11.18_Martín del Campo Pérez

ANALISIS DE LA DIVERGENCIA FUNCIONAL DE GENES DUPLICADOS
DE LEVADURA
Martín del Campo Pérez, V.; De Luna Fors, A.; Ascencio Sánchez, D.I.
Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ).
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO)
Centro de Investigación de Estudios Avanzados del Politécnico Nacional, Irapuato
(CINVESTAV del IPN, Irapuato).
RESUMEN
El presente trabajo consiste en la construcción de cepas mutantes diploides (2n) de
Saccharomyces cerevisiae. Se trabajó con dos cepas, cada una con un un gen marcador:
BY4741 YFP-URA3 (MATa) y Y7092 CFP-natR (MATα). Se seleccionaron parejas de
genes duplicados en levadura, donde sólo uno de cada par es esencial. Éstos genes se
clonaron en un vector de Escherichia coli (E. coli), el cual se purificó y buscó que cada
gen se insertara en el plásmido bidireccionalmente (Fo y Re). Se aparearon los dos
sexos de S. cerevisiae, MATa y MATα, para producir una cepa diploide (2n) y
posteriormente transformarla con el vector de clonación de E. coli. Se obtuvieron 6
cepas mutantes que deben esporular y realizar un experimento de competición, el cual
determinará la divergencia funcional en esos genes.
INTRODUCCIÓN
La levadura Saccharomyces cerevisiae es reconocida como un sistema modelo
representado en un eucariote simple cuyo genoma puede ser fácilmente manipulado.
(Sherman, 2002). Sus propiedades que hacen a ésta levadura particularmente adecuada
para estudios biológicos, incluyen un rápido crecimiento, fácil replicación, aislamiento
de mutaciones, y lo más importante, un sistema de transformación de DNA altamente
versátil (Woods et al. 2002), además de que pueden crecer como haploides o diploides.
Por tanto, es posible identificar mutaciones recesivas en células haploides y después
combinar mutaciones en diploides por análisis de complementación (Hartwell et al.
2000). Tiene un conjunto haploide de 16 cromosomas lineares bien caracterizados. La
secuencia total de DNA cromosómico, constituye 12,052 kb, del cual hay 6,183 ORFs
de más de 100 aminoácidos de largo (A. Goffeau, 1996). Las levaduras pueden alternar
su ciclo de vida entre haploides (1n) y diploides (2n). Las células haploides son de dos
sexos: a y α. Los dos tipos sexuales pueden reproducirse mitóticamente como células
estables, o bien pueden comprometerse en reproducción sexual donde las células
opuestas se comunican a través de proteínas llamadas feromonas que induce a las
células de distinto sexo a la fusión celular en seguida de fusión nuclear.
¿Cómo evoluciona el genoma?, es una pregunta muy compleja y que hasta hoy,
no tiene una respuesta definitiva. La divergencia funcional es una medida de la
conservación evolutiva de un gen a través de mutaciones puntuales, tales como
pequeñas deleciones e inserciones (Krylov et al. 2003). En los genes que han sido
duplicados y retenidos en el genoma durante largos periodos, hay muchos casos donde
los patrones de expresión promueven nuevas funciones o especializaciones en el
organismo (Nembaware et al. 2009). Estudios recientes muestran que la divergencia en
la secuencia reguladora (regulación-cis) ha sido responsable de cambios en el fenotipo
de varias especies cercanas taxonómicamente. Éste es un debate controversial, por que
existe la contraparte teórica, basada en que la regulación-cis no es la única y más
importante para la divergencia funcional, lo que implica que también la secuencia
codificante puede variar, así como también los cambios en los RNAm y/o factores de
transcripción, es por ésta causa que se necesita mayor investigación (Pennisi, 2008).
OBJETIVO GENERAL
Determinar si la divergencia funcional en Saccharomyces cerevisiae se encuentra en la
función bioquímica del gen (expresada en proteína) o en la función regulatoria
(promotor).
METODOLOGÍA Y RESULTADOS
Se seleccionaros ocho pares de genes duplicados en levadura, de los cuales solo se
trabajó con dos pares. Los criterios de selección fueron los siguientes:
 Tamaño
 Misma localización sub-celular
 Un gen de cada par, es esencial (es decir, la mutación por deleción completa es
letal).
No.
A1
A2
B1
B2
Gen
SDH3
YMR118C
GSP1
GSP2
Tamaño
1691 pb
1473 pb
1554 pb
1500 pb
Localización
Mitocondria
Mitocondria
Núcleo
Núcleo
Esencial
Si
No
Si
No
Fig. 1: Características de los genes duplicados en levadura
Se sometió a PCR las secuencias de parejas de genes seleccionados para
amplificarlos mediante primers previamente diseñados. Se utilizó la enzima XmaI para
los sitios de restricción de clonación en el vector pFA6 para los genes A1, B1 y A2, B2
con los primers respectivamente: RS-X1Fo y RS-X1re, RX-X2Fo y RS-X2re . Se
hizo una digestión con XmaI al producto de PCR. El vector utilizado pFA6. Se trató
previamente con fosfatasa alcalina. La reacción de digestión del producto de PCR , se
incubó 1 hora a 37ºC así como se inactivó la enzima de restricción a 65ºC durante 20
min. La reacción de ligación del vector pFA6 con el producto de PCR se llevó a cabo
durante una noche a 16ºC en el termociclador.
Se transformaron células competentes de E. coli DH5-α mediante “heat-shock” a
42ºC y posteriormente se colocaron en hielo durante 2 minutos. Después se incubaron a
37ºC durante 1 hora en agitación a 225 rpm. Se hizo un inóculo de células
transformadas en medio LB-Líquido. Posteriormente se hizo una extracción de
plásmidos. Se debe centrifugar a 13000 rpm durante 3 minutos, 3ml del inóculo y se
tira el sobrenadante para quedarse con las células transformadas. Resuspender las
células en 100µl con medio LB en el vortex. Agregar 300µl de solución TENS y agitar
6 veces por inversión extracción cloroformo:fenol (1:1). Agregar un volumen de
cloroformo y otro de fenol, por cada volumen de volumen del tubo. Centrifugar 13000
rpm durante 5 minutos. Obtener el sobrenadante y adicionar un volumen de cloroformo.
Centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos y añadir dos volúmenes de etanol absoluto
frio (-20ºC) Mantener a -20ºC durante 20 minutos y centrifugar a 14000 rpm durante 10
minutos. Descartar el sobrenadante, añadir 500µl de etanol al 70% y centrifugar 13000
rpm durante 2 minutos. Descartar el sobrenadante y secar la pastilla. Resuspender
pastilla en 50µl de solución TE. Se hizo un análisis de restricción con enzimas, a los
insertos en el vector. Se debe encontrar insertos bidireccionales.
Se hizo un PCR con primers diseñados que ampliaran regiones específicas. Los
genes que se insertaron en dirección Fo, son a los que se amplificó el ORF y los genes
con inserto en dirección Re, se les amplificó el promotor. Se apareó dos cepas de
levadura: Y7092 (MATα can1∆::STE2pr-SP_his5 lyp1∆ his3∆1 leu2∆0 ura3∆0
met15∆0) con marcador CFP (Proteína Cian Fluorescente) y con resistencia a
Kanamicina (kan) y BY4741 (MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 xxx∆::kanR) con
marcador YFP (Proteína Amarilla Fluorescente) y con el gen deletado para uracilo.
Cada cepa contenía una carga genética haploide (n) y al aparearse y formar una cepa
diploide (2n), la recombinación homóloga de sus genomas, hizo posible crecer a la cepa
en un medio con kanamicina y sin uracilo. Se hizo una selección de diploides con
genotipos combinados, los cuales hacían sobrevivir a las levaduras en un medio
selectivo y éstas fueron candidatas a ser transformadas con los genes A1, A2, B1 y B2
(cada gen con insertos bidireccionales en el vector pFA6). Al cultivar las células
transformadas en medio YPAD, solo crecieron A1-Fo, A1-Re, A2-Fo, A2-Re, B1-Fo y
B2-Fo. El resto de las levaduras no transformadas con los insertos B1-Re y B2-Re,
puede deberse a un defecto con el primer diseñado para amplificar la parte regulatoria
de éstos genes. Se debe resaltar que debido a la falta de tiempo para continuar con el
proyecto, deben seguir próximos experimentos: Se debe poner a competir las cepas
mutantes con el marcador CFP y YFP con cepas de referencia, cada colonia producida
por espora contendría una quimera genética (el promotor de un gen y el ORF del otro
gen de cada pareja de genes duplicados). Se debe analizar la taza de crecimiento de cada
una, esto es un indicador para determinar si la parte reguladora del gen al combinarse
con la secuencia codificante de el otro gen duplicado, manifiesta un fenotipo letal y por
tanto la fluorescencia indicada será de la cepa de referencia y que la formación de esa
quimera genética no es viable para la supervivencia de la cepa, y por caso contrario, si
se detecta fluorescencia de la mutante, significa que la quimera realizada, es viable para
la supervivencia de la levadura, y que tal vez la divergencia que adquirió con el paso del
tiempo, no fue del todo letal. Para comprobar donde se encuentra la divergencia de cada
gen, es necesario secuenciarlo y analizar si tiene o no cambios. (DeLuna et al. 2008)
CONCLUSION
La importancia de éste estudio se suma a la contribución para entender como es
que el genoma se comporta y cómo ha cambiado a través de millones de años.
Actualmente existe gran controversia entre investigadores los cuales afirman que la
divergencia se encuentra en la parte reguladora del gen, ya que los cambios en la región
codificante serían de mayor impacto en la expresión. Ellos piensan que al mutar la
región reguladora, la expresión tendría cambios controlados así como también en
modular el grado de expresión. Por otro lado se encuentran los investigadores en
desacuerdo con ésta teoría, argumentando que se debe investigar más hasta adquirir la
información suficiente que la haga irrefutable, a pesar que en experimentos previos haya
indicios de que la divergencia se encuentra en la región regulatoria (Pennisi, 2008). Por
tanto, ésta investigación busca contribuir a un mayor entendimiento del comportamiento
de la evolución del genoma, para que en un futuro próximo se tenga mayor
conocimiento del el y nos permitan prevenir, diagnosticar y tratar padecimientos de
enfermedades relacionas genéticamente (DeLuna, 2007). El camino es largo pero se está
trabajando en investigación y el conjunto de esos resultados proporcionarán una mejor
visión del panorama genético.
BIBLIOGRAFÍA:
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[Publicación periódica]. - [s.l.] : Nature, 2008.
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Krylov Dmitri M. Yuri I. Wolf, Igor B. Rogozin, and Eugene V. Koonin Gene Loss,
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Pennisi Elizabeth Deciphering the Genetics of Evolution [Publicación periódica]. [s.l.] : Science, 2008. - Vol. 321.
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Silver, Ruth C. Verves. Genetics [Libro]. - [s.l.] : McGraw Hill, 2000. - 1era Edición :
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