóxicas, a través de un ejercicio en el que se involucren muestras ciegas con toxicidad conocida. 7. PROPUESTA DE ESTUDIOS Y/O INVESTIGACIONES DE SEGUIMIENTO a. Para el caso de las pruebas con microalgas será necesaria una práctica más intensiva que permita disminuir la variabilidad intralaboratorio que hasta ahora se ha observado. b. La capacidad analítica de los laboratorios participantes y otros más que deseen adherirse a este grupo, debe ser probada al menos una vez al año con ejercicios Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) de intercalibración, que pueden incluir las sustancias ya utilizadas y otras de interés nacional. c. La incorporación de pruebas con otras especies, tanto subrogadas, como presentes en los ecosistemas de México, es necesaria para contar con una batería de pruebas que incluya organismos de al menos tres niveles tróficos, que permitan la identificación de la toxicidad de diversas muestras ambientales y de una amplia variedad de sustancias químicas. d. El desarrollo de baterías de pruebas para suelos y aguas marinas es necesario para poder responder a los problemas de contaminación que se presentan en estos ecosistemas. 8. RECOMENDACIONES a. Llevar a cabo al menos un ejercicio de intercalibración al año con los laboratorios participantes y otros que deseen incorporarse, con las especies utilizadas en este proyecto. b. Comprobar la capacidad del CENICA en el manejo y determinación de la toxicidad de muestras sólidas a través de un ejercicio que involucre muestras ciegas con toxicidad conocida. c. México debe contar con al menos un cepario en el que se mantengan, con estricto control, las cepas necesarias para las pruebas de toxicidad. d. Ampliar el número de laboratorios con capacidad para el desarrollo de pruebas de toxicidad con daphnidos y microalgas de agua dulce y otras. 9. CONCLUSIONES La consistencia de los datos obtenidos por las diferentes instituciones participantes en el ejercicio de intercalibración para la construcción de cartas control indican que los laboratorios se encuentran en un proceso de avance para lograr la óptima capacidad analítica. Asimismo, demuestran la nobleza de los procedimientos analíticos transferidos, ya que estos laboratorios son capaces de generar resultados reproducibles, especialmente para el protocolo de D. magna, D. exilis y en menor medida para S. capricornutum, Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) procedimiento que aún requiere de ajustes metodológicos y de continuidad en su uso para el mejoramiento de capacidades analíticas en los laboratorios participantes Vinculando la información obtenida de la CE50 promedio de los tóxicos de referencia de las cartas control, con los resultados de las muestras ciegas conteniendo a estos mismos tóxicos, se observa que la variación interlaboratorio es del orden del 40% lo cual es aceptable en esta clase de ejercicios de intercalibración en los que un valor del 60% puede aún ser permitido, (Lewis et al., 1994; De Graeve et al., 1990), sin embargo en lo que respecta a la variabilidad intralaboratorio lo deseable es manejarse en una variabilidad <25%, sin embargo en este ejercicio resultó ser mayor al 40% para algunos laboratorios, los cuales deben fomentar un mejor desempeño del protocolo a fin de lograr una replicabilidad y confiabilidad analítica aceptables. Los resultados de la calibración del procedimiento de prueba de D. magna, empleando como organismo de prueba a D. exilis, y el de Selenastrum empleando A. falcatus, indicaron que ambos protocolos son aptos para su uso con las especies alternativas mencionadas, efectuando los ajustes necesarios al protocolo, indicados en este documento. La comparación de las respuestas (CE50) de los organismos de prueba a los distintos metales indica la siguiente escala de sensibilidad: Para cladóceros: D. magna Hg > Cu > Cr >>>>As D. exilis Cu > Hg >Cr >>As Para microalgas: S. capricornutum A. falcatus Cu > Hg > Cr>As Cu >>> Hg > Cr >As Estos resultados indican que la sensibilidad a los metales analizados con las especies de distribución en México, Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus es equivalente a la observada para Daphnia magna y Selenastrum capricornutum, respectivamente, e incluso Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) en algunas ocasiones como el caso del Arsénico y Cu, estas pueden ser mucho más sensibles que las especies subrogadas. Por ello éstas especies pueden considerarse como candidatos adecuados para su empleo en el monitoreo ambiental o de sustancias químicas solubles cuyo control sea de interés para México, sin embargo es necesario ampliar el análisis de su ámbito de sensibilidad al análisis de orgánicos solubles o solubilizadles, a fin de perfilar su ámbito de detección de tóxicos. El manejo de muestras sólidas demostrado por el CENICA fue adecuado, ya que la muestra ciega no debía mostrar toxicidad al ser analizada, y este laboratorio obtuvo el resultado esperado de toxicidad no detectada con las tres especies utilizadas. Sin embargo será necesario continuar haciendo pruebas, especialmente con muestras tóxicas. Los resultados de este proyecto en sus tres fases (2005, 2006 y 2007) demuestran que es factible desarrollar las capacidades necesarias para contar con laboratorios competentes en la evaluación toxicológica de muestra ambientales y sustancias específicas en México, si se cuenta con cepas de organismos y se trabaja en el control de calidad de las pruebas. 10. REFERENCIAS Castillo G. C., Schafer L. 2000. Evaluation of a bioassay battery for water toxicity testing: A Chilean experience. Environ. Toxicol. 15(4): 331-337. Díaz,-Báez, C., Ronco A. yPica-Granados Y. 2004. Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna. En: Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas: estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. Castillo G. (eds.). IDRCIMTA pag. 52-64. Díaz,-Báez, Pica-Granados Y , Sobrero M.C. 2004. Aseguramiento y Control de Calidad de Ensayos de Toxicidad. En: Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Calidad de Aguas: estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. Castillo G. (eds.) IDRC-IMTA pag. 125-140. Pica-Granados, Y.; Trujillo, D.G.; Hernandez, S. H. Bioassay standardization for water quality monitoring in Mexico. Environ. Toxicol. 2000, 15(4), 322-330. Pica-Granados Y., Ronco A. y Díaz,-Báez, C., 2004. Ensayo de toxicidad crónica con Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata). Método de enumeración celular basado en el uso de hemocitómetro Neubauer. En: Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas: estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. Castillo G. (eds). IDRC-IMTA pag. 80-98. Pica-Granados Y. y Trujillo-Domínguez G. 2008. Procedimiento para la Generación de Extractos Orgánicos y Elutriados de Suelos y Sedimentos para su Análisis en Ensayos de Toxicidad. En: Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México, Ramírez Romero P. y A. Mendoza Cantú. (eds.).INE/SEMARNAT. 416 pp. Ramírez Romero P , Pica-Granados Y. y Martínez -Jerónimo F. 2006 . Informe final del Proyecto. Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Segunda etapa. INE-UAM-I-IMTA, 135 pp, Ronco A, Gagnon P, Díaz-Báez M C, Arkhipchuk V, Castillo G, Castillo L E, Dutka B J, Pica-Granados Y, Ridal J, Srivastava R C, Sánchez A. (2002) Overview of results from the WaterTox intercalibration and environmental testing phase II program: Part1, Statistical analysis of blind simple testing. Environ. Toxicol. 17: 232-240. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 11. ANEXOS Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) TALLER DE TRANSFERENCIA DE TECNOLOGIA “ Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas” Proyecto: Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas TERCERA ETAPA 14-15 de junio, 2007. Jiutepec, Morelos, México. UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, UNIDAD IZTAPALAPA Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGÍA DEL AGUA Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) INSTRUCTORES Biól. Homero Hernández Salgado. IMTA I.I.Q. Gissel Trujillo Domínguez. IMTA M.C Yolanda Pica Granados IMTA Dr. Fernando Martínez Jerónimo. IPN INSTITUCIONES QUE FINANCIAN Y COORDINAN EL PROYECTO Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA) Universidad Autónoma Metropolitana., Unidad Iztapalapa. (UAM-I). PARTICIPANTES EN EL PROYECTO DE INTERCALIBRACIÓN: Gerencia de Saneamiento y Calidad del Agua. CNA México D.F. Instituto Mexicano del Petróleo (IMP). México D.F. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa (UAM-I) México D.F Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA) Escuela Nacional de Ciencias Biológica,(IPN). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROGRAMA GENERAL “Taller de Transferencia de Tecnología: Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas”. Tercera Etapa JUEVES 14 Sala de juntas Edificio 9 9:00 – 9:15. Presentación del Taller (Patricia Ramírez Romero) 09:15 – 11:00 Discusión y revisión de resultados de pruebas de avance por parte de los laboratorios participantes (IMP, CNA, y CENICA) 11:00-13:00 Manejo del cultivo de Daphnia exilis, verificación del protocolo (Fernando Martínez Jerónimo, IPN) 13:00-14.15 Comida en el Centro de Capacitación del IMTA. 14:15-14:45 Revisión del protocolo para análisis de toxicidad con algas, con énfasis en el manejo del inóculo de prueba, conteo de pruebas u cultivo (Yolanda Pica Granados, IMTA) 14:45-15:15 Discusión de problemáticas 15:15-16:15. Revisión sobre montaje de cultivos (método de medición de concentración de nutrientes, aforos, conservación de soluciones, inóculo inicial para desarrollo de cultivos (Homero Hernández, IMTA). 16:15-17:15 Preparación de inóculo algal para pruebas de toxicidad con S: capricornutum, así como la generación de criterios sobre manejo y cuantificación de algas con la cámara Neubauer y cálculos. (Homero Hernández, IMTA). 17:15- 18:15 Revisión de procedimientos de prueba con S. capricornutum (Homero Hernández, IMTA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) VIERNES 15 Los participantes se dividirán en equipos para realizar las actividades de medición señaladas 09:00 – 13:00 Equipo 1 Actividades prácticas de conteo algal (asignado 1:30 h) .(Homero Hernández) Equipo 2. Montaje de prueba por parte de los participantes (asignado 1:00 h)(Gissel Trujillo D).. Equipo 3: Calibración de pipetas (Yolanda Pica) 13:00 – 14:00 Comida 14:00 – 14:30 Análisis comparativo de la toxicidad crónica con Ankistrodesmus falcatus vs S. capricornutum (Sandra Luz Guerra, IPN) 14.30-16:00 Conclusiones de las observaciones efectuadas durante la experimentación y desarrollo del taller. 16:00-17:00 Acuerdos sobre continuidad del proyecto Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] el DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROGRAMA CENICA “ANÁLISIS DE MUESTRAS SÓLIDAS” MARTES 13: Laboratorio de Calidad del Agua, Edificio 10 09:00- 9:30am: Bienvenida y presentación del grupo. CENICA 9:30-10:00 . Definición General de la Metodología para análisis en sedimentos. M.C. Yolanda Pica Granados Actividad Práctica 10:00 – 11:00 Domínguez) preparación de muestras para procesamiento. Molido, tamizado (Gissel Trujillo 11:00 -12:30. Preparación y montaje de los sistemas de extracción de fases orgánica y elutriados (Gissel Trujillo Domínguez) 12:30 – 13:30 Centrifugación de elutriados y concentración de extractos orgánicos 13:30 – 14:30 Comida. Comedor IMTA 14:30 – 16:00 Manejo de extractos, transferencia a reservorios y aforo. JUEVES 14 8:30 – 9:00 Retiro de muestras del sistema soxhlet 13:45 – 14:15 Rotovaporación de muestras montadas Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) VIERNES 15 8:30 – 9:00 Vaciado de extractos a viales. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ENSAYO DE TOXICIDAD CRONICA CON Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella Subcapitata). MÉTODO DE ENUMERACIÓN CELULAR BASADO EN EL USO DE HEMOCITÓMETRO NEUBAUER. Yolanda Pica Granados Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Alicia Ronco Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina Maria Consuelo Díaz Báez Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia _______________________________________________________________ Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp. PRINCIPIO DE LA PRUEBA El género y la especie de Selenastrum capricornutum fueron modificados formalmente a Pseudokirchneriella subcapitata (Hindak, 1990), sin embargo, para mantener consistencia con la literatura que la refiere, se empleará en éste procedimiento su nombre original: Selenastrum capricornutum. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Selenastrum capricornutum, es una alga verde (clorofita) unicelular con forma de media luna (Figura 1) y un volumen aproximado de entre 40 y 60 μm3, que puede encontrarse en sistemas acuáticos epicontinentales eutróficos u oligotróficos. Este método puede ser utilizado por sí mismo o como parte de una batería para estimar la potencial fitotoxicidad de aguas dulces superficiales o subterráneas, aguas servidas y otro tipo de muestras líquidas, tales como: eluriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier compuesto puro soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser practicada en laboratorios que cuenten con una infraestructura básica, siendo un ensayo sencillo y de bajo costo. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 1. Microfotografìa de Selenastrum capricornutum Cuando las células son expuestas a muestras que contienen contaminantes tóxicos su reproducción se afecta alterando la tasa de crecimiento de la población de las algas. El efecto de inhibición de la población causada por los agentes tóxicos en una muestra luego de 96 h de exposición, bajo condiciones de temperatura controlada (24 ± 2º C), se determina comparándolo con el crecimiento normal observado en un sistema libre de agentes contaminantes conocido como control. Dependiendo del número de concentraciones y réplicas preparadas para el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (concentración de inhibición media), la LOEC (concentración mínima a la cual se observa efecto) y la NOEC (concentración a la cual no se observa efecto). El protocolo de prueba con el alga Selenastrum. capricornutum presentado en este manual, es una modificación del método estándar publicado por la Agencia de Protección Ambiental de Canadá (Environment Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los cambios introducidos (Blaise et al., 2000) corresponden al uso de volúmenes reducidos (2.6 mL en viales de borosilicato de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) vidrio de 20 mL) y la cuantificación de las células mediante una cámara de conteo (Neubauer) utilizando un microscopio óptico. REACTIVOS, SOLUCIONES Y CULTIVO DEL ORGANISMO DE PRUEBA Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de pureza. Para su preparación se emplea agua destilada en vidrio o Millipore Super Q (USEPA,1992). Medio de cultivo para proliferación de algas (1X) El medio de cultivo se basa en la preparación de una serie de cinco soluciones: la primera de ellas conteniendo micronutrientes y las cuatro restantes con macronutrientes; todas ellas con las concentraciones adecuadas para asegurar un crecimiento óptimo de las algas durante el periodo de incubación. a. Preparación de soluciones Para la preparación de las cinco soluciones stock, rotular cinco frascos de 500 ml (preferentemente material aforado) de la siguiente manera: solución 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente. Agregar 350 ml de agua a cada uno de ellos. Solución 1. Micronutrientes: Se elabora adicionando las diversas sales y soluciones enlistadas en la tabla 1, las cuales deberán agregarse al frasco de 500mL etiquetado como solución 1. micronutrientes, en el orden fijado en dicha tabla sin alterar la secuencia de adición ya que se formarán precipitados difíciles de solubilizar. Asegúrese que antes de adicionar el siguiente compuesto químico o solución las sales se encuentren completamente disueltas. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Para la preparación de las soluciones de cloruro de zinc, cloruro de cobalto, molibdato de sodio y cloruro de cobre, emplear 5 frascos de 100 ml de capacidad, que deben ser previamente etiquetados con el nombre de cada compuesto químico disuelto. En el caso del cloruro de cobre se etiquetan dos frascos, diferenciándolos con los números I y II. Posteriormente seguir las instrucciones que se señalan a continuación. Tabla 1. Reactivos utilizados en la preparación de solución de micronutrientes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Compuesto Fórmula Masa en gramos (g) o Volumen (mL) de solución stock Cloruro de Magnesio Cloruro de Calcio Ácido Bórico Cloruro de Manganeso Cloruro de Zinc (solución) Cloruro Férrico Cloruro de Cobalto (solución) Molibdato de Sodio (solución) Cloruro de Cobre (solución) Etilen diaminotetracético: sal disódica MgCl2·•6H2O CaCl2·•2H2O H3BO3 MnCl2·•4H2O* ZnCl2* FeCl3·•6H2O* CoCl2·•6H2O* Na2MoO4·•2H2O CuCl2·•2H2O Na2EDTA·•2H2O 6.08 2.20 0.0928 0.208 1 mL de la solución 0.0799 1 mL de la solución 1 mL de la solución 1 mL de la solución 0.150 * Estos compuestos pueden ser sustituidos por sulfatos. Por ejemplo, ZnCl2 o ZnSO4. Si así se hiciera, recalcular estequiométricamente las masa a utilizar. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Solución de cloruro de zinc Verter en el frasco 70 ml de agua, agregar luego 164 mg de cloruro de zinc (ZnCl2). Llevar a volumen final de 100 mL con agua y mezclar bien. Solución de cloruro de cobalto Verter en el frasco 70 mL de agua, agregar 71.4 mg de cloruro de cobalto (CoCl2•·6H2O). Llevar a volumen con agua hasta completar 100 mL y mezclar bien. Solución de molibdato de sodio Verter en el frasco 70 mL de agua, luego agregar 363 mg de molibdato de sodio (Na2MoO4·•2H2O). Finalmente completar el volumen hasta 100 mL con agua y mezclar bien. Solución de cloruro de cobre Verter 70mL de agua en dos de los frascos de 100 mL; en el primero de ellos agregar 60.0 mg de cloruro de cobre (CuCl2·• 2H2O), luego llevar a volumen de 100 mL con agua y mezclar bien. Una vez lista esta primera solución de cloruro de cobre, tomar 1 mL, verter en el segundo frasco y completar el volumen de 100 mL con agua;1 mL de esta segunda solución es el que se emplea para la preparación de la solución núm.1 de micronutrientes. Después de haber agregado todos los componentes al frasco de la solución núm. 1 de micronutrientes, llevar a volumen de 500 mL con agua (Tabla1). Soluciones de Macro-nutrientes: Adicionar en los frascos respectivos de 500mL restantes las cantidades de las sales indicadas a continuación (Tabla 2). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tabla 2. Reactivos utilizados en la preparación de solución de macro-nutrientes Frasco Compuesto Solución 2 Nitrato de Sodio Solución 3 Sulfato de Magnesio Solución 4 Fosfato de Potasio Solución 5 Bicarbonato de Sodio Fórmula Masa (g) NaNO3 MgSO4·•7H2O 25.5 14.7 K2HPO4 1.044 NaHCO3 15.0 Mezclar bien hasta disolver y, posteriormente, adicionar agua hasta alcanzar el volumen de 1 000mL en cada uno de los recipientes. Las soluciones stock pueden ser conservadas refrigeradas (sin congelar) durante dos meses. Este medio de proliferación también puede ser empleado para otras especies de algas tales como Ankistrodesmus sp, Scenedesmus sp, entre otras. Por cada litro de medio de cultivo que se desee preparar, se adiciona en agua destilada 1 mL de cada una de las cinco soluciones en forma ordenada. Así, se debe iniciar con la 1 hasta terminar con la 5, llevando a volumen de 500 mL al finalizar. Se sugiere no alterar el orden de adición de las soluciones ya que se pueden formar precipitados difíciles de eliminar. Mezclar bien después de la adición de cada solución. Al final, el pH del medio deberá ser 7.5 ± 0.1, por lo que es necesario ajustarlo, ya sea con NaOH o HCl 1 N. Inmediatamente, filtrar el medio bajo condiciones asépticas (mechero o campana de flujo laminar) a través de una membrana de éster de celulosa de 0.22 µm de abertura de poro y 47 mm de diámetro. El sistema de filtración y el matraz de captación deben estar estériles. Para la filtración se puede utilizar una bomba de vacío. El medio nutritivo esterilizado se inocula con las algas. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) b. Cultivo y propagación de las algas La inoculación se realiza bajo condiciones de esterilidad ya sea mediante el trabajo cerca de un mechero, o utilizando una campana de flujo laminar. El cultivo se puede iniciar a partir de cepas mantenidas en medio sólido tomando las células con un asa y esparciéndolas en el medio nutritivo líquido, o a partir de un cultivo líquido de algas que haya alcanzado la fase estacionaria y tenga una densidad celular entre 1 y 3 millones de células/mL. Cuando los cultivos alcanzan esta densidad se caracterizan por presentar un color verde intenso, que se logra entre los cinco y siete días después de la inoculación. En el caso que se seleccione esta última opción, se debe tomar 50 mL del cultivo por cada litro de medio estéril. El medio inoculado, se coloca a 24°C ± 2°C dentro de una cámara con iluminación superior a 2 000 lux, manteniendo aireación permanente. En el caso que no se cuente con el sistema de iluminación se puede utilizar un sistema similar al presentado en el Anexo de este protocolo. Para la aireación, se puede emplear una bomba de aire para acuarios, o se utiliza directamente el aire de la línea del laboratorio. En este último caso, se debe eliminar las impurezas intercalando filtros entre la fuente y el recipiente de cultivo. Los filtros permiten mantener condiciones axénicas, y eliminan las partículas sólidas o líquidas (polvo del aire, emulsiones de aceite, etc). Existen filtros especiales disponibles en el mercado de artículos para laboratorio, en el caso de no contar con ellos puede fabricarse en el laboratorio, empacando carbón activado y lana de vidrio. La manguera se conecta a un tubo hueco de vidrio o a una pipeta despuntada previamente esterilizados. El tubo se introduce en el medio inoculado cuidando de que el extremo llegue cerca del fondo del recipiente para que el burbujeo evite la formación de depósitos de algas. El extremo opuesto, se conecta a la manguera, y deberá sobresalir del recipiente; para ello, se fija a la boca de la botella de cultivo con un tapón estéril. Una vez que el cultivo alcanza la fase estacionaria (cinco a siete días), se retira de la cámara de incubación y se deja reposar a 4º C. Esto puede hacerse en el refrigerador o en el interior de un cuarto frío, bajo condiciones de oscuridad de 48 a 72 h. El cultivo sedimentado es separado del sobrenadante por decantación, lo cual permite obtener el concentrado de algas que se utilizará en las pruebas de toxicidad, o en la alimentación de otros organismos como es el caso de Daphnia magna. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Reactivación de algas inmovilizadas Alternativamente al mantenimiento de un cultivo de algas, algunos laboratorios mantienen las algas inmovilizadas sobre alginato en la forma de perlas, las cuales pueden conseguirse comercialmente. En este caso, cuando se van a realizar pruebas de toxicidad, es necesario liberar las células de la matriz de alginato, para lo cual se sigue el procedimiento que se describe a continuación. Para la desinmovilización, se toman entre 10 y 12 perlas con algas asegurándose de que estén libres de medio líquido. Se transfieren a un tubo cónico de 50 mL, se adiciona 5 mL de citrato de sodio 0.1 M, y se sella el recipiente. A continuación se agita vigorosamente durante treinta segundos, repitiendo el procedimiento cada dos minutos hasta que la matriz se haya disuelto completamente (de veinte a treinta minutos). Con ayuda de un agitador o vortex (a intensidad moderada), se puede reducir el tiempo de proceso a cinco minutos. Una vez disueltas las perlas, centrifugar a 3 000 rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante, conservar las algas sedimentadas, resuspender las células en 5 mL de la solución amortiguadora utilizada para las pruebas (0.15 mg NaHCO3/L). Medio nutritivo enriquecido (18X) para las Pruebas de Toxicidad Este medio se prepara a partir de las soluciones 1, 2, 3, 4, y 5 empleadas en la elaboración del medio nutritivo para la proliferación de algas. Para la preparación se recomienda utilizar un recipiente aforado de 1 L debidamente rotulado. Se coloca 800 mL de agua a los cuales se adiciona 18 mL de cada una de las soluciones ordenadamente como ya se indicó. Terminada la adición de las soluciones, llevar a volumen con agua destilada y ajustar el pH a 7.5 ± 0.1 con NaOH o HCl 1 N. Solución amortiguadora para las Pruebas (15 mg NaHCO3/L) Para su preparación se toma un matraz aforado de 1L y se coloca 900 mL de agua destilada, se adiciona 1 mL de la Solución 5 empleada anteriormente, se mezcla y se completa a volumen. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Medio sólido para mantenimiento de las cepas Disolver 1 g de agar-agar en 100 mL del medio nutritivo para desarrollo de Selenastrum capricornutum, y llenar con medio los tubos de ensayo hasta la mitad de su volumen. Cerrar los tubos y esterilizar en autoclave u olla de presión a 120° C, 15 lb durante quince o veinte minutos. Al término del período, sacar los tubos, apretar sus tapas y dejar enfriar en posición inclinada hasta que el medio se solidifique. El medio sólido puede conservarse en refrigeración hasta por un mes. Inoculación de las algas en medio sólido Bajo condiciones de esterilidad, transferir con un asa bacteriológica las algas cultivadas en medio sólido al tubo con medio fresco, esparciendo las células en estría sobre la superficie del medio. La inoculación se inicia en zona más profunda del tubo, y se continúa hacia el exterior. Una vez inoculado los nuevos medios, incubar a 24 ± 2 ºC, con iluminación continua e intensidad de luz superior a 2 000 lux por un periodo entre 48 y 72 h. Cuando se observe crecimiento se retiran los tubos de la cámara y se almacenan en oscuridad a 4 ± 2 ºC. Bajo estas condiciones, las algas continuarán creciendo pero de forma lenta. MATERIALES Y EQUIPOS Materiales • • Pipetas de vidrio graduadas (5 y 10mL) Pipeta automática de 100µL con puntas estériles Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) • • • • • • • • • • • Pipeta automática de 100-1 000 µL con puntas estériles Viales de centelleo de vidrio borosilicato claro de 20 mL de capacidad Papel (film) transparente Cámaras de iluminación (ver en Anexo 1, como opción, un diseño de cámara para pruebas Gasa y algodón Tubo de vidrio o pipeta de vidrio despuntada Manguera de acuario Botellas de 1L o matraces aforados de igual capacidad 5 Botellas de 500 mL o matraces aforados de igual capacidad 6 Botellas de 100 mL o matraces aforados de igual capacidad Recipiente de vidrio claro para cultivo de boca angosta, preferentemente esterilizable, de 10-20L de capacidad • Asas bacteriológicas • • • • • Tubos de centrífuga (opcional) Tubos de cultivo con tapa de rosca. Tubos de centrífuga de 50 mL, plásticos con tapa de rosca y estériles (opcional) Hemocitómetro o Cámara Neubauer (ver en punto 4.5.6, indicaciones de manejo) Matraz de Filtración de 4L EQUIPOS • Microscopio óptico con aumento de 100x • Potenciómetro • Balanza Analítica • Bombas de acuario • Bomba de vacío • Sistema de filtración • Mechero o Campana de flujo laminar • Centrífuga (opcional) • Base de agitación o Vortex (opcional) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROCEDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE LA PRUEBA Preparación del inóculo de algas para desarrollo de pruebas Conocido el número células presentes en el inóculo mediante cámara de Neubauer, se debe hacer una dilución con el fin de obtener en cada vial de prueba una concentración inicial de 10 000 células./mL. Como el volumen final en cada vial incluyendo el inóculo es de 2.6 mL (Figura 2), se prepara 2 mL de una suspensión de algas que contenga 2.6 x 106 células/mL de la siguiente manera: Factor de dilución (FD) = Número células./mL en el concentrado/2.6x106 células./mL. Volumen (mL) del cultivo de algas para 2mL = 2mL / Factor de dilución Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 1. PREPARACION DE INOCULO Conteo del número de células por microscopía óptica con cámara Neubauerl Dilusión del cultivo para obtener 2mL 6 con 2.6 x 10 células Cultivo de S. capricornutum de 4 a 7 días en desarrollo de fase exponencial Adición de 18ml de medio de enriquesimiento 2. PREPARACION DE Inóculo con 5 2.6 x 10 células CONTROL 2.5mL agua moderadamente dura 5mL Muestra 2.5 mL buffer Transferencia secuencial de 2.5mL Mezclar Mezclar Mezclar Mezclar Descartar 2.5 mL REPLICA 1 REPLICA 2 Av. SanREPLICA Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y 3 Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613Agregar 3662 y10µL 5804 4600 Ext. 2592 a cada celdilla Correo electrónico [email protected] 100 50 % 3. DESARROLLO DE PRUEBA 25 12.5% 6.25% DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 2. Esquema del procedimiento de prueba con S. capricornutum La preparación del inóculo que será utilizado en las pruebas debe provenir de un cultivo en fase exponencial. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de un celda de conteo o Cámara de Neubauer. La densidad celular del cultivo se obtiene para poder calcular el factor de dilución necesario para asegurar una concentración de 2.6 millones de células por mililitro (2.6 x 106 células./mL) en un volumen de 2 mililitros. Con el fin de ilustrar este cálculo se presenta el siguiente ejemplo: 1. Cálculo del factor de dilución (FD): FD = No. de células./mL en el cultivo algal / 2.6 x 106 células. /mL Si la concentración de células por mililitro en el cultivo fue de 2.9 x 106 células./mL, entonces: FD = 2.9 x 106 células/mL / 2.6 x 106 células/mL = 1.115 2. Cálculo del volumen de cultivo de algas en 2 mL (V): V (mL) = 2mL / Factor de dilución Sustituyendo en el ejemplo, el volumen de cultivo en 2 mL será: V (mL) = 2mL / 1.115 = 1.79 mL El resultado indica que deberá tomarse 1.79 mL del concentrado de algas y adicionar solución amortiguadora hasta completar un volumen de 2mL. Esta dilución se puede realizar en tubos cónicos de centrífuga de 50 mL con ayuda de una pipeta automática. Los 2 mL tendrán una concentración de algas de 2.6 x 106 células./mL, la cual nuevamente se diluye adicionando 18 mL del medio nutritivo enriquecido (18x) para tener una densidad final de 2.6 x 105 células/mL . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Método de dilución de muestras Se recomienda que el sistema experimental incluya las diluciones de la muestra problema, así como las correspondientes al control positivo que contiene al tóxico de referencia y una serie de cinco viales que serán de utilidad como control o control negativo (ver Aseguramiento y control de calidad de bioensayos). Los cinco viales rotulados como control (C1 hasta C5) deben llenarse solo con 2.5 mL de la solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). Para el caso de las muestras problema o de control positivo, se requiere por lo menos 15 viales de borosilicato de vidrio de 20 mL similares a los utilizados en contadores de centelleo (Arensberg et al.,1995) organizados en series de 5 viales cada una. Cada serie constituye una réplica. Se rotulan los viales de la primera serie de la siguiente manera: P1, Q1, R1, S1, y T1, la segunda, deberán rotularse de la misma forma pero con el subíndice 2, y la tercera con el subíndice 3. En los viales rotulados P1, P2, y P3 se colocan 5mL de solución más concentrada de la muestra (100%). Los restantes viales se utilizarán para la preparación de las diluciones seriadas de la muestra (ver figura 2). Para iniciar el proceso de dilución de la muestra, en cada uno de los viales restantes se coloca 2.5 mL de solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). A continuación, se transfiere 2.5 mL de la muestra (100%) del vial rotulado como P1 al vial Q1, la concentración en este vial corresponde a la primera dilución 1:2 o 50% (v/v). Se mezcla y se continúa el proceso tomando 2.5 mL del vial Q1 y pasándolo al R1 en cual se tiene la segunda dilución 1:2 y una concentración de 25% (v/v), y así sucesivamente hasta llegar al vial T1 , como al finalizar en el vial T1 se tiene un volumen de 5mL se toman 2.5 mL y se descarta. Se sigue el mismo procedimiento para las series 2 y 3 y al finalizar el proceso de dilución, se mezcla el contenido de cada uno de los viales del sistema de prueba. Terminado el proceso de dilución de la muestra, se procede a adicionar 100µL del inóculo de algas anteriormente preparado y cuya concentración es 2.6 x 105 células/mL, a cada uno de los viales de la prueba. La concentración final de las algas en cada uno de los viales será 10 000 células/mL. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Se colocan los viales en la cámara con iluminación fluorescente (luz blanca fría), con una intensidad luminosa entre 60-80 µE/m2s (aproximadamente 4 000 lux). Anexo al presente se presenta el diseño y procedimiento de elaboración de un modelo piramidal de cámara que puede ser construido con materiales de bajo costo y permite que en toda el área se tenga una distribución homogénea de luz. Tabla 3. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con S. capricornutum 1. Tipo de Ensayo 2. Temperatura 3. Calidad de Luz 4. Intensidad Luminosa 5. Fotoperíodo 6. Volumen del Recipiente 7. Volumen de la Solución de Prueba 8. Edad del Cultivo usado como Inóculo 9. Densidad Celular Inicial 10. Número de Réplicas 11. Velocidad de Agitación 12. Agua de Dilución 13. Factor de Dilución 14. Duración de la Prueba 15. Efecto Medido 16. Resultado Final 17. Aceptabilidad de los Resultados 18. Control positivo Estático 22 ± 2°C Fluorescente, blanco-frío 60-80 μE / m2/ s (4 000 ± 10% lux) Iluminación continua Viales de 20 mL 2.6 mL 4 a 7 días 104 células/mL Tres Manual, discontinua Solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L) 0.3 ó 0.5 96 h Crecimiento (conteo) IC50 Densidad celular en el control >500,000 cél/ml Cu(II) a partir de una solución de Cu SO4 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) La incubación de los viales se lleva a cabo durante 72 h. Si no se cuenta con un sistema de agitación orbital, se debe hacer agitación manual de cada uno de los viales tres veces durante el día. La agitación contribuye a promover el adecuado desarrollo de la población de las algas. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta en la Tabla 3 y en las Figuras 2 y 3. Diagrama de flujo ensayo S. capricornutum Cultivo de S capricornutum en medio sólido Subcultivo en medio líquido 3 días, 24°C, 100rpm Sustancias Tóxicas Subcultivo en medio líquido 3 días, 24°C, 100rpm Preparación de Diluciones Inóculo BIOENSAYO No. Células/mL Inicial pH inicial Registro de Datos No. Células./mL diaria (72 h) pH final Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] Cálculo de la Biomasa % de Inhibición DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 3. Ensayo de toxicidad crónica con S. capricornutum Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ANÁLISIS DE DATOS Al finalizar el tiempo de exposición se inicia el conteo del número de algas en cada vial. Para el conteo se toman entre 20 a 50 µl de la suspensión con ayuda de una pipeta automática, y se coloca en la celda de conteo o la cámara Neubauer. La cuantificación se efectúa siguiendo el método de manejo recomendado para este tipo de celdas, y que se describe más adelante. Conocidos los recuentos del número de algas, se procede a establecer el porcentaje de inhibición (% I) en cada una de las diluciones, el cual se cuantifica de la siguiente manera: % I = 100 – [(promedio céulasl/mL de las réplicas en la dilución / promedio células/mL de las réplicas del control)] x 100 Conteo con la Cámara Neubauer La cámara Neubauer, también conocida como hemocitómetro, consta de un cubre-objetos de cuarzo y un porta-objetos de un grosor mayor a los de uso común (Figura 4). En la parte superior del porta-objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña (Figura 4. A-B) (UNAM, 1986). Usando el objetivo de 10x de un microscopio óptico, se enfoca de forma que en el campo se cubra un cuadrado cuya área corresponde a 1 mm2, generalmente se trabaja con el cuadro central. El área del cuadro central es de 1mm2 y se encuentra subdividida en 25 cuadrados. Cada uno de estos cuadrados mide 0.2 mm de lado, por lo que el área de cada uno será 0.04 mm2 (Figura. 4. C) Al colocar el cubre-objetos sobre el porta-objetos se tiene una profundidad de 0.1mm de forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes será 0.1 mm3 (1.0 mm2 x 0.1 mm = 0.1 mm3). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma: • • • • • • • • • • Limpiar con papel de arroz la cámara de Neubauer. Colocar el cubre-objetos sobre los canales tal como se indica en la Figura 4. Agitar manualmente el frasco con la solución de algas a evaluar hasta observar coloración homogénea o disolver los agregados celulares. Con ayuda de una pipeta serológica de 1mL o con una pipeta automática de 100µL tome 0.1 mL de la suspensión de algas y colocando la punta de la pipeta en el borde del cubre-objetos dejar que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que ella pase a los canales laterales (Figura 4.D). Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la cámara previamente. Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x. Localizar el cuadro central de la rejilla de 25 cuadros de 0.04 mm2, hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar las células que se encuentran sobre el mismo (Figura 4.C). Contar el número de células en el cuadrado central tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. Para obtener resultados más exactos se recomienda tener un conteo entre doscientas y trescientas células por muestra. Cuando en el cuadro central existen menos de doscientas células, es necesario revisar más cuadros para el conteo. Se sugiere continuar el conteo en los cuatro cuadros que forman las esquinas de la cuadrícula. Si aún así no se alcanza las doscientas células, se debe contar el total en los 25 cuadros. Anotar el número de cuadros contados. En caso opuesto, en que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final. Determinación de la densidad celular La densidad celular de la suspensión de algas se calcula de la siguiente forma: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 1. En caso de haber empleado los cuadrantes de 0.04 mm2 : No. células en 0.1 mm3 = No. total células contadas / No. cuadros 0.04 mm2 Esto dará el número total de células por 0.1 mm3 (volumen obtenido de multiplicar el área de 1mm2 x 0.1mm profundidad de la cámara). El número de células por mL, se obtendrá de multiplicar el valor obtenido anteriormente por 10000. No. células por mL = No. células en 0.1 mm3 x 10 000 2. En caso de haber empleado los cuadrantes de 1 mm2 : Núm. células en 0.1 mm3 =Núm. total células contadas / Núm. cuadros 1 mm2 en conteo Este valor corresponderá al número total de células en 0.1 mm3. Para obtener el número por mL, se multiplica por 10 000. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Cámara A Neubauer B 1 mm Canal transversal Canales longitudinales C 1 mm Colocar cubreobjeto 2 3 1 5 4 0.2 Conteo por cuadrantes Adicionar 0.01mL mL de solución algal Figura. 4. Conteo Celular mediante la utilización de la Cámara de Neubauer Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) REFERENCIAS Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N., 1995. A. Miniscale Algal Toxicity Test . Chemosphere, 30:2103-2115. Blaise C., Forget, G. & Trottier, S., 2000. “Toxicity Screening of Aqueous Samples Using a Cost-Effective 72-hour Exposure Selenastrum capricornutum Assay. Environ Toxicol., 15:352-359. Environment Canada. 1992. Biological Test Method: Growth Inhibition Test Using the Freshwater alga Selenastrum capricornutum. Environmental Protection Series EPS 1/RM/24. Hindak, F., 1990. “Studies of the Clorococcal Aalgae (clorophyta)”, V. Biologicke Prace (Slovenskej Akademic Vied), Bratislava, 36:1-225 UNAM, 1986. “Biología Celular”. Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. pp. 20-28 U.S EPA. 1992. Short -term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms. EPA-600/4-91-022. 3th ed. Philip L ewis, A., L.; Klem, D.. J. & Lazorchak, J. M. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Construcción de Una Cámara de Iluminación Casera para el Ensayo de Toxicidad con S. capricornutum Homero Hernández Salgado Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Patente en registro _______________________________________________________________ Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp. MATERIALES • • • • • • • • • • • • Dos Pliegos de papel empleado para construcción de maquetas, color blanco, rígido y resistente (ej. cascarón), de aproximadamente 1.40 x 0.60 m. Cinta adhesiva de 5 a 7 cm ancho Tijeras o navaja Papel aluminio Carrete de hilo nylon Marcador indeleble color azul o amarillo Guantes de látex Embudo de tallo largo de plástico transparente o vidrio de 10.5cm de abertura de boca y 10 de fondo 30 cm de alambre de 1mm de diámetro extensión eléctrica Socket para foco con entradas para clavija de conexión Bombilla de luz halógena fría 20W/11-860-120V.-350mA, 1 155 lumen 50/60Hz, de triple foco (ej. Osram Dulux) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) • Conexión para anterior Preparación de la pantalla de iluminación De los pliegos de papel para construcción, cortar cuatro triángulos de 60cm por lado, posteriormente cortar una de las esquinas de tal forma que se obtenga un polígono de 60 cm de base por aproximadamente 57cm de altura. (Figura 5. A) Forrar con papel aluminio los primeros 20 cm de la base de cada triángulo a manera de banda, la cual quedará en el interior de la cámara una vez armada (Figura 5. B). Formar la cámara uniendo los triángulos por sus lados, para estructurar una pirámide trunca en su punta (Figura 5. C) con ayuda de la cinta adhesiva. Pegar por la parte exterior. Colocación del sistema de iluminación a. Sistema de filtrado A 20cm de la boca superior introduzca en una esquina hilo nylon resistente y cruce a la esquina opuesta, repita la operación en otra de las esquinas de tal forma que se forme una cruz o red de soporte (Figura 6. D). Trozar el tallo del embudo hasta su base. Cortar el guante de cirujano conservando la banda de aproximadamente 8cm de la muñeca del mismo. Eliminar el resto. Colocar la banda de látex, obtenida del guante de cirujano, en la boca del embudo sin tallo, de forma que cubra solo 5 cm, y dejar un espacio traslúcido de 5 cm (Figura 6. D). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Enderezar el alambre y enrollar uno de los extremos de tal forma que se fije en el interior del embudo. Introducir el alambre por el orificio dejado por el tallo del embudo. Dar un espacio de 5cm, y en el extremo saliente formar un gancho (Figura 6. D). Colgar el embudo del centro de la red de sostén (Figura 6. E). Colocación de lámpara Atornillar la bombilla de luz halógena de triple barra en el porta-lámpara correspondiente. Introducir el sistema por el interior de la pirámide de tal forma que la rosca del portalámpara salga por la punta de la pirámide. Tomar la conexión múltiple y enroscar al resto del sistema por el exterior. Esto dará estructura y soporte a la lámpara (Figura 6. E). a. Base de la cámara Cortar un cuadrado de papel para construcción de 62 cm2. Forrar una cara con papel aluminio. Ubicar el centro del cuadrado y en torno a él dibujar un cuadrado de 10cm, después marcar dos más de forma concéntrica, el primero de 40 cm por lado y el segundo de 60 cm por lado (Figura 6. F). Trazar líneas diagonales con el marcador, en la banda que se forma entre el cuadrado 1 y 3. El área marcada señalará la zona donde siempre deberán ser colocados los viales de prueba dentro de la cámara. En esta banda, bajo el diseño antes mencionado, la iluminación será homogénea proporcionando una intensidad luminosa de entre 2 800 y 3 000 lux. El borde del recuadro 3 es el sitio donde la pantalla de la cámara de iluminación deberá ser colocada (Figuras. 6. F y 7. G). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Preparación de la Pantalla Vista Lateral 2.5 cm 2.5 cm A B cm cm 60 cm cm 60 60 60 20 cm 57 cm 60 cm Papel Aluminio 60 cm Vista interior C 60 cm 60 cm Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 5. Preparación de pantalla de iluminación Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Sistema de filtrado de luz D 5 cm de alambre Colocación de la lámpara Extensión eléctrica Socket para foco con entradas para clavija de conexión Cono de vidrio Cubierta de látex E 10 cm Socket para bombilla de luz fría, halógena 5 cm Bombilla de luz fría, halógena 10.5 cm Base de la cámara Forro de aluminio 3 2 F 1 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, Area5613 de 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] iluminación 10 cm 10 cm 40 cm 10 cm Borde de unión para la pantalla DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 6. Colocación de sistema de iluminación Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) G Socket para foco con entradas para clavija de conexión Extensión eléctrica Socket para bombilla de luz fría, halógena Bombilla de luz fría, halógena 20 cm Alambre Red de sostén 5 cm Trampa de luz 20 cm Forro de aluminio Area de iluminación homogénea Figura 7. Vista tridimensional de la cámara de iluminación Sugerencias Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Cambiar la lámpara de iluminación de triple barra de forma regular, cada 45 días si es que el uso es continuo, o calcule las horas de uso equivalentes. El cambio debe efectuarse ya que el brillo de la lámpara tiende a disminuir con el uso reduciendo la intensidad luminosa, lo que puede reducir significativamente el crecimiento de las algas durante el desarrollo de pruebas ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON DAPHNIA MAGNA Maria Consuelo Díaz Báez Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia Yolanda Pica Granados Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Alicia Ronco Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PRINCIPIO DE LA PRUEBA Dentro del grupo de cladóceros, las especies del género Daphnia son las más utilizadas como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogenética (lo cual asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de toxicidad, a nivel universal. El género Daphnia se ubica dentro del orden cladócera de la clase crustácea, y especies como Daphnia magna, Daphnia pulex, y Daphnia similis, son utilizadas extensivamente en pruebas de toxicidad, por lo cual existe una extensa información sobre las técnicas de cultivo, los requisitos de temperatura, luz y nutrientes, así como su respuesta a muchos tóxicos. Específicamente, los ensayos de toxicidad con Daphnia magna (figura 1), permiten determinar la letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua de poro de sedimentos, entre otros. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 1. Vista general de Daphnia magna En las pruebas de toxicidad con D. magna, neonatos menores de 24h de edad son expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un perÍodo de 48h, al término del cual se cuantifica el número de organismos muertos. Con estos resultados se establece la proporción o porcentaje de mortalidad producida. Materiales, Reactivos y Equipos Material Biológico Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Las hembras partenogenéticas de D. magna pueden obtenerse directamente de compañías proveedoras de materiales biológicos, quienes certifican la especie. También pueden ser obtenidas de otras fuentes como laboratorios especializados donde se llevan a cabo pruebas de toxicidad con este cladócero o por medio de su recolección en campo; en estos casos la especie deberá ser taxonómicamente identificada. Materiales de laboratorio • • • • • • • • • • • • • • • • • Acuarios de 3 L de capacidad. Vaso de precipitado de 2 000, 1 000 y 600 mL. Pipetas volumétricas y graduadas de 1, 2, 5, 10 y 20 mL. Matraz aforado de 100 mL. Pipetas pasteur y bulbos de latex Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL, peras para pipetas Pipetas automáticas de 250, 500 y 1 000 μL; puntas para micropipetas. Recipientes plásticos de 30, 50mL, 100 mL Papel aluminio. Garrafón o bidón de 20 litros Manguera delgada para bombas de acuario. Matraz Kitasato de 2 L. Platos para pesar reactivos. Espátulas Hielera y hielo o geles refrigerantes. Papel parafilm Tubos de ensayo Reactivos • • • NaHCO3 MgSO4 KCl Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) • • • • • • • CaSO4.•2H2O Biotina Tiamina Vitamina B12 Na2SeO4 K2Cr2O7 Agua deionizada o destilada Equipos • Microscopio Estereoscópico • Balanza Analítica • Plancha de Agitación con magneto. • Bombas para acuario • Controlador de temperatura ambiente (equipo de aire acondicionado u otro). • Refrigerador (4 ± 2 °C) • Bomba de vacío • Mechero de Bunsen • Autoclave o equivalente • Medidor de oxígeno disuelto • Potenciómetro • Tituladores para dureza y alcalinidad. • Termómetro. • Sistema purificador de agua (deionizador, sistema Milli-Q) o una fuente de abastecimiento de agua destilada. • Centrífuga CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE LOS ORGANISMOS DE PRUEBA Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Los cultivos de D. magna pueden mantenerse en recipientes de uno, dos o tres litros, o cualquier otro sistema que resulte funcional. Con el fin de mantener condiciones óptimas para el crecimiento de los individuos, se recomienda mantener una densidad poblacional de no mayor de 12 individuos por litro. Los organismos se mantienen en agua reconstituida con una dureza entre 160 y 180 mg CaCO3 /L. El agua se prepara en el laboratorio (APHA,1998), y puede suplementarse con una solución de vitaminas y selenio, cuando se detecten problemas en la reproducción, o se presente una alta mortalidad entre los 14 y 21 días por malformación de las antenas (figura. 2). Ojo Corazón Antenas Ovario y Bolsa incubatriz Intestino Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 2. Principales rasgos morfológicos de Daphnia magna Los cultivos se mantienen a una temperatura de 21 ± 2ºC, un fotoperíodo aproximado de 16 h luz /8 h oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux (ver condiciones en tabla 1). Agua dura reconstituida (APHA,1998): Para su preparación se recomienda colocar en un garrafón: 19L de agua deionizada o destilada, y adicionar 2.4 g de MgSO4, 3.84 g de NaHCO3 y 0.16 g de KCl. Agitar hasta disolver completamente las sales. Paralelamente, disolver 2.4 g de CaSO4 •2H2O en 1L de agua deionizada o destilada. Es necesario tener en cuenta que la disolución de esta sal puede requerir un período de tiempo prolongado. Terminada la solubilización de la sal, incorporar la solución de CaSO4•2H2O al garrafón, lo cual permitirá obtener 20L de agua dura reconstituida. Suplementos (adicionar solo en caso de un crecimiento deficiente del cultivo): Cuando se determine la necesidad de suplementar el agua dura, debe prepararse por separado las soluciones de Biotina, Vitamina B12, Tiamina y Selenito de Sodio (Na2SeO4 ) (Elendt & Bias,1990), de la siguiente forma: Solución de Biotina: Solución de Vitamina B12 Solución de Tiamina: Selenito de Sodio (Na2SeO4): 0.0075 g/L 0.010 g/L 0.075 g/L 0.010 g/L Tabla 1. Resumen de las Condiciones Recomendadas para el Mantenimiento de Cultivos de Daphnia magna Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Temperatura Calidad de Luz Intensidad Luminosa Fotoperíodo Recipientes Mantenimiento Alimentación Dosis de Alimento 21 ± 2oC Fluorescente, blanco-frío ≤ 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido 16 horas luz - 8 oscuridad de Los cultivos se mantienen en recipientes de 2L de vidrio transparentes, y deben permanecer tapados Cultivos puros de Selenastrum capricornutum u otras algas verdes unicelulares. La cantidad de alimento suministrada se calcula de la siguiente manera: V= A x B / C donde: V= volumen a ser adicionado A= número de organismos B= número de células por daphnia (1.5 x106 células por daphnia /día) C = densidad celular de la suspensión algal El alimento es suministrado diariamente. Suplemento Alimenticio Densidad Poblacional Limpieza Los cultivos pueden suplementarse con las soluciones de vitaminas y selenito. No mayor de 12 individuos/L Diariamente se debe retirar las exubias (mudas) y los restos que se encuentren en el fondo de los recipientes. Cada viernes se cambia el agua de los Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) acuarios que deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua desionizada. No se debe emplear jabón ni otros detergentes. Recolección de Neonatos Diariamente se retiran los neonatos con una pipeta Pasteur de plástico con una abertura lo suficientemente ancha para no ocasionar daños a los neonatos. Las soluciones preparadas se deben mantener refrigeradas (4°C ± 2), y pueden almacenarse por un período de hasta seis meses. Para un volumen de veinte litros de agua dura reconstituida, se adicionan los siguientes volúmenes de cada una de las soluciones: tiamina (20 mL), vitamina B12 (4 mL), biotina (2 mL), y selenito de sodio (4 mL). Una vez terminada la preparación del agua reconstituida, se mide el pH, el cual deberá oscilar entre 7.6 y 8.0. Posteriormente, se airea el líquido de forma permanente hasta el momento de su uso (mínimo 24 h). El aire utilizado debe estar libre de grasas y aceites. Se recomienda que antes de utilizar el agua se determine: 1) la concentración de oxígeno (la cual debe estar por encima de 6 mg/L), y 2) y la dureza (que debe encontrarse dentro del intervalo preestablecido de 160-180 mg CaCO3/L). En caso de que alguno de los parámetros de control se encuentre fuera de los intervalos mencionados, el agua deberá desecharse. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Igualmente, con cada lote de agua dura preparada, antes de su utilización, ya sea como medio de cultivo y/o para la dilución de las muestras, se debe realizar un bioensayo que permita comprobar que no se presenta ningún efecto sobre la supervivencia de las daphnias. Para esta prueba, se colocan en tres recipientes un volumen de 30 mL de agua y 10 neonatos/recipiente. Al cabo de las 48 h la supervivencia deberá ser mayor del 90%, en caso contrario se debe descartar el agua reconstituida. Limpieza y mantenimiento Para el mantenimiento del cultivo se sugiere aplicar un ciclo de renovación definido a criterio del analista. El ciclo permite mantener un cultivo de organismos en etapas óptimas de reproducción. Algunos autores (CETESB/L5.018, 1991) recomiendan mantener lotes de individuos separados por edad, desde 0-1 semana hasta 4 ó 5 semanas de la siguiente forma: Madurez sexual 0-24h 1 semana 2 semana Inicio de partos 3 semana 4 semana 5 semana Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Neonatos con los que se reinicia un nuevo cultivo Hembras que se descartan Figura 3. Cultivo de organismos—ciclo de renovación Diariamente o cada tercer día dependiendo del desarrollo del cultivo, deben retirarse los neonatos, los cuales pueden ser destinados al desarrollo de pruebas o eliminados. Con igual periodicidad se deberá efectuar la limpieza y el suministro de alimento. Para la limpieza se emplea un sifón con el cual se remueve las exubias y los restos de alimento depositados en el fondo de los recipientes. Al finalizar, se recupera el volumen de agua en cada recipiente, adicionando y/o haciendo el recambio de 1/3 del volumen con agua reconstituida fresca. Una vez por semana (por ejemplo el viernes), después del retiro de los neonatos y antes del suministro de alimento, se transfieren las hembras adultas a recipientes limpios conteniendo partes iguales del agua antigua y agua de dilución fresca Se recomienda desechar los organismos mayores a 4 o 5 semanas, y reemplazarlos e iniciar un nuevo cultivo con los neonatos colectados ese día. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Cuando se van a realizar pruebas, el día previo se extraen los neonatos presentes en el cultivo, para de esa forma garantizar que los neonatos encontrados al día siguiente tengan menos de 24 h de nacidos. Alimentación Para la alimentación de los cultivos, se puede emplear suspensiones de diferentes especies de algas (Selenastrum capricornutum, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella sp. Scenedesmus sp., etc.). Para el cultivo de los dos primeros géneros, se recomienda utilizar medio AAP cuyos detalles de preparación se presenta en el protocolo de prueba para S. capricornutum (US EPA 1991); para las restantes especies se puede utilizar medio Bristol, cuya composición se detalla en la tabla 2 . La alimentación con cultivos de S. capricornutum se realiza cada tercer día, después de la limpieza. Para determinar la cantidad de alimento (cultivo algal) que debe suministrarse a cada recipiente del cultivo, calcular el volumen de la siguiente manera: V = (AxB)/C donde: V = volumen del concentrado algal, A= número de daphnias por acuario, B = dosis óptima recomendada (1.5 x 106 células por daphnia / día) C= concentración (Número de células/mL) de la suspensión de algas (para su determinación se utiliza una cámara de Neubauer cuyo manejo se presenta en el protocolo de prueba con Selenastrum capricornutum). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tabla 2. Medio de Cultivo o Medio Bristol Solución de macronutrientes: Compuesto Solución núm. Solución Madre (g/L) 1 2 3 4 5 6 8 25 2.5 7.5 7.5 2.5 17.5 3.1 g/100mL 5.0 g/100mL NaNO3 CaCl2•H2O MgSO4 • 7H2 O K2HPO4 NaCl KH2PO4 Mezcla 1:1* KOH EDTA Mezcla 1:1* FeSO4•7H2O H2SO4 H3BO3 9 10 mL de la solución madre por L de solución 10 10 10 10 10 10 1 0.498 g/100mL 0.1 mL/L 1 1.142 g/100mL 1 Solución de elementos traza: Compuesto ZnSO4 .7H2 O MnCl2 . 4H2 O MoO3 CuSO4 .5H2O Co(NO3 )2 .6H2O 1 mL/L Solución Madre (g/100 mL) 0.882 0.144 0.071 0.157 0.049 *Estas mezclas deben ser preparadas hasta el momento previo de su adición al medio Bristol PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Para el desarrollo de pruebas de toxicidad aguda con D. magna se emplean neonatos (< 24h de nacidos) expuestos a diferentes concentraciones de una muestra o de un agente tóxico durante un periodo de 48 h. Como resultado de dicha exposición, es posible determinar la concentración de la muestra o compuesto problema, que produce la muerte al 50 % de la población de neonatos expuestos (concentración letal media o CL50), con un nivel de confiabilidad del 95%. También puede determinarse la concentración mínima donde aún se observa efecto de mortalidad (Lower Observable Effect Concentration, LOEC), así como aquella donde la muestra no produce la muerte de neonatos (No observable Effect Concentration, NOEC). Cuando no hay un conocimiento de la toxicidad de las muestras, es recomendable llevar a cabo una prueba preliminar, en la cual se prepara un amplio número de concentraciones sin réplicas (por ejemplo: 0.001, 0.01, 0.1, 1,10, y 100 %). Para la prueba se coloca 30 mL de cada una de las diluciones en los vasos de prueba, se transfieren 10 neonatos, y a las 24 h se registra el número de organismos muertos. Con esta información podrá establecerse el intervalo de concentración en el cual se puede esperar el 0 y el 100% de mortalidad. Este intervalo, se utiliza como guía para la preparación de las diluciones en las pruebas definitivas. Para la preparación de las diluciones de las muestras, se utiliza como medio de dilución agua dura reconstituida (180 y 160 mg/L CaCO3), sin ningún suplemento. En la preparación del agua, se debe determinar los parámetros señalados anteriormente (APHA, 1998). Preparación de las soluciones de Prueba: muestras ambientales (efluentes y aguas superficiales) Para preparar la diluciones de la muestra se recomienda utilizar un factor de dilución de 0.5, el cual permite cubrir un amplio intervalo de dilución (por ejemplo, 100, 50, 25, 12.5, 6.25% etc.). Si se observa un alto porcentaje de mortalidad durante las primeras horas del bioensayo, es necesario realizar más diluciones de a muestra y repetir el bioensayo. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Las pruebas definitivas, requieren por lo menos 5 diluciones, por lo que es necesario preparar un mínimo de 100 mL por dilución. Este volumen será suficiente para el llenado de las tres réplicas (25 ml en cada uno) de cada concentración. Como recipientes se pueden emplear vasos de polietileno desechables (figura 5) de 30 mL, o vasos de precipitado de vidrio de 50 mL . Además de las diferentes concentraciones de la muestra, se debe preparar junto con las respectivas réplicas, un control negativo con agua dura reconstituida sin suplementos, y un control positivo con una solución del tóxico de referencia (Cr VI) en la concentración que, según la carta control previamente elaborada, corresponda a la CL50 Una vez preparadas cada una de las soluciones, se transfieren diez neonatos de menos de 24h de nacidos a cada uno de los recipientes. Para realizar este procedimiento se puede utilizar una pipeta despuntada. Terminada la transferencia se cubren los vasos con papel Parafilm y se colocan bajo condiciones controladas de iluminación y temperatura (tabla 2) por un periodo de 48h. Transcurrido el tiempo establecido, se revisan los vasos de prueba y se registra el número de organismos muertos en cada uno. La muerte se reconoce, por la carencia de movilidad o la ausencia de ritmo cardíaco. Antes de efectuar las lecturas se agitan los recipientes en forma circular para reactivar el movimiento de los organismos que se posan inmóviles en el fondo. Aquellos que no presenten movilidad pueden observarse con un microscopio estereoscópico para confirmar la ausencia de ritmo cardíaco. 1. PREPARACION DE DILUCIONES Aforar a 100mL AGUA DURA MUESTRA Concentración 100% 6,25 mL 12,5 mL 25 mL 50 mL 100 mL 100 mL Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 100 mL A 100 mL A 100 mL A 100 mL A 100 mL A 100 mL A DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 4 Procedimiento de la prueba Tabla 3. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con D. magna 1. Tipo de Ensayo 2. Temperatura 3. Calidad de Luz 4. Intensidad Luminosa 5. Fotoperíodo 6. Volumen del Recipiente 7. Volumen de la Solución de Prueba 8. Edad de los organismos de prueba 9. No de organismos en cada vaso 10. Número de Réplicas 11. Agua de Dilución 12. Factor de Dilución 13. Duración de la Prueba 14. Efecto Medido 15. Resultado Final 16. Aceptabilidad de los Resultados 17. Control positivo Estático 20 ± 2°C Fluorescente, blanco-frío 10-20 μE / m2/ s (800 ± 10% lux) 16 horas luz - 8 oscuridad Vasos de 50 mL 30 mL < 24h diez Tres Agua Dura 0.3 ó 0.5 48 h Mortalidad (inmovilidad) CL50 Mortalidad en el control negativo < 10% Cr(VI) a partir de una solución de K2Cr2O7 El resumen general de las condiciones de la prueba con Daphnia magna se presenta en la tabla 3 y en las figuras 4 y 5. Cultivos de Sustancias Tóxicas/ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Mantenimiento Muestra Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] Neonatos 24 h Preparación de Diluciones DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Figura 5. Diagrama de flujo de las actividades vinculadas al desarrollo del protocolo de prueba de Daphnia magna Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Calculo de la CL50 Para el cálculo de la CL50 y sus respectivos límites de confianza al 95%, se utiliza el método Probit, ya sea manualmente o con ayuda de paquetes estadísticos que tengan este procedimiento. El método de análisis PROBIT permite estimar la CE50 o CL50 ajustando los datos de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que siguen una distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de organismos afectados, o muertos por la acción tóxica de una sustancia, se transforma a unidades Probit. Esta transformación, permite el ajuste a una línea de regresión, en la cual la concentración correspondiente al Probit 0.5, corresponderá a la cantidad de sustancia capaz de generar el efecto estudiado en la mitad de la población. Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CE50 o CL50 deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad. Aceptabilidad de los resultados • • • La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10% La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/L. La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos en la carta control. En caso de emplear un control positivo de concentración cercana a la CL50, los valores de mortalidad obtenidos deberán encontrarse cercanos al 50%. Se puede considerar aceptable el encontrar mortalidades entre el 33 y 57% . REFERENCIAS Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) APHA, 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20th ed., American Public Health Association. Ap. 8010G.. Washington D.C., pp.. 8-20, 8-23. CETESB, 1991., Agua-Teste de toxicidade com D. similis Clauss 1876, (Cladócera, Crustácea), Metodo de essaio. L5.018. Agosto 1991. CETESB. Dutka B.J., 1989. Methods for Microbiological and Toxicological Analysis of Water, Wastewaters and Sediments: National Water Research Institute (NWRI) Environment Canada. Burlington Ontario. Edley, M. T., & R. Law, 1988. Evolution of Life Histories and Experimental Population of Daphnia magna. Biol. J. Limn. Soc. 34: 309-326. Yields in Elendt B. P. & Bias W. R., 1990. “Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing Effects of the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of Daphnia magna. Wat. Res. 24 (9): 1157-1167. Girling, A. E. & Garforth, B. M. 1989. “Influence of variations in culture medium on the survival and reproduction of Daphnia magna”, Bull. Environ. Contam. Toxicol., 42:119-125. Goulden, C. E., Comotto, R. M., Hendrickson, J. A. Jr., Horning, L. L., & K. L. Johnson., 1982. Procedures and recomendations for the culture and use of Daphnia in bioassay studies, Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, & W. E. Bishop, eds., American Society for Testing and Materials, pp 139-160. Gutiérrez, L. E., Lerdo de Tejada B. A., Huerto-Delgadillo R. I., y C. J. García. 1989., Procedimientos de evaluación tóxica de efluentes industriales líquidos utilizando Daphnia magna Straus (Cladócera, Crustácea), Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. México. pp. 105. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Klüttgen, B., Dülmer, U., Engels, M., & H. T. Ratte. 1994., “A Dam and Artificial Freshwater for the Culture of Zooplankton”. Water Research. 28 (3): 743-746. Lewis, M. A., & A. W. Maki. 1981., “Effects of water hardness and diet on productivity of Daphnia magna Strauss, in Laboratory Culture”. Hydrobiology. 85: 175-179. US EPA Environmental Protection Agency (EPA)., 1991. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluent and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. 4th ed, Weber, C.I., ed. EPA-600/4-90-027. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Procedimiento para la Generación de Extractos Orgánicos y Elutriados de Suelos y Sedimentos para su Análisis en Ensayos de Toxicidad Yolanda Pica Granados Gissel Trujillo Domínguez Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Campo de aplicación La toxicidad medida a través de los ensayos con organismos como Daphnia magna, Vibrio fischeri, Pseudokirchneriella subcapitata y algunos otros, está referida a los efectos causados por compuestos en la fase soluble o solubilizados, de tal modo que en el caso de matrices sólidas es necesario llevar a esta fase los materiales contaminantes contenidos en los sólidos que se desean analizar (por ejemplo sedimentos, suelos y productos industriales) aplicando un procedimiento controlado que permita el análisis de su toxicidad empleando diversas especies de organismos de prueba sin la generación de falsos positivos. Causados por la interferencia del tratamiento de las muestras. Este procedimiento es aplicable en el análisis de matrices sólidas (por ejemplo suelos, sedimentos, productos químicos, etc.) con el objetivo de extraer los compuestos tóxicos solubilizables en los disolventes de extracción seleccionados por su posibilidad de aplicarse en volúmenes controlados, para el desarrollo de pruebas de toxicidad. Los resultados de toxicidad que surjan de esta clase de manejo de muestra ya sea por medio de elutriados, de extractos orgánicos o ambos, pueden ser aplicables para comparaciones de dosis efectos cuando se comparan con el contenido de contaminantes (en casos en que las propiedades de polaridad de los disolventes empleados sea Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) consistente para ambos), así mismo es de utilidad para zonificar los gradientes de afectación en un sitio (por ejemplo suelos o sedimentos), o en su defecto, para el seguimiento del comportamiento en el tiempo de un material que se sospecha tóxico (por ejemplo suelo, sedimento o materiales diversos), entre otros. La aplicación de esta herramienta en estudios ambientales más amplios también puede ser aplicable con fines de investigación ya que brinda información sobre el potencial tóxico, sin embargo su interpretación requerirá de conjuntar otras variables acordes a los objetivos de cada proyecto, de modo que la integración y las implicaciones de dicha información deberán ser manejada por especialistas en el tema. Definiciones Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento. Elutriado: extracto acuoso Blanco: es usado indistintamente con la palabra control. Control negativo o blanco de procedimiento:- se asigna este término al lote o tratamiento, dentro del diseño experimental, que replica las condiciones que afectan al conjunto de tratamientos, excepto la sustancia o mezcla de ellas que son investigadas en la prueba. Control positivo: se asigna este término a una muestra, dentro del diseño experimenta del procedimiento de trabajo, cuya respuesta (CE50) y su variabilidad ha sido previamente evaluada y calibrada a través de pruebas de toxicidad. Esta muestra se prepara tomando como muestra materiales empleados como de referencia. Material Sistema de extracción Soxhlet Vaso pp. 250 o 500 mL Conos de papel filtro No.1 purificados Pipetas Pasteur Viales cromatográfico de 5 mL con tapa de rosca Viales aforados de 5 mL Tubos de centrífuga plástico, desechables, estériles y de fondo cónico de 50 mL con tapa Tamiz de No. 60 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Morteros y mano de mortero Equipo Balanza analítica Parrilla de extracción: Evaporador Rotatorio Buchi Horno de secado (40 ± 5 °C) Plancha de calentamiento o Dispensador de nitrógeno Refrigerador a temperatura de 4 ± 2°C Pipetas automáticas de 1000 μL Centrífuga Baño ultrasónico Reactivos Metanol calidad HPCL, plaguicida o nanogrado Agua destilada o desionizada Procedimiento Para el análisis de materiales sólidos (por ejemplo suelos, sedimentos u otros) se maneja el material con base en peso seco para la producción de extractos orgánicos. Para la generación de elutriados puede emplearse el material en su estado original (base húmeda o seca). Preparativos Para muestras de suelo y sedimentos, y en otros casos en que esto aplique, el material es secado a temperatura ambiente o, en su defecto, con ayuda de un horno de secado a una temperatura de 40 ± 5 °C. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Posteriormente el material se disgrega y se muele en mortero hasta que éste logre su paso por un tamiz de malla del No. 60 (equivalente a 2mm de apertura de malla). En caso de productos químicos o manufacturados cuya presentación sea en polvos, éstos se procesan en su forma original sin molido o tamizado previo. Una vez listo el material, se pesan idealmente 20 g, sin embargo de no haber muestra suficiente puede emplearse cantidades de 10 gr. en adelante o incluso menores (5 g), sólo si se sospecha que la muestra podría contener carga elevada de tóxicos. El material, para la producción de los extractos orgánicos, se pesa llenando un cono de papel filtro del No. 1 (12.5 cm.) donde quedarán empacados. El papel filtro se purifica con días de anticipación empleando la extracción en Soxhlet en los mismos términos del manejo indicado para muestras, dejándose secar a temperatura ambiente. En el caso de la producción de elutriados, el material se pesa llenando un tubo de centrífuga de 50 mL de material plástico esterilizado en el que se efectuará el elutriado. Para ambos casos, extractos orgánicos o elutriados, el peso correspondiente deberá registrarse en la bitácora del analista. Extracción Soxhlet (extracto orgánico) La muestra contenida en el cono de papel filtro se introduce en el vaso del sistema Soxhlet y se monta junto con el refrigerante y el matraz de bola. El volumen del disolvente en el matraz de bola puede variar dependiendo de la capacidad del sistema Soxhlet en uso, requerirá de 250 mL para el mas pequeño o hasta 350 mL para uno de mayor volumen. Ajuste el volumen del disolvente considerando que al condensarse e ir goteando en el interior del vaso del Soxhlet debe llegar al codo de vaciado sin que el matraz de bola se vacíe. En él debe quedar siempre un excedente para evitar que el extracto se queme. Montar el sistema Soxhlet en la parrilla de extracción. En el caso del uso de metanol como disolvente de extracción, encender cada parrilla colocando el indicador de temperatura en el número 5 o 6, conectar simultáneamente el sistema de enfriamiento a una temperatura de 10 a 18 °C, cuanto más frío la condensación será más eficiente. En el caso de uso de metanol la extracción debe mantenerse en funcionamiento por un tiempo de alrededor de 20 horas, que es equivalente a aproximadamente 10 o 12 ciclos de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) renovación. En caso del uso de otro disolvente, el tiempo de extracción puede variar, en cuyo caso deberán hacerse los ajustes de tiempo, temperatura y ciclos adecuados correspondientes. Al término del periodo apagar las parrillas y dejar enfriar aun con el flujo de enfriamiento en funcionamiento. Desmontar los sistemas de extracción Recuperar en el matraz de bola el disolvente aún contenido en el vaso. Cubrir con papel aluminio la boca de los matraces de bola que contienen los extractos orgánicos y mantener en refrigeración hasta que se proceda a la evaporación y concentración del extracto. Por cada lote de muestras prepare un blanco y un control positivo. Evaporación Llene el baño Maria del equipo de evaporación a un nivel que cubra los matraces de bola una vez inmersos en él. Si el extracto es con base en metanol, caliente el baño a 40 ± 5 °C y conecte la fuente de enfriamiento del refrigerante, cuidando que se logre una temperatura de 10 a 18 °C. En caso de la concentración de extractos metabólicos, acoplar una bomba de vacío conectada al refrigerante del evaporador rotatorio. Colocar el matraz de bola conteniendo el extracto, ajustar el seguro de la boca de evaporador y girar a cierre la válvula de alivio del condensador del evaporador rotatorio. Encienda la bomba de vacío y ajústela a una presión de 30 a 40 psi, simultáneamente gire la perilla de rotación del equipo evaporador para que el matraz de bola empiece a girar. Elija una velocidad media. Ajuste su sistema de evaporación a fin de optimizar el proceso de concentración. Para ello ajuste la presión, la temperatura del baño Maria y de la fuente de enfriamiento tomando como base la siguiente información. Cuanto menor es la presión que se emplea se requiere manejar la temperatura del baño en el límite máximo aceptable (45 °C) y la de enfriamiento en los niveles más bajos mientras que cuando la presión es mayor podemos emplear una menor temperatura en el baño y un enfriamiento de temperatura media dentro del ámbito óptimo señalado. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Cuando el volumen del disolvente sea alrededor de 2 mL, detenga la rotación de la bola, apague la bomba de vacío y gire la válvula de alivio del condensador para abrirla y liberar el vacío. Una vez hecho lo anterior podrá retirar el matraz de bola y colocar el siguiente. Trasvasado Enjuague los viales de 5 mL con metanol y deje secar. Transfiera el concentrado contenido en el matraz de bola a un vial de 5 mL empleando una pipeta Pasteur (no las reutilice). Tome volúmenes adicionales de disolvente limpio (por ejemplo metanol) para limpiar las paredes del matraz, recupérelo y adiciónelo también al vial junto con el concentrado previamente trasvasado. Reduzca los volúmenes del concentrado del extracto colocando los viales sobre una parrilla tibia, logre la temperatura idónea sólo encendiendo la parrilla sin seleccionar niveles de calor (aproximadamente 30- 45 °C). También puede hacerse uso de flujo de nitrógeno para su concentración. Cuando el nivel del volumen en el vial se reduzca a la mitad de su capacidad, podrán adicionarse los nuevos volúmenes que resulten de los enjuagues posteriores del matraz de extracción. Enjuague este recipiente hasta que las paredes queden limpias, siempre incorporando el disolvente al vial con el concentrado. Una vez terminada la limpieza del matraz deje reducir el volumen del concentrado contenido en el vial hasta alcanzar aproximadamente 3 mL. Cubra y guarde los viales en refrigeración hasta su análisis en pruebas de toxicidad. Preparativos para pruebas de toxicidad de extractos orgánicos Transfiera el volumen de los viales conteniendo el concentrado a viales aforados. Emplee enjuagues al vial original usando disolvente limpio (por ejemplo metanol), adicione al vial aforado hasta alcanzar el nivel de 4 mL. Para preparar su sistema de prueba emplee como volumen máximo del extracto orgánico, un volumen menor o igual a la concentración de disolvente (% v/v) correspondiente al nivel de efecto no observable (NOEC), el cual deberá haber sido previamente determinado. Dentro del sistema de prueba, la manera de demostrar una adecuada selección de los volúmenes de disolvente a niveles que no generan falsos positivos es a través de la respuesta obtenida del análisis de toxicidad del Blanco de procedimiento, el cual deberá no presentar efecto en las Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) pruebas de toxicidad, o en su defecto éste no deberá ser mayor al efecto observado en el control negativo. Para el caso del metanol, la concentración máxima de este disolvente en el sistema de prueba que se establece como recomendable para D. magna, V. fischeri e Hydra attenuata, debe ser ≤ 1.2%. En caso de P. subcapitata éste debe ser ≤ 0.1%. Tomando como ejemplo el sistema de prueba con V. fischeri, cuyo volumen final en el preparado de la concentración inicial es de 2750 μL, que se logra al adicionar 250μL de solución de ajuste osmótico (MOAS) y 2500mL de la muestra, entonces se tendría que hacer el siguiente preparado: Adicionar los 250 μL de MOAS a la celdilla que contendrá la máxima concentración. Posteriormente adicionar 2500 μL de agua de reconstitución. Mezclar con ayuda de la micropipeta de 1000 μL, succionando y eyectando el líquido tres veces. Con ayuda de una micropipeta de volumen variable ajustada a 30 μL, succionar ese volumen de la celdilla en preparación, de modo que quede a 2720 μL su llenado. Posteriormente restituir el volumen, nuevamente a 2750 μL, adicionando 30 μL del concentrado del extracto orgánico. Bajo este esquema de preparación de la muestra, se logra una concentración de metanol en el sistema de prueba de 1.09% (v/v), menor al máximo recomendado. Para efectuar los cálculos de la concentración inicial del sedimento en el sistema de prueba ver la sección de manejo de resultados de este ensayo. Elutriados El material contenido en los tubos de centrífuga deberá asentarse al fondo del recipiente. Esto se logra golpeando ligeramente la base del tubo sobre una superficie. Al terminar mida el volumen que ocupa el material leyendo en la escala que presentan los tubos. Anote el dato en la bitácora junto con el registro del peso correspondiente. Mezclar el sedimento con agua destilada en una relación máxima de 1:4 (una parte de sedimento por cuatro de agua) haciendo uso de la lectura del volumen que ocupa el material de la muestra para establecer las proporciones. Puede elegir el uso de relaciones de Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) volumen menores, tal como 1:2 o 1:3. Considere que la limitante será la capacidad del tubo a 50 mL. Cierre los tubos y agite vigorosamente a fin de mezclar homogéneamente el material en el agua y anote el volumen adicionado junto con los datos anteriormente señalados. Posteriormente puede colocar los tubos en una parrilla de agitación o en su defecto emplear un baño ultrasónico. En caso de usar baño ultrasónico, llene la tina a la capacidad correspondiente, introduzca los tubos y cúbralos manteniéndolos sumergidos en el agua hasta el nivel de la base de su tapa. Ajuste el baño ultrasónico para su funcionamiento por 60 minutos sin calentamiento, tiempo que los tubos deberán permanecer en su interior. Al término de una hora de agitación o sonicación apague los instrumentos y saque los tubos. Déjelos reposar en posición vertical dentro de un refrigerador para su sedimentación. Por cada lote de muestras o número de control monte un blanco y un control positivo. Previo al desarrollo de pruebas de toxicidad, coloque los tubos en centrifugación por un tiempo de 15 minutos a una velocidad de 2000 a 4000 rpm hasta que aparezca el sedimento. Detenga la centrifugación y emplee el sobrenadante acuoso (elutriado) para el desarrollo de pruebas de toxicidad obteniendo los volúmenes necesarios succionando el líquido sin resuspender el sedimentado. Debido a que el elutriado es un extracto acuoso el procedimiento de prueba podrá desarrollarse de la misma forma en que se llevan a cabo las pruebas de toxicidad rutinarias. Para efectuar los cálculos para determinar la concentración inicial emplee las guías correspondientes indicadas en la sección de manejo de resultados de este procedimiento, haciendo los ajustes de volúmenes y pesos que correspondan. Precauciones Cuidar que los materiales empelados en la producción de extractos o elutriados estén siempre libres de tóxicos. Cuidar que a lo largo del procedimiento para la elaboración de extracto orgánico, no se adicione a éste agua que puede incorporarse por condensación en los refrigerantes del sistema Soxhlet o por un inadecuado secado de la muestra. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Cuidar que durante la extracción, la cantidad de disolvente siempre sea la suficiente para alcanzar el nivel de vaciado del vaso del Soxhlet, a fin de que se mantengan los ciclos de renovación de extracción funcionando, de otra manera se quemará el extracto contenido en el matraz de bola. En caso de que éste no alcance el nivel necesario puede adicionarse más disolvente al matraz de bola cuidando de apagar la parrilla y dejar enfriar previamente. Cuidar que la temperatura del agua empleada para enfriar los refrigerantes se mantenga en un intervalo adecuado para promover la condensación del disolvente. En el caso de metanol se recomienda manejar una temperatura de 10- 18 °C. De emplearse otro disolvente deberá ajustarse a la temperatura que convenga de acuerdo a su volatilidad, evitando siempre la pérdida del disolvente de extracción. Para el enfriamiento puede emplearse un baño de recirculación de agua o en su defecto agua directa de la toma. Cuidar que al término o al inicio de cada lote extraído o por extraer en el sistema Soxhlet, se efectúe un enjuague con acetona (grado HPLC, nanogrado o plaguicidas) y posteriormente con metanol (grado HPLC, nanogrado o plaguicida) con el objetivo de evitar contaminación cruzada. Cuidar que mientras el sistema Soxhlet no esté en uso, se protejan las entradas de los refrigerantes con papel aluminio para aislar de polvos. Cuide que durante el uso del evaporador rotatorio se maneje un balance de las variables de presión y temperatura del baño María a fin de evitar que el extracto de la muestra se proyecte en el interior del condensador y lo contamine, o en su defecto, se provoque la pérdida del extracto. Cuide que durante la reducción de volúmenes durante el trasvasado de la muestra a los viales de 5 mL si emplea parrilla de calentamiento, ésta se encuentre sólo tibia, de lo contrario el concentrado se proyectará y la muestra se perderá. En el caso de la producción de elutriados, etiquete los tubos escribiendo directamente sobre la pared o la tapa del mismo con plumón indeleble ya que las etiquetas de papel pueden desintegrarse en el baño ultrasónico. Manejo de resultados Consideraciones para los cálculos de concentración. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tomando en cuenta que en el caso de la producción de extractos orgánicos, el volumen de concentrado que se emplea para el análisis de toxicidad será sólo una porción del concentrado, deberemos hacer los ajustes y cálculos necesarios para expresar adecuadamente el resultado. Continuando con el ejemplo de la prueba con V. fischeri, en el que se empleó una proporción de 30 μL de un volumen total del concentrado de 4 mL obtenidos a partir de un peso inicial de la muestra que para fines del ejemplo será de 20 g, entonces podemos decir que la concentración inicial, expresada con mg Eq/mL, en la máxima concentración preparada sería de 54.54 mg Eq/mL, a partir de los siguientes cálculos: 20 g 150mg * 1000 = 4000 μL ml 30 μL 150mg mL = 54.54mgEq 2750mL mL Donde: 20 g = Peso inicial del material extraído 4000 μL = Volumen del concentrado del extracto 30 μL = Volumen del concentrado del extracto adicionado al sistema de prueba para análisis de toxicidad 2750 mL = Volumen total de la solución en el sistema de prueba. La concentración obtenida debe ser expresada anteponiendo el término “Equivalentes”, que se expresa como Eq. (54.54 mg Eq/mL). Se introduce esta modalidad ya que debe considerarse que la concentración obtenida está referida a una cantidad de material que fue extraída, de modo que en realidad los organismos de prueba se exponen al material soluble o extractado cuya cantidad no es posible determinar, sin embargo esta es relativa al peso medido del material trabajado. Las concentraciones de las diluciones subsecuentes tendrán que afectarse por el factor de dilución empleado para su preparación. Interpretación de resultados Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Los resultados de la prueba al concentrado del control negativo o blanco de procedimiento, proveen información útil para detectar la posibilidad de falsos positivos, ya que a través de su análisis se determina la contribución que el proceso de manejo de muestras, ya sea por producción de extractos o elutriados, tiene sobre la respuesta tóxica obtenida en pruebas de toxicidad, así como la del posible efecto que pueda causar la adición de volúmenes de disolvente en el sistema de prueba. Con fines de aceptación de los resultados, las pruebas de toxicidad del blanco de procedimiento deberán demostrar que no hay efecto, o que éste no es mayor al efecto observado en el control negativo. Esto indicará que el proceso de manejo de muestra así como el volumen de disolvente adicionado al sistema de prueba no contribuye a la toxicidad ni a la generación de falsos positivos. El control positivo permitirá controlar la efectividad del proceso de extracción de tal manera que la respuesta de la prueba de toxicidad del concentrado o elutriado deberá encontrarse en una concentración previamente determinada para el material de referencia, tanto en el caso del elutriado como del extracto orgánico. Referencias Ho. T.Y. H. y G. J. Quinn. 1993. Physical and Chemical Parameters of sediment extraction and fractionation that influence toxicity as evaluated by Microtox. Environmental Toxicology and Chemistry. 12:615-625. Hong Do C. L., K. Becker-van Stooten, S. Jean-Jacques, T. Lam Minh y J. Tarradellas. 2000. Toxicity of sediments from the Ho Chi Minh city canals and Saigon River , Viet Nam. Environmental Toxicology. 15: (5): 469-475 Jonson T. y E. R. Long. 1998. Rapid toxicity assessment of sedimets from estuarine ecosystems, a new tandem in vitro testing aproach. Environmental Toxicology and Chemistry. 17 (6) 1099-1106. Pica-Granados Y., R.I. Huerto-Delgadillo, D. G. Trujillo, S. H. Hernández y O.U. Bucio. 1998. Control integral de lirio acuatico e implicaciones toxicologicas en el lago de Chapala. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Proyecto CONACyT 0768P-B. Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental. Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. México. Vol II: 58pp Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA-112SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con Photobacterium phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36. Sveson A., T. Vikor y M. Remberger. 1997. Toxicity of elemental sulfur in sediments 1998. Environmental Toxicology. 13: (3): 217-224. U.S Army Corps of Enginierrs, 1976. Ecological Evaluation of proposed discharge of dredge or fill material into navigable waters. COE D-76-17 Final Report U.S Army Engineer Water Ways Experiment Station Vicksburg. MS. Wang C., Y. Wang, Z. Mo y Z. Wang. 2003. Ecotoxicological Examination of sediment extracts of Huaihe River, China by in vitro bioassay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 71: 782-790. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Aseguramiento y Control de Calidad de Ensayos de Toxicidad María Consuelo Díaz Báez Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia Yolanda Pica Granados Instituto Mexicano de Tecnología del Agua Maria Cecilia Sobrero Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. Argentina Este procedimiento se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp. _________________________________________________________________ Campo de aplicación Un elemento importante en el muestreo y análisis de muestras ambientales es utilizar métodos aprobados y estandarizados; sin embargo, este hecho por si solo no es suficiente para lograr resultados analíticos exactos y confiables. Interferencias de la matriz utilizada, fallas de equipos y errores de los analistas pueden llevar a inexactitudes en los resultados. En el caso de las pruebas de toxicidad, la calidad analítica es un reto complejo porque no sólo los factores mencionados anteriormente afectan la confiabilidad de los resultados, sino que además otra serie de factores como la variabilidad natural de las poblaciones de prueba, el estado fisiológico de los individuos o las condiciones ambientales mantenidas durante las determinaciones, pueden contribuir a aumentar la variabilidad de los resultados. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Pese a ello, es necesario contar con resultados confiables y reproducibles, por lo que los laboratorios deben desarrollar programas de control de calidad que aseguren la exactitud de los datos obtenidos. La validación y aprobación de los resultados obtenidos en bioensayos requieren de un programa de aseguramiento y control de calidad (ACC) bien diseñado y aplicado regularmente. Este programa debe generar valores que puedan probarse técnicamente y defenderse legalmente. En el presente capítulo se definen los procedimientos de control de calidad y las actividades obligatorias que deben realizarse durante las pruebas de toxicidad. Estas actividades son de dos tipos, unas de manejo y otras de funcionamiento. Las primeras se refieren a los planes operativos donde se especifican los procedimientos estandarizados y los resultados reportados con un alto nivel de confianza, y las segundas al conjunto de medidas que se toman durante la aplicación de los protocolos de análisis. Estos procedimientos permiten un adecuado aseguramiento y establecen la calidad de las determinaciones del laboratorio a través de evaluaciones internas y externas de control. Esto último incluye el análisis del comportamiento de las muestras evaluadas, así como la comparación de los resultados entre laboratorios y la realización de auditorías. Programas de aseguramiento de calidad Un programa de aseguramiento de calidad, no sólo es necesario para la producción de datos sino además debe ser la guía de operación del laboratorio. El programa debe concretarse en el diseño de un plan de trabajo consignado en un manual operativo. El plan debe ser suficientemente extenso para que pueda aplicarse a la mayoría de las actividades que se llevan a cabo y a su vez suficientemente flexible para permitir cambios ocasionales cuando sea necesario. En él se debe incluir la organización del laboratorio, los objetivos de calidad en relación a precisión y exactitud, los procedimientos de muestreo y custodia de las muestras, los protocolos de prueba, los procedimientos de calibración (especificando los métodos utilizados para determinar la precisión y exactitud de los resultados, validación y reporte de los resultados) y los sistemas de auditoria. Protocolos de prueba Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Uno de los problemas relacionados con los programas de control de calidad de pruebas de toxicidad es la existencia de un gran número de pruebas, muchas de las cuales no han sido estandarizadas. Sólo algunas de ellas han sido aprobadas y validadas por organizaciones como las agencias de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) y Canadá (Environment Canada) que cuentan con metodologías que pueden ser incorporadas al trabajo de rutina de cualquier laboratorio. Aunque varios de los ensayos recomendados en el documento no han sido incorporados oficialmente por las mencionadas agencias, en el presente capítulo se definen algunos elementos de control necesarios para su aplicación a muestras de agua potable, aguas de poro de sedimentos, suelos y lodos, aguas superficiales y subterráneas, aguas residuales industriales y domésticas. Varios de los métodos recomendados por la USEPA para análisis toxicológicos de muestras de agua se consignan en los siguientes documentos: Methods for measuring the Acute Toxicity of Effluents to Freshwater and Marine Organisms, EPA 600/4-90/027F, 1993, 4th Edition. Short Term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms, EPA 600/4-91-002, 1994, 3rd Edition. También, la American Society for Testing Materials (ASTM) ha publicado un gran número de métodos de aplicación en ecotoxicología, y la International Organization for Standardization (ISO) y la Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), de la cual forman parte muchos países de Europa y Norteamérica, han publicado un gran número de métodos de aplicación en ecotoxicología desde los primeros años de la década de los ochenta. En general, los trabajos realizados por estas agencias han permitido concluir que “los análisis de toxicidad son herramientas que al ser usadas conjuntamente con las mediciones químicas y ecológicas, permiten identificar, cuantificar y generar criterios para el control de la descarga de contaminantes tóxicos”. Países como Canadá han incorporado dentro de sus regulaciones la aplicación de ensayos de toxicidad. Entre las principales se pueden mencionar: el Acta de Pesca (Fisheries Act), el Acta de Protección Ambiental [Canadian Environmental Protection Act (CEPA)], el Acta para Transporte de Productos Peligrosos (Transportation of Dangerous Goods Act), el Acta Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) para los productos usados en el Control de Plagas (Pest Control Products Act), así como muchas otras actas del gobierno federal. Calibración de instrumentos y soluciones en el laboratorio Un elemento importante en los programas de control de calidad es contar con instrumentos confiables. Por ello, debe mantenerse un programa de mantenimiento, calibración y verificación periódica para todos los equipos en uso. Cuando se utilizan equipos o instrumentos en los que se requieren soluciones de referencia, pesas u otros artefactos para su calibración, es necesario que estos medios de calibración sean certificados. En el caso de emplear estándares de referencia, la solución patrón debe ser previamente valorada con referencia a una solución o reactivos certificados. Materiales y reactivos del laboratorio Material de vidrio En el comercio es posible encontrar diferentes calidades de material de vidrio, por lo que es importante tener en cuenta el tipo y grado requerido para cada una de las actividades que se van a desarrollar. Igualmente, como en muchas de las pruebas se realizan diluciones, es necesario contar con material volumétrico clase A calibrado que asegure la medición de los volúmenes medidos en forma precisa. Además del cumplimiento de las características requeridas del material de vidrio, debe contarse con procedimientos adecuados de limpieza, que en muchos casos dependen de los parámetros a determinar. Por esta razón, el laboratorio deberá contar con procedimientos detallados para la limpieza, almacenamiento y protección del material. Reactivos A nivel comercial existe un gran número de reactivos que son fabricados con diferentes grados de pureza. Por ello, la selección cuidadosa del grado requerido de los reactivos a Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) utilizar en este tipo de pruebas es de gran importancia. En el desarrollo de pruebas de toxicidad se recomienda utilizar reactivos que cumplan los requerimientos establecidos por la American Chemical Society para reactivos analíticos, grado ACS. Los reactivos empleados como compuestos tóxicos de referencia deberán ser de uso exclusivo para la preparación de una solución patrón, tener un grado de pureza de cuando menos 99.5%, con certificado. La mayoría de las pruebas de toxicidad y el mantenimiento de cultivos, requiere, de agua Tipo I, (APHA, 1998) la cual no contiene compuestos o elementos en concentraciones detectables. Compuestos tóxicos de referencia Un compuesto tóxico de referencia es una sustancia orgánica o inorgánica utilizada en pruebas de toxicidad con fines de control de calidad analítica de los organismos a utilizar en las pruebas. Para ello, en la etapa inicial del montaje de un método de prueba, debe seleccionarse un compuesto soluble, de pureza igual o mayor al 99%, al cual se le realicen pruebas de toxicidad para una especie determinada, con el fin de establecer el intervalo de concentración del compuesto seleccionado que produce el efecto esperado. Una vez definido el patrón de la relación dosis-respuesta para el compuesto elegido, puede ser empleado como compuesto tóxico de referencia. El registro histórico de la respuesta al compuesto tóxico de referencia, expresada a través de los valores de CL50 /CI50 /CE50, es de utilidad para el control del estado fisiológico de los organismos empleados y sirve de evidencia para demostrar la estabilidad de su respuesta biológica. En la literatura se mencionan muchos compuestos que pueden emplearse como compuestos tóxicos de referencia. La USEPA (1993), cita el empleo de cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de cadmio (CdCl2), sulfato de cobre (CuSO4), dodecil sulfato de sodio (SDS) y dicromato de potasio (K2Cr2O7). Otras agencias como Environment Canada recomienda al Zinc(II) como compuesto tóxico de referencia inorgánico y al fenol para sustancias orgánicas; sin embargo, estos compuestos pueden Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) sustituirse por otros dependiendo de la especie de prueba, la matriz utilizada y los puntos finales medidos. La precisión de los resultados de las pruebas de toxicidad en el laboratorio es calculada a través de la confección de cartas o gráficas de control. Estas gráficas, son una herramienta que permite determinar la variabilidad de los resultados y en consecuencia definir la aptitud de un laboratorio para obtener resultados confiables. Cartas de control de calidad La carta control es la herramienta de registro que brinda los elementos de juicio para establecer los intervalos aceptables de variación de la respuesta de los organismos de prueba a un compuesto tóxico de referencia, con un margen de confianza del 95%. Esta carta es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie empleada, de la estabilidad de la respuesta biológica y de la repetibilidad (exactitud) de los resultados obtenidos. La carta control se genera a partir de los resultados de pruebas sucesivas con el compuesto tóxico de referencia seleccionado, para el cual de obtiene el valor de la concentración de efecto medio (CL50 /CI50 /CE50). Inicialmente ésta puede ser construida con un mínimo de cinco datos y posteriormente se debe continuar realizando ensayos con el compuesto tóxico para ingresar mensualmente nuevos valores hasta completar una serie de veinte resultados. Los valores se van integrando a manera de puntos en un gráfico que relaciona el número de ensayo, ubicado en el eje X o abscisa, y el valor de la concentración de efecto medio (CL50 /CI50 /CE50), en el eje Y u ordenada (figura A.1). Posteriormente los valores son empleados para el cálculo del valor promedio y la desviación estándar (σ) de la población de datos. Con estos parámetros estadísticos se calculan los valores límite (superior e inferior) que definen el intervalo de variación aceptable o intervalos de confianza (95%) en el que deberán encontrarse los valores de CL50 /CI50 /CE50 obtenidos para futuros ensayos con el compuesto tóxico de referencia. Los valores del límite superior e inferior se obtienen al adicionar o sustraer, respectivamente, del promedio dos desviaciones estándar de acuerdo a: Concentración limite superior = Promedio + 2σ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Concentración limite inferior = Promedio - 2σ Para la elaboración de las cartas control se debe preparar una solución estándar del compuesto tóxico de referencia seleccionado, empleando reactivos con pureza mínima del 99.5% y material volumétrico clase A calibrado. Con la solución estándar del compuesto tóxico, se preparan diluciones para obtener una serie de concentraciones de manera que se logre obtener al menos dos valores de efecto mayores al 50 % y dos más menores a dicho porcentaje. En general, es de esperar que la serie de concentraciones utilizada produzca a través del tiempo la misma respuesta en cada concentración. Se procede a calcular el punto final de la prueba (CL50 /CI50 /CE50) utilizando cualquiera de las técnicas estadísticas recomendadas. La carta control es utilizada para evaluar la tendencia de los resultados, por lo que el promedio acumulado y los límites de confianza son recalculados con cada nuevo dato obtenido. Después de dos años de colección de datos, o de 20 evaluaciones, la carta control se mantiene usando solamente los 20 datos más recientes. En general, se recomienda realizar pruebas mensuales con los compuestos tóxicos seleccionados; sin embargo, algunos laboratorios prefieren llevar a cabo ensayos con mayor frecuencia. Los valores de la CL50/CI50/CE50 fuera del intervalo establecido son indicativos de algún cambio en la consistencia metodológica o de alteración de la sensibilidad de los organismos. En el caso de análisis de puntos finales como la CL50, CI50, y la CE50 se espera que por azar y con una probabilidad asociada de P0.05, sólo uno de los veinte ensayos caiga fuera de los límites establecidos. Si en más de un ensayo con los compuestos tóxicos de referencia el valor cae fuera de los límites, los resultados de las pruebas efectuadas deben considerarse provisionales y sujetos a confirmación. Si el problema persiste y el valor de CL50 /CI50 /CE50 del compuesto tóxico de referencia se aleja significativamente del intervalo esperado, deberá realizarse una revisión de la sensibilidad de los organismos de prueba y eliminar los datos generados bajo estas circunstancias. En este caso, se debe revisar cuidadosamente el procedimiento y repetir las pruebas con un nuevo lote de organismos. El comportamiento de las gráficas de control puede cambiar en el tiempo, reduciéndose los intervalos de variación en la medida en que se adquiere habilidad en el manejo de los procedimientos de prueba. Bajo este esquema también es factible que se obtengan valores Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) fuera de los nuevos límites; sin embargo, la incidencia de estos casos no deberá ser mayor del 5%. Considerando lo anterior es responsabilidad de cada laboratorio demostrar, a través de la generación de estos gráficos, su capacidad para obtener resultados confiables, antes de llevar a cabo pruebas con muestras de aguas o efluentes. En este sentido, la precisión intra-laboratorio de cada procedimiento de prueba se debe expresar en términos del coeficiente de variación (CV%), calculado a partir de: ⎡⎛ σ ⎞ ⎤ CV = ⎢⎜ ⎟ * 100⎥ ⎣⎝ media ⎠ ⎦ Este valor se establece realizando un mínimo de cinco o más ensayos con diferentes lotes de organismos, el mismo compuesto tóxico de referencia, iguales concentraciones, las mismas condiciones y el mismo análisis de datos. En la tabla A.1 se presenta un ejemplo para la elaboración de una carta de control (figura A.1) para pruebas con Daphnia magna utilizando como compuesto tóxico de referencia al cromo (VI). Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Tabla A.1. Resultados de CL50 obtenidos a (VI) como compuesto tóxico de referencia. Número de CL50-48h (mg Cr(VI)/L) Bioensayo 1 0.16 2 0.18 3 0.17 4 0.19 5 0.16 6 0.17 7 0.18 8 0.18 9 0.17 10 0.18 11 0.16 12 0.17 13 0.16 14 0.17 15 0.18 16 0.16 17 0.16 18 0.17 19 0.17 20 0.17 Promedio 0.1705 Desviación 0.0089 Estándar CV (%) 5.20 48 horas con Daphinia magna utilizando cromo Límites de confianza al 95% (mg Cr(VI)/L) 0.15 – 0.18 0.16 – 0.19 0.16 – 0.19 0.18 – 0.20 0.15 – 0.17 0.16 – 0.19 0.17 – 0.19 0.16 – 0.19 0.16 – 0.18 0.17 – 0.19 0.15 – 0.18 0.16 – 0.18 0.15 – 0.17 0.16 – 0.19 0.16 – 0.19 0.15 – 0.17 0.15 – 0.18 0.15 – 0.18 0.16 – 0.18 0.16 – 0.18 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) CL50-48h (mg Cr +6 /L) 0.2 0.19 Promedio + 2s= 0.18 0.18 0.17 Promedio = 0.17 0.16 0.15 Promedio - 2s= 0.15 0.14 0.13 0.12 0.11 0.1 0 5 10 15 20 Número del Bioensayo Figura A.1. Carta control para Daphnia magna usando cromo VI) como compuesto tóxico de referencia. Preparación de soluciones de control Control Positivo Generalmente, como control positivo se utiliza una solución del compuesto tóxico de referencia con una concentración cercana a la CL50/CE50/CI50. Para su elaboración, se prepara inicialmente una solución estándar con una alta concentración, a partir de la cual se preparan soluciones menos concentradas, utilizando como diluente agua dura reconstituida (USEPA, 1993) o el medio recomendado para cada prueba. En todos estos procedimientos se debe emplear para la preparación de los compuestos tóxicos de referencia reactivos con Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) pureza mínima del 99.5% y material volumétrico clase A calibrado. Estas diluciones deben prepararse hasta obtener una concentración cercana al valor promedio de la CL50/CE50/CI50 obtenida en cada laboratorio. Preparación de las soluciones para determinación de la CL50/CE50/CI50 del compuesto tóxico de referencia Cada laboratorio debe conocer el patrón de respuesta de sus organismos al compuesto tóxico de referencia, lo cual permitirá determinar las concentraciones óptimas para elaborar la curva dosis-respuesta. Para determinar el volumen de solución estándar necesario para la preparación de la concentración de interés, puede emplearse la siguiente regla: Vi * Ci =V f *C f Donde: Vi y Vf = volúmenes iniciales y finales Ci y Cf = concentraciones iniciales y finales Se recomienda hacer verificaciones periódicas de la concentración del compuesto tóxico, dado que fenómenos de volatilización, evaporación, etc., pueden afectar la concentración del compuesto en la solución. Preservación de las soluciones del compuesto tóxico de referencia Las soluciones del compuesto tóxico de referencia deben mantenerse en frascos ámbar o protegidos de la luz con cubierta de papel aluminio a una temperatura de 4 ± 2 ºC (refrigeración). En estas condiciones de preservación, la solución de prueba puede perdurar por más de 45 días y la solución estándar por más de 6 meses. Mientras no se detecten resultados fuera de los límites normales de respuesta indicado por la carta control del compuesto tóxico de referencia, los patrones podrán usarse por un prolongado período de tiempo. Sin embargo, se sugiere efectuar su renovación a los 45 días y 6 meses, respectivamente. Es importante también, realizar la valoración química de la solución de prueba. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Preparación del control negativo El control negativo corresponde a una solución del medio de cultivo del organismo, o puede utilizarse agua reconstituida con las características de pH, dureza y alcalinidad óptimas para el desarrollo de los organismos o agua salina, como en el caso de Vibrio fischeri. Cualquiera que sea la solución seleccionada existe un porcentaje de efecto máximo que no debe ser superado durante las pruebas. Para la preparación de estos controles se debe seguir los procedimientos recomendados en cada una de las pruebas. Blanco de procedimiento Cuando las muestras son sometidas a un proceso de extracción o concentración previo a un análisis de toxicidad, se recomienda incluir un blanco de procedimiento por cada lote de muestras. La preparación del blanco depende del método aplicado; sin embargo, se debe seguir todo el protocolo establecido para la muestra. La toxicidad resultante en este blanco no debe exceder el 10% (APHA, 1998), en caso contrario los resultados quedan invalidados, pues la respuesta estaría indicando interferencias producto del procesamiento de la muestra. Replicabilidad y sensibilidad La sensibilidad de las pruebas depende del número de réplicas por concentración, nivel de significancia establecido y tipo de análisis estadístico que se lleve a cabo. Por esta razón, cuando la variabilidad permanece constante, la sensibilidad de la prueba puede incrementarse aumentando el número de réplicas. Sin embargo, el mínimo número de réplicas variará con los objetivos de la prueba y el método estadístico seleccionado para el análisis de los datos. Existen muchos factores que pueden afectar el éxito y la precisión de un ensayo de toxicidad, los más importantes son: Experiencia y habilidad del analista Edad, condición y sensibilidad de los organismos de prueba Calidad del agua de dilución Control de temperatura Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Calidad y cantidad de alimento suministrado a los organismos Por tanto, los resultados dependen del origen y tipo de las especies utilizadas y de las condiciones bajo las cuales se llevan a cabo las pruebas, tales como temperatura, oxígeno disuelto, alimento y calidad del agua de dilución. Igualmente, la replicabilidad y precisión serán función del número de organismos utilizados por concentración. La capacidad del personal del laboratorio para obtener resultados consistentes y precisos debe demostrarse con el compuesto tóxico de referencia, antes de llevar a cabo pruebas con muestras. La precisión para cada prueba debe establecerse por lo menos con cinco ensayos con el tóxico de referencia. Muestras duplicada Las muestras duplicadas corresponden a muestras colectadas al mismo tiempo en una misma fuente. Cuando se colectan menos de cinco muestras no es necesario tomar duplicados. Cuando el número de muestras está entre 5 y 10 se debe tomar una muestra por duplicado; si son más de 10 se debe tomar el 10% del total de muestras como duplicados. Cada muestra duplicada debe procesarse y ensayarse bajo las mismas condiciones de las otras muestras. Los resultados de CE50/CL50/CI50 obtenidos de muestras duplicadas de una muestra deben ser analizados mediante una prueba estadística para establecer si las diferencias observadas son o no estadísticamente significativas (APHA, 1992). Este análisis puede efectuarse de forma manual siguiendo el desarrollo que se muestra a continuación: Cálculo de factores Réplica1 CE 50 ⋅1 F1 = Min ⋅ IC ⋅1 Réplica 2 CE 50 ⋅ 2 F2 = Min ⋅ IC ⋅ 2 Donde: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) F = Factor para establecer los límites, con un 95% de confianza, del valor de CE50 CE50 = definido como CE50 en el reporte impreso de la prueba en caso de emplear los programas de cálculo automáticos Min IC = límite inferior del intervalo de confianza Relación de factores F1, 2,3 = Anti log (log F1 ) 2 + (log F2 ) 2 + (log F3 ) 2 Relación entre los valores de CE50 de las réplicas de acuerdo a: CE50 max CE50 min Significancia A partir de los cálculos anteriores, si la resultante de CE50 max/CE50 min excede el valor obtenido para F1,2, entones las diferencia entre las CE50 de las muestras replicadas es significativa, mientras que en el caso de ser menor o igual la diferencia será no significativa. Puntos finales El objetivo de un ensayo de toxicidad en una muestra de agua, efluente o compuesto puro es estimar la concentración segura o concentración a la cual no se observa efecto; sin embargo, este término es más un concepto biológico que un resultado estadístico, por lo que los resultados aquí utilizados serán: la concentración más alta a la cual no se observa efecto (NOEC); la concentración más baja a la que se observa efecto (LOEC), la concentración efectiva (CE) la cual corresponde a una estimación de la concentración del compuesto tóxico que puede causar un efecto adverso observable mediante una respuesta discreta en un porcentaje dado de organismos; concentración letal (CL) la cual corresponde a la concentración del tóxico o efluente o muestra que causa la muerte a un determinado porcentaje de la población expuesta y concentración inhibitoria (CI) la cual corresponde a la Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) concentración del compuesto tóxico, muestra o efluente que puede producir una reducción de una respuesta biológica en una población expuesta. El valor de la CL50/CE50/CI50 se debe obtener tanto para el compuesto tóxico de referencia como para las muestras simples o duplicadas. Para el cálculo de la CL50/CE50/CI50 se puede utilizar técnicas de estimación de punto como los métodos Probit, Spearman-Karber, Gráfico, etc., para lo cual se puede utilizar programas computacionales especialmente diseñados. Un ejemplo es la versión de la USEPA Probit 1.5. Referencias. American Public Health Association (APHA). 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th ed. Washington D.C.. Ap. 8010G. pag 8-20-8-23. American Public Health Association (APHA). 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20th ed. Washington D.C. United Sates Environmental Protection Agency (USEPA). 1993. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluent and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. 4th ed. Weber, C.I., Ed., EPA-600/4-90-027. United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1994. Short Term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms. 3rd ed. EPA 600/4-91-002. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PREPARACIÓN DE TOXICOS DE REFERENCIA Proyecto: Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas”, 1. Daphnia magna Pesar 0.045 g de (K2Cr2O7) Dicromato de potasio y llevar a 100m L con AGUA DESTILADA para el preparado de solución de 160 ppm como Cromo VI A partir de esta concentración se prepararán soluciones de <2 ppm, ejemplo: Si deseas preparar una serie de diluciones de 0.20, 0.16, 0.12 ppm etc.. la preparación de la primera requerirá de tomar 2.5 mL de la solución de 160 ppm y llevar a 2L con AGUA DURA SIN SELENITO DE SODIO NI VITAMINAS, la segunda tomaras 2 mL y la tercera 1.5 mL. Para llevar a ese mismo volumen con agua dura. Las diluciones distintas de aquella cercana a la que resulte la CE50 pueden prepararse en volúmenes mucho menores, de 100mL, cada vez que se planea preparar curva para evaluación del tóxico de referencia, sin embargo recuerde preparar por lo menos 2 L de aquella concentración que resulte cercana a la CE50, ya que destinará 500mL para su valoración y el resto para la preparación del control positivo que acompañara al análisis de las muestras problema a lo largo de toda su intercalibración. 2. Selenastrum capricornutum Pesar aproximadamente 0.2511 gr de Sulfato de Cobre y llevar a 100mL con AGUA DESTILADA, esta solución tendrá una concentración de 1000 ppm como Cu II (A). A partir de esta solución Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) madre (A) se prepara una segunda solución tomando 1 mL de (A) la primera y se afora a 100 mL con AGUA DESTILADA, se obtendrá una concentración de 10 ppm como Cu II. A partir de esta concentración se prepararán soluciones de < 0.1ppm , ejemplo: Si se desea preparar una serie de diluciones de 0,08, 0.06, 0.04, 0.02 ppm, puede optar por hacer la adición directa a los tres viales de centelleo. En este caso para preparar la primera concentración (0.08 ppm) tendría que adicionar 20 μL (microlitros) de la solución B a cada uno de los viales adicionando el volumen que reste para alcansar los 2.5 ml con MEDIO BUFFER DE NaHCO3 (ver desarrollo de prueba) y que este caso seria 2480 μL, en el caso de la segunda 15 μL con 2885 μL de buffer, la tercera 10 μL y 2490 μL de buffer y así sucesivamente. Puede optar por preparar las soluciones en recipientes como matraz aforados de 10 mL en cuyo caso, y siguiendo el mismo ejemplo de las concentraciones anteriores, requeriría de adicionar 80 μL (microlitros) y aforar a 10 mL con la solución BUFFER DE NaHCO3 , para la de 0.06 adicionar 60 μL y así sucesivamente. Las diluciones distintas de aquella cercana a la que resulte la CI50 pueden prepararse en los volúmenes mencionados o directamente en los viales de prueba, sin embargo recuerde que para la concentración cercana a la CI50 requiere preparar por lo menos 2 L de la solución ya que destinará 500mL para su valoración y el resto para las pruebas del tóxico de referencia que acompañara la evaluación de las muestras problema a lo largo de toda la intercalibración. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) SUBCOORDINACIÓN DE HIDROBIOLOGÍA Y EVALUACIÓN AMBIENTAL. ASUNTO: Instructivo para manejo de muestras ciegas Jiutepec, Mor., a 16 de julio de 2007 TERCER GRUPO DE MUESTRAS (FASE III) Antes de iniciar cualquier actividad con el manejo de sus muestras PRIMERO LEA ESTE INSTRUCTIVO PREPARATIVOS PREVIOS: 1) Iniciar con la preparación de agua dura sin vitaminas ni Selenito de sodio, de acuerdo a la guía señalada en su protocolo para el desarrollo de pruebas con Daphnia magna, 5 litros bastara para efectuar los análisis con D.magna. D. exilis y Selenastrum capricornutum. 2) El agua dura antes mencionada se empleará como medio de dilución de los volúmenes contenidos en los viales del 1al 4 que usted recibirá y que contienen 2mL de una solución tóxica, MANEJELA CON CUIDADO. 3) Preparar 4 matraces aforados de 500mL lavados adecuadamente con ácidos y enjuagues de agua destilada, de acuerdo al procedimiento indicado para manejo de material destinado a pruebas toxicológicas (omita el paso del horneado). El material debe garantizar el no estar contaminado, idealmente emplee material nuevo o cuyo uso previo usted conozca. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PRUEBA: 4) Adicionar un volumen de aproximadamente 200mL de agua dura (ver 1) en cada matraz aforado previamente etiquetado con los números que correspondan (1, 2, 3 y 4) posteriormente vacíe el contenido de lo viales en los matraces con ayuda de una pipeta automática de volumen de 1mL o pipeta Pasteur u otros que le permitan transferir el volumen sin derramarlo y sin escurrirlo por las paredes del matraz. Es importante que la solución caiga directa sobre el agua dura contenida. Una vez vacío el vial llénelo con agua dura (sin derramar) y repita la operación de vaciado y transferencia al matraz empelando el mismo material usado en el vaciad o inicial. Realice cinco veces esta operación a fin de lograr lo enjuagues suficientes para garantizar la recuperación total de la solución trasferida al matraz. Posteriormente tape y agite cuidadosamente el matraz en movimientos circulares (no lo invierta). Una vez homogeneizada la solución adicione el resto de volumen de agua dura hasta alcanzar la línea de aforo del matraz de 500 mL. Tape el matraz asegurando el esmeril y agite, en esta ocasión invierta un par de veces para homogeneizar la solución. CUIDADOS 5) Una vez preparadas sus soluciones cúbralas con papel aluminio, etiquételas externamente con los números correspondientes (10-13) y manténgalas cerradas siempre en refrigeración después de cada uso. 6) Cada vez que emplee las soluciones, vacíe los volúmenes necesarios en copas desechables o viales o cualquier material nuevo libre de tóxicos para de este transferir a sus sistemas de prueba, NUNCA TOME VOLUMENES DIRECTO DEL MATRAZ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) INSERTANDO PUNTAS O PIPETAS EN SU INTERIOR, SU SOLUCION SE PUEDE CONTAMINAR. PREPARACIÓN DE DILUCIONES PARA PRUEBA En todos los casos realizar ensayos de búsqueda, con curvas concentraciones No. Muestra 10 11 12 13** Daphnia magna BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA Daphnia exilis BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA S. capricornutum BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA BUSQUEDA con 4 Las diluciones de las muestras deben prepararse con base en los procedimientos específicos para D. magna, D. exilis y S. capricornutum. Prepárelas de forma directa, es decir ej: Si pretende preparar una muestra al 6% en 100 mL, tome 6 mL con pipeta preferentemente automática o en su defecto serológica de volumen adecuado, coloque en matraz aforado y lleve a la marca de aforo en matraz de 100mL (para D. magna y/o D. exilis) o use para S. capricornutum los volúmenes que correspondan con base a las indicaciones de la preparación de prueba. Precauciones : • No use la estrategia de preparar las diluciones de forma secuencial. Dilución secuencial es la forma de preparación que se basa en el uso de un volumen de la dilución previa para preparar la subsiguiente. NO USE ESTE MÉTODO Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) • Utilice material nuevo o adecuadamente lavado. • Emplee material aforado y clase AA. ENVIO DE RESULTADOS Los resultados deberán ser enviados antes de 31 de agosto vía electrónica a [email protected] o [email protected], los cuales, SIN EXCEPCIÓN, deberán enviarse en la forma en que se le indican a continuación. A) Enviar en tres mensajes, cada uno conteniendo la información de cada prueba por separado. Cada mensaje deberá contener los archivos correspondientes: 1. La carta control que corresponda (D. magna, D. exilis y Selenastrum capricornutum) con datos actualizados. La carta deberá presentarse en el archivo Excel proporcionado a ustedes previamente (se anexa nuevamente al presente mensaje). 2. Los archivos de datos tanto del PROBIT como del FORMATO CON LOS DATOS EXPERIMENTALES obtenidos. Deberán ser un total de dos archivos por muestra para cada prueba. Si el formato PROBIT lo pasan a Word abriéndolo con lo block de notas, copiándolo e insertándolo en Word, pueden entonces generar un solo archivo para los reportes probit que incluyan los cuatro resultados correspondientes al set de muestras analizadas, sin embargo no olviden enviar el formato con datos (estos últimos se anexan nuevamante a la presente). 3. Para fácil identificación, sus archivos deberán nombrarse de la siguiente manera: ej. 10DmCENICA 10DeCENICA 10ScCENICA Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Indica: Muestra 10 para Daphnia magna (Dm), Daphnia exilis (De) y Selenastrum capricornutum (Sc) de CENICA (institución que corresponda). ATENTAMENTE M.C. YOLANDA PICA GRANADOS Investigado Titular A. Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) SUBCOORDINACIÓN DE HIDROBIOLOGÍA Y EVALUACIÓN AMBIENTAL. ASUNTO: Instructivo para manejo de muestras ciegas Jiutepec, Mor., a 16 de julio de 2007 ANALISIS DE SÓLIDOS (FASE III) PARA USO EXCLUSIVO DE CENICA Antes de iniciar cualquier actividad con el manejo de sus muestras PRIMERO LEA ESTE INSTRUCTIVO Se envía a ustedes dos muestras de sedimentos, que acompañan a las cuatro muestras ciegas, con el objetivo de que efectúen con ellas el procedimiento en el cual se instruyeron durante el segundo taller del proyecto “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas”. Ambas muestras se encuentran secas, molidas y tamizadas por lo que solo será necesario monten su sistema de extracción y realicen dicho procedimiento así como el de generación de elutriados. No olvide montar en paralelo su sistema control o blanco de procedimiento. Una vez obtenido el extracto efectúe el análisis del mismo con D. magna no olvide que en caso del extracto orgánico (metanol) la dosis de este solvente en el sistema de prueba nunca podrá ser mayor al 1% para D. magna. En el caso del elutriado no existe tal limitación salvo el control de la dureza del agua en el sistema de prueba . Por favor si tiene dudas sobre el desarrollo de las pruebas no dude en comunicarse con nosotros. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Agradecería, enviar a los resultados de estas muestras, así como las del blanco de procedimiento para el día 17 de agosto. Si bien puede emplear el formato de resultados de D.magna, aplicable a las muestras ciegas será necesario que anote, en la parte de observaciones los siguientes datos: Peso extraído, volumen al que fue llevado el extracto (aprox. 4ml) o el elutriado, volumen del elutriado o del extracto adicionado al sistema de prueba en su concentración inicial y volumen total de líquidos en el sistema de prueba. No efectué los cálculos de probit, solo envié los datos obtenidos capturados en el formato de la prueba que corresponda anotando las concentraciones o dosis trabajadas. Precauciones : • No use la estrategia de preparar las diluciones de forma secuencial. Dilución secuencial es la forma de preparación que se basa en el uso de un volumen de la dilución previa para preparar la subsiguiente. NO USE ESTE MÉTODO • Utilice material nuevo o adecuadamente lavado. Emplee material aforado y clase AA, así como pipetas automáticas previamente calibradas en los volúmenes de uso en prueba. ATENTAMENTE M.C. YOLANDA PICA GRANADOS Investigado Titular A. Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) CARTA CONTROL DE Daphnia exilis bioensayos realizados en CENICA FECHA 21-Ago-07 17-Sep-07 15-Oct-07 06-Nov-07 21-Nov-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 +6 EC50 Cr 0.107 0.109 0.123 0.104 0.101 D. Exilis 0.1088 0.1088 0.1088 0.1088 0.1088 Media - 2sd 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 Media +2sd 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.17 0.15 L.S 0.13 PROM 0.11 0.09 0.07 L.I 0.05 0 Media Dst Media + 2sd Media -2sd No. secuencial 2 4 6 0.1088 0.00850 0.13 -0.09 Cr +6 CE50 mg/L Análisis Probit 1 2 3 4 5 Mean St. Dev. CV Mean +2sd Mean - 2sd 0.107 0.109 0.123 0.104 0.101 0.1088 0.008497058 7.809796245 0.18 0.12 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia exilis FECHA 02-Sep-07 06-Sep-07 06-Sep-07 13-Sep-07 13-Sep-07 CNA No. secuencial 1 2 3 4 5 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.158 0.143 0.119 0.135 0.135 0.1380 0.01418 0.1664 0.1096 10.27 Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr IV 0.16 Promedio +2σ.= 0.166 CL 50 (mg/L) INSTITUCIÓN: 0.14 Promedio = 0.138 0.12 Promedio -2σ.= 0.109 0.1 1 2 3 4 5 6 Número de experimento FECHA 02-Sep-07 06-Sep-07 06-Sep-07 13-Sep-07 13-Sep-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.158 0.143 0.119 0.135 0.135 0.1380 0.01418 0.1664 0.1096 10.27 Media - 2sd 0.1096 0.1096 0.1096 0.1096 0.1096 ;edia 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 Media +2sd 0.1664 0.1664 0.1664 0.1664 0.1664 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia exilis INSTITUCIÓN: Instituto Mexicano del Petróleo LC50 Cr VI 0.148 0.142 0.144 0.159 0.1483 0.00759 0.1634 0.1331 5.12 Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr VI 0.17 Promedio +2σ.= 0.1343 0.16 CL 50 (mg/L) FECHA No. secuencial 02-Ago-07 1 15-Ago-07 2 23-Ago-07 3 30-Ago-07 4 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación Promedio = 0.103 0.15 0.14 Promedio -2σ= 0.071 0.13 0.12 1 2 3 4 Número de experimento FECHA No. secuencial 02-Ago-07 1 15-Ago-07 2 23-Ago-07 3 30-Ago-07 4 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.148 0.142 0.144 0.159 0.1483 0.00759 0.1634 0.1331 5.12 Media Media - 2sd Media + 2sd 0.1331 0.1480 0.1634 0.1331 0.1480 0.1634 0.1331 0.1480 0.1634 0.1331 0.1480 0.1634 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia exilis INSTITUCIÓN. IMTA LC50 Cr VI 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.101 0.123 0.125 0.115 0.128 0.1031 0.01562 0.1343 0.0718 15.16 Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr VI Promedio +2σ.= 0.1343 0.14 0.13 0.12 CL 50 (mg/L) No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación 0.11 Promedio = 0.103 0.1 0.09 0.08 0.07 Promedio -2σ= 0.071 0.06 0.05 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Número de experimento No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.101 0.123 0.125 0.115 0.128 0.1031 0.01562 0.1343 0.0718 15.16 Media 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 Media - 2sd 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 Media +2sd 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.085 0.084 0.098 0.114 0.096 0.101 0.123 0.125 0.115 0.128 0.1031 0.01562 0.1343 0.0718 15.16 Media 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 0.10306667 Media - 2sd 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 0.0718 Media +2sd 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 0.1343 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Hidrobiología Experimental PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas FECHA No. secuencial LC50 Cr VI 12-Jun-07 1 0.106 13-Jun-07 2 0.108 14-Jun-07 3 0.101 19-Jun-07 4 0.101 20-Jun-07 5 0.163 20-Jun-07 6 0.153 21-Jun-07 7 0.115 21-Jun-07 8 0.104 21-Jun-07 9 0.075 22-Jun-07 10 0.137 25-Jun-07 11 0.125 25-Jun-07 12 0.106 26-Jun-07 13 0.148 26-Jun-07 14 0.164 27-Jun-07 15 0.141 27-Jun-07 16 0.111 27-Jun-07 17 0.115 28-Jun-07 18 0.096 28-Jun-07 19 0.107 03-Jul-07 20 0.135 Media 0.1206 Dst 0.02411 Media + 2sd 0.1688 Media -2sd 0.0723 Coef. Variación 20.00 Organismo: Daphnia exilis 48h Toxicidad Aguda Tóxico de referencia: Cr(IV) 0.200 Promedio +2σ.= 0.1688 0.150 CL 50 (mg/L) CARTA CONTROL Daphnia exilis FECHA No. secuencial LC50 Cr VI 12-Jun-07 1 0.106 13-Jun-07 2 0.108 14-Jun-07 3 0.101 19-Jun-07 4 0.101 20-Jun-07 5 0.163 20-Jun-07 6 0.153 21-Jun-07 7 0.115 21-Jun-07 8 0.104 21-Jun-07 9 0.075 22-Jun-07 10 0.137 25-Jun-07 11 0.125 25-Jun-07 12 0.106 26-Jun-07 13 0.148 26-Jun-07 14 0.164 27-Jun-07 15 0.141 27-Jun-07 16 0.111 27-Jun-07 17 0.115 28-Jun-07 18 0.096 28-Jun-07 19 0.107 03-Jul-07 20 0.135 Media 0.1206 Dst 0.02411 Media + 2sd 0.1688 Media -2sd 0.0723 Coef. Variación 20.00 Promedio = 0.1206 0.100 Promedio -2σ.= 0.0723 0.050 0.000 0 5 10 15 20 Número de ensayo Media Media - 2sd Media +2sd 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 0.1206 0.0723 0.1688 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia exilis INSTITUCIÓN: UAM-I LC50 Cr VI 0.077 0.087 0.079 0.087 0.071 0.077 0.071 0.08 0.071 0.072 0.068 0.074 0.0762 0.00624 0.0886 0.0637 8.19 Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr VI 0.1 0.095 Promedio +2σ.= 0.0886 0.09 CL 50 (mg/L) No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación 0.085 0.08 Promedio = 0.0762 0.075 0.07 0.065 0.06 Promedio -2σ= 0.0637 0.055 0.05 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Número de experimento No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.077 0.087 0.079 0.087 0.071 0.077 0.071 0.08 0.071 0.072 0.068 0.074 0.0762 0.00624 0.0886 0.0637 8.19 Media - 2sd 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 Media Media + 2sd 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 0.0762 0.09 Media Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) CARTA CONTROL DE Daphnia Magna bioensayos realizados en CENICA FECHA 09-Jul-07 09-Jul-07 17-Jul-07 30-Jul-07 01-Ago-07 31-Ago-07 18-Sep-07 10/10/2007 05/11/2007 21/11/2007 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EC50 Cr +6 0.169 0.104 0.097 0.171 0.099 0.109 0.123 0.104 0.101 0.107 D. Magna 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 Media - 2sd Media +2sd 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.18 0.16 L.S 0.14 0.12 0.1 PROM 0.08 0.06 L.I 0.04 0.02 0 0 Media Dst Media + 2sd Media -2sd No. secuencial 2 4 6 8 10 12 0.1184 0.02812 0.17 -0.06 Cr +6 CE50 mg/L Análisis Probit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mean St. Dev. CV Mean +2sd Mean - 2sd 0.169 0.104 0.097 0.171 0.099 0.109 0.123 0.104 0.101 0.107 0.1184 0.028123537 23.75298733 0.18 0.12 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media Dst Media + 2sd Media -2sd EC50 Cr +6 Media - 2sd D. magna 0.16 0.153 0.167 0.153 0.157 0.156 0.168 0.156 0.15 0.15 0.161 0.163 0.151 0.15 0.14 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 0.1556 Media +2sd 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.155666667 0.00737 0.17 -0.14 PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa INSTITUCIÓN CNA No. secuencial Cr +6 CE50 mg/L LABORATORIO Análisis Probit 0.16 0.153 0.167 0.153 0.157 0.156 0.168 0.156 0.15 0.15 0.161 0.163 0.151 0.15 0.14 0.155666667 0.007374344 4.737266081 0.22 0.19 01-Sep-07 Organismo: Daphnia magna 48h mortalidad Tóxico de referencia: Cr+6 en agua dura 0.18 Promedio +2σ.= 0.20 0.17 CL 50 (mg/L) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Mean St. Dev. CV Mean +2sd Mean - 2sd FECHA: CNA 0.16 0.15 Promedio = 0.155 0.14 0.13 Promedio -2σ.= 0.13 0.12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Número de experimento Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia magna INSTITUCIÓN: Instituto Mexicano del Petróleo No. secuencial 2 3 4 6 7 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.162 0.163 0.157 0.142 0.148 0.1544 0.00913 0.1727 0.1361 5.91 Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr IV Promedio +2σ.= 0.1727 0.17 CL 50 (mg/L) FECHA 27-Jul-07 10-Ago-07 17-Ago-07 25-Ago-07 30-Ago-07 Promedio = 0.1544 0.15 Promedio -2σ.= 0.1361 0.13 1 2 3 4 Número de experimento FECHA 27-Jul-07 10-Ago-07 17-Ago-07 25-Ago-07 30-Ago-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.162 0.163 0.157 0.142 0.148 0.1544 0.00913 0.1727 0.1361 5.91 Media Media - 2sd Media +2sd 0.1544 0.1361 0.1727 0.1544 0.1361 0.1727 0.1544 0.1361 0.1727 0.1544 0.1361 0.1727 0.1544 0.1361 0.1727 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 5 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia magna INSTITUCIÓN: IMTA No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.153 0.151 0.158 0.153 0.152 0.16 0.14 0.15 0.14 0.155 0.147 0.147 0.16 0.147 0.153 0.158 0.152 0.167 0.166 0.156 0.157 0.17 0.16 0.175 0.167 0.1558 0.00873 0.1732 0.1383 5.61 FECHA May-06 May-06 May-06 May-06 May-06 Oct-06 Oct-06 Oct-06 Oct-06 Ene-07 Ene-07 Ene-07 Ene-07 Mar-07 Abr-07 Abr-07 Abr-07 Jul-07 Jul-07 Jul-07 Jul-07 Oct-07 Oct-07 Oct-07 Oct-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.153 0.151 0.158 0.153 0.152 0.16 0.14 0.15 0.14 0.155 0.147 0.147 0.16 0.147 0.153 0.158 0.152 0.167 0.166 0.156 0.157 0.17 0.16 0.175 0.167 0.1558 0.00873 0.1732 0.1383 5.61 Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr IV 0.18 Promedio +2σ.= 0.1727 CL 50 (mg/L) FECHA May-06 May-06 May-06 May-06 May-06 Oct-06 Oct-06 Oct-06 Oct-06 Ene-07 Ene-07 Ene-07 Ene-07 Mar-07 Abr-07 Abr-07 Abr-07 Jul-07 Jul-07 Jul-07 Jul-07 Oct-07 Oct-07 Oct-07 Oct-07 0.16 Promedio = 0.1544 0.14 Promedio -2σ.= 0.1361 0.12 1 2 3 4 Número de experimento Media - 2sd 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 0.138 Media 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 0.1558 Media +2sd 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 0.1732 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 5 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Hidrobiología Experimental PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia magna ENCB, IPN Organismo: Daphnia magna ENCB 48h Toxicidad Aguda Tóxico de referencia: Cr(IV) Promedio +2σ.= 0.1990 0.2 CL 50 (mg/L) FECHA No. secuencial LC50 Cr VI 07-Ago-07 1 0.15 07-Ago-07 2 0.14 08-Ago-07 3 0.16 09-Ago-07 4 0.17 14-Ago-07 5 0.16 15-Ago-07 6 0.18 15-Ago-07 7 0.17 16-Ago-07 8 0.19 03-Oct-07 9 0.13 21-Ago-07 10 0.17 22-Ago-07 11 0.19 25-Jun-07 12 0.19 26-Jun-07 13 0.19 26-Jun-07 14 0.16 26-Sep-07 15 0.19 03-Oct-07 16 0.18 10-Oct-07 17 0.21 18-Oct-07 18 0.22 Media 0.1750 Dst 0.02307 Media + 2sd 0.2211 Media -2sd 0.1289 Coef. Variación 13.18 Promedio = 0.1667 0.15 Promedio -2σ.= 0.1344 0.1 0 FECHA No. secuencial LC50 Cr VI Media - 2sd media 07-Ago-07 1 0.15 0.1289 0.175 07-Ago-07 2 0.14 0.1289 0.175 08-Ago-07 3 0.16 0.1289 0.175 09-Ago-07 4 0.17 0.1289 0.175 14-Ago-07 5 0.16 0.1289 0.175 15-Ago-07 6 0.18 0.1289 0.175 15-Ago-07 7 0.17 0.1289 0.175 16-Ago-07 8 0.19 0.1289 0.175 03-Oct-07 9 0.13 0.1289 0.175 21-Ago-07 10 0.17 0.1289 0.175 22-Ago-07 11 0.19 0.1289 0.175 25-Jun-07 12 0.19 0.1289 0.175 26-Jun-07 13 0.19 0.1289 0.175 26-Jun-07 14 0.16 0.1289 0.175 26-Sep-07 15 0.19 0.1289 0.175 03-Oct-07 16 0.18 0.1289 0.175 10-Oct-07 17 0.21 0.1289 0.175 18-Oct-07 18 0.22 0.1289 0.175 Media 0.1750 Dst 0.02307 Media + 2sd 0.2211 Media -2sd 0.1289 Coef. Variación 13.18 5 10 Número de ensayo Media +2sd 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 0.2211 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Daphnia magna INSTITUCIÓN: UAM-I No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.144 0.124 0.17 0.147 0.157 0.151 0.154 0.133 0.144 0.147 0.157 0.151 0.1483 0.01181 0.1719 0.1246 7.97 Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad Tóxico de referencia: Cr IV Promedio +2σ.= 0.1727 0.17 CL 50 (mg/L) FECHA 06-Sep-06 08-Sep-06 13-Sep-06 20-Sep-06 21-Sep-06 25-Sep-06 18-Ene-07 24-Ene-07 11-Oct-07 18-Oct-07 01-Nov-07 07-Nov-07 Promedio = 0.1544 0.15 0.13 Promedio -2σ.= 0.1361 0.11 1 2 3 4 5 Número de experimento FECHA 06-Sep-06 08-Sep-06 13-Sep-06 20-Sep-06 21-Sep-06 25-Sep-06 18-Ene-07 24-Ene-07 11-Oct-07 18-Oct-07 01-Nov-07 07-Nov-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI Media - 2sd 0.144 0.12 0.124 0.12 0.17 0.12 0.147 0.12 0.157 0.12 0.151 0.12 0.154 0.12 0.133 0.12 0.144 0.12 0.147 0.12 0.157 0.12 0.151 0.12 0.1483 0.01181 0.1719 0.1246 7.97 Media Media +2sd 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 0.148 0.17 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) “Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum FECHA 07-Ago-07 07-Ago-07 10-Ago-07 10-Ago-07 13-Ago-07 13-Ago-07 No. secuencial +2 EC50 Cu 1SCEN 2SCEN 3SCEN 4SCEN 5SCEN 6SCEN Media Dst Media + 2sd Media -2sd CV Media - 2sd 0.036 0.026 0.035 0.034 0.023 0.026 0.030 0.006 0.041 0.019 45.480 S. Capricorn Media +2sd 0.019 0.019 0.019 0.019 0.019 0.019 0.030 0.030 0.030 0.030 0.030 0.030 0.041 0.041 0.041 0.041 0.041 0.041 PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa INSTITUCIÓN: CENICA No. secuencial Cr +6 CE50 mg/L Análisis Probit 07-Ago-07 07-Ago-07 10-Ago-07 10-Ago-07 13-Ago-07 13-Ago-07 1SCEN 2SCEN 3SCEN 4SCEN 5SCEN 6SCEN Mean St. Dev. CV Mean +2sd Mean - 2sd 0.036 0.026 0.035 0.034 0.023 0.026 0.030 0.006 18.738 0.041 0.019 Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral 0.046 LABORATORIO FECHA: CNA 01-Ago-06 Promedio +2σ.= 0.04 0.041 CL 50 (mg/L) FECHA 0.036 Promedio = 0.025 0.031 0.026 0.021 0.016 Promedio -2σ.= 0.009 0.011 0.006 0.001 1 3 Número de experimento 5 7 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) “Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum FECHA 29-Sep-06 29-Sep-06 29-Sep-06 03-Nov-06 03-Nov-06 08-Dic-06 19-Ene-07 02-Feb-07 06-Ago-07 16-Ago-07 17-Ago-07 20-Ago-07 27-Ago-07 No. secuencial +2 EC50 Cu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Media Dst Media + 2sd Media -2sd S. Capricornutum Media - 2sd 0.022 0.022 0.022 0.018 0.02 0.027 0.009 0.023 0.024 0.027 0.033 0.034 0.04 0.025 0.008 0.040 -0.009 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 Media +2sd 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 0.040 PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa INSTITUCIÓN: CNA No. secuencial Cr +6 CE50 mg/L Análisis Probit 29-Sep-06 29-Sep-06 29-Sep-06 03-Nov-06 03-Nov-06 08-Dic-06 19-Ene-07 02-Feb-07 06-Ago-07 16-Ago-07 17-Ago-07 20-Ago-07 27-Ago-07 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Mean St. Dev. CV Mean +2sd Mean - 2sd 0.022 0.022 0.022 0.018 0.02 0.027 0.009 0.023 0.024 0.027 0.033 0.034 0.04 0.025 0.008 31.776 0.040 0.009 Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral LABORATORIO 0.046 FECHA: CNA 01-Ago-06 Promedio +2σ.= 0.04 0.041 CL 50 (mg/L) FECHA 0.036 0.031 0.026 Promedio = 0.025 0.021 0.016 0.011 0.006 0.001 -1 Promedio -2σ.= 0.009 1 3 5 7 Número de experimento 9 11 13 15 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) “Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum INSTITUCIÓN IMP 11.09.06 14.09.06 14.09.06 15.09.06 15.09.06 26.09.06 28.09.06 29.09.06 30.10.06 10.11.06 20.11.06 26.01.07 26.01.07 24.02.07 01.03.07 09.03.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07 13.07.07 13.07.07 23.07.07 23.07.07 30.07.07 06.08.07 13.08.08 13.08.08 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Media Dst Media + 2sd Media -2sd EC50 Cu Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral 0.0305 0.0336 0.0366 0.0328 0.0297 0.0357 0.0330 0.0284 0.0466 0.0390 0.0480 0.0404 0.0497 0.0437 0.0455 0.0403 0.0366 0.0469 0.0380 0.0340 0.0480 0.0390 0.0510 0.0350 0.0380 0.0310 0.0370 0.0600 0.0550 Promedio +2σ.= 0.0519 0.0500 0.0450 CL 50 (mg/L) FECHA +2 Promedio = 0.0388 0.0400 0.0350 0.0300 0.0250 Promedio -2σ.= 0.0257 0.0200 0.0150 0.0388 0.00655 0.0519 0.0257 0.0100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Número de experimento FECHA 11.09.06 14.09.06 14.09.06 15.09.06 15.09.06 26.09.06 28.09.06 29.09.06 30.10.06 10.11.06 20.11.06 26.01.07 26.01.07 24.02.07 01.03.07 09.03.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07 13.07.07 13.07.07 23.07.07 23.07.07 30.07.07 06.08.07 13.08.08 13.08.08 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Media Dst Media + 2sd Media -2sd +2 EC50 Cu 0.0305 0.0336 0.0366 0.0328 0.0297 0.0357 0.0330 0.0284 0.0466 0.0390 0.0480 0.0404 0.0497 0.0437 0.0455 0.0403 0.0366 0.0469 0.0380 0.0340 0.0480 0.0390 0.0510 0.0350 0.0380 0.0310 0.0370 Media - 2sd Media Media +2sd 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0257 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0388 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0519 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0413 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0363 0.0388 0.00655 0.0519 0.0257 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Hidrobiología Experimental PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum 07.05.07 13.11.06 13.11.06* 06.05.07 06.05.07* 02.07.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07* 03.09.07 03.09.07 03.09.07 03.09.07 * = Lamparas No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Media Dst Media + 2sd Media -2sd C:V +2 EC50 Cu 0.049 0.0498 0.05 0.0545 0.0545 0.0485 0.0428 0.0523 0.0534 0.0553 0.0387 0.0474 0.0365 0.0443 Organismo: Selenastrum capricornutum 72h inhibición Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral Promedio +2σ.= 0.0601 0.06 0.055 CL 50 (mg/L) FECHA Promedio = 0.0484 0.05 0.045 0.04 0.035 0.0484 0.00590 0.0601 0.0366 12.1934 Promedio -2σ.= 0.0366 0.03 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Número de experimento INSTITUCIÓN: IPN, ENCB FECHA 07.05.07 13.11.06 13.11.06* 06.05.07 06.05.07* 02.07.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07 02.07.07* 03.09.07 03.09.07 03.09.07 03.09.07 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Media Dst Media + 2sd Media -2sd C:V EC50 Cu+2 0.049 0.0498 0.05 0.0545 0.0545 0.0485 0.0428 0.0523 0.0534 0.0553 0.0387 0.0474 0.0365 0.0443 Media - 2sd 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 0.0366 Media 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 0.04835714 Media +2sd 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0601 0.0484 0.00590 0.0601 0.0366 12.1934 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum INSTITUCIÓN: UAM-I No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.036 0.043 0.039 0.029 0.038 0.036 0.041 0.034 0.039 0.037 0.0372 0.00388 0.0450 0.0294 10.43 Organismo: S. capricornutum 72h inhibición Tóxico de referencia: Cu II 0.05 Promedio +2σ.= 0.0886 0.045 CL 50 (mg/L) 07-Sep-06 11-Sep-06 14-Sep-06 15-Sep-06 12-Ene-07 03-Sep-07 10-se-07 01-Oct-07 11-Oct-07 29-Oct-07 0.04 Promedio = 0.0762 0.035 0.03 Promedio -2σ= 0.0637 0.025 0.02 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Número de experimento 07-Sep-06 11-Sep-06 14-Sep-06 15-Sep-06 12-Ene-07 03-Sep-07 10-se-07 01-Oct-07 11-Oct-07 29-Oct-07 No. secuencial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media Dst Media + 2sd Media -2sd Coef. Variación LC50 Cr VI 0.036 0.043 0.039 0.029 0.038 0.036 0.041 0.034 0.039 0.037 0.0372 0.00388 0.0450 0.0294 10.43 Media - 2sd 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 0.0372 Media Media + 2sd 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 0.0294 0.0450 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra Ciega 10: Exilis EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Conc. 0.1500 0.3000 0.7500 1.5000 3.0000 Number Exposed 30 30 30 30 30 Number Resp. 5 20 22 30 30 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.1667 0.6667 0.7333 1.0000 1.0000 0.1667 0.6667 0.7333 1.0000 1.0000 0.2241 0.5124 0.8588 0.9689 0.9960 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 8.403 = 7.815 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi-square value exceeds the calculated * * chi-square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu Sigma = = -0.534739 0.381235 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 6.402648 0.367787 ( 5.232349, 7.572948) Slope 2.623051 0.662664 ( 0.514454, 4.731649) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EXILIS Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 0.038 0.069 0.095 0.118 0.292 0.725 0.899 1.237 2.250 95% Confidence Limits Lower Upper 0.000 0.000 0.000 0.001 0.057 0.381 0.461 0.588 0.874 0.117 0.169 0.209 0.243 0.635 16.264 45.356 215.929 4271.367 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EXILIS PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - o o . . .. .. ... .... .... .... ... o o .... .... ... .... .... ... .... .... o .... ... .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 10 DEFINITIVA Daphnia exilis(2) 2007/09/11 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 30.0000 40.0000 50.0000 30 30 30 30 15 20 30 30 0.5000 0.6667 1.0000 1.0000 0.5000 0.6667 1.0000 1.0000 0.4266 0.8128 0.9505 0.9875 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 6.812 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 *************************************************************** * WARNING * * The tabular chi-square value exceeds the calculated * * chi-square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** * NOTE * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** Mu = 1.331405 Sigma = 0.164059 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) --------------------------------------------------------------------Intercept -3.115416 3.111219 ( -16.502991, 10.272159) Slope 6.095379 2.163985 ( -3.216249, 15.407008) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Point Conc. LC/EC 1.00 8.907 LC/EC 5.00 11.522 LC/EC 10.00 13.217 LC/EC 15.00 14.500 LC/EC 50.00 21.449 LC/EC 85.00 31.727 LC/EC 90.00 34.807 LC/EC 95.00 39.927 LC/EC 99.00 51.648 95% Confidence Limits Lower Upper 0.0858 Cr PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ - o o . . .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. ... .... 6+ .... .... ... .... o .... 5+ o ... .... .... ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 11 DEFINITIVA (2) 2007/09/05 D. exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.5000 1.0000 2.0000 3.0000 30 30 30 30 0 0 17 24 0.0000 0.0000 0.5667 0.8000 0.0000 0.0000 0.5667 0.8000 0.0000 0.0232 0.4707 0.8528 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.489 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 0.312561 Sigma = 0.156961 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 3.008670 0.419233 ( 2.186973, 3.830367) Slope 6.371010 1.166937 ( 4.083814, 8.658206) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 0.886 1.133 1.292 1.412 2.054 2.987 3.264 3.722 4.761 95% Confidence Limits Lower Upper 0.530 0.772 0.941 1.074 1.797 2.602 2.800 3.110 3.762 1.142 1.380 1.530 1.643 2.321 3.788 4.314 5.250 7.638 0.02054 Hg PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ - . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 7+ . .. .. ... .... 6+ .... .... o ... .... o .... 5+ ... .... .... ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+o o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 12 DEFINITIVA 2007/09/04 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 40.0000 60.0000 80.0000 100.0000 30 30 30 30 9 19 27 30 0.3000 0.6333 0.9000 1.0000 0.3000 0.6333 0.9000 1.0000 0.2627 0.6969 0.9085 0.9753 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 1.576 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.699240 Sigma = 0.153055 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -6.102115 1.910099 ( -9.845910, -2.358320) Slope 6.533578 1.080761 ( 4.415287, 8.651869) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 22.039 28.021 31.848 34.723 50.031 72.089 78.595 89.331 113.578 95% Confidence Limits Lower Upper 13.656 19.389 23.340 26.428 43.708 64.802 69.895 77.770 94.200 28.352 34.154 37.772 40.465 55.349 84.450 94.976 113.638 160.461 4As PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ - o . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 7+ . .. .. ... ...o 6+ .... .... ... ....o .... 5+ ... .... .... .o. .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 13 DEFINITIVA (2) 2007/09/15 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 20.0000 35.0000 50.0000 30 30 30 30 0 0 5 13 0.0000 0.0000 0.1667 0.4333 0.0000 0.0000 0.1667 0.4333 0.0000 0.0057 0.1439 0.4494 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.329 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.720029 Sigma = 0.165512 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -5.392145 2.815425 ( -10.910379, 0.126089) Slope 6.041845 1.731277 ( 2.648543, 9.435147) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 21.627 28.040 32.204 35.358 52.484 77.905 85.536 98.238 127.368 95% Confidence Limits Lower Upper 9.041 16.134 21.787 26.446 45.691 60.904 64.856 71.103 84.306 28.073 33.593 37.279 40.352 74.056 176.154 217.351 297.096 535.080 0.2099 cu PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ - . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 7+ . .. .. ... .... 6+ .... .... ... .... .... 5+ ... ..o. .... ... .... 4+ o... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia exilis Fecha de Inicio INSTITUCIÓN________IMP-M-10 06/08/2007 Fecha de Término 08/08/2007 Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No. TOTAL DE 2 3 1 ORGANISMOS No. No. No. No. No. No. Expuestos Muertos a b Inicial Final Inicial Final Inicial Final (t 0) (t 48h) CONTROL POSITIVO: Cr VI ( mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA 10 10 7 10 10 10 4 9 10 10 5 10 30 30 14 1 DILUCIÓN CE50 Obs. (%) M-10 100 10 1.0 0.1 control 10 10 10 10 10 0 4 9 9 10 10 10 10 10 10 0 4 8 10 9 10 10 10 10 10 0 2 10 9 10 30 30 30 30 30 30 20 3 2 1 6.452 0.0258 M-11 100 7 4 1 control 10 10 10 10 10 0 0 1 9 10 10 10 10 10 10 0 0 2 8 9 10 10 10 10 10 0 0 2 9 9 30 30 30 30 30 30 30 25 4 2 2.391 0.0239 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) M-12 M-13 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) 100 10 1.0 10 10 10 0 9 9 11 11 11 1 9 9 10 11 11 0 9 9 31 32 34 30 5 5 0.1 control 10 10 9 9 11 10 9 10 11 11 10 11 32 31 4 1 100 80 60 10 10 10 0 0 3 10 10 10 0 0 0 10 10 10 0 0 2 30 30 30 30 30 25 40 20 10 10 0 5 10 10 0 10 4 10 control 5 6 30 30 25 15 Control positivo________________ 11 00 29.14 0 2.33 21.32 0.0853 8 10 91 0 10 Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA Ma. Cristina González Lozano FIRMA: FECHA: 30-08-2007 RESPONSABLE S FIRMA : Juan C. Cid Núñez FECHA: 30-08-2007 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] 30 1 DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dem102007 IMTA Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.1500 30 17 0.5667 0.5667 0.5399 0.2000 30 23 0.7667 0.7667 0.8217 0.2500 30 29 0.9667 0.9667 0.9406 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.074 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.839125 Sigma = 0.152013 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 10.520085 1.359279 ( 7.855899, 13.184272) Slope 6.578384 1.825138 ( 3.001113, 10.155656) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dem102007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.064 0.018 0.094 LC/EC 5.00 0.081 0.031 0.110 LC/EC 10.00 0.092 0.041 0.119 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 15.00 0.101 0.049 0.126 LC/EC 50.00 0.145 0.106 0.164 LC/EC 85.00 0.208 0.187 0.260 LC/EC 90.00 0.227 0.201 0.308 LC/EC 95.00 0.258 0.221 0.401 LC/EC 99.00 0.327 0.261 0.669 CR 0.145 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) dem102007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ o... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM112007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0620 30 16 0.5333 0.5333 0.5484 0.1250 30 25 0.8333 0.8333 0.8059 0.2500 30 28 0.9333 0.9333 0.9447 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.246 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.257524 Sigma = 0.410840 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 8.060860 0.704409 ( 6.680218, 9.441502) Slope 2.434037 0.692079 ( 1.077562, 3.790512) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM112007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.006 0.000 0.017 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 5.00 0.012 0.001 0.026 LC/EC 10.00 0.016 0.002 0.033 LC/EC 15.00 0.021 0.003 0.038 LC/EC 50.00 0.055 0.023 0.077 LC/EC 85.00 0.147 0.110 0.276 LC/EC 90.00 0.186 0.134 0.444 LC/EC 95.00 0.262 0.173 0.930 LC/EC 99.00 0.499 0.270 3.871 0.0210 hg Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) DEM112007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o. ‐ ... ‐ .... 6+ o... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ...o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM122007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.6250 30 2 0.0667 0.0667 0.0713 1.2500 30 10 0.3333 0.3333 0.3218 2.5000 30 21 0.7000 0.7000 0.7057 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.033 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = 0.235698 Sigma = 0.299943 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 4.214191 0.186295 ( 3.849053, 4.579329) Slope 3.333966 0.681148 ( 1.998916, 4.669016) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM122007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.345 0.128 0.538 LC/EC 5.00 0.552 0.277 0.765 LC/EC 10.00 0.710 0.414 0.930 LC/EC 15.00 0.841 0.540 1.067 LC/EC 50.00 1.721 1.400 2.264 1.721 as LC/EC 85.00 3.520 2.578 6.765 LC/EC 90.00 4.170 2.933 8.901 LC/EC 95.00 5.359 3.538 13.412 LC/EC 99.00 8.579 5.001 29.113 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) DEM122007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o.. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ o... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. o ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM132007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0500 30 1 0.0333 0.0333 0.0263 0.1000 30 10 0.3333 0.3333 0.3613 0.1500 30 22 0.7333 0.7333 0.7161 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.204 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.932532 Sigma = 0.190107 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 9.905293 1.051311 ( 7.844723, 11.965862) Slope 5.260186 1.085126 ( 3.133339, 7.387033) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM132007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.042 0.021 0.057 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 5.00 0.057 0.035 0.071 LC/EC 10.00 0.067 0.045 0.080 LC/EC 15.00 0.074 0.054 0.088 LC/EC 50.00 0.117 0.101 0.138 LC/EC 85.00 0.184 0.152 0.271 LC/EC 90.00 0.205 0.165 0.323 LC/EC 95.00 0.240 0.186 0.419 LC/EC 99.00 0.323 0.232 0.686 0.117 cu Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) DEM132007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o.. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ ..o. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ o.. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia exilis Fecha de Inicio INSTITUCIÓN: __IPN-ENCB____ __21/AGO/07___ Fecha de Término _________ Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No. TOTAL DE 2 3 1 ORGANISMOS No. No. No. No. No. No. Expuestos Muertos a b Inicial Final Inicial Final Inicial Final (t 0) (t 48h) CONTROL POSITIVO: Cr VI ( mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA 10 10 10 10 10 10 30 0 DILUCIÓN CE50 Obs. 23.9 0.0933 2 1.2 0.012 (%) 10 11 20 9 8 10 7 10 6 29 8 25 30 35 40 10 10 10 10 7 3 1 1 10 10 10 10 6 1 1 1 10 10 10 10 3 3 2 1 30 30 30 30 14 23 26 27 0.8 1.6 2.4 3.2 10 10 10 10 7 3 2 2 10 10 10 10 5 7 3 1 10 10 10 10 9 1 0 1 30 30 30 30 9 15 25 26 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) a 4.0 10 0 10 1 10 0 30 30 12 30 50 70 90 10 10 10 10 10 4 0 0 10 10 10 10 10 3 0 0 10 10 10 10 10 4 1 0 30 30 30 30 0 19 29 30 47.6 13 40 60 80 10 10 10 8 6 0 10 10 10 8 6 3 10 10 10 7 2 0 30 30 30 7 16 27 54.3 0.2172 = ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) b 3.81 = a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 ) Control positivo________________ Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE S FECHA: FIRMA : FECHA: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS 07 Y Daphnia exilis REALIZADOS EN LA UAMI EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0334 20.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.2185 40.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.6098 60.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8150 80.0000 30 29 0.9667 0.9667 0.9090 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.186 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.522618 Sigma = 0.285027 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐0.342005 0.750221 ( ‐1.812438, 1.128429) Slope 3.508434 0.472253 ( 2.582819, 4.434049) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.237 3.922 10.470 LC/EC 5.00 11.318 7.127 15.067 LC/EC 10.00 14.366 9.767 18.354 LC/EC 15.00 16.874 12.056 21.016 LC/EC 50.00 33.313 27.881 39.214 0.133 cr LC/EC 85.00 65.769 54.286 86.908 LC/EC 90.00 77.252 62.386 106.881 LC/EC 95.00 98.053 76.253 145.990 LC/EC 99.00 153.348 110.088 264.442 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ ...o 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ o .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.7800 30 0 0.0000 0.0000 0.0194 1.5600 30 6 0.2000 0.2000 0.1402 3.1200 30 14 0.4667 0.4667 0.4631 6.2500 30 22 0.7333 0.7333 0.8150 12.5000 30 30 1.0000 1.0000 0.9702 25.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9979 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.796 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 0.522437 Sigma = 0.305037 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.287298 0.257122 ( 2.783340, 3.791256) Slope 3.278291 0.413455 ( 2.467919, 4.088664) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.650 0.363 0.938 LC/EC 5.00 1.049 0.676 1.397 LC/EC 10.00 1.354 0.937 1.736 LC/EC 15.00 1.608 1.165 2.016 LC/EC 50.00 3.330 2.744 4.0330.033 Hg LC/EC 85.00 6.896 5.519 9.454 LC/EC 90.00 8.192 6.413 11.743 LC/EC 95.00 10.573 7.970 16.272 LC/EC 99.00 17.063 11.874 30.274 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... o ‐ .... ‐ .... 5+ o.. ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ o .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0023 20.0000 30 3 0.1000 0.1000 0.0596 40.0000 30 10 0.3333 0.3333 0.3886 60.0000 30 20 0.6667 0.6667 0.6784 80.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8395 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9197 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 5.151 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 1.668829 Sigma = 0.236006 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐2.071122 0.979860 ( ‐3.991647, ‐0.150597) Slope 4.237176 0.564457 ( 3.130840, 5.343512) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 13.177 7.888 17.967 LC/EC 5.00 19.082 12.922 24.282 LC/EC 10.00 23.247 16.772 28.579 LC/EC 15.00 26.560 19.968 31.953 LC/EC 50.00 46.648 40.211 53.148 3.73 as LC/EC 85.00 81.927 70.463 101.591 LC/EC 90.00 93.604 79.130 120.415 LC/EC 95.00 114.034 93.516 155.655 LC/EC 99.00 165.139 126.870 254.009 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ ...o ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0031 20.0000 30 4 0.1333 0.1333 0.0453 40.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.2574 60.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4829 80.0000 30 15 0.5000 0.5000 0.6514 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.7655 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 20.601 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 1.790522 Sigma = 0.289270 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Intercept ‐1.189789 2.154590 ( ‐7.170931, 4.791353) Slope 3.456975 1.210097 ( 0.097745, 6.816206) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 13.110 0.000 29.666 LC/EC 5.00 20.640 0.000 38.646 LC/EC 10.00 26.290 0.000 45.200 LC/EC 15.00 30.954 0.000 50.964 LC/EC 50.00 61.734 16.228 1410.444 0.24 Cu LC/EC 85.00 123.118 72.843 %17881983090688.000 LC/EC 90.00 144.961 81.405 % 560660735.853E+07 LC/EC 95.00 184.647 94.580 % 284234135.170E+11 LC/EC 99.00 290.704 122.573 % 100000002.004E+12 NOTE ‐ Upper limits greater than or equal to 1.E20 are really infinite Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ... o ‐ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... 4+ .... o ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra ciega 10: MAGNA Number Exposed Conc. 12.0000 25.0000 50.0000 100.0000 20 20 20 20 Number Resp. 3 11 19 20 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.1500 0.5500 0.9500 1.0000 0.1500 0.5500 0.9500 1.0000 0.1293 0.5950 0.9375 0.9977 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu Sigma = = = 0.344 = 5.991 1.342022 0.232697 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -0.767244 1.168410 ( -3.057328, 1.522840) Slope 4.297430 0.839783 ( 2.651454, 5.943405) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 6.320 9.105 11.061 12.614 21.980 38.299 43.676 53.062 76.444 95% Confidence Limits Lower Upper 2.683 4.781 6.476 7.923 17.345 30.472 34.022 39.785 52.726 9.473 12.510 14.575 16.207 27.209 56.916 69.362 93.606 166.201 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - o . . .. o.. ... .... .... .... ... .... ...o ... .... .... ... .... o.... .... ... .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Selenastrum capricornutum MUESTRA CIEGA 10 2007/09/04 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 25.0000 50.0000 100 100 100 31 66 97 0.3100 0.6600 0.9700 0.3100 0.6600 0.9700 0.2788 0.7321 0.9371 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.968 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 *************************************************************** * WARNING * * The tabular chi-square value exceeds the calculated * * chi-square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** * NOTE * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** Mu = 1.193570 Sigma = 0.330079 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 1.383990 0.944209 ( -10.613124, 13.381104) Slope 3.029574 0.715767 ( -6.064964, 12.124112) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Point Conc. LC/EC 1.00 2.665 LC/EC 5.00 4.473 LC/EC 10.00 5.896 LC/EC 15.00 7.104 LC/EC 50.00 15.616 LC/EC 85.00 34.329 LC/EC 90.00 41.362 LC/EC 95.00 54.515 LC/EC 99.00 91.503 95% Confidence Limits Lower Upper 0.062 cR Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ . 7+ . o .. .. ... .... 6+ .... .... ... .... o .... 5+ ... .... o .... ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 11 2007/09/04 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 2.5000 100 49 0.4900 0.4900 0.4172 5.0000 100 60 0.6000 0.6000 0.7352 7.5000 100 86 0.8600 0.8600 0.8684 10.0000 100 99 0.9900 0.9900 0.9287 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 17.303 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) *************************************************************** * WARNING * * The tabular chi-square value exceeds the calculated * * chi-square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** * NOTE * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** Mu = 0.473093 Sigma = 0.359340 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 3.683439 0.688076 ( 0.722649, 6.644229) Slope 2.782878 0.959982 ( -1.347925, 6.913682) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 0.434 0.762 1.029 1.261 2.972 7.007 8.583 11.592 20.372 95% Confidence Limits Lower Upper 0.029 Hg Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - o . . .. .. ... .... ...o .... ... .... .... o o ... .... .... ... .... .... .... ... .. .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUETRA CIEGA 12 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.1000 0.5000 1.0000 2.5000 100 100 100 100 0 18 40 90 0.0000 0.1800 0.4000 0.9000 0.0000 0.1800 0.4000 0.9000 0.0005 0.1470 0.4622 0.8784 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.917 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 0.029904 Sigma = 0.315406 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 4.905189 0.083274 ( 4.741972, 5.068406) Slope 3.170518 0.308182 ( 2.566482, 3.774554) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 0.198 0.324 0.422 0.505 1.071 2.274 2.717 3.538 5.803 95% Confidence Limits Lower Upper 0.131 0.240 0.330 0.408 0.951 1.923 2.247 2.823 4.310 0.263 0.402 0.506 0.591 1.211 2.855 3.536 4.866 8.900 0.0856 As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ .. .. ... .o.. 6+ .... .... ... .... .... 5+ ... ...o .... ... .... 4+ .o.. .... ... .. .. 3+ . . . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) -. 2+ 1+ 0+o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 13 2007/09/03 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 60.0000 80.0000 100.0000 100 100 100 43 93 98 0.4300 0.9300 0.9800 0.4300 0.9300 0.9800 0.4454 0.9010 0.9916 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.659 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = 1.790183 Sigma = 0.087713 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -15.409530 2.514245 ( -20.337450, -10.481609) Slope 11.400805 1.370869 ( 8.713902, 14.087709) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 38.560 44.249 47.618 50.035 61.686 76.048 79.909 85.993 98.680 95% Confidence Limits Lower Upper 32.190 38.475 42.294 45.070 58.523 72.906 76.221 81.220 91.164 43.208 48.379 51.409 53.578 64.276 80.374 85.378 93.591 111.594 0.2467 cu Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ .. .. o... .... 6+ .... .... ... .... .... 5+ ... ..o. .... ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . . . o Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum Fecha de Inicio INSTITUCIÓN: IPN, ENCB 13 Agosto 2007 Fecha de Término 25 Agosto 2007 Reportar Número de células x campo RÉPLICA No. 1 CONTROL NEGATIVO: Medio mineral 2 3 TOTAL DE ORGANISMOS 4 5 137. 122. 137. 5 5 5 140 143 PROMEDIO % 1 2 (No. cél x mL) INHIBICIÓN 136.1 0 DILUCIÓN CE50 Obs. (µg/L) 20 40 60 80 100 CONTROL POSITIVO +2 (Cu ) No. MUESTRA 117 112 107 75 85 92.5 48 52 38.5 14.5 29.5 15 13.5 13.5 9 112 84.167 46.167 19.667 12 17.708 42.89 38.158 66.079 85.550 91.183 DILUCIÓN (%) 10 IPN 50 100 85 120 102. 5 65 70 91.67 5.172 95 87.50 9.483 No tóxica Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 12 IPN 10 25 50 100 130 105 92.5 87.5 80 40 29 37.5 54.5 5 4 7.5 109.2 69.2 40.3 5.5 6.429 31.77 40.714 65.429 95.286 2.59 13 IPN 10 25 50 100 160 130 105 125 110 125 55 52 53 1 2 1 131.67 120.00 53.33 1.33 6.064 36.95 14.388 61.950 99.049 0.21 1) No de células x campo x 10,000 2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100) Control negativo________________ Control positivo_______________ OBSERVACION ES: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE FECHA: Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas FIRMA : FECHA: PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum Fecha de Inicio INSTITUCIÓN: IPN, ENCB 13 Agosto 2007 Fecha de Término 25 Agosto 2007 Reportar Número de células x campo RÉPLICA No. 1 CONTROL NEGATIVO: Medio mineral 225 2 3 TOTAL DE ORGANISMOS 4 5 237. 267. 5 5 252 265 PROMEDIO % 1 2 (No. cél x mL) INHIBICIÓN 249.4 0 DILUCIÓN CE50 Obs. (PPM) CONTROL POSITIVO +2 (Cu ) No. MUESTRA 40 60 80 100 192. 5 79.5 23.5 4.5 192. 195 5 135 110 21.5 17.5 3.5 6 193.333 108.167 20.833 4.667 20.55 55.35 55.55 91.44 98.08 215 11.64 16.89 DILUCIÓN (%) 11 IPN 6.25 12.5 25 50 215 220 210 127. 112. 105 5 5 57.5 65 105 65 62.5 70 115 75.83 65.83 52.74 68.84 72.95 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 1) No de células x campo x 10,000 2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100) Control negativo________________ Control positivo_______________ OBSERVACION ES: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE FECHA: FIRMA : FECHA: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS Y Selenastrun capricornatum REALIZADOS EN LA UAMI PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 100 16 0.1600 0.1600 0.1762 40.0000 100 69 0.6900 0.6900 0.6445 60.0000 100 85 0.8500 0.8500 0.8710 80.0000 100 95 0.9500 0.9500 0.9526 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.494 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.516310 Sigma = 0.231459 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐1.551091 0.594456 ( ‐2.716224, ‐0.385957) Slope 4.320415 0.368534 ( 3.598088, 5.042743) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 9.503 7.036 11.821 LC/EC 5.00 13.664 10.837 16.202 LC/EC 10.00 16.583 13.627 19.191 LC/EC 15.00 18.898 15.893 21.532 LC/EC 50.00 32.833 29.897 35.663 0.1313 Cr LC/EC 85.00 57.042 52.011 63.872 LC/EC 90.00 65.005 58.612 74.165 LC/EC 95.00 78.893 69.707 92.879 LC/EC 99.00 113.437 95.905 142.514 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .o ‐ ... ‐ .... 6+ ....o ‐ .... ‐ ... ‐ .o.. ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ ..o. ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.3100 100 0 0.0000 0.0000 0.0188 1.2500 100 26 0.2600 0.2600 0.2678 2.5000 100 61 0.6100 0.6100 0.5421 5.0000 100 83 0.8300 0.8300 0.7970 10.0000 100 89 0.8900 0.8900 0.9402 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 8.954 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 0.354023 Sigma = 0.415098 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Intercept 4.147134 0.180901 ( 3.571509, 4.722760) Slope 2.409067 0.326693 ( 1.369531, 3.448602) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.245 0.038 0.531 LC/EC 5.00 0.469 0.118 0.856 LC/EC 10.00 0.664 0.213 1.113 LC/EC 15.00 0.839 0.315 1.336 LC/EC 50.00 2.260 1.449 3.313 0.0226 LC/EC 85.00 6.085 4.022 13.622 LC/EC 90.00 7.692 4.866 20.028 LC/EC 95.00 10.885 6.372 35.905 LC/EC 99.00 20.877 10.344 109.625 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... o 6+ o.... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .o.. 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ .o. ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 100 13 0.1300 0.1300 0.1050 5.0000 100 37 0.3700 0.3700 0.3549 10.0000 100 44 0.4400 0.4400 0.5030 50.0000 100 76 0.7600 0.7600 0.8129 100.0000 100 96 0.9600 0.9600 0.8977 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 8.421 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 0.994114 Sigma = 0.793090 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.746532 0.209519 ( 3.079844, 4.413220) Slope 1.260890 0.169503 ( 0.721533, 1.800248) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.141 0.005 0.583 LC/EC 5.00 0.489 0.040 1.448 LC/EC 10.00 0.950 0.124 2.382 LC/EC 15.00 1.486 0.263 3.366 LC/EC 50.00 9.865 4.747 19.156 0.7892 As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 85.00 65.475 30.770 303.885 LC/EC 90.00 102.456 43.834 638.341 LC/EC 95.00 198.915 72.629 1954.661 LC/EC 99.00 690.367 181.397 16460.193 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 5+ ... ‐ ....o ‐ ..o. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .o.. ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 100 28 0.2800 0.2800 0.2909 20.0000 100 45 0.4500 0.4500 0.4049 40.0000 100 50 0.5000 0.5000 0.5277 60.0000 100 53 0.5300 0.5300 0.5990 80.0000 100 71 0.7100 0.7100 0.6479 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 4.886 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.534580 Sigma = 0.970845 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.419336 0.276081 ( 2.878217, 3.960454) Slope 1.030030 0.177253 ( 0.682615, 1.377446) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.189 0.013 0.709 LC/EC 5.00 0.866 0.132 2.232 LC/EC 10.00 1.951 0.445 4.125 LC/EC 15.00 3.376 1.011 6.262 LC/EC 50.00 34.244 26.318 44.843 0.1369 cu LC/EC 85.00 347.348 185.074 1189.282 LC/EC 90.00 600.918 280.843 2700.129 LC/EC 95.00 1353.704 519.015 9133.452 LC/EC 99.00 6209.519 1633.007 90309.078 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o ... ‐ .... ‐ .... 5+ ..o o ‐ o... ‐ .... ‐ ..o ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra ciega 10: MAGNA Number Exposed Conc. 12.0000 25.0000 50.0000 100.0000 20 20 20 20 Number Resp. 3 11 19 20 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.1500 0.5500 0.9500 1.0000 0.1500 0.5500 0.9500 1.0000 0.1293 0.5950 0.9375 0.9977 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu Sigma = = = 0.344 = 5.991 1.342022 0.232697 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -0.767244 1.168410 ( -3.057328, 1.522840) Slope 4.297430 0.839783 ( 2.651454, 5.943405) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 6.320 9.105 11.061 12.614 21.980 38.299 43.676 53.062 76.444 95% Confidence Limits Lower Upper 2.683 4.781 6.476 7.923 17.345 30.472 34.022 39.785 52.726 9.473 12.510 14.575 16.207 27.209 56.916 69.362 93.606 166.201 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - o . . .. o.. ... .... .... .... ... .... ...o ... .... .... ... .... o.... .... ... .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra Ciega 11;MAGNA Number Exposed Conc. 0.3000 0.7500 1.5000 3.0000 6.0000 30 30 30 30 30 Number Resp. 2 24 29 30 30 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.0667 0.8000 0.9667 1.0000 1.0000 0.0667 0.8000 0.9667 1.0000 1.0000 0.0857 0.7476 0.9863 0.9999 1.0000 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu Sigma = = = 1.436 = 7.815 -0.255396 0.195558 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 6.305986 0.265782 ( 5.785053, 6.826920) Slope 5.113570 0.829355 ( 3.488035, 6.739105) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 0.195 0.265 0.312 0.348 0.555 0.886 0.989 1.165 1.583 95% Confidence Limits Lower Upper 0.112 0.173 0.218 0.254 0.462 0.740 0.815 0.935 1.199 0.264 0.338 0.386 0.424 0.658 1.160 1.347 1.689 2.608 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - o . . .. o .. ... .... .... o... ... .... .... ... .... .... ... .... .... .... ... .. o Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra Ciega 12:MAGNA Conc. 6.0000 Number Exposed 20 Number Resp. 0 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.0000 0.0000 0.0422 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 12.0000 25.0000 50.0000 100.0000 20 20 20 20 2 2 2 2 0.1000 0.1000 0.1000 0.1000 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) 0.1000 0.1000 0.1000 0.1000 = 1.866 = 7.815 0.0567 0.0762 0.0988 0.1261 *************************************************************** * NOTE * * * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** Mu Sigma = = 4.408896 2.103648 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 2.904166 0.677868 ( 1.575544, 4.232789) Slope 0.475365 0.437643 ( -0.382416, 1.333145) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 95% Confidence Limits Lower Upper 0.327 8.884 51.625 169.307 25638.697 3882541.500 12733004.000 73992200.000 %2007300096.000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - . . .. .. ... .... .... .... ... .... .... ... .... .... ... .... .... o o o.o. ... .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+ o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Muestra Ciega 13:MAGNA Number Exposed Conc. 12.0000 25.0000 50.0000 100.0000 30 30 30 30 Number Resp. 0 3 6 25 Observed Proportion Responding Proportion Responding Adjusted for Controls Predicted Proportion Responding 0.0000 0.1000 0.2000 0.8333 0.0000 0.1000 0.2000 0.8333 0.0017 0.0488 0.3260 0.7749 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu Sigma = = = 4.503 = 5.991 1.811516 0.249624 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -2.256974 1.232535 ( -4.672744, 0.158795) Slope 4.006022 0.695713 ( 2.642425, 5.369619) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure Conc. Point LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC 1.00 5.00 10.00 15.00 50.00 85.00 90.00 95.00 99.00 17.014 25.172 31.017 35.711 64.791 117.551 135.343 166.772 246.727 95% Confidence Limits Lower Upper 8.776 15.649 21.174 25.850 54.211 92.365 103.447 121.949 165.034 24.010 32.657 38.708 43.611 80.021 180.723 221.953 301.957 541.153 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) MAGNA PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ - . . .. .. ... .... o .... .... ... .... .... ... .... .... ... .... o .... o .... ... .. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 10 DEFINITIVA 2007/09/11 D. magna Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 30.0000 40.0000 50.0000 30 30 30 30 0 10 28 30 0.0000 0.3333 0.9333 1.0000 0.0000 0.3333 0.9333 1.0000 0.0006 0.3285 0.9378 0.9989 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.065 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.505133 Sigma = 0.063093 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -18.855776 4.651087 ( -27.971907, -9.739646) Slope 15.849614 3.065975 ( 9.840302, 21.858927) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 22.822 25.197 26.563 27.526 31.999 37.198 38.547 40.636 44.865 95% Confidence Limits Lower Upper 18.095 21.144 22.948 24.232 29.977 34.996 36.068 37.643 40.646 25.489 27.488 28.650 29.485 33.880 41.252 43.499 47.148 55.023 0.128 Cr PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ - o Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) . 7+ . .. o.. ... .... 6+ .... .... ... .... .... 5+ ... .... .o.. ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 11 DEFINITIVA (2) 2007/09/05 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.5000 1.0000 2.0000 3.0000 30 30 30 30 0 0 18 24 0.0000 0.0000 0.6000 0.8000 0.0000 0.0000 0.6000 0.8000 0.0001 0.0273 0.4894 0.8603 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.223 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 0.305267 Sigma = 0.158856 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept 3.078333 0.402000 ( 2.290413, 3.866253) Slope 6.295027 1.130930 ( 4.078405, 8.511650) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 0.862 1.107 1.264 1.382 2.020 2.951 3.227 3.686 4.729 95% Confidence Limits Lower Upper 0.519 0.757 0.923 1.054 1.765 2.569 2.768 3.080 3.739 1.112 1.348 1.497 1.610 2.284 3.729 4.247 5.169 7.522 0.0202 Hg PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ 8+ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) . 7+ . .. .. ... .... 6+ .... .... o ... .... o.... 5+ ... .... .... ... .... 4+ .... .... ... .. .. 3+ . -. 2+ 1+ 0+o o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 MUESTRA CIEGA 12 DEFINITIVA 2007/09/12 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 40.0000 60.0000 80.0000 100.0000 30 30 30 30 0 0 3 23 0.0000 0.0000 0.1000 0.7667 0.0000 0.0000 0.1000 0.7667 0.0000 0.0001 0.0998 0.7668 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.005 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.964904 Sigma = 0.048186 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -35.777157 8.065721 ( -51.585972, -19.968344) Slope 20.752745 4.110723 ( 12.695728, 28.809761) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure Conc. LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00 71.254 76.850 80.011 82.217 92.237 103.477 106.331 110.705 119.399 95% Confidence Limits Lower Upper 60.241 67.932 72.339 75.408 88.174 98.337 100.530 103.763 109.903 77.113 81.709 84.373 86.294 96.753 113.736 118.615 126.363 142.553 7.37 As PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ 9+ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 8+ 7+ 6+ 5+ 4+ 3+ -. 2+ 1+ - . . .. .. ... .... .... .o.. ... .... .... ... .... .... ... .... .... o... ... .. .. . Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) 0+o -+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia magna Fecha de Inicio INSTITUCIÓN__________IMP-M-10 07/08/2007 Fecha de Término 09/08/2007 Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No. TOTAL DE 2 3 1 ORGANISMOS No. No. No. No. No. No. Expuestos Muertos a b Inicial Final Inicial Final Inicial Final (t 0) (t 48h) CONTROL POSITIVO: Cr VI ( mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA 11 10 7 10 11 10 4 10 11 10 6 9 33 30 16 1 DILUCIÓN CE50 Obs. (%) M-10 M-11 100 10.0 1.0 10 10 10 2 8 9 10 10 10 1 8 9 11 10 10 0 8 10 31 30 30 28 6 2 0.1 control 10 10 10 10 10 11 9 11 10 10 9 9 30 31 2 1 100 10.0 5.0 1.0 10 10 10 10 0 0 1 9 10 10 10 10 0 0 5 9 10 10 10 10 0 0 1 9 30 30 30 30 30 30 23 3 27.90 0.1116 1 3.006 0.0306 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) M-12 M-13 a control 10 10 10 9 10 10 30 1 100.0 10.0 5.0 10 10 10 3 7 8 10 10 10 4 8 9 10 10 10 4 8 8 30 30 30 19 7 5 1.0 control 10 10 8 10 10 10 9 9 10 10 9 10 30 30 4 1 50 40 30 10 10 11 0 2 6 10 10 10 0 2 3 10 10 12 0 4 4 30 30 33 30 22 20 20 10 control 11 11 10 8 9 10 11 12 10 7 11 9 11 10 10 8 7 10 33 33 30 10 6 1 = ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) b 57.97 4.54 0 28.20 0.112 8 = a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 ) Control positivo________________ Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA Ma. Cristina González RESPONSABLE Juan C. Cid Núñez Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Lozano FIRMA: S FECHA: 30-08-2007 FIRMA : FECHA: 30-08-2007 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm102007 IMTA Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.1000 30 1 0.0333 0.0333 0.0315 0.1500 30 10 0.3333 0.3333 0.3396 0.2000 30 22 0.7333 0.7333 0.7298 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.010 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.773533 Sigma = 0.121812 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 11.350205 1.303700 ( 8.794953, 13.905457) Slope 8.209358 1.631138 ( 5.012327, 11.406389) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm102007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.088 0.059 0.106 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 5.00 0.106 0.080 0.122 LC/EC 10.00 0.118 0.094 0.132 LC/EC 15.00 0.126 0.104 0.140 LC/EC 50.00 0.168 0.154 0.187 LC/EC 85.00 0.225 0.200 0.287 LC/EC 90.00 0.241 0.211 0.320 LC/EC 95.00 0.267 0.228 0.376 LC/EC 99.00 0.323 0.262 0.512 0.168 cr Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) dmm102007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ .o. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .o.. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ .. ‐ o. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm112007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0062 30 2 0.0667 0.0667 0.0719 0.0125 30 16 0.5333 0.5333 0.5197 0.0250 30 28 0.9333 0.9333 0.9386 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.049 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.913027 Sigma = 0.201570 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 14.490635 1.581769 ( 11.390368, 17.590902) Slope 4.961055 0.823153 ( 3.347674, 6.574436) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm112007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.004 0.002 0.006 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 5.00 0.006 0.004 0.007 LC/EC 10.00 0.007 0.005 0.008 LC/EC 15.00 0.008 0.006 0.009 LC/EC 50.00 0.012 0.010 0.014 LC/EC 85.00 0.020 0.016 0.027 LC/EC 90.00 0.022 0.018 0.031 LC/EC 95.00 0.026 0.021 0.039 LC/EC 99.00 0.036 0.027 0.062 0.22 hg Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) dmm112007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ..o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ .. o ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm122007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 6.2500 30 5 0.1667 0.1667 0.1937 12.5000 30 24 0.8000 0.8000 0.7438 25.0000 30 29 0.9667 0.9667 0.9852 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.340 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = 0.967137 Sigma = 0.198115 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 0.118301 0.918373 ( ‐1.681711, 1.918313) Slope 5.047576 0.908152 ( 3.267598, 6.827555) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm122007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 3.208 1.692 4.424 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) LC/EC 5.00 4.378 2.707 5.624 LC/EC 10.00 5.167 3.467 6.412 LC/EC 15.00 5.778 4.087 7.021 LC/EC 50.00 9.271 7.783 10.857 LC/EC 85.00 14.875 12.483 19.929 LC/EC 90.00 16.636 13.712 23.425 LC/EC 95.00 19.634 15.678 29.914 LC/EC 99.00 26.792 19.982 47.737 9.271 As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) dmm122007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. o ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ o... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ ...o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm132007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0250 30 5 0.1667 0.1667 0.1426 0.0500 30 15 0.5000 0.5000 0.5554 0.1000 30 28 0.9333 0.9333 0.9110 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.698 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.335740 Sigma = 0.249229 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 10.359500 0.952228 ( 8.493132, 12.225868) Slope 4.012382 0.710523 ( 2.619756, 5.405007) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm132007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.012 0.006 0.018 LC/EC 5.00 0.018 0.010 0.024 LC/EC 10.00 0.022 0.014 0.028 LC/EC 15.00 0.025 0.017 0.032 LC/EC 50.00 0.046 0.038 0.055 LC/EC 85.00 0.084 0.068 0.121 LC/EC 90.00 0.096 0.076 0.148 LC/EC 95.00 0.119 0.090 0.202 LC/EC 99.00 0.175 0.121 0.362 0.046 Cu Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) dmm132007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ...o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ o... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas PROYECTO “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia magna Fecha de Inicio INSTITUCIÓN: __IPN-ENCB__ ____________ Fecha de Término ________ ______ Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No. TOTAL DE 2 3 1 ORGANISMOS No. No. No. No. No. No. Expuestos Muertos a b Inicial Final Inicial Final Inicial Final (t 0) (t 48h) CONTROL POSITIVO: Cr VI ( mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA 10 10 10 10 10 10 30 0 DILUCIÓN CE50 Obs. 39 0.161 (%) 10 30 40 50 60 70 11 10 10 10 10 7 7 4 0 0 10 10 10 10 10 8 2 3 0 0 10 10 10 10 10 7 6 6 0 0 31 30 30 30 30 9 15 17 30 30 11 1.6 2.4 3.2 4.0 10 10 10 10 10 7 2 0 10 10 10 10 10 4 1 0 10 10 10 10 10 3 1 2 30 30 30 30 0 16 26 28 2.48 0.0248 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) a 12 50 75 100 10 10 10 9 4 2 10 10 10 10 6 6 10 10 10 1 10 3 30 30 30 2 10 19 88.05 6.972 13 25 50 75 100 10 10 10 10 10 7 0 0 10 10 10 10 10 5 0 0 10 10 10 10 10 6 0 0 30 30 30 30 0 12 30 30 51.99 = ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) b Ajuste Logit 0.196 = a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 ) Control positivo________________ Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE S FECHA: FIRMA : FECHA: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS 07 Y Daphnia magna imta REALIZADOS EN LA UAMI EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0271 3.1250 30 3 0.1000 0.1000 0.0977 6.2500 30 5 0.1667 0.1667 0.1810 12.5000 30 7 0.2333 0.2333 0.2987 25.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4425 50.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.5944 75.0000 30 21 0.7000 0.7000 0.6784 100.0000 30 24 0.8000 0.8000 0.7331 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.891 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 12.592 Mu = 1.511443 Sigma = 0.785075 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.074779 0.246654 ( 2.591337, 3.558221) Slope 1.273764 0.168761 ( 0.942991, 1.604536) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.484 0.119 1.128 LC/EC 5.00 1.660 0.616 3.066 LC/EC 10.00 3.201 1.463 5.278 LC/EC 15.00 4.986 2.603 7.674 LC/EC 50.00 32.467 23.420 47.405 0.129 cr LC/EC 85.00 211.395 122.433 504.063 LC/EC 90.00 329.303 176.322 905.558 LC/EC 95.00 635.057 301.003 2169.386 LC/EC 99.00 2176.522 812.762 11277.423 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ o.... ‐ o... ‐ .... ‐ ..o. 5+ ... ‐ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... o 4+ ...o ‐ o... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ o .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 30 3 0.1000 0.1000 0.0571 5.0000 30 8 0.2667 0.2667 0.3628 10.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.5707 30.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8454 50.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9203 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 6.351 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 0.898600 Sigma = 0.568931 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.420547 0.275167 ( 2.881220, 3.959874) Slope 1.757682 0.247535 ( 1.272513, 2.242851) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.376 0.102 0.804 LC/EC 5.00 0.918 0.345 1.649 LC/EC 10.00 1.477 0.656 2.433 LC/EC 15.00 2.037 1.007 3.176 LC/EC 50.00 7.918 5.564 10.861 0.079 Hg LC/EC 85.00 30.778 21.088 54.175 LC/EC 90.00 42.437 27.751 82.522 LC/EC 95.00 68.302 41.236 155.614 LC/EC 99.00 166.765 85.115 520.727 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... ‐ ..o. 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... o ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con daphnia magna imta m. 12 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 1 0.0333 0.0333 0.0203 20.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0711 40.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.1874 60.0000 30 8 0.2667 0.2667 0.2919 80.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.3795 100.0000 30 15 0.5000 0.5000 0.4523 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.742 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 2.062135 Sigma = 0.518486 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 1.022778 0.740639 ( ‐0.428875, 2.474432) Slope 1.928691 0.420006 ( 1.105480, 2.751903) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.178 1.509 13.741 LC/EC 5.00 16.191 6.092 24.877 LC/EC 10.00 24.983 12.621 34.684 LC/EC 15.00 33.479 20.269 44.189 LC/EC 50.00 115.381 84.152 219.384 extrapolada. 9‐23 as LC/EC 85.00 397.644 211.957 1795.334 LC/EC 90.00 532.877 261.518 2977.138 LC/EC 95.00 822.229 356.351 6310.671 LC/EC 99.00 1854.768 634.420 25916.201 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ o... ‐ .... ‐ ...o ‐ ..o ‐ .... 4+ ...o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. o ‐ o .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0034 20.0000 30 4 0.1333 0.1333 0.0736 40.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4248 60.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.7080 80.0000 30 26 0.8667 0.8667 0.8578 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9301 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 6.057 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 1.647344 Sigma = 0.238869 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐1.896429 0.939587 ( ‐3.738021, ‐0.054838) Slope 4.186393 0.545775 ( 3.116673, 5.256112) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 12.350 7.419 16.868 LC/EC 5.00 17.965 12.179 22.912 LC/EC 10.00 21.939 15.825 27.039 LC/EC 15.00 25.106 18.856 30.285 LC/EC 50.00 44.396 38.150 50.686 0.177 cu LC/EC 85.00 78.507 67.513 96.987 LC/EC 90.00 89.842 75.991 114.991 LC/EC 95.00 109.713 90.090 148.741 LC/EC 99.00 159.597 122.898 243.128 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ o... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... o 5+ ... ‐ .... ‐ ....o ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum Fecha de Inicio No. de Evento :Elutriado A,B y soxhlet 15/10/07 Fecha de Término 15/11/07 Reportar Número de células x campo RÉPLICA No. 1 1 2 CONTROL NEGATIVO: medio mineral RÉPLICA No. 2 3 4 RÉPLICA No. 3 5 6 169 171 195 183 158 164 TOTAL DE ORGANISMOS PROMEDIO 1 (No. cél x mL) % 2 INHIBICIÓN 173.33 DILUCIÓN CE50 Obs. (%) (PPM) CONTRO L POSITIVO +2 (Cu ) No. MUESTRA 0.020 0.040 0.060 0.080 112 68 57 35 114 66 58 33 116 67 53 32 114 64 54 31 113 69 54 30 115 67 51 33 114 66.83 54.50 32.33 32 60 67 81 161 5 0.033 DILUCIÓN (%) Elutriad o A 100 159 158 160 162 162 165 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Elutriad oB 100 152 153 155 154 151 150 152.5 10 Soxhlet A 1 160 159 161 159 158 157 159 6 Soxhlet B 1 149 148 145 143 146 145 162 14 Blanco 1 162 161 163 165 161 160 154.5 5 2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100) Control positivo________________ Control negativo________________ OBSERV ACIONE S: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE FECHA: FIRMA : FECHA: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de Extracción de Sedimento Daphnia magna Fecha de Inicio No. de Evento: A-DMCEN – B- DMCEN 15-10-2007 Fecha de Término 15-11-2007 Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. 1 No. No. Inicial Final CONTROL POSITIVO: Cr VI ( No. Inicial No. Final No. Inicial 10 10 10 TOTAL DE ORGANISMOS No. Expuestos a Final (t 0) Muertos b (t 48h) mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA RÉPLICA No. RÉPLICA No. 2 3 10 10 10 30 0 DILUCIÓN CE50 Obs. (%) ELUTRIADO A 100 10 0 10 0 ELUTRIADO B 100 10 0 10 0 SOXHLET A 1% 10 0 10 0 10 0 20 0 30 0 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) a SOXHLET B 1% 10 0 10 0 10 0 30 0 BLANCO 1% 10 0 10 0 10 0 30 0 = ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) b = a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 ) Control positivo________________ Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA FIRMA: RESPONSABLE S FECHA: FIRMA : FECHA: Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) Taller de transferencia de tecnología: “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas Resultados de Extracción de Sedimento con Daphnia exilis Fecha de Inicio No. de Evento: A-DECEN – B- DECEN 15-10-2007 Fecha de Término 15-11-2007 Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No. TOTAL DE 2 3 1 ORGANISMOS No. No. No. No. No. No. Expuestos Muertos a b Inicial Final Inicial Final Inicial Final (t 0) (t 48h) CONTROL POSITIVO: Cr VI ( mg/L) CONTROL NEGATIVO: Agua dura No. MUESTRA 10 10 10 10 10 10 30 0 DILUCIÓN CE50 Obs. (%) ELUTRIADO A 100 10 0 10 0 20 0 ELUTRIADO B 100 10 0 10 0 20 0 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected] DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL (CENICA) a SOXHLET A 1% 10 0 10 0 10 0 30 0 SOXHLET B 1% 10 0 9 1 9 1 30 2 BLANCO 1% 10 0 10 0 10 0 30 0 = ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3 % Efecto en: (No org. muertos/30 x 100) b = a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 ) Control positivo________________ Control negativo______________ OBSERVACION ES: ANALISTA RESPONSABLE S Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592 Correo electrónico [email protected]