practicas de laboratorio identificacion bacteriana

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
PRACTICAS DE LABORATORIO
IDENTIFICACION BACTERIANA
Maye Bernal Rivera
Introducción
Para establecer el Diagnóstico Etiológico de la Enfermedad Infecciosa, se debe partir
de una muestra clínica procedente del paciente en estudio, para ser procesada en el
laboratorio clínico, dependiendo del diagnóstico presuntivo consignado en la orden de
solicitud expedida por el médico tratante.
Para realizar la identificación bacteriana la muestra del paciente se siembra en
diferentes medios de cultivo, en condiciones ambientales específicas, dependiendo
del microorganismo que se pretenda aislar.
Esta primera parte del módulo de Bacteriología corresponde a la identificación del
microorganismo (género y especie) la cual conlleva a establecer el diagnóstico
etiológico.
Medios de Cultivo
Definición:
Medio de Cultivo es el conjunto de nutrientes y sustratos que permiten el crecimiento
la multiplicación y el aislamiento de las diferentes especies bacterianas para llegar a
su identificación y otros estudios complementarios, tales como su comportamiento
frente a los antimicrobianos. Un medio de cultivo mínimo debe tener: agua, una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una sal para mantener estable la
concentración de iones.
Clasificación
Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a:
-
Origen
- Naturales
- Sintéticos
-
Consistencia
- Líquidos
- Sólidos
- Semi-sólidos
-
Composición
- Nutritivos
- Enriquecidos
- Selectivos
-
Diferenciales
Medios de Transporte
Son aquellos que aseguran la viabilidad de la bacteria desde el momento de la toma
de la muestra hasta su llegada y procesamiento en el Laboratorio. Carecen de un
nutriente mínimo indispensable, evitando así el crecimiento de las bacterias. Como
ejemplo tenemos el medio de Stuart, Ames, Sílica gel, Cary Blair, etc.
Medios de Conservación
Son medios que permiten mantener la viabilidad de las bacterias, conservando sus
características fisiológicas, morfológicas, tintoriales, etc. Los hay para tiempos cortos
y tiempos más prolongados, aunque para mantener y garantizar todas las
características bacterianas se deben conservar liofilizadas o congeladas a -70ºC o en
nitrógeno a -120ºC. . Ejemplos de este tipo de medios son: medio de Dorset, medio
de leche descremada triptona glucosa glicerol (LDTGG), solución de Greaves, etc.
Para el cultivo de bacterias, además de suministrarles sus requerimientos
nutricionales (medios de cultivo óptimos), se les debe proporcionar las condiciones
ambientales necesarias para permitirles su crecimiento y multiplicación.
Condiciones ambientales
-
-
Temperatura
Concentración atmosférica
- Presencia de de O2 (Aerobiosis)
- Disminución de O2 (Microaerofilia)
- Presencia de CO2 (Capnofilia)
- Atmósfera de Nitrógeno (Anaerobiosis)
Porcentaje de humedad
Presencia de Luz
Selección de Medios
Para la recuperación de los microorganismos a partir de las muestras clínicas, es
indispensable hacer la selección adecuada de los medios primarios de cultivo para
obtener resultados óptimos. Es importante para el medico conocer los diferentes
medios utilizados en el Laboratorio Clínico para en un momento dado poder
interpretar adecuadamente los resultados y detectar posibles falsos negativos. En el
siguiente cuadro se pude ver, dependiendo del agente etiológico en determinada
entidad, el medio de cultivo adecuado.
SELECCION DE MEDIOS DE CULTIVO
Entidad
Agente Etiológico
Medio de Cultivo
Faringitis estreptocócica
Streptococcus pyogenes
Agar Sangre
Uretritis gonocócica
Neisseria gonorrhoeae
Thayer Martin *
Tuberculosis pulmonar
Mycobacterium tuberculosis
Ogawa Kudoh
Tos ferina
Bordetella pertussis
Bordet Gengou

modificado
Técnicas de Inoculación
Las técnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varían,
dependiendo del objetivo.
Esterilización del Asa Bacteriológica
Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango
que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente material,
(ferro níquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,)
dependiendo de la necesidad.
Para su esterilización se utiliza calor seco (llama), y se procede
así:
-
Prender el mechero
Tomar el asa bacteriológica por el mango y colocarla en
posición vertical, sobre la llama del mechero, hasta que el
alambre quede al rojo vivo.
Dejar enfriar o enfriar dentro del medio de cultivo, antes de
tomar las colonias.
-
Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo
1. Siembra en Medio Líquido (Caldo)
- Obtener la muestra con asa bacteriológica o escobillón
- Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotación.
2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta)
- Obtener la muestra con asa
- Hacer estrías en la superficie del medio
3. Siembra en Agar semisólido (taco)
- Obtener la muestra con asa recta
- Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio
2
1
3
Medios en Caja de Petrí
Siembra por agotamiento:
El objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga
colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificación y sensibilidad a los
antimicrobianos.
1. Obtener la muestra con escobillón o asa y suspenderla en un extremo de la
placa de agar, haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (primer
cuadrante)
2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante
primero y extenderlas hasta el cuadrante dos
3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante
dos y extenderlas hasta el cuadrante tres
4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante
tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro.
Siembra en cuadrícula:
El objetivo de esta técnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias
(UFC)
1. Obtener la muestra con asa calibrada o pipeta automática que dispense
una cantidad exacta y distribuirla con el asa en línea recta por todo el centro
2. Hacer estrías de extremo a extremo en sentido contrario a la línea de
inóculo
3. Girar la placa y hacer estrías de extremo a extremo, en sentido contrario a
las anteriores
PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo
Proporcionar al estudiante el conocimiento científico y las habilidades prácticas de los
métodos y técnicas utilizados en Microbiología Médica para el aislamiento e
identificación de los principales agentes patógenos para el hombre a partir de
muestras clínicas, lo que le permitirá actuar correctamente en su práctica médica en
el campo de las enfermedades infecciosas.
PARTE I. SIEMBRA
Objetivos específicos
-
Practicar el manejo aséptico de medios de cultivo
Aprender a esterilizar el asa bacteriológica
Conocer las diferentes técnicas de siembra
Realizar la transferencia (repique) de bacterias desde un cultivo puro (cepa) a
diferentes tipos y medios de cultivo.
Tomar una muestra de frotis faríngeo y sembrarla en Agar Sangre
Objetivos:
- Trabajar con una muestra real
- Marcar (identificar) adecuadamente los medios de cultivo
- Aprender a tomar una muestra faríngea
- Practicar la siembra por agotamiento en una placa de Agar Sangre
- Conocer un cultivo bacteriano mixto
- Apreciar y conocer la flora bacteriana normal en orofaringe
- Detectar portadores de Streptococcus pyogenes
- Informar adecuadamente el resultado del faringocultivo, para una correcta
interpretación de reportes recibidos posteriormente.
Materiales
-
Asa curva y asa recta
Mechero de gas
Cepas bacterianas puras
Medios de Cultivo
- Tubos:
- Caldo Nutritivo
- Agar Nutritivo (inclinado)
- Agar semisólido (taco)
- Cajas de Petrí:
- Agar Nutritivo
- Agar Sangre (2 cajas)
- Agar Mc Conkey
- Escobillones y baja-lenguas estériles
Procedimiento
1. Conocer, ordenar y describir cada uno de los 6 medios de cultivo que va a
sembrar
2. Marcar en la base (nunca en la tapa) adecuadamente cada uno de los medios.
Pedro López
170305001
FF
La etiqueta debe contener:
1. Nombre del paciente
2. Registro de laboratorio, que debe incluir
la fecha y consecutivo del Laboratorio
3. Tipo de muestra
3. Sembrar en Caldo de cultivo así:
a. Coger con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa pura,
b. Coger el asa con la mano derecha y esterilizarla
c. Retirar la tapa del tubo con el dedo meñique de la mano derecha y
mantenerla ahí (no colocar sobre el mesón, para evitar contaminación)
d. Flamear la boca del tubo
e. Introducir el asa estéril y tomar una colonia
f. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa
g. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el
meñique de la derecha retirar la tapa, flamear la boca del tubo
h. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotación
i. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo
j. Esterilizar el asa
4. Sembrar en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos (a a la j) pero al sembrar
hacer estrías sobre la superficie del agar
5. Sembrar en Agar semisólido: Seguir los mismos pasos (a a la j) pero al sembrar,
utilizar el asa recta e inocular en línea recta por el centro y hasta la mitad del agar.
6. Sembrar en Agar, en Cajas de Petrí: Sembrar por “agotamiento” primero el agar
nutritivo, luego el agar sangre y por último el agar McConkey, así:
a. Seguir los pasos a a la f
b. Tomar la base de la caja por los bordes, con el índice y pulgar de la mano
izquierda y voltear la mano para que la superficie del agar quede hacia
arriba
c. Descargar el inóculo en el primer cuadrante haciendo estrías de lado a
lado, como lo indica la figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear
el asa y enfriarla en un extremo del agar
d. Girar la caja e iniciar las estrías partiendo del primer cuadrante, flamear el
asa, y enfriarla en el extremo del agar
e. Girar nuevamente la caja y repetir una vez más el mismo procedimiento.
7. Colocar las cajas de Agar Sangre con la tapa hacia abajo, dentro de la jarra con
vela (CO2 al 5%) y algodón mojado en agua estéril (ambiente de humedad)
8. Colocar los otros medios (cajas con la tapa hacia abajo y tubos en los vasos) en
la canasta destinada para ello
9. Incubar a 37ºC por 24 horas en aerobiosis
Siembra a partir de muestra faríngea
1. Identificar correctamente la caja
2. Sentar al “paciente” cómodo
3. Alistar el escobillón (pretratado) y bajalenguas
estériles
4. Colocarse los guantes
5. Indicar al paciente que abra la boca, colocar el
bajalenguas y con el escobillón frotar las amígdalas
6. Hacer la siembra por agotamiento y luego picar el
medio unas 4 veces, con el objeto de aumentar la producción de hemolisina
beta sensible al oxígeno
7. Incubar en CO2, 24 horas a 37ºC.
Actividad
1. Clasifique los medios de cultivo utilizados
2. Investigue en caso de ser necesario transportar una muestra faríngea, cuál o
cuáles medios de transporte se recomiendan
3. Describa las técnicas de siembra y su utilidad
4. Una vez obtenido el crecimiento, que pasos se debe seguir para la
identificación bacteriana?
5. Escriba los microorganismos que forman parte de la flora normal faríngea