AMPLIFICACIÓN DE DNA. 1 ACTIVIDAD PRÁCTICA

1
ACTIVIDAD PRÁCTICA
AMPLIFICACIÓN DE DNA.
Objetivos: Que el alumno conozca y/o realice:

Amplificación de DNA.
Introducción
La Biología Molecular se ha convertido en una poderosa herramienta en muchos campos de las
Ciencias Biológicas, Bioquímicas y Médicas. En la actualidad se utiliza ampliamente ya sea en la
investigación o el diagnóstico de enfermedades. Esta metodología ha posibilitado los avances en las
investigaciones médicas resultando en un mejor diagnóstico y conocimiento de los desarreglos
sanguíneos, deficiencias inmunológicas, fibrosis quísticas y el cancer. Ha ayudado, además, en las
investigaciones de las enfermedades de los animales, el conocimiento y monitoreo de los recursos
naturales, así como en las ciencias taxonómicas, en la Genética evolutiva y del desarrollo, entre otras.
Hace 20 años el DNA era una de las macromoléculas más difíciles de analizar y parecía una ardua
tarea el comprender la función de tan larga estructura nucleotídica. Sin embargo, la situación hoy es
completamente diferente, pues el DNA se ha convertido en la macromolécula más fácil de estudiar.
Extracción y purificación del DNA
El DNA puede ser fácilmente extraído y purificado de una célula o tejido y, una vez aislado, es mucho
más estable que muchas otras macromoléculas: Puede cortarse con una alta precisión y
reproducibilidad utilizando enzimas de restricción, permitiendo la escisión de fragmentos específicos
de DNA que a su vez, mediante la técnica de clonaje, se puede obtener en cantidades ilimitadas.
Utilizando las técnicas de hibridización y los métodos de secuenciación rápida de fragmentos
clonados se puede determinar la estructura y organización de una gran parte del genoma de los
organismos, de hecho se ha abierto la posibilidad del conocimiento de la secuencia y estructura del
genoma humano. La fase inicial, la extracción y purificación del DNA, es muy sencilla y no por eso
menos importante. Una buena extracción, no solo en cantidad sino en calidad, favorecen o aseguran
la obtención de los resultados esperados y la repetibilidad de los mismos. Casi todos los métodos de
extracción de DNA se basan en la lisis enzimática de las células y tejidos por medio de Proteinasa K,
la precipitación de las proteínas y restos tisulares en un solvente (usualmente Fenol-Cloroformo) y la
colecta de la fase acuosa, donde queda disuelto el DNA, que puede ser precipitado utilizando Etanol
absoluto y, disuelto en un buffer apropiado, puede conservarse por mucho tiempo para su estudio.
Además, en el mercado existen muchas firmas que producen "Kits" para la extracción y purificación
de DNA.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
Este método no es más que la síntesis in vitro de DNA. Es una nueva y potente herramienta que ha
causado una revolución en la Biología Molecular. Es tan sensible que una sola molécula de DNA
puede ser amplificada y una sola copia de genes pueden ser extraídos de mezclas genómicas
complejas y visualizarlas como distintas bandas en geles de agarosa. Puede ser utilizado, además,
para efectuar búsquedas y/o secuencia rápido insertos directamente de alicatas de fagot individuales
o colonias de bacteria. Adelantos, tales como el uso de una DNA polimerasa termoestable y la
automatización del método inventado por Kary Mullis han posibilitado el desarrollo de numerosas y
diversas aplicaciones del PCR a través de la comunidad de investigadores. Sin lugar a dudas, un solo
protocolo no sería apropiado para todas las situaciones; en consecuencia cada nueva aplicación del
PCR requerirá de la optimización.
2
Algunos de los problemas más frecuentemente encontrados incluyen:




No-detección de los productos.
Presencia de bandas inespecíficas debidas a errores en la inserción de los "primer" o su
extensión.
La formación de "dímeros de primers" que compiten en la amplificación con los
productos deseados.
Mutaciones o heterogeneidad debida a errores en la incorporación de bases.
Protocolo Estándar de Amplificación por PCR
Aunque las condiciones estándares amplifican la mayoría de las secuencias, estas se presentan a
continuación principalmente para prever las condiciones iniciales para el diseño de nuevas
aplicaciones del PCR. La optimización del PCR puede ser altamente ventajosa para una aplicación
dada, especialmente en aquellas relacionadas con las pruebas de diagnóstico repetitivo o los
procedimientos analíticos que requieren de una ejecución óptima.
Protocolo Estándar
1. Poner 100 µl de reacción en un tubo Eppendorf de 0.5 mL, mezclarlo y cubrirlo con 75 µL de aceite
mineral:
Mezcla:
DNA molde (de 105 a 106 moléculas "blanco"*)
20 pMol. de cada primer
20 mM Tris-HCl (pH 8.3, 20oC)
1.5 mM MgCl2
25 mM KCl
0.05% de Tween 20
100 µg/ml de gelatina estéril o seroalbúmina bovina libre de nucleasa
50 µM de cada dNTP
2 Unidades de Taq DNA polimerasa
*1 ug de DNA genómico = 3 x 105 Moléculas blanco
10 ug de DNA de Levaduras = 3 x 105
1 ug de DNA de E. coli = 3 x 105
1% de una placa de M-13 = 106
2. Desarrollar de 25 a 35 ciclos de PCR utilizando el siguiente esquema de ToC:
Desnaturalización:
Annealing:
Extensión:
96oC por 15 seg. (Inicialmente se pueden utilizar tiempos
mayores)
55oC por 30 seg.
72oC por 1.5 seg.
3. Los ciclos deben terminar con una extensión final de 5 Min. a 72 oC. La reacción se detiene
enfriando a 4oC y/o adicionando EDTA 10mM.
Factores que afectan el desarrollo del PCR.
1. Concentración de Enzimas: La recomendada oscila, para la Taq DNA polimerasa (Perkin- Elmer
Cetus), entre 1Sin embargo los requerimientos de enzimas pueden variar respecto al DNA molde o a los primers.
Para optimizar el PCR se recomienda probar concentraciones de enzimas entre 0.5 - 5
Unidades/100ul y chequear los resultados a través de electroforésis en gel. Si la concentración de
enzima es muy alta, se producirían y acumularían productos inespecíficos de fondo y, si es muy poca
se obtendría una insuficiente cantidad del producto deseado.
Nota: Las enzimas (Taq DNA polimerasa) de diferentes proveedores pueden comportarse de manera
diferente debido a las distintas formulaciones, condiciones de ensayo y/o definiciones de Unidad.
3
2. dNTPs: Las soluciones almacenadas (Stock) de dNTPs deben ser neutralizadas a pH 7.0 y debe
determinarse su concentración espectrofotométricamente. Los Stock primarios deben ser diluidos
hasta 10 mM, subdivididos y almacenados a -20oC. Se recomienda para el trabajo una solución que
contenga 1mM de cada dNTP. La estabilidad de los dNTPs durante ciclos repetidos es tal que
aproximadamente el 50% permanece como dNTP luego de haber transcurridos 50 ciclos.
Una concentración entre 20-200 mM de cada uno resulta en un balance óptimo entre el rendimiento,
la especificidad y la fidelidad. Los 4 dNTPs deben usarse a concentraciones equivalentes para
minimizar los errores de incorporación. Cuando se utilizan bajas concentraciones de dNTP (con
relación a las originalmente recomendadas para los PCR que utilizaban el fragmento Klenow 1.5 mM
de cada uno) aumentan tanto la especificidad y la fidelidad. Además minimiza los errores de
annealing en sitios inespecíficos.
Se debe decidir la menor concentración posible de dNTP apropiada para la longitud y la composición
3. Concentración de Magnesio (Mg): Esta puede afectar las siguientes etapas: Annealing de los
primer, la temperatura de disociación de las cadenas tanto del DNA molde como de los productos del
PCR, la especificidad de los productos, la formación de dímeros de primers y la actividad y fidelidad
de la enzima. La enzima (Taq DNA polimerasa) necesita Mg libre suficiente para su unión con el DNA
molde, los primers y para la inclusión de los dNTP. De tal modo los PCRs deben contener 0.5-2.5 mM
de Mg por encima de la concentración total de dNTP.
Nota: La presencia de EDTA u otros agentes quelantes en la solución de primers o en el DNA molde
puede afectar el óptimo aparente de Mg.
4. Otros componentes de la reacción: Se recomienda utilizar como buffer para el PCR Tris-HCl de 1050 mM (pH 8.3 - 8.8) cuando se mide a 20oC. El Tris es un buffer iónico dipolar que tiene un pk a de
8.3 a 20oC y un pka de -0.021/oC, de modo que el verdadero pH de 20 mM Tris-HCl (pH 8.3 a 20oC)
varía entre 7.8 y 6.8 durante las condiciones tópicas de los ciclos termales.
. Se puede adicionar hasta 50 mM de KCl en la mezcla de reacción para facilitar el annealing.
Concentraciones superiores a 50mM de KCl ó NaCl a 50mM inhiben la actividad de la Taq
polimerasa.
. Mientras que el DMSO resulta útil en los PCRs realizados con el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I de E. coli, el 10% de DMSO inhibe la actividad de la Taq polimerasa en un 50% y su uso
no se recomienda para la mayoría de las aplicaciones de los PCR.
. La gelatina o la Seroalbúmina bovina (BSA) (100ug/ml) y los detergentes no iónicos como el Tween
20 o el Laureth 12 (0.05-0.1%) se incluyen para estabilizar la enzima, aunque la mayoría de los
protocolos funcionan sin la adición de proteínas.
Annealing: La temperatura y el tiempo requerido para el Annealing depende de la composición,
longitud y concentración de los primers en la amplificación , una T oC aplicable sería 5oC por debajo de
la verdadera temperatura de annealing de los primers; como la Taq DNA polimerasa está activa en un
amplio rango de ToC, la extensión de los primers ocurrirá a bajas temperaturas incluyendo en la etapa
de Annealing. El rango de actividad de la enzima varía en dos órdenes de magnitud entre 20-85oC. La
temperatura de annealing que oscila en el rango de 55 a 72oC generalmente produce buenos
los primers. El aumento de la temperatura de annealing aumenta la discriminación contra los primers
incorrectamente "acoplados" y reduce la extensión errónea de nucleótidos en el extremo 3' de los
primers. Además, las altas temperaturas especialmente en los primeros ciclos ayudan a incrementar
la especificidad. Para lograr el máximo de especificidad en el ciclo inicial, la enzima Taq polimerasa
puede añadirse luego de ocurrida la primera desnaturalización y durante el Annealing.Bajas
temperaturas de extensión conjuntamente con altas concentraciones de dNTP favorecen la extensión
errónea de los primers y de nucléotidos mal incorporados. Por esta razón algunos investigadores
argumentan que el PCR debe realizarse mejor utilizando primers mas largos y solamente dos
temperaturas.
Ej: Desde 55-75oC para el Annealing y la extensión y de 94-97oC para la desnaturalización y la
separación de las cadenas.
4
Extensión: El tiempo de extensión depende de la longitud y la concentración de la "secuencia blanco"
y de la temperatura. Tradicionalmente la extensión se realiza a 72oC puesto que esta temperatura es
la cercana al óptimo para la extensión de los primers en el modelo que utiliza al M-13. Los estimados
de la incorporación de nucleótidos a 72oC varían de 35 a 100 nucléotidos/segundos en dependencia
del buffer, el pH, la concentración de sales y la naturaleza de la muestra de DNA. Se considera un
minuto como tiempo suficiente de extensión para producir a 72oC hasta 2 Kb de producto. Sin
embargo, tiempos de extensión más largos pueden ayudar en los primeros ciclos si la concentración
de sustratos es muy baja y en los últimos ciclos cuando la concentración de productos sobrepasa la
concentración de enzimas.
Tiempo y Temperatura de desnaturalización: La mayor causa de los fallos de un PCR lo
constituyen la desnaturalización incompleta de la muestra y/o los productos del PCR. las condiciones
tópicas de desnaturalización son 30 seg. a 95oC o 15 seg. a 97oC, aunque pudieran utilizarse
temperaturas mas altas especialmente en muestras con regiones ricas en G+C. La desnaturalización
del DNA a la temperatura de separación de las cadenas (Tss) ocurre en pocos segundos, sin
embargo, llegar a Tss en el interior del tubo puede tomar algun tiempo. Debe monitorearse la
Temperatura dentro de un tubo de reacción utilizando una "sonda termopar de baja masa" . La
desnaturalización incompleta permite que el DNA se renaturalice y esto reduce el rendimiento de
productos, por otra parte, etapas de desnaturalización que sean muy largas o a muy altas
temperaturas llevan a la pérdida innecesaria de la actividad enzimática. El tiempo de vida media de la
actividad de la Taq polimerasa es menor de 2 horas a 92.5oC, de 40 min. a 95oC y de 5min. a 97.5oC.
Número de Ciclos: Depende principalmente de la concentración inicial de la muestra de DNA cuando
se han optimizado el resto de los parámetros. Un error común es ejecutar muchos ciclos.
Demasiados ciclos pueden incrementar la cantida y complejidad de los productos inespecíficos de
fondo. Por supuesto muy pocos ciclos darían un bajo rendimiento de productos. Tómese la siguiente
tabla de Número de Ciclos vs. concentración inicial de muestra como una guía.
Número de moléculas de Muestra
Número de ciclos
3 x 105
25 - 30
1.5 x 104
30 - 35
103
35 - 40
50
40 - 45