30 de abril de 2010

EXAMEN
NOMBRE DEL ALUMNO
COMENTARIOS DEL CURSO:
1. ¿Qué distingue la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas? ¿todas las proteínas tienen estructura
cuaternaria?
2. ¿Cómo podrías determinar si una proteína tiene estructura cuaternaria?
3. ¿Que contribuye a la insolubilidad de proteínas fibrosas tal como la keratina y como esta insolubilidad
contribuye a la función de estas proteínas?
4. ¿Qué factores limitan el tamaño de una proteína?
5. Un estudiante tiene que preparar algunas soluciones, ya que es necesario que él obtenga algunos extractos de
globulinas a partir de una planta que se conoce tiene propiedades antiproliferativas para células transformadas,
entre estas soluciones, se encuentra un amortiguador de fosfatos 10 mM el cual hay que ajustar a un pH
fisiológico y debe de contener una concentración de NaCl a 0.15 M.
a. Que protocolo propones para la realización de esta solución.
b. Cuál es el pH al que debe de ajustarse la solución.
c. Para que se ajusta el NaCl a 0.15 M.
6. Los lípidos, las moléculas pequeñas y las partículas sin carga entran y salen de la célula con relativa facilidad.
¿Qué características de la membrana celular pueden inferirse de estas observaciones?. Enumere tres
mecanismos de transporte de sustancias hacia el interior de la célula.
7. El punto isoeléctrico de la pepsina. La pepsina es el nombre asignado a varias enzimas digestivas secretadas por
las glándulas a nivel del estómago. Estas glándulas también secretan ácido clorhídrico, el cual ayuda a disolver
los alimentos, permitiendo que la pepsina actúe sobre las proteínas. La mezcla resultante de alimento, HCL y
enzimas digestivas tienen un pH cercano de 1.5.
a. ¿Qué punto isoeléctrico puedes predecir que tiene la pepsina?
b. ¿Qué grupos funcionales deben estar presentes para conferirle este punto isoeléctrico a la pepsina?
c. ¿Cuáles aminoácidos en la proteína deberán contribuir a tales grupos funcionales?
8. Número de residuos de triptófano en la seroalbúmina bovina. Un análisis cuantitativo de aminoácidos revela
que la seroalbúmina bovina (BSA) contienen 0.58% de triptófano (Mr 204) por peso.
a. Calcula el peso molecular mínimo de la BSA (por ejem. Asumiendo que existe solamente una molécula
de triptófano por molécula de proteína)
b. La filtración en gel de BSA arroja un peso molecular estimado de 70,000 Da. ¿Cuantos residuos de
triptófano están presentes en una molécula de seroalbúmina?
Un estudiante del curso de bioquímica del Posgrado en Ingeniería Bioquímica, tiene la tarea de purificar una proteína,
específicamente una enzima del ciclo del ácido cítrico (la enzima citrato sintasa) localizada en la matriz mitocondrial siguiendo
un protocolo experimental que a continuación se describe.
En base a tu experiencia en el Laboratorio, proporciona las siguientes respuestas:
a)
b)
c)
Se adquieren para lograr el objetivo 20 kg de corazón de res. La muestra es transportada en hielo y todos los pasos
involucrados en la purificación de la enzima son realizados en un cuarto frío o en presencia de hielo. El homogenado del
tejido de corazón es obtenido en un homogenizador de alta velocidad en un medio que contiene buffer de pH de 7.2 con
una concentración aproximada de sacarosa de 0.2M.
i)
¿Porque usar tejido de corazón de res y sobre todo porque en las cantidades descritas?
ii)
¿Cuál es el propósito de mantener el tejido frío y suspendido en la solución de sacarosa 0.2M a pH 7.2?
iii)
¿Qué le sucede al tejido cuando este es homogenizado?
El extracto crudo de homogenizado de corazón resultante, tiene una apariencia densa y opaca como resultado de una
centrifugación diferencial.
i)
¿Qué es lo que ocurre en esta operación?
Se procede con la purificación a partir de la fracción sobrenadante (porción que tiene la mayor cantidad de mitocondria
intacta). Se continúa lisando a la mitocondria osmóticamente. El lisado, el cual es menos denso que el homogenizado,
30 de abril de 2010
9.
e)
f)
g)
Valor 2 puntos
30 de abril de 2010
d)
pero más opaco, consiste principalmente de membrana mitocondrial y el contenido interno de la mitocondria. A este
lisado se le somete a un fraccionamiento con sulfato de amonio a determinadas concentraciones. La solución inicial con
el sulfato de amonio se somete a una centrifugación y posteriormente se decanta el sobrenadante y se descarta el pellet.
Al sobrenadante, el cual es más claro que el lisado, se le adiciona una cantidad mayor de sulfato de amonio, se disuelve
la sal y se repite la operación de centrifugación, en esta ocasión se tiene el antecedente de que en el pellet se encuentra
la proteína de interés.
i)
¿Cuál es la razón de agregar de forma diferenciada la sal?
Se solubiliza el pellet salino que contienen las proteínas mitocondriales en la menor cantidad de amortiguador, para
posteriormente someterlo a diálisis contra grandes volúmenes de amortiguador pH 7.2.
i)
¿Porque no se incluye sulfato de amonio en el amortiguador utilizado en la diálisis?
ii)
¿Por qué se emplea una solución buffer en lugar de agua?
iii)
Si necesitas liofilizar la fracción proteica ¿que sugieres emplear en la Diálisis?
Con la fracción dializada, se realiza una separación empleando la cromatografía de exclusión de tamaño. Continuando
con el protocolo, se colecta la primer fracción de proteína que eluye de la columna y se descartan el resto de las
fracciones que eluyen de la columna. Se detecta la proteína midiendo la absorbencia a 280 nm en las fracciones.
i)
¿Por qué supones que se recomienda colectar la primera fracción de proteína? Y en función a esto, ¿Qué
puedes inferir en relación al PM de la proteína?
ii)
¿Por qué se determina la absorbencia a 280 nm y no a otra longitud de onda?
Se dispensa la fracción colectada en € en una columna de cromatografía de intercambio iónico. Después descartas la
solución inicial que eluye de la columna. Se adiciona una solución de lavado a un pH superior al de la columna y se
colecta la fracción proteica que eluye inmediatamente. Explica porque se hace esto.
Se corre una pequeña muestra de la fracción ahora muy reducida en volumen, sobre un gel de isoelectroenfoque.
Cuando se tiñe el gel muestra tres bandas extremadamente cercanas, lo que no permite concluir la pureza de la misma.
De acuerdo al protocolo, la proteína de interés tiene un pI de 5.6, sin embargo, se decide hacer más ensayos para
identificar la pureza de la proteína. Se corta la banda que muestra un pI de 5.6 y se somete a un SDS-PAGE. Por esta
técnica se observa la presencia de una sola banda.
i)
¿Por qué se considera que por isoelectroenfoque no se concluye la pureza de la proteína? Discútelo en función
del pI.
ii)
¿Qué información encuentras por SDS-PAGE?
iii)
¿Por qué es tan importante la electroforesis después del isoelectroenfoque?