Ácidos nucleicos y cromatina
Anuncio
Estructura y Función de los ácidos nucleicos Estructura de los acidos nucleicos 1 2 Estructura secundaria del ADN: Características Principales Diferencias estructurales del ADN y el ARN Porque Timina en el ADN y uracilo en el ARN? Dos cadenas polinucleotídicas enrrolladas en una doble hélice dextrógira H20 La Citosina se deamina espontaneamente formando Uracilo Las hebras son antiparalelas Las enzimas reparadoras reconocen estas "mutaciones" y reemplazan Us por Cs NH3 Los esqueletos azucar-fosfato en el exterior de la doble hélice Porque 2´-dideoxi en el ADN ? Pares de base planares a trav és de puentes de hidrógeno, en el centro de la estructura A T (2 H) GC (3H) Si no hubiera Timina (5-metil-U) como distinguir las U normales de las resultantes de deaminación? Dos grupos OH en el ARN lo hacen más suceptible a hidrólisis. Pares de base separados 3.4 A. Una v uelta de hebra (3.4 nm) tiene aprox. 10 pares de base El ADN sin OH en 2´ es más estable a hidrólisis. La posición de los esqueletos azucar-fosfato definen surco mayor y menor. 3 4 Reglas de síntesis de moléculas informativas Odio ser una molécula de ADN!! Acidos nucleicos y proteínas Hay tanta información que debo recordar!! Formados por un número limitado de subunidades Las unidades son agregadas secuencialmente formando cadenas lineales Flujo de información en la célula Cada cadena tiene un punto de inicio, avanza en una única dirección y tiene un punto de finalización Los productos de la síntesis primaria son modificados previamente a cumplir su función 5 6 Reconocimiento de ADN por proteínas Señales en el ADN Señales Donde comienza y termina un gen? Donde comienza y termina una proteína? Como leer estas señales? Legibilidad 7 8 Legibilidad de secuencias de ADN La estructura de los ácidos nucleicos no es rígida Accesibilidad a la secuencia (surcos mayor y menor) Enlaces móvil es Variación con Enlace N-glicosídico Enlace Fosfo-di-éster movimientos de pares de base Formas alternativas del ADN Movilidad de las bases dependiendo de la secuencia v aría el ángulo entre los pares de base 9 Ladeado Abertura Giro Propulsor 10 Propiedades fisico-químicas de los ácidos nucleicos Formas alternativas del ADN forma A condiciones de baja humedad híbridos ADN- ARN ARN- ARN 11pb/vta bases inclinadas surco mayor profundo surco menor angosto, mas expuesto 1. Desnaturalización de los ácidos nucleicos forma Z alternancia de purinas y pirimidinas (CGCGCG) lev ógira 12 pb/vta surco mayor muy profundo y cerrado surco menor muy expuesto Desnaturalización Parcial del ADN necesaria para procesos de copiado Aumento de Temperatura Regiones ricas en AT se disocian primero Experimental Por temperatura Se analiza mediante espectroscopía Aumento de Temperatura Disociación cooperativa de las hebras Separación de hebras y formación de ovillos Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADN Depende del contenido de GC Tm Temperatura de disociación T a la que la mitad del ADN está disociado 11 12 Denaturalización de los ácidos nucleicos: Tm 2. Renaturalización del ADN Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADN Se analiza mediante espectroscopía Depende del contenido de GC Tm Temperatura de disociación T a la que la mitad del ADN está disociado Reacción Bimolecular Encuentro de hebra complementaria Zipping de complementarias depende del tiempo y de la concentración de reactantes Aplicaciones Complejidad del genoma Búsqueda de secuencias específicas 13 14 Reasociación de ADN: complejidad del genoma Cinética de reasociación del ADN genómico humano Permite analizar complejidad de un genoma Co t1/2 = 1 / k 2 k 2 = constante de segundo orden Co = concentración de ADN t1/2 = tiempo medio de reacción Secuencias repetidas reasocian rapidamente Secuencias únicas reasocian lentamente 50 rápido(repetidos) intermedio (repetido) Co t1/2 Co t1/2 % DNA reasociado % DNA reasociado 0 0 Fracciones obtenidas: reasociación rápida reasociación intermedia reasociación lenta Co t1/2 100 50 Cot1/2 Cot1/2 lento (copia única) Cot1/2 I I I I I log Co t log Cot 15 intermedio (repetido) 100 lento (copia única) 16 Fracciones obtenidas: reasociación rápida reasociación intermedia reasociación lenta rápido(repetidos) I I I I 3. Hibridación de ácidos nucleicos 3. Hibridación de ácidos nucleicos Búsqueda de secuencias específicas en mezclas complejas de ácidos nucleicos En soportes sólidos Southern Blot Northern Blot Dot blot Micro-arrays ADN ARN En solución En soportes sólidos 17 Southern Blot Northern Blot Dot blot Micro-arrays ADN ARN 18 Estructura terciaria de los ácidos nucleicos: palíndromes, horquillas y cruciformes 19 20 Acidos nucleicos monocatenarios: Estructura secundaria y terciaria Topología y función Los ARN suelen adoptar distintas conformaciones, muchas de ellas estables y mantenidas por regiones autocomplementarias 21 • Superenrrollamiento necesario para la compactación del ADN y su función • In vivo la mayoría del ADN está superenrrollado negativamente • Esto favorece la disociación local de las hebras, importantes durante la duplicación y transcripción • Enzimas topoisomerasas regulan los niveles de superenrrollamiento celular • Es posible que se formen estructuras alternativas debido a desenrrollamientos locales generados por superrollamiento 22 Topología del ADN Estructuras complejas de ARN Como hace el ADN para caber en los limitados volumenes intracelulares? Superenrrolamiento Asociación con proteínas El ADN relajado en forma B tiene 10 pb/vta. Un ADN superenrrollado tiene mas o menos pb/vta. (superenrrollamiento positivo o negativo) •Torsión (Twist) •Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe) Topoisómeros 23 24 Torsión y superenrrollamiento Organización del material hereditario Al superenrrollar el ADN se genera tensión, que se expresa en un desenrrollamiento local del ADN (v ariando la torsion). Al separar las hebras, se genera tensión que se resuelv e enrrollando sobre si misma la molécula de ADN (v ariando el superenrrollamiento). • Lk = Tw + Wr Volumen limitado Neutralización de cargas del ADN • Ligazón (Linking number) Torsión (Tw ist) Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe) 25 Necesidad de compactación Organización funcional del ADN mecanismos de segregación en duplicación accesibilidad de proteínas reguladoras de la expresión génica 26 El nucleoide bacteriano El núcleo eucariota El genoma bacteriano incluye un cromosoma circular y moléculas pequeñas circulares (plásmidos) 10,000 nm No existe núcleo definido El genoma nuclear humano comprende 46 moléculas de ADN lineales ADN en “región nucleoide” El largo sumado de este ADN es mas de 1.5 metros El diámetro del núcleo es aprox. 10 nm Varios dominios de 40-80 Kb superenrrollados asociado a ARN y proteínas 27 28 El ciclo celular El nucleo interfásico Durante la división se visualizan cromosomas individuales Los cromosomas metafásicos son la forma más condensada de la cromatina Cromatina complejo compuesto por ADN y proteínas Eucromatina zonas menos condensadas Heterocromatina zonas más condensadas Toda la cromatina se condensa previamente a la división celular Los cromosomas son herramientas de segregación del material hereditario Cuáles son los pasos de compactación? 29 30 La cromatina: microscopía La cromatina: bioquímica Análisis bioquímico A partir de núcleos aislados se puede aislarse cromatina Cantidades similares de ADN y proteínas Al microscopio electrónico se observan fibras de 30 nm y collar de cuentas de 10 nm Digestión de ADN con nucleasas repetidos de 160-200pb Proteínas básicas – HISTONAS 31 32 Las histonas • • • • • Proteínas básicas pequeñas Altamente conservadas Centro globular y colas ricas en Lys y Arg Sitios de acetilación de Lys en colas N terminales (+) Sitios de fosforilación en Ser en colas de H1 El octámero de histonas Las histonas H2A y H2B forman un dímero H1 Dos H3 y dos H4 forman un tetrámero H2A H2B Dos dímeros H2A-H2B y un tetrámero H3-H4 forman un octámero con forma de disco aplanado hélice variable H3 Histone Fold H2A/H2B Dimer “handshake” H4 33 conservado 34 El nucleosoma Las colas de las histonas del core •Sobre el octámero se enrrolla el ADN •Cada octámero organiza 145 pb en 1 ¾ vuelta •48 nm ADN en un disco de 6x11nm •Sitios distantes en el ADN se aproximan (accesibilidad) •Otros sitios quedan cubiertos (en la cara interna) •Cargadas positivamente •Pasan entre las vueltas de ADN •Contactan con el ADN adayente y del octámero próximo 35 36 El solenoide La histona H1 • No forma parte del octámero •Organiza el ADN a la entrada y salida del octámero Hélice nucleosomal 6 nucleosomas por vuelta 37 38 Correlación estructura función Proteínas no histonas en la cromatina •La modificación de histonas es VITAL en la expresión génica •La acetilación y desacetilación de histonas es cíclica Eliminación de histonas (Tratamiento con detergentes leves o altas concentraciones salinas) • Colas cargadas + Se unen al ADN de nucleosomes adyacentes • Alto nivel de histona H1 Matriz nuclear proteica y bucles de ADN unidos a la matriz • Colas acetiladas NO se unen al ADN • Bajo nivel de histona H1 Matriz nuclear + 2M NaCl NO es posible la transcripción Fibra de 30 nm 39 DNA loops Existe transcripción génica histonas Cuentas 10 nm 40 El andamiaje (scaffold) Bucles de cromatina Igual tratamiento en cromosomas metafásicos revela un esqueleto proteico del cromosoma (scaffold) del que salen bucles de ADN de 30 a 100 Kb Existen regiones de ADN que se unen al scaffold SARs (scaffold attachment regions) MARs (matrix attachment regions) SARs=MARs La matriz nuclear proteica es el scaffold durante la interfase Loops of 30 – 90 kb 41 42 Bucles como dominios de cromatina Visualización in vivo de niveles superiores de compactación: cromosomas plumulados Cada bucle fijado al scaffold puede presentar una estructura diferente, mas o menos condensada. A. Lampbrush chromosomes. Cromosomas meióticos apareados parcialmente condensados y pausados durante la profase meiótica para sintetizar ARNs y proteinas a ser almacenadas para el desarrollo temprano del huevo. Pueden ser dominios funcionalmente independientes 43 44 El cromosoma metafásico Dominios condensados Forma de máxima compactación de la cromatina Los bucles de ADN fijados al scaffold se pliegan formando una superhélice Unidad estructural segregacional de la información hereditaria 1µm Constricción secundaria Región organizadora nucleolar Con genes ribosomales Cromosoma mitótico 10 µm radial loop chrosomosom e model Centromero Constricción primaria Sitio de unión de proteínas que forman cinetocoro Brazos Porciones del cromosoma entre el centrómero y el telómero cromátide cromátide 45 46 El cromosoma Citogenética: técnicas de estudio de los cromosomas Unidad funcional de la información hereditaria La CITOGENETICA analiza la cantidad y morfología de los cromosomas Los cromosomas se pueden describir en base a la posición del centromero Telómeros Regiones terminales de los cromosomas Secuencias repetidas particulares Mecanismo de duplicación particular Función = Integridad cromosómica Bandeo cromosómico Tratamiento desnaturalizante o enzimático del cromosoma y posterior tinción Cada cromosoma revela un patrón específico de bandas claras y oscuras, Orígenes de replicación ARS (secuencias de replicación autónomas) Varios por cromosoma Función = replicación Centrómero Constricción primaria Rico en secuencias repetidas Sitio de unión de proteínas que forman cinetocoro Función = segregación 47 48 Técnicas de localización cromosómicas Técnicas de bandeo cromosómico FISH Revelan diferencias estructurales en la cromatina que constituye cada banda Hibridación in situ sobre cromosomas con sondas fluorescentes Tratamiento desnaturalizante o enzimático y tinción Bandas oscuras y claras (1-10 Mb) •Bandeo G •tratamiento con tripsina Bandas claras zonas activas replicación temprana Bandas oscuras zonas inactivas replicación tardía •Bandeo R •patrón opuesto a Bandeo G •Bandeo C •heterocromatina constitutiva •pericentromérica Cariotipo Espectral Multiple FISH con sondas específicas de cada cromosoma marcadas con un fluorocromo diferente 49 50 Correlación estructura función Niveles de compactación mecanismos de segregación en duplicación Dominios topológicos independientes ( Regulación independiente) Compactación Compactación debida al scaffold / matriz nuclear Represor transcripcional Compactación debida a histonas Tamaño compacto 51 DNA longitud 2 x 23 = 46 cromosomas 92 moléculas ADN 10 µm esfera 12,000 Mbp 4 m DNA 400,000 x Cromosma mitótico 2 cromátides, 1 µm espesor 2 moléculas ADN 10 µm forma X 2x 130 Mbp 2x 43 mm DNA 10,000 x Dominio de ADN Bucle de AND anclado 1 replicón ? 60 nm x 0.5 µm 60 kbp 20 µm DNA 35 x Fibra de cromatina approx. 6 nucleosomas por vuelta of 11 nm 30 nm diámetro 1200 bp 400 nm DNA 35 x nucleosoma disco 1 ¾ vueltas de ADN (146 bp) + ADN linker 6 x 11 nm 200 bp 66 nm DNA 6 - 11 x 1 bp 0.33 nm DNA 1x Par de bases 0.33 x 1.1 nm Problemas compactado Núcleo (humano) neutralización de cargas del ADN 52 Que sucede durante la duplicación y la transcripción?
