microscopia - Facultad de Medicina

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
PRACTICAS DE LABORATORIO
MICROSCOPIA
Maye Bernal Rivera
El MICROSCOPIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Historia
Componentes
Uso
Cuidado
Mantenimiento y Precauciones
Utilidad para el médico
HISTORIA
La palabra microscopio viene del griego mikro,
pequeño y skop, visión. Los microscopios son
instrumentos que nos permiten observar objetos
pequeñísimos que no se pueden ver a simple
vista, ni con la ayuda de una lupa. La palabra
microscopio fue utilizada por primera vez por los
componentes de la "Academia dei Lincei", una
sociedad científica a la que pertenecía Galileo y
que publicaron un trabajo sobre la observación
microscópica del aspecto de una abeja.
El primer microscopio fue inventado, por una
casualidad en experimentos con lentes según los
Italianos hacia 1610 por Galileo y según los
holandeses por Zacharías Janssen (1580-1638)
quien inventó un microscopio con una especie de
tubo con lentes en sus extremos, de 8 cm. de
largo soportado por tres delfines de bronce; pero
se obtenía imágenes borrosas a causa de las
lentes de mala calidad. Estos primeros
microscopios aumentaban la imagen 200
veces. Sin embargo las primeras publicaciones
importantes en el campo de la microscopia
aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi
prueba la teoría de Harvey sobre la circulación
sanguínea al observar al microscopio los
Microscopio desarrollado por Anthony van
Leeuwenhoek’s
capilares sanguíneos y, el inglés Robert
Hooke (1635-1701)
publica su obra
Micrographia,
con
dibujos
de
sus
observaciones. Sus aparatos usaban lentes
relativamente grandes. A mediados del siglo
XVII
un
comerciante
holandés,
Leenwenhoek,
utilizando
microscopios
simples de fabricación propia describió por
primera
vez
protozoos,
bacterias,
espermatozoides y glóbulos rojos. Durante
este siglo muchos estudiosos de las lentes y
los microscopios hicieron toda clase de
pruebas y ensayos para lograr un resultado
de mayor precisión. Entre los intentos fue el
del italiano Marcello Malpighi (1628-1694)
que en 1660 logró ver los vasos capilares de
un ala de murciélago. El holandés Antonie
van Leeuwenhoek (1632-1723), perfeccionó
el microscopio usando lentes pequeñas,
potentes, de calidad y, su artefacto era de
menor tamaño. Alrededor del 1676
logró observar la cantidad de
microorganismos que contenía el
agua estancada. También descubrió
los espermatozoides del semen
humano y más adelante, en 1683, las
bacterias. Durante el siglo XVIII el
microscopio sufrió diversos adelantos
mecánicos que aumentaron su
estabilidad y su facilidad de uso
aunque no se desarrollaron mejoras
ópticas. Las mejoras mas importantes
de la óptica surgieron en 1877 cuando
Abbe
publica
su
teoría
del
microscopio y por encargo de Carl
Zeiss
mejora la microscopía de
inmersión sustituyendo el agua por
aceite de cedro lo que permite obtener
aumentos de 2.000. A principios de
Microscopio binocular de óptica avanzada. Siglo IX
los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no
consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo existía un
deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo,
mitocondria, etc.). Los microscopios ópticos actuales permiten agrandar la imagen
más de 2.000 veces.
Pero recién en el Siglo XX llegó el gran cambio, el microscopio electrónico de
transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado; este
utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania
en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido
(SEM). Estos microscopios podían ampliar las imágenes hasta 7.000 veces. Se
continuó perfeccionando hasta llegar a aumentar unos 2 millones de veces. Y en la
actualidad los Microscopios Electrónicos de efecto túnel, amplían la imagen hasta
10 millones de veces.
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO
oculares
revólver
objetivos
platina
cabezal
brazo
Desplazamiento
platina
condensador
macrométrico
foco
micrométrico
base
Sistema óptico
-
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo.
-
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
-
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
-
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
-
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
-
SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
-
PLATINA: Lugar donde se coloca la preparación.
-
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o
binocular
-
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar
los objetivos.
-
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
Micrométrico que consigue el enfoque correcto
MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
Observación de preparaciones en fresco
1. Bajar la platina hasta el tope
2. Colocar el objetivo de menor aumento (4x) en posición de observación
3. Colocar la preparación sobre la platina
4. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular,
ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose
dañar alguno de ellos o ambos
5. Mirar a través de los oculares y lentamente, ir separando el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra,
girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
6. Pasar al objetivo 10x La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 4.
7. Pasar al objetivo de 40x el cual enfoca a muy poca distancia de la preparación y
por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación
si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión
si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
Observación de preparaciones con objetivo de inmersión
1. Bajar al tope la platina.
2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos
indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que colocarse la gota de
aceite.
3. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre
éste y el de x40.
4. Dejar caer una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz, sin
permitir que el gotero toque la preparación
5. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de 100X.
6. Mirar directamente al objetivo y lentamente subir la platina hasta que la lente
toque la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se
adosara a la lente.
7. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el
objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x
por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
8. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se
puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite.
Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la
operación desde el paso 3.
9. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca
el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede
retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de
inmersión en posición de observación.
10. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para
óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
CUIDADO
En la observación
1. Colocar el microscopio en una mesa fija, de modo tal que pueda sentarse con
comodidad para ver el ocular sin apoyarse.
2. No bajar la lente mientras se está mirando por el microscopio. Puede golpear
el portaobjeto y romperlo o romper la lente.
3. El objeto a observar debe estar muy bien iluminado. Si los objetos son opacos
deben ser iluminados desde arriba para poder verlos en detalle.
4. Colocar el portaobjeto sobre la platina de manera tal que la parte que se
quiera observar se encuentre bajo la lente.
5. Fijar siempre el portaobjeto con los broches
Al finalizar el trabajo
1.
2.
3.
4.
5.
Bajar la preparación
Colocar el objetivo de menor aumento en posición de observación
Limpiar con papel suave secante la platina
Limpiar los objetivos con papel óptico
Bajar la intensidad de luz de la lámpara
6. Apagar el microscopio y desenchufarlo
7. Dejar enfriar el bombillo, antes de transportarlo a la Sala de Microscopios
8. Colocar una mano en la base y la otra en el brazo o columna y desplazarlo en
posición erguida. No inclinarlo ya que se pueden caer los oculares.
9. Cubrir el microscopio con la funda y colocarlo en su estuche correspondiente
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador).
2. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la
mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra.
3. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo
mientras se está observando a través del ocular.
4. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella
algún líquido, secarlo con un papel suave absorbente.
5. No dejar los preparados sobre la platina, y menos aún si el microscopio está
encendido. Tanto en la lupa como en el microscopio óptico se destruirá
6. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo
con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o etanol-éter (9:1). NUNCA utilizar
xilol para limpiar las lentes.
7. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico el ajuste y revisión
general de los mismos.
8. No extraer las lentes ni tocarlas con los dedos.
9. Apagar mientras no se esté utilizando
PRACTICA DE LABORATORIO
OBJETIVOS
-
-
Utilizar el Microscopio de luz corriente como instrumento óptico para visualizar en
preparaciones previamente coloreadas, estructuras de diferentes grados de
complejidad biológica que, por su tamaño, no son observables con el ojo
desnudo.
Identificar el microscopio de luz, definir sus partes y especificar la función que
cumple cada una.
Describir los principios ópticos y no ópticos que rigen el poder amplificador del
microscopio y definir sus límites de amplificación.
Enfocar una preparación “en fresco” con los objetivos de pequeño aumento (10X)
y mediano aumento (40X).
Enfocar una preparación coloreada con los objetivos de pequeño (10X), mediano
(40X) y gran aumento (100X).
Enfocar la misma preparación con el objetivo panorámico (4x)
Verificar y calcular la ampliación de un objeto de dimensión dado, de acuerdo al
objetivo y ocular usados.
MATERIALES
- Microscopio de luz
- Papel Arroz
- Aceite de inmersión
- Solución limpiadora de lentes (Etanol-Éter 9:1)
- Láminas y laminillas
- Muestra “en fresco” y gotero
- Láminas coloreadas
PROCEDIMIENTO
CONOCIMIENTO DEL MICROSCOPIO
- Ubicar en su microscopio cada una de las partes (óptica y mecánica).
- Determinar la función de cada una de estas partes. (Figura 1).
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Enfoque de preparaciones “en fresco” en 10X
- Colocar sobre un porta objetos una gota de la preparación “en fresco” y cubrir
con una laminilla
- Conectar el microscopio
- Prender la fuente de luz
- Revisar que las siguientes partes del microscopio estén en posición:
- La platina en su tope inferior
- Objetivo 10X abajo
- El carro de transporte centrado
- El condensador en su tope inferior
- El diagrama casi cerrado
- Observar que el campo del microscopio se encuentre uniformemente iluminado.
-
-
Colocar la preparación “en fresco”, sobre la platina del microscopio.
Sujetar la lámina con la palanca del carro de transporte.
Centrar la preparación sobre la fuente de luz en la apertura circular de la platina.
Mirar la platina por el lado y mover el botón de ajuste, subir, hasta llegar al tope.
La distancia que queda del objetivo 10X es de aproximadamente 0.5 cm.
Mirar ahora por el ocular y bajar suavemente la platina hasta lograr captar la
imagen del objeto en observación.
Hacer el ajuste de las lentes oculares a su distancia interpupilar desplazando los
tubos porta-oculares con ambas manos hasta que en el campo microscópico
aparezca solamente una imagen.
Ajustar la nitidez de la imagen moviendo lentamente el tornillo micrométrico de
ajuste.
NOTA: En algunos microscopios antiguos se mueve el tubo del ocular hasta
colocar el objetivo a esta distancia de la platina.
Obtener el contraste óptimo de la imagen regulando:
-
La intensidad de la lámpara
La posición del condensador y la apertura del diafragma.
Podemos afirmar que a menos luz, mayor contraste de tal modo que este se
obtiene básicamente cerrado el diafragma y colocando el condensador en su
tope inferior. Con el diafragma podemos graduar la magnitud del cono de luz que
sale del condensador, aumentando la profundidad de foco de la imagen.
-
Dibujar los hallazgos
Enfoque con el objetivo 40X
-
-
Señalar con una flecha en el esquema que acaba de realizar, la célula, o la
estructura que desea estudiar con el objetivo 40X
Centrar sobre la parte iluminada de la platina la célula o estructura señalada.
Este paso es muy importante pues de no quedar centrado podría salirse del
campo microscópico ya que al cambiar el objetivo 10X a 40X el campo queda
reducido en la misma proporción.
Sin mover la posición de la platina, girar el revolver hasta colocar el objetivo 40X
en posición.
Abrir un poco el diafragma
Subir a la mitad el condensador
La imagen aparecerá en el microscopio con aspecto borroso.
Ajustar la nitidez de la imagen moviendo lentamente el tornillo micrométrico de
ajuste.
Dibujar los hallazgos.
Bajar la lámina de la platina y descartarla en el recipiente de descarte que
contiene hipoclorito
Enfoque con el objetivo 100X.
-
Revisar que las siguientes partes del microscopio estén en posición:
La platina en su tope inferior
Objetivo 10X abajo
El carro de transporte centrado
El condensador en su tope inferior
El diagrama casi cerrado
-
-
Observar que el campo del microscopio se encuentre uniformemente iluminado.
Colocar la lámina coloreada sobre la platina
Enfocar en 10X
Por la parte posterior dejar caer sobre la preparación una gota de aceite de
inmersión, teniendo el cuidado de no tocar la lámina.
Sin mover la posición de la platina, girar el revolver hasta dejar el objetivo 100X
en su tope
Subir el condensador
Abrir completamente el diafragma
Bajar el objetivo de 100X hasta que quede en contacto con el aceite.
NOTA: El aceite de inmersión tiene el mismo índice de refracción del vidrio
(1.5) e impide la refracción de los rayos de luz que salen de la preparación antes
de entrar al objetivo. Al no utilizar el aceite y dejar la capa de aire que tienen un
índice de refracción 1, parte de los rayos luminosos no penetran al objetivo que
por su alta curvatura tiene un diámetro muy pequeño y la imagen aparece
borrosa.
Mirar ahora por el ocular y observar la imagen de nuevo en el campo.
Obtener la nitidez de la imagen con el tormillo micrométrico.
Dibujar los hallazgos.
Bajar la lámina y limpiarla suavemente con papel de arroz
Colocar la lámina en la bandeja destinada para ello.
Devolución del microscopio
Antes de abandonar su mesa de trabajo limpiar perfectamente su microscopio como
se indica a continuación:
-
-
Apagar el microscopio
Colocar la platina en su tope inferior
Colocar el objetivo 10X en posición.
Con el papel arroz limpiar la parte óptica del microscopio empezando por los
objetivos 10X y 40X:
Retirar ahora el aceite del objetivo 100X.
Nota: Al no retirar el aceite, este se seca sobre la lente objetivo
formando una capa espesa que interfiere con la función de la lente.
Limpiar la platina completamente y centrar el carro de transporte
Dejar enfriar completamente la lámpara, antes de transportarlo a la sala de
Microscopios y revisar todas las partes, antes de entregarlo al responsable.