Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en la
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Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en la fracción aromática de los vinos Tannat. por Eduardo Boido 2002 Uruguay Tesis entregada como parte de los requerimientos para la obtención del título de DOCTOR EN QUÍMICA Facultad de Química. Universidad de la República ii Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en la fracción aromática de los vinos Tannat. por Eduardo Boido Tesis entregada como parte de los requerimientos para la obtención del título de DOCTOR EN QUÍMICA Facultad de Química Universidad de la República 2002 Uruguay Director: Dr. Eduardo Dellacassa Codirector: Lic. Francisco Carrau Tribunal: Dr. (r.n.) Horacio Heinzen, Prof. Catedrático, Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Química Dr. G. Versini, Director del Laboratorio Analisi e Ricerche, Centro Sperimentale, Istituto Agrario di San Michele all’Adige, Italia Ing. Agr. Edgardo Disegna (MSc), Jefe Programa de Fruticultura, INIA iv A Caterina “... olvidar 15000 encantos es mucha sensatez ...” v vi “Trae vino, toma un laúd, y deja que sus modulaciones nos recuerden las de la brisa que pasa como nosotros” Omar Khayyam (1048-1123) vii Vitis vinifera L. cv Tannat Ampelografía de T. Trancy, copia de Traité Gènèral de Viticulture (IV), P. Viala y V. Vermorell, 1903. viii ix Bacterias lácticas en el vino (a) Oenococcus oeni, principal bacteria responsable de la fermentación maloláctica; y otras bacterias lácticas importantes en el vino, (b) Lactobacillus brevis, (c) Lactobacillus casei, (d) Pediococcus pentosaceus. x (a) (b) (d) (c) xi xii Agradecimientos Este trabajo fue posible gracias a la ayuda de muchas personas. En primer lugar debo agradecer a Caterina, a mis padres y a mi abuela Margarita que me apoyaron en los distintos momentos vividos durante la realización de mi tesis. A mis directores, Dr. Eduardo Dellacassa y Francisco Carrau, que me iniciaron en la idea de realizar este trabajo, y sugirieron como resolver los distintos problemas a los que me fui enfrentando. A los integrantes de la Sección Enología y de la Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales por la ayuda que siempre me brindaron. En especial a Karina y Adriana por su invalorable colaboración en el trabajo de laboratorio. A la Sección Evaluación Sensorial, Adriana, Ana, Paula y Aida, por su gran contribución en la realización de experiencias fundamentales de este trabajo. A los integrantes de la Cátedra de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, y de la Cátedra de Farmacia, por su ayuda en distintas etapas de mi trabajo. Por los mismos motivos, debo agradecer a la Escuela de Enología, a la Asociación de Enólogos y al INAVI. A los Drs. Giuseppe Versini y Giorgio Nicolini, Istituto San Michelle all’Adige, por su gran ayuda y critica en pasos fundamentales de la investigación realizada. A los Drs. Evelin Bartowski, Paul Henschke y Peter Costello, Australian Wine Research Institute, por brindarme su tiempo y conocimiento. Deseo agradecer además, por la atención a mis muchas preguntas, al Dr. Patrick Iland (Univ. de Adelaida), Dr. Tomas Henick-Kling (Universidad de Cornell), Dres. Tony Wolf y Bruce Zoecklein (Universidad de Virginia). A las empresas que colaboraron con diversos materiales e infraestructura, Vinos Finos J. Carrau, y Bodega y Viñedos Améndola Hnos. y Boido S.C., en especial a Pablo, Antonio y Verónica. A los organismos que de alguna forma ayudaron a financiar este trabajo, la CSIC, el INIA, y el CYTED. xiii xiv Parte de este trabajo de tesis ha sido publicada en las siguientes revistas y congresos: Boido, E., Lloret, A., Medina, K., Carrau, F., Dellacassa, E. Effect of β-glycosidase activity of Oenococcus oeni on the glycosylated flavor precursors of Tannat wine during malolactic fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50, 23442349. Lloret, A., Boido, E., Lorenzo, D., Medina, K., Carrau, F., Dellacassa, E., Versini, G. Aroma variation in Tannat wines: effect of malolactic fermentation on ethyl lactate level and its enantiomeric distribution. Italian Journal of Food Science, 2002, 14, 175-180. Gámbaro, A., Boido, E., Zlotejablko, A., Medina, K., Lloret, A., Dellacassa, E., Carrau, F. Effect of malolactic fermentation on the descriptive analysis of Tannat wine aroma. Australian Journal of Grape and Wine Research, 2001, 7, 27-32. Boido, E., Carrau, F., Dellacassa, E., Medina, K., Lloret, A., Versini, G. Modificación en la composición aromática producidas por la fermentación maloláctica en los vinos Tannat y su evolución durante la crianza. VIII Congreso Latinoamericano de Viticultura y Enología, 2001, Montevideo, Uruguay. Lloret, A., Boido, E., Medina, K., Lorenzo, D., Carrau, F., Carlin, S., Dellacassa, E., Versini, G. Importancia de la distribución enantiomérica del lactato de etilo en el aroma de vinos tintos luego de la fermentación maloláctica. VIII Congreso Latinoamericano de Viticultura y Enología, 2001, Montevideo, Uruguay. Carrau, F., Boido, E., Dellacassa, E., Lloret, A., Medina, K., Versini, G. Vitis vinifera L. cv. Tannat produces the typical red wine of Uruguay. 52nd. Anual Meeting American Society for Enology and Viticulture, 2001, San Diego, Estados Unidos. Boido, E., Carrau, F., Dellacassa, E., Medina, K., Lloret, A., Versini, G. Studies of aroma compouds developed during malolactic fermentation and ageing of Tannat wines. 2nd International Viticulture and Enology Congress, 2000, Cape Town, South Africa. Boido, E., Carrau, F., Dellacassa, E., Lloret, A., Medina, K., Versini, G. Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en la composición aromática de las fracciónes libre y ligada para la variedad Tannat. VII Congreso Latinoamericano de Viticultura y Enología, 1999, Mendoza, Argentina. Gámbaro, A., Boido, E., Zlotejablko, A., Medina, K., Lloret, A., Dellacassa, E., Carrau, F. Análisis descriptivo de aroma de vino Tannat. SENSIBER’99. II Simposio Iberoamericano de Evaluación de Propiedades Sensoriales de Alimentos, 1999, DF, Mexico. Boido, E., Carrau, F., Dellacassa, E., Lloret, A., Medina, K. Estudios del perfil aromático de vinos Tannat, y su modificación por la fermentación maloláctica. V Jornadas Uruguayas de Ciencia y Tecnología de Alimentos, 1999, Montevideo, Uruguay. Boido, E., Dellacassa, E., Carrau, F., Moyna, P. An improved means of monitoring malolactic fermentation in wines by TLC-densitometry. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 1999, 12, 269-271. xv xvi Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla de contenido Resumen............................................................................................................................. 7 Capítulo 1 - Introducción y antecedentes bibliográficos............................................. 11 La variedad Tannat ....................................................................................................... 11 Elementos de descripción ampelográfico de la variedad, características agronómicas y tecnológicas ........................................................................................................... 11 Clones cultivados y sus características ..................................................................... 12 Nuevas variedades obtenidas por cruzamiento con la variedad Tannat ................... 16 Importancia de las bacterias lácticas y la fermentación maloláctica: antecedentes y proyección..................................................................................................................... 19 Bacterias lácticas en el vino: biología, taxonomía y metabolismo........................... 20 La fermentación maloláctica: generalidades, ventajas y desventajas de su aplicación 28 Incidencia de diversos factores con importancia enológica en la realización de la fermentación maloláctica.......................................................................................... 33 Diferentes formas de inoculación del vino con bacterias lácticas para realizar la fermentación maloláctica.......................................................................................... 34 Otros métodos de realizar la desacidificación de un mosto o vino........................... 35 Bibliografía ................................................................................................................... 37 Capítulo 2 - Los aromas en el vino. Origen, naturaleza y características. Identificación de los compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos de la variedad Tannat.............................................................................................................. 47 Introducción.................................................................................................................. 47 Aromas varietales ..................................................................................................... 48 Terpenos ............................................................................................................... 48 Pirazinas................................................................................................................ 55 Carotenoides y derivados C13 norisoprenoides..................................................... 56 Formas glicosidadas.............................................................................................. 63 Precursores de origen fenólico y sus derivados.................................................... 65 Compuestos azufrados responsables de aromas varietales y sus precursores ...... 68 Aromas prefermentativos.......................................................................................... 70 Aromas fermentativos............................................................................................... 72 1 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Alcoholes...............................................................................................................73 Ácidos grasos y sus ésteres ...................................................................................74 Compuestos carbonílicos.......................................................................................74 Compuestos azufrados...........................................................................................75 Lactonas.................................................................................................................75 Fenoles volátiles ....................................................................................................76 Aromas postfermentativos.........................................................................................76 Evolución de los terpenos......................................................................................77 Evolución de los norisoprenoides..........................................................................80 Técnicas analíticas de cuantificación de los compuestos aromáticos libres y ligados en el mosto y el vino. .........................................................................................................82 Extracción en fase sólida...........................................................................................84 Amberlite XAD-2..................................................................................................84 Cartucho ISOLUTE ENV+ .................................................................................85 Objetivo .........................................................................................................................88 Materiales y métodos.....................................................................................................89 Vinos utilizados para los análisis ..............................................................................89 Extracción de los compuestos volátiles.....................................................................89 Extracción con resina Amberlite XAD-2 ..............................................................90 Extracción con cartucho ISOLUTE ENV+.........................................................90 Identificación de los compuestos aromáticos............................................................93 Cuantificación de compuestos aromáticos ................................................................94 Resultados y discusión ..................................................................................................94 Conclusiones ...............................................................................................................109 Bibliografía..................................................................................................................111 Capítulo 3 - Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en los compuestos volátiles del vino. Efecto de la cepa de Oenococcus oeni utilizada. ......127 Introducción.................................................................................................................127 Compuestos volátiles modificados como consecuencia de la FML........................129 Acetato de etilo....................................................................................................129 Lactato de etilo ....................................................................................................130 Otros esteres ........................................................................................................130 Acetaldehído........................................................................................................130 2 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Diacetilo (2,3-butanodiona)................................................................................ 130 Otros compuestos................................................................................................ 133 Objetivo ...................................................................................................................... 136 Materiales y métodos.................................................................................................. 136 Preparación del vino ............................................................................................... 136 Análisis de los vinos ............................................................................................... 138 Análisis de los compuestos volátiles ...................................................................... 138 Análisis estadístico ................................................................................................. 138 Resultados y discusión................................................................................................ 139 Estudio de los compuestos aromáticos libres ......................................................... 140 Estudio de los grupos de compuestos aromáticos libres......................................... 147 Estudio de los compuestos aromáticos ligados....................................................... 149 Análisis de componentes principales...................................................................... 151 Análisis discriminante ............................................................................................ 157 Conclusiones............................................................................................................... 158 Bibliografía ................................................................................................................. 160 Capítulo 4 - Modificaciónes producidas por la fermentación maloláctica en los compuestos volátiles del vino. Efecto de la crianza del vino en botella. .................. 165 Introducción................................................................................................................ 165 Esteres y alcoholes superiores ................................................................................ 165 Terpenos y norisoprenoides.................................................................................... 166 Fenoles volátiles ..................................................................................................... 166 Objetivo ...................................................................................................................... 168 Materiales y métodos.................................................................................................. 169 Análisis de los compuestos volátiles ...................................................................... 169 Análisis estadístico ................................................................................................. 170 Resultados y discusión................................................................................................ 171 Estudio de los compuestos volátiles libres ............................................................. 171 Estudio de los grupos de compuestos aromáticos libres......................................... 179 Estudio de los compuestos aromáticos ligados....................................................... 180 Análisis de componentes principales...................................................................... 184 Análisis discriminante ............................................................................................ 188 Conclusiones............................................................................................................... 190 3 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía..................................................................................................................192 Capítulo 5 - Modificaciónes producidas por la fermentación maloláctica en los compuestos volátiles. Estudio de la variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo. ...............................................................................................................197 Introducción.................................................................................................................197 Los compuestos quirales en la naturaleza ...............................................................197 Desarrollo de nuevas técnicas para la determinación del exceso enantiomérico ....198 La estereoisomería óptica y la percepción de los aromas .......................................199 Los compuestos enantioméricos en la fermentación maloláctica ...........................202 Objetivo .......................................................................................................................204 Materiales y métodos...................................................................................................204 Muestras utilizadas ..................................................................................................204 Aislamiento del lactato de etilo ...............................................................................204 Identificación y cuantificación ................................................................................205 Análisis de la relación enantiomérica para el lactato de etilo .................................205 Reactivos utilizados.................................................................................................207 Determinación de los descriptores aromáticos........................................................207 Determinación del umbral de percepción al olfato .................................................207 Resultados y discusión ................................................................................................207 Conclusiones ...............................................................................................................210 Bibliografía..................................................................................................................211 Capítulo 6 - Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en los compuestos volátiles del vino. Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni sobre los componentes aromáticos glicosidados. ........................................................................217 Introducción.................................................................................................................217 Compuestos glicosidados en enología.....................................................................217 Actividad β-glicosidasa en el proceso de vinificación ............................................218 Actividad β-glicosidasa de Oenococcus oeni..........................................................219 Objetivo .......................................................................................................................219 Materiales y métodos...................................................................................................220 Cepas, medios y condiciones de cultivo..................................................................220 Vinificaciones..........................................................................................................220 Síntesis de los glicoconjugados ...............................................................................221 4 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Ensayo en medio sintético ...................................................................................... 221 Análisis de los compuestos aromáticos .................................................................. 223 Análisis estadístico ................................................................................................. 223 Resultados y discusión................................................................................................ 224 Efecto de la FML sobre los compuestos aromáticos libres y ligados..................... 224 Estudio de posibles modificaciones químicas en las agliconas .............................. 226 Estudio del efecto del polisacárido bacteriano sobre la fijación de los compuestos aromáticos............................................................................................................... 227 Conclusiones............................................................................................................... 229 Bibliografía ................................................................................................................. 231 Capítulo 7 - Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en el perfil sensorial de los vinos..................................................................................................... 237 Introducción................................................................................................................ 237 Objetivo ...................................................................................................................... 238 Materiales y métodos.................................................................................................. 241 Muestras utilizadas ................................................................................................. 241 Test triangular......................................................................................................... 241 Entrenamiento del panel sensorial para realizar el perfil descriptivo de aromas ... 242 Evaluación de las muestras para la determinación del perfil descriptivo de aromas ................................................................................................................................ 243 Análisis de los datos ............................................................................................... 244 Resultados y discusión................................................................................................ 246 Resultados obtenidos en la 1er. experiencia ........................................................... 246 Resultados obtenidos en la 2da. experiencia .......................................................... 251 Conclusiones............................................................................................................... 259 Bibliografía ................................................................................................................. 261 Capítulo 8 - Estudio de las variaciones en las concentraciones de los compuestos volátiles libres y su relación con las modificaciones del perfil sensorial en el vino. 265 Introducción................................................................................................................ 265 Importancia de los compuestos volátiles en el aroma del vino .............................. 265 Aplicación del análisis de datos a los problemas de relación instrumental-sensorial ................................................................................................................................ 270 Objetivo ...................................................................................................................... 273 5 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Materiales y métodos...................................................................................................274 Cálculo de las unidades de aroma ...........................................................................274 Correlación de los datos químicos y sensoriales por PLS.......................................274 Resultados y discusión ................................................................................................277 Diferencias en las unidades de aroma para los distintos compuestos determinados en las muestras. ............................................................................................................277 Análisis de datos por PLS .......................................................................................280 Conclusiones ...............................................................................................................284 Bibliografía..................................................................................................................286 Capítulo 9 - Conclusiones .............................................................................................289 6 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Resumen La variedad Vitis vinifera L. cv Tannat, que tiene origen en los viñedos franceses de los Pirineos, fue introducida en Uruguay por Pascual Harriague en el año 1874, y se extendió a todas las zonas vitícolas de nuestro país, ubicándose actualmente en el primer lugar de producción entre las variedades de calidad para la vinificación. Uruguay ha desarrollado en los últimos años una estrategia de ingreso al mercado internacional en base a vinos de esta variedad, que lo caracterizan y diferencian. Esta decisión explica la importancia del enfoque de un trabajo de investigación que tenga como objetivo ajustar el manejo del cultivo y las técnicas de vinificación para esta variedad, que por ser poco cultivada excepto en nuestro país, no ha sido prácticamente estudiada en el resto del mundo. Uno de los pasos fundamentales en la vinificación de los vinos tintos es el que corresponde a la fermentación maloláctica (FML), la que produce fundamentalmente una degradación del ácido málico a ácido láctico, con una beneficiosa reducción de la acidez. Este proceso es conducido por bacterias lácticas, las que se encuentran presentes desde el inicio hasta el fin de la vinificación, y en muchos casos en la conservación. El aroma de un vino está conformado por una compleja mezcla de un gran número de compuestos volátiles presentes en un rango de concentración muy amplio. Por lo tanto, la influencia de las bacterias lácticas en el perfil de compuestos volátiles, y en el aroma de un vino, debe ser considerado también un factor determinante en el proceso de vinificación. En el presente trabajo se estudió el perfil de los compuestos volátiles presentes en los vinos de la variedad Tannat, y las modificaciones producidas durante la fermentación maloláctica, así como su efecto en la caracterización sensorial de los vinos de esta variedad. Se estudiaron, en particular, algunos factores como: la cepa bacteriana utilizada para realizar esta etapa de vinificación, y el efecto de la conservación de los distintos vinos sobre las modificaciones aromáticas encontradas. Se estudiaron también dos fenómenos particulares producidos durante la fermentación maloláctica y relacionados con el perfil de compuestos volátiles como son: la relación de enantiómeros para el lactato de etilo, y la expresión de la actividad β-glicosidasa de la bacteria, en condiciones de vinificación, frente a los compuestos volátiles ligados. Entre los resultados obtenidos se determinó que la concentración de un número importante de compuestos aromáticos en forma libre fue modificada por la fermentación malolác7 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat tica. En todos los ensayos se produjo una disminución de los ésteres, en particular del acetato de hexilo y caproato de etilo, esta disminución se relacionó con la menor intensidad encontrada en algunos descriptores frutales para los vinos luego de la fermentación maloláctica. Se demostró además que estas modificaciones son dependientes de la cepa de Oenococcus oeni que interviene en la fermentación, encontrándose diferencias significativas en algunos de los compuestos modificados, dentro de los cuales se encuentra el lactato de etilo y algunos acetatos. Las modificaciones en el perfil de compuestos aromáticos durante la crianza en botella, produjo en algunos casos diferencias mayores entre los vinos control y con FML, como ocurre en el comportamiento opuesto en las variaciones del lactato de etilo y malato de dietilo. En otros casos la conservación provocó la desaparición de las diferencias, producidas por la FML, que fueron determinadas en los vinos jóvenes, como ocurre con los acetatos y ésteres etílicos, las cuales prácticamente desaparecen durante la conservación. El compuesto que presentó la mayor variación en su concentración, como consecuencia de la fermentación maloláctica, fué el lactato de etilo. Este compuesto modifica además su relación enantiomérica como consecuencia del metabolismo de las bacterias lácticas, con una producción mayoritaria del isómero (S)- en esta etapa de la vinificación. Este estereoisómero presentó diferencias en sus descriptores sensoriales respecto al (R)-, y por lo tanto este cambio en la configuración puede ser la responsable de algunos de los cambios aromáticos detectados como consecuencia de la FML. Como parte del estudio del metabolismo bacteriano, también se comprobó la actividad βglicosidasa de Oenococcus oeni en condiciones de vinificación, aunque esta actividad no produjo el aumento correspondiente en las agliconas. Esta diferencia encontrada en el balance de masa de las agliconas pudo finalmente explicarse por la existencia de fenómenos de retención, oclusión en la estructura molecular, y/o adsorción de los compuestos aromático frente a los polisacáridos extracelulares producidos por la bacteria Oenococcus oeni. En resúmen, los resultados obtenidos pusieron de relevancia el papel de la FML en el perfil de los vinos tintos, demostrando la importancia de su efecto según la selección de la cepa utilizada. La magnitud de los cambios detectados en algunos compuestos fue mayor que su umbral de percepción y, por lo tanto, puede provocar modificaciones en el perfil sensorial de esos vinos. Este aspecto puso de manifiesto la necesidad de profundi- 8 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat zar en los mecanismos de fermentación y sus efectos, buscando una explicación a través del estudio de la composición de las fracciones volátiles y sus variaciones. 9 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat 10 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Capítulo 1 Introducción y antecedentes bibliográficos La variedad Tannat La variedad Vitis vinifera L. cv Tannat tiene su origen en los viñedos de los Pirineos (Viala y Vernorell, 1903), ha sido cultivada desde la antiguedad en el sud-oeste de Francia, y en la actualidad la mayoría de los viñedos de esta variedad se ubican en la zona de Madiran (Francia) (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995). En Uruguay, esta variedad tinta fue introducida por Pascual Harriague en el año 1874, desde Concordia (Argentina), siendo implantada en el departamento de Salto, en el paraje Saladero de la Caballada (de Frutos y Beretta, 1999). Estos viñedos alcanzaron originalmente una extensión de 200 hectáreas, desde donde la variedad Tannat se expandió al resto del territorio. Actualmente, en una superficie plantada de aproximadamente 9.150 hectáreas de viñedos, el Tannat se encuentra distribuido en todas las zonas vitícolas del país, con un total de aproximadamente 5.000.000 de plantas (Scarone et al., 2002), ubicándose por su volumen de cosecha, 11.127.500 kg en el año 2002 (Scarone et al., 2002), en el 3er. lugar respecto al resto de variedades presentes en el país, y en el primer lugar considerando a las variedades de alta calidad. En los últimos años el Uruguay ha decidido desarrollar esta variedad como estrategia para el ingreso al mercado internacional de vinos varietales (Carrau, 1997). El objetivo es disponer de vinos que caractericen al país y lo diferencien, al igual que ya lo han hecho otros países de los llamados del “Nuevo Mundo” - Australia, Sudáfrica, Chile, Argentina y EEUU - con otras variedades (Syrah, Pinotage, Carmenere, Malbec y Zinfandel respectivamente). Elementos de descripción ampelográfico de la variedad, características agronómicas y tecnológicas Entre las principales características ampelográficas que describen y se utilizan para la clasificación de esta variedad tinta, se encuentran (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995; Viala y Vernorell, 1903): • ápice vegetativo con pilosidad densa; 11 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos • hojas jóvenes rojizas con reflejos dorados; • hojas adultas grandes, pentagonales, enteras, con 3 o 5 lóbulos y el lóbulo central más largo, seno peciolar poco abierto o cerrado, bordes con dientes cortos, cierta pigmentación antociánica en las nervaduras, limbo enrollado, y densidad media de pilosidad en la cara inferior; • racimos cilíndricos con dos alas, compactos y de tamaño medio; • granos de forma redondeada, de tamaño medio, y de color rojo violáceo muy fuerte a negro azulado. Según la fenología para la variedad Tannat, la época de brotación se encuentra 4 días después de la variedad Chasselas, y la madurez se produce, por ser una variedad de segundo período, tres semanas y tres días después de Chasselas (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995). Entre sus aptitudes agronómicas, esta variedad se destaca como una cepa vigorosa que normalmente se adapta a la poda larga, teniendo baja resistencia a los ácaros y a la podredumbre gris (Botrytis), siendo además sensible a la Peronóspora y al Oidium (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995; Galet, 1985). Desde el punto de vista tecnológico, la variedad Tannat produce vinos coloreados, muy tánicos y con una acidez un poco elevada, permitiendo producir vinos tintos de calidad, con mucho cuerpo y aptitudes para el envejecimiento, el cual puede ser muy prolongado en algunos casos (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995; Galet, 1985). Clones cultivados y sus características De la misma forma que en el resto de la naturaleza, existen pequeñas diferencias entre las distintas plantas que pertenecen a una misma variedades de Vitis vinifera. Estas pequeñas diferencias pueden causar algunas mejoras en las características varietales, como por ejemplo tamaño de grano, compactación del racimo, vigor, sensibilidad a patógenos, o diferencias en los estados fenológicos. Esta última característica pueden ser de utilidad al viticultor, para definir por ejemplo pequeñas diferencias en el momento de cosecha y por lo tanto dar un mayor tiempo a la cosecha del predio, permitiendo así combinar en una misma plantación sectores que difieran en esta característica. Por lo tanto, desde el punto de vista del manejo del material vegetal en viticultura, la propagación de material de una misma planta seleccionada por algún criterio diferencial, a la cual se le denomina “planta madre”, se identifica como un “clon” para la variedad correspondiente. Un clon es la 12 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat descendencia vegetativa de una cepa elegida por su identidad, características fenotípicas y su estado sanitario. Estos clones son seleccionados registrando los que presentan las mejores características, y produciendo material que será luego utilizado por los distintos viveros en la producción de plantas. En la actualidad existen registrados por el Establissement National Technique pour l’Amelioration de la Viticulture (ENTAV) de Francia, nueve clones seleccionados de la variedad Tannat - clon 398, 399, 472, 473, 474, 475, 717, 794 y 944 - siendo los primeros clones registrados el 398 y 399 en el año 1975 (Blanchard, 1999; Boidron et al., 1995). Existe además otro clon seleccionado en Francia, el cual no ha sido registrado, y se identifica como clon H6-06, y un clon #1 evaluado por la Foundation Plant Material Service en California, Estados Unidos (Wolf, 2002). Las plantaciones existentes en Uruguay pueden dividirse en dos casos bien diferenciados; plantaciones antiguas en la cual no se utilizaba material de selección clonal; y plantaciones actuales, enmarcadas en la reconversión de los viñedos que esta realizando el sector. Estas últimas provienen de selecciones clonales, siendo posible encontrar en general 4 ó 5 clones, de los 9 clones de la variedad Tannat registrados por el ENTAV, siendo el clon 398 el más utilizado. Las principales características de los distintos clones se resumen en las Tablas 1.1, 1.2 y 1.3, y en la Figura 1.1. En la Tabla 1.1 se describen los datos fenológicos de los distintos clones, donde se indica que la mayor diferencia en fechas de brotación se obtiene entre los clones 475 y 473. En la Tabla 1.2 se reportan las distintas características agronómicas y de los mostos obtenidos para diferentes clones, presentando los clones 398 y 399 los valores de mayor acidez. Se debe destacar que el clon 398 presenta en general valores de pH mas elevados que los demás, lo que podría explicarse por su relación málico/tartárico. Por otra parte, en la Figura 1.1 se reportan los resultados de rendimiento y porcentaje de alcohol potencial para los clones registrados por el ENTAV, presentando los mayores rendimientos el clon 398 y 472 aunque con menores contenidos de alcohol potencial. Los valores de porcentaje de alcohol potencial más altos se presentan para el clon 474. 13 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Tabla 1.1 Estados fenológicos de los distintos clones de la variedad Tannat. Clon Brotación 1 Floración 2 Envero 3 Cosecha 398 25 de marzo 12 de junio 25 de agosto - 399 - 12 de junio 26 de agosto - 472 23 de marzo 12 de junio 23 de agosto - 473 27 de marzo 12 de junio 28 de agosto - 474 23 de marzo 11 de junio 22 de agosto - 475 21 de marzo 11 de junio 22 de agosto - 717 24 de marzo 12 de junio 23 de agosto - 794 24 de marzo 12 de junio 23 de agosto - 944 23 de marzo 12 de junio 24 de agosto - H6-06 24 de marzo 12 de junio 25 de agosto - #1 3 de mayo 24 de junio - 8 de Octubre Todas las fechas corresponden al hemisferio norte, siendo los datos promedio de 6 años en Francia, excepto para el clon #1 para el cual se presentan los datos promedio de 7 años en la zona de Virginia, Estados Unidos. 1 Fecha estimada de estado fenológico 4 según la escala de Eichom y Lorenz. 2 Fecha estimada de estado fenológico 23 según la escala de Eichom y Lorenz. 3 Fecha estimada de estado 50% de granos enverados. Elaborado en base a datos de Blanchard (1999) y Wolf (2002) Las aptitudes enológicas de los distintos clones fueron investigadas por varios autores, las mismas pueden verse en la Tabla 1.3, presentando las mejores características el clon 473 y 474. Por otra parte Boidron et al. (1995) han realizado una clasificación de los clones del ENTAV, agrupándose al clon 398, 717 y 794 como clones de producción limitada y un muy bueno nivel cualitativo (clasificación A), el 472, 473, 474 y 944 dentro del grupo de producción media y buen nivel (clasificación B); y por último, los clones 399 y 475, se identifican por su producción elevada, produciéndose vinos neutros (calsificación C). El comportamiento de los diferentes clones se ve influenciado por el portainjerto utilizado y la zona de cultivo, como puede verse en la Tabla 1.4 elaborada a partir de datos 14 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat obtenidos en Francia. En Uruguay se han realizado estudios durante 15 años para el clon 398 de la variedad Tannat sobre 6 portainjertos diferentes: Rupestris du Lot, Riparia Glorie, SO4, R99, 1103P y 3309C (Disegna et al., 2001). En este trabajo se determinó que el portainjerto SO4 resultó ser el más productivo. Sin embargo, al igual que otros autores, Disegna et al. (2001) determinaron que la productividad y el índice de Ravaz (relación de la producción sobre el peso de poda) presentaron una correlación negativa respecto a los parámetros analíticos relacionados con la calidad de los vinos. En este sentido, los índices de polifenoles totales y contenido de antocianos más elevados se obtuvieron en las combinaciones sobre 1103P, Riparia Glories y Rupestris du Lot (Disegna et al., 2001). Tabla 1.2 Principales características de algunos clones de la variedad Tannat, datos promedios de 6 años, excepto para el clon #1 en el cual se promediaron 7 años. Peso del Clon Peso de sar- Rendimiento racimo (g) mientos (kg) (kg/planta) Alcohol Acidez potencial pH (g/L)2 398 287 0.812 5.26 11.67 3.3 7.08 399 243 0.434 3.98 12.54 3.0 7.73 472 286 0.534 4.99 11.62 3.0 6.75 473 228 0.410 3.69 12.55 3.1 6.76 474 249 0.588 4.07 13.17 3.1 6.99 475 252 0.534 4.17 12.29 3.0 6.95 717 259 0.515 4.35 12.45 3.0 6.54 794 260 0.426 3.89 12.46 3.0 6.54 944 252 0.515 3.88 12.24 3.0 6.95 H 6-06 226 0.215 3.72 12.10 3.1 6.95 #1 281 - 10.01 12.67 3.61 5.42 1 determinación realizada previo congelado de la muestra 2 expresada en g/L de ácido sulfúrico Elaborado en base a datos de Blanchard (1999) y Wolf (2002) 15 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Figura 1.1 Comportamiento de rendimiento y grado alcoholico potencial obtenido para los distintos clones de la variedad Tannat. Datos promedios de 6 años. 13.4 474 Grado alcohólico probable 13.0 12.6 473 399 794 944 12.2 717 475 H6-06 11.8 472 11.4 3.4 3.8 4.2 4.6 5.0 398 5.4 Rendimiento (kg/planta) Elaborado en base a datos de Blanchard (1999) Nuevas variedades obtenidas por cruzamiento con la variedad Tannat Una forma de jerarquizar una variedad de Vitis vinifera se establece cuando esa variedad se utiliza como material de partida en programas de mejoramiento genético. En este sentido, actualmente se encuentran en evaluación nuevas variedades obtenidas por cruzamiento, entre las cuales aproximadamente en una veintena participa la variedad Tannat (Lassalle, 1993). Entre los cruzamientos desarrollados se encuentran algunos que presentan interés tanto desde el punto de vista agronómico como enológico, destacándose los cruzamientos Iraila (Tannat x Pinot), Donibane (Tannat x Abouriou), Achemoyeta (Tannat x Cabernet Franc), Artzebat (Tannat x Merlot), Ekigaïna (Tannat x Cabernet Sauvignon), Gorospil, Sansoin, y Euski (todos cruzamientos de Tannat x Courbu rouge) (Lassalle, 1993). 16 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 1.3 Características tecnológicas de los clones de la variedad Tannat. Clon Aptitud enológica 1 Descripción de los vinos 2 nariz intensa de frutas rojas y espeequilibrado expresancias, boca redonda pero con final 398 do finesa e intensidad seco, taninos agresivos, vegetales, aromática faltos de madurez nariz muy discreta de frutas y espe399 varietal cias con notas vegetales, ligero, con final corto nariz muy discreta sin nitidez, buen 472 ataque en boca pero falto de estructura, vino ligero nariz potente de frutas maduras (casis, mora), redondo en boca, 473 taninos presentes, buena estructura y equilibrio nariz poco intensa, buen ataque en 474 buena tipicidad boca, buena estructura pero con taninos duros, final un poco ácido tánico con falta de nariz y boca con etanal muy mar475 finesa cado, final corto, desequilibrado equilibrado expresan- nariz discreta, ligeramente frutal, 717 do finesa e intensidad falto de volumen en boca con taniaromática nos astringentes muy marcados estructurado y equili- nariz discreta, vegetal, taninos muy 794 brado, acidez inferior marcados, agresivos y astringentes nariz intensa con notas de frutas 944 potente, varietal rojas y especias, algo vegetal, taninos secantes nariz discreta de frutas y vegetales, H 6-06 notas lácticas, boca equilibrada, pero ligera y falta de estructura Puntuación media en la degustación3 12.2 12.1 12.4 13.9 13.1 11.3 12.6 13.8 11.4 13.3 1 elaborado en base a datos de Boidron et al. (1995) 2 degustación de vinificaciones del año 1996, ensayo de clones, Francia (Vergnes, 1997) 3 el análisis estadístico de preferencia (test de Kramer, 95%) resulta en una diferencia significativa para el clon 473, presentando una preferencia frente a los demás, no siendo diferenciados los otros clones 17 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Tabla 1.4 Influencia del portainjerto y suelo en el rendimiento y grado alcohólico en potencia para la variedad Tannat, datos promedio de 10 años en la zona de Francia. llano valle limoso arcillo-limosa costa fondo de Portainjerto Rendimiento Grado alcohóli(g/yema) co en potencia 5BB 446 11.2 196-17 422 11.1 101-14 458 11.3 3309 C 417 11.3 Riparia Glorie 427 11.7 420 A 182 11.2 110 Ri 208 11.2 101-14 193 11.3 140 Rug 226 11.1 3309 C 208 11.3 420 A 362 11.7 4010 357 11.3 3309 C 293 11.6 Elaborado en base a datos de Blanchard (1999) 18 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Importancia de las bacterias lácticas y la fermentación maloláctica: antecedentes y proyección. Las bacterias lácticas (LAB) están presentes desde el inicio hasta el fin de la vinificación, y en muchos casos durante la conservación, jugando un rol significativo en la elaboración de un vino (Fleet et al., 1984; Lafon-Lafourcade et al., 1983). El crecimiento y metabolismo de las LAB produce cambios deseables e indeseables en la composición del vino. Estos microorganismos están primariamente involucrados en la fermentación maloláctica (FML), en la cual se produce la degradación de ácido L-málico con la producción subsecuente de ácido L-láctico y CO2, siendo éste el principal cambio por el cual durante muchos años se ha manejado este proceso. La degradación de varios gramos por litro de ácido málico en el vino, produce cambios importantes en la composición de este producto, pero al mismo tiempo ocurren muchas otras reacciones, consecuencia del metabolismo de las LABs y procesos bioquímicos involucrados, que contribuyen a la mejora sensorial de la calidad, aunque no todos estos cambios tienen por qué ser beneficiosos (Davis et al., 1985b; Henick-Kling, 1993; Wibowo et al., 1985). Debido a que la bacteria tiene como objetivo principal su multiplicación, utiliza muchos sustratos que encuentra en el vino para obtener energía y sintetizar componentes celulares. Sin embargo, no todas las bacterias tienen los mismos requerimientos, y por lo tanto la técnica de elaboración de los vinos debe establecer un control sobre la actividad bacteriana, promoviendo el desarrollo de bacterias lácticas cuando la fermentación maloláctica es deseada, o impidiendo su desarrollo cuando esta ha terminado o no es deseada. Inicialmente los microbiólogos estudiaron las características más importantes de las bacterias lácticas para la vinificación, dentro de las que se encuentran los procesos metabólicos primarios como la degradación de azúcares y ácido málico, y la influencia de los principales parámetros involucrados en la multiplicación de las bacterias. Todos estos estudios iniciales se orientaron a optimizar las operaciones durante la vinificación tratando de promover la fermentación maloláctica y controlar la contaminación bacteriana. Los adelantos en estas investigaciones se fueron tomando como las bases de la microbiología enológica moderna, sin embargo muchos aspectos permanecieron desconocidos y la industria sufrió serios problemas en el control de la fermentación maloláctica, produciéndose - en los mejores casos - pérdidas de cultivos de bacterias, o en los peores un aumento en la acidez volátil. 19 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Finalmente en los últimos 15 años se han producido progresos sustanciales, y actualmente se tiene a disposición de la industria vitivinícola y prontos para su uso, las primeras generaciones de cultivos de bacterias lácticas liofilizados, las cuales han demostrado ser confiables en los procesos de vinificación (Lonvaud-Funel, 2000). Sin embargo, la influencia de las condiciones de la fermentación maloláctica y de la especie y cepa de bacteria utilizada sobre la calidad del vino producido, no están aún claramente determinados. Es así que metabolitos que son considerados secundarios, y poco importantes desde el punto de vista enológico, pueden producir diferencias en la composición de los vinos, y por lo tanto establecer diferencias según la especie o cepa de bacteria que realiza la fermentación maloláctica. Los avances en este tema deben inevitablemente producirse mediante la identificación de sustratos y productos del metabolismo bacteriano que aún no han sido estudiados (Henschke, 1993; Lonvaud-Funel, 2000). Estas determinaciones exigen sin duda técnicas avanzadas de análisis químico debido a las cantidades muy pequeñas de los componentes a estudiar. Por lo tanto, un enfoque que priorice sistemas de extracción, detección e identificación de metabolitos en cantidades traza, junto con la contribución de la biología molecular para la identificación de las distintas cepas, son las líneas de trabajo en las que se desarrollan actualmente los avances de la investigación sobre la fermentación maloláctica. Bacterias lácticas en el vino: biología, taxonomía y metabolismo. Las bacterias lácticas tienen entre sus principales características las de presentar reacción positiva a la coloración de Gram, dar resultado negativo al test de catalasa, no presentar movilidad, no formar esporas, y pueden tener forma de cocos o bastones (du Toit y Pretorius, 2000). Por otra parte, las bacterias lácticas tienen como característica adicional su capacidad de producir ácido láctico como principal producto de la fermentación de la glucosa. La estructura celular de las bacterias, por ser células procariotas y por los tanto presentar una organización muy simple, puede dividirse en tres elementos principales: pared y membrana celular, citoplasma y núcleo (Ribereau-Gayon et al., 1998). La pared celular de las bacterias lácticas, que como se mencionó se presentan positivas a la coloración de Gram, está constituida principalmente de peptidoglicanos y ácidos teicoicos. Los peptidoglicanos son polímeros formados por cadenas de ácido N-acetil mu20 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat rámico y N-acetil glucosamina, ambos derivados de la glucosa, unidas por enlaces de tipo β(1→4), como se muestra en la Figura 1.2. En el ácido murámico se unen cadenas de aminoácidos, y a su vez estas cadenas pueden tener uniones entre sí. La secuencia de estas cadenas se utiliza como criterio taxonómico (Ribereau-Gayon et al., 1998). Figura 1.2 Cadena del polisacárido peptidoglicano bacteriano, (a) estructura general, (b) esquema de la estructura con uniones entre las cadenas para la especie Oenococcus oeni. CH2OH (a) OO N-acetil glucosamina OH (NAG) CH2OH O O Ácido N-acetil murámico O (NAM) CH NH NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM CO O CH3 (b) CH3 NH CO CO NH CH3 L-Ala L-Ala D-Gln D-Gln L-Lys L-Ala D-Ala D-Gln L-Ala (L-Ser) L-Ser L-Lys D-Ala L-Lys D-Ala CO Adaptado de Ribereau-Gayon et al. (1998) Los progresos realizados en biología molecular han aportado nuevos criterios de clasificación, en base a la similitud de los resultados obtenidos en el análisis del genoma (Lonvaud-Funel et al., 1991; Yasui et al., 1997). La secuenciación de los nucleótidos puede realizarse sobre una porción del genoma y no sobre el total, encontrándose para el caso de las bacterias lácticas muchos trabajos de clasificación en base a la fracción 16S del ARN ribosomal (Bartowsky y Henschke, 1999; Klijn et al., 1991; Nissen et al., 1994). 21 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Las bacterias lácticas encontradas en mostos y vinos pertenecen a los géneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus. Este últimos género fue propuesto por Dicks et al. (1995), a partir del renombramiento de la especie Leuconostoc oenos que se designa actualmente como Oenococcus oeni. Además de la clasificación de las bacterias lácticas en cocos y bastones por su morfología, se pueden clasificar por su carácter homofermentativo o heterofermentativo según su capacidad de transformación de glucosa en ácido láctico en más de un 85% las primeras, y ácido láctico, anhídrido carbónico, etanol y ácido acético las segundas. En el grupo de los cocos, el género Pediococcus tiene comportamiento homofermentativo, mientras que los géneros Leuconostoc y Oenococcus son heterofermentativos. En cambio los Lactobacillus presentan distintos comportamientos, siendo posible encontrar homofermentativos, heterofermentativos facultativos y heterofermentativos obligatorios. El primer grupo no es capaz de fermentar las pentosas, pero fermentan la glucosa produciendo solo ácido láctico mediante la vía de Embden-Meyerhoff-Parnas. Según algunos autores no se han identificado ninguna especie homofermentativa perteneciente al género Lactobacillus en mostos y vinos (Ribereau-Gayon et al., 1998), mientras que otros autores citan al L. mali (Divies et al., 1998). Los bastones heterofermentativos pueden dividirse en facultativos con capacidad de transformar la glucosa produciendo sólo ácido láctico, pero transforman las pentosas con producción de ácido láctico y acético por la vía de la pentosa-fosfato, y las bacterias heterofermentativas obligatorias que no pueden fermentar glucosa por la via de Embden-Meyerhoff-Parnas por no poseer la enzima fructosa-1,6-difosfato aldolasa. Estas bacterias deben transformar la glucosa por la vía de la pentosa-fosfato produciendo CO2, ácido láctico, ácido acético y etanol (Ribereau-Gayon et al., 1998). Estas diferencias en los procesos fermentativos de la glucosa son de extrema importancia en enología en los casos de desarrollo bacteriano antes del fin de la fermentación alcohólica, ya que son capaces de producir un incremento en la acidez volátil y el consiguiente deterioro del producto. En la Tabla 1.5 puede verse un esquema de la clasificación y características de las principales bacterias lácticas reportadas en mostos y vinos. 22 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 1.5 Clasificación y características de las principales bacterias lácticas reportadas en mostos y vinos. anaerobias Gram (+) catalasa negativa ácido láctico de glucosa cocos bastones homofermentativos heterofermentativo heterofermentativo facultativo heterofermentativo obligatorio Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus Pediococcus parvulus Oenococcus oeni Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii Lactobacillus buchneri Lactobacillus fermentum Adaptado de Divies et al. (1998), Ribereau-Gayon et al. (1998) La evolución de la población de bacterias lácticas durante la fermentación y conservación de los vinos ha sido estudiada por varios autores (Fleet et al., 1984; Lafon-Lafourcade et al., 1983), encontrándose una disminución en la población inicial proveniente de la uva, la cual se encuentra en el entorno de 104 células/mL, durante la fermentación alcohólica, para tener luego de un tiempo variable de latencia un crecimiento hasta valores superiores a 106 células/mL, predominando generalmente en esta etapa el Oenococcus oeni. Una vez terminada la FML se produce una disminución de la población, en general controlada con el agregado de SO2 como inhibidor, pudiéndose producir un aumento en la población de especies contaminantes en el caso de que no se realizara este agregado. Entre las vías metabólicas para obtención de energía, se encuentran en primer lugar la fermentación láctica de la glucosa, ya sea en la vía homo o heterofermentativa, tal como se presenta en la Figura 1.3. La heterofermentación de la glucosa se realiza por la vía de las pentosas con la formación de una pentosa fosfato que mediante la fosfocetolasa se divide en 3-fosfogliceraldehído y acetilfosfato, el primero conduce a la formación de ácido láctico, mientras que el segundo produce etanol por la acción de la acetaldehído deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa. En presencia de un aceptor de NADH, como son el O2 o la fructosa que se reduce a manitol, el acetilfosfato es transformado en ácido acético produciendo una molécula de ATP. 23 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos Figura 1.3 Metabolismo de la glucosa por las bacterias lácticas, (a) homofermentación por la vía de Embden-Meyerohof-Parnas, y (b) heterofermentación por la vía del 6fosfogluconato. glucosa glucosa ATP ATP (a) (b) ADP ADP glucosa-6-fosfato glucosa-6-fosfato NAD+ NADH + H+ 6-fosfogluconato fructosa-6-fosfato NAD+ ATP NADH + H+ ADP ribulosa-5-fosfato fructosa-1,6-difosfato fuctosa-1,6-difosfato aldolasa 2 Pi xilulosa-5-fosfato dihidroxiacetona fosfato gliceraldehído-3-fosfato + 2 NAD 2 NADH + H fosfocetolasa + gliceraldehído-3-fosfato 2 ác. 1,3-disfosfoglicérico Pi acetil fosfato NAD+ NADH + H+ NADH + H+ NAD+ 2 ADP 2 ATP ác. 1,3-disfosfoglicérico 2 ác. 3-fosfoglicérico 2 H2O acetaldehído ADP NADH + H+ ATP NAD+ ác. 3-fosfoglicérico (1) etanol ADP 2 ác. fosfoenolpirúvico ATP 2 ADP H2O ác. acético ác. fosfoenolpirúvico 2 ATP 2 ác. pirúvico ADP 2 NADH + H+ ATP 2 NAD+ ác. pirúvico 2 ác. láctico NADH + H+ NAD+ ác. láctico (1) vía metabólica desarrollada en presencia de un aceptor de NADH, como son el O2 o la fructosa que se reduce a manitol. Adaptado de du Toit y Pretorius (2000), Divies et al. (1998), Ribereau-Gayon et al. (1998) 24 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 1.4 Metabolismo de las pentosas por las bacterias lácticas. pentosa ribulosa-5-fosfato xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa gliceraldehído-3-fosfato Pi acetil fosfato NAD+ ADP NADH + H+ ATP ác. 1,3-disfosfoglicérico ác. acético ADP ATP ác. 3-fosfoglicérico H2O ác. fosfoenolpirúvico ADP ATP ác. pirúvico NADH + H+ NAD+ ác. láctico Adaptado de du Toit y Pretorius (2000), Divies et al. (1998), Ribereau-Gayon et al. (1998) 25 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos En el caso del metabolismo de las pentosas, como se describe en la Figura 1.4, la molécula de acetilfosfato conduce exlusivamente a la formación de ácido acético, obteniéndose por lo tanto como productos finales de esta ruta, ácido acético y láctico. El metabolismo de los ácidos orgánicos por las bacterias lácticas presenta importancia para la enología en el estudio del caso del ácido málico y cítrico, en cambio el ácido tartárico, principal ácido del vino, es metabolizado solo por algunas cepas de L. plantarum y L. brevis produciendo una enfermedad en los vinos llamada “tourne”. Por el contrario O. oeni no puede utilizar el ácido tartárico (van Vuuren y Dicks, 1993). En el caso del ácido málico, las enzimas conocidas con capacidad de utilizar este ácido como sustrato, son la malato deshidrogenasa y enzima málica, obteniéndose por la primera oxalato, el cual es descarboxilado a piruvato, y por la segunda piruvato directamente (Henick-Kling, 1993; van Vuuren y Dicks, 1993). Una tercera posibilidad de utilización del ácido málico por una enzima que catalise su descarboxilación directa produciendo ácido L-láctico sin intermediarios, ha sido estudiada por distintos autores. Esta enzima fue aislada inicialmente del Lactobacillus plantarum, y posteriormente de otras especies (Caspritz y Radler, 1983; Lonvaud-Funel y Strasser de Saad, 1982; Naouri et al., 1990); la misma ha sido caracterizada por distintos autores, y se le llamó enzima maloláctica (Arthurs y LLoyd, 1999; Labarre et al., 1996). El ácido cítrico es degradado por L. plantarum, L. casei, Oenococcus oeni y Leuconostoc mesenteroides, mientras que las cepas del género Pediococcus y las especies L. hilgardii y L. brevis son incapaces de metabolizarlo. Las bacterias lácticas, mediante la enzima citrato liasa, catalizan la ruptura del ácido cítrico en ácido acético y oxalacetato con posterior descarboxilación a piruvato (Martineau, 1995), como se puede ver en la Figura 1.5. El metabolismo de este ácido se produce al mismo tiempo que la degradación del ácido málico, produciendo un aumento en la acidez volátil del vino por la formación de ácido acético, y obteniéndose el diacetilo, el cual es un importante compuesto en el perfil aromático de los vinos (Martineau, 1995; Martineau et al., 1995a; Martineau et al., 1995b). 26 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 1.5 Metabolismo del ácido cítrico por las bacterias lácticas. CITRATO (1) oxaloacetato acetato (2) 2,3-butanodiol CO 2 NAD + NADH (3) lactato TPP TPP CoA CO 2 (5) (6) CO 2 α-acetolactato TPP (4) NAD + O 2 (8) NADH acetoína (9) H 2O CO 2 acetaldehído trifosfato CO 2 NAD + (10) piruvato NAD + NADH (7) NADH diacetilo acetil-CoA NADH (11) acetil fosfato ADP NAD + (13) acetaldehído NADH (12) ATP acetato (14) NAD + etanol (1) citratoliasa; (2) oxaloacetato descarboxilasa; (3) lactato deshidrogenasa; (4) piruvato deshidrogenasa complex; (5) piruvato descarboxilasa; (6) α-acetolactato sintetasa; (7) diacetilo sintetasa; (8) acetato descarboxilasa; (9) diacetilo reductasa; (10) acetoína reductasa; (11) fosfotransacetilasa; (12) acetatokinasa; (13) acetaldehído deshidrogenasa; (14) alcohol deshidrogenasa Adaptado de Martineau (1995) 27 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos La fermentación maloláctica: generalidades, ventajas y desventajas de su aplicación La fermentación maloláctica (FML) es una etapa microbiológica típica en el proceso de producción de los vinos tintos. Este proceso fermentativo ocurre, en la mayoría de los casos, con posterioridad a la fermentación alcohólica, por la acción de bacterias lácticas, siendo en general producida por Oenoccocus oeni. Durante la FML se produce la transformación del ácido L-málico en ácido L-láctico y CO2 (Davis et al., 1985b; HenickKling, 1993). Las primeras observaciones de este proceso se remontan a fines del siglo XIX y principios del XX, aunque los investigadores de la época no le daban una interpretación correcta, observando el aumento de la acidez volátil, luego de la fermentación alcohólica, que coincidía con un incremento en la población bacteriana y una disminución de acidez total que adjudicaban a la precipitación de bitartrato, sin ser investigada la disminución de ácido málico que realmente se producía (Divies et al., 1998; Ribereau-Gayon et al., 1998). Por lo tanto sus conclusiones eran totalmente erróneas, considerando esta situación un inicio de accidente grave en la vinificación y por lo tanto sugerían evitarlo. Es a partir de los trabajos de L. Ferré en 1922 en la zona vitivinícola de Borgoña (Francia), y de J. Ribéreau-Gayon en 1936 en Burdeos (Francia) que fue posible establecer las primeras bases del proceso. En Uruguay, los primeros estudios sobre este tema se encuentran el al década de 1960, basándose fundamentalmente en la aislación y caracterización de diferentes bacterias lácticas, y su utilización en vinificaciones experimentales (Cano Marotta et al., 1961; Poittevin y Carrasco, 1966; Poittevin et al., 1963). Desde el punto de vista de la calidad final del producto, los beneficios y desventajas de la FML han sido muy discutidos, dependiendo fundamentalmente de la región vitícola, variedad de uva, composición del vino, técnica de elaboración y objetivos buscados por el enólogo. El proceso de fermentación maloláctica en los vinos, si bien ampliamente documentado, representa una etapa necesaria en muchos vinos, pero dependiente de muchos factores y de las características iniciales. La FML produce en los vinos cambios beneficiosos como son: • reducción de la acidez. Este proceso resultó ser el mejor método que tiene el enólogo para reducir la acidez de un vino en forma natural, pudiendo disminuir el contenido de ácidos entre 0.1 y 0.3%, y aumentando el pH entre 0.1 y 0.3 unidades (Davis et al., 28 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat 1986; Henick-Kling, 1993; Wibowo et al., 1985). En vinos de zonas de clima frío, la acidez es elevada, y esta reducción es considerada beneficiosa, en cambio en vinos de zonas calientes, los vinos producidos son de elevado pH y por lo tanto esta reducción de la acidez puede dar vinos de muy baja acidez, insípidos y favorables para el crecimiento de bacterias contaminantes. • estabilidad microbiológica, en vinos que no hayan realizado la FML existen grandes riesgos de que se produzca un ataque bacteriano al ácido málico luego de embotellar el vino, y por lo tanto que se produzcan borras, turbidez y gas, deteriorando el producto. Esta estabilidad microbiológica luego de la FML no es absoluta ya que el vino aún contiene nutrientes, como son restos de azúcares y ácido cítrico, que pueden soportar el crecimiento de bacterias contaminantes (Davis et al., 1985b; Davis et al., 1986; Wibowo et al., 1985). • modificaciones del sabor y aroma de los vinos; al igual que durante la fermentación alcohólica, en la cual la población de levaduras es del orden de 107 a 108 cel/mL produciendo cambios dramáticos en las propiedades sensoriales del jugo de uva; durante la FML, las bacterias lácticas desarrollan una densidad de células similar, por lo cual ocurren cambios en las cualidades sensoriales del vino, produciendo además de ácido láctico, diferentes compuestos aromáticos (Bartowsky y Henschke, 1995; HenickKling et al., 1993; Henick-Kling et al., 1994; Laaboudi et al., 1995). En contraste, también se producen cambios indeseados en el vino por efecto de la FML. Es el caso de: • cambios sensoriales desfavorables como la producción de aromas que recuerdan a las hojas de geranio (Pelargonium spp.), producido por el metabolismo del ácido sórbico (ácido 2,4-hexadienoico), que es usado como preservante químico para inhibir el crecimiento de levaduras S. cerevisiae, pero que no tiene efecto frente a las bacterias lácticas (Fugelsang, 1997). La transformación del ácido sórbico conduce a la formación de 2-etoxihexa-3,5-diene, el cual tiene un bajo umbral de percepción (0.1 µg/L (Chisholm y Samuels, 1992). También se ha descripto la aparición de aroma a ‘ratón’ asociado a los siguientes compuestos: dos tautómeros de la 2-acetiltetrahidropiridina, la 2-acetil-1-pirrolina y la 2-etil-3,4,5,6-tetrahidropiridina (Costello, 1998; Costello et al., 1992; Davis et al., 1985b). • disminución del color de los vinos tintos. Luego de la FML han sido reportados cambios de este tipo por diversos autores, sin embargo existen diferencias en el porcentaje 29 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos de disminución que se reportan (Rankine et al., 1970; Rauhut et al., 1995; Vetsch y Lüthi, 1964). La principal causa de la disminución del color es el aumento del pH provocando por la fermentación maloláctica, lo cual produce un desplazamiento en el equilibrio de los distintos antocianos hacia las formas incoloras. Se ha encontrado además una disminución en el contenido de antocianos libres, siendo posible demostrar que se produce una degradación de los mismos por las células viables, posiblemente por ruptura de los enlaces β-glicosídicos de los antocianos con formación de las correspondientes antocianinas, las cuales son muy inestables y se degradan rápidamente (Vivas et al., 1994; Vivas et al., 1995; Vivas et al., 1997a; Vivas et al., 1997b). • producción de aminas biogénicas. La histamina es la más importante de estas aminas desde punto de vista toxicológico, determinada en vinos junto con aproximadamente otras 20 aminas biogénicas, aunque las cantidades encontradas en vino son generalmente 10 veces menores que las encontradas en otros alimentos. Ciertos Pediococcos y Lactobacillus han sido implicados como responsables de la producción de histamina por descaboxilación de la histidina (Figura 1.6) (Soufleros et al., 1998). Recientemente se han publicado trabajos en los que se demuestra que algunas cepas de O. oeni pueden producir histamina por poseer el gen que controla la producción de la enzima histidina descarboxilasa (Coton et al., 1998), aunque sólo unas pocas cepas han demostrado tener esta actividad (Leitao et al., 2000). Figura 1.6 Formación de histamina a partir de histidina. COOH N N NH2 (1) NH2 N CO2 histidina (1) histidina descarboxilasa Adaptado de Ribereau-Gayon et al. (1998) 30 N histamina Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat • producción de precursores de carbamato de etilo, el cual es un carcinógeno animal (Mirvish, 1968) que se encuentra en los alimentos y bebidas fermentadas incluyendo al vino (Ough, 1976; Ough, 1993). Durante la FML, además del consumo de ácido málico, algunas bacterias heterofermentativas degradan arginina, que es uno de los aminoácidos cuantitativamente más importantes en el mosto de uva y vino (Spayd y Andersen-Bagge, 1996; Sponholz, 1991). La degradación de la arginina por las bacterias lácticas se produce por la vía de la arginina desiminasa, formándose amonio, ornitina, CO2 y ATP como productos finales, y citrulina como producto intermedio (Figura 1.7) (Liu y Pilone, 1998; Liu et al., 1994; Mira de Orduña et al., 2001). Durante esta degradación, las bacterias excretan pequeñas cantidades de citrulina, la cual es precursor en la formación de carbamato de etilo en vino (Mira de Orduña et al., 2000; Stevens y Ough, 1993). Sin embargo, no está clara la influencia de la FML en la formación de carbamato de etilo, algunos investigadores reportan que no hay aumento de este metabolito durante la FML conducida por O. oeni (Tegmo-Laarsson et al., 1989; Tegmo-Larsson y Henick-Kling, 1990), mientras que en otros casos se ha determinado que existe un aumento en el carbamato de etilo (Sponholz, 1992; Sponholz et al., 1991). Las ventajas biológicas por las cuales se produce la FML han sido muy difíciles de entender ya que en la descarboxilación del ácido L-málico por la enzima maloláctica, que se realiza sin productos intermedios, no se tiene fosforilación a nivel de sustrato (y por lo tanto producción de ATP). De esta forma, durante algún tiempo se consideró que no había un incremento en la energía durante la FML, y desde este punto de vista la única ventaja fisiológica consistía en un incremento en el pH del medio (Henick-Kling, 1993). Sin embargo, en estudios más recientes se a propuesto que O. oeni, y otras bacterias lácticas, obtienen una ventaja energética durante la FML por un incremento del pH intracelular y de la fuerza de movimiento de proton (∆p) (Cox y Henick-Kling, 1995; HenickKling et al., 1991; Salema et al., 1996). Por otra parte, Cox y Henick-Kling (1989) han demostrado la producción de ATP durante la FML, siendo ligada esta producción al ∆p a través de la membrana y el funcionamiento de la ATPasa. En el modelo actualmente aceptado, una molécula de malato entra a la célula, es descarboxilada, y salen de la célula + una molécula de lactato y CO2 en simporte con H generando un ∆p que puede ser utilizado en los procesos de transporte o convertido en ATP por intermedio de la ATPasa 31 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos asociada a la membrana (Cox y Henick-Kling, 1995; Henick-Kling, 1995; Henick-Kling et al., 1991; Olsen et al., 1991). Figura 1.7 Metabolismo de la arginina por la via de al arginina desiminasa. Excreción de citrulina, precursor del carbamato de etilo O NH NH2 HN NH2 H 2O HN (1) H2N H2N NH3 COOH COOH arginina citrulina Pi (2) H2N etanol O NH2 O H2N COOH ornitina P carbamil fosfato ADP (3) ATP CO2 + NH3 (1) arginina desiminasa (2) ornitina transcarbamilasa (3) carbamato quinasa Adaptado de Mira de Orduña et al. (2001) 32 carbamato de etilo Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Incidencia de diversos factores con importancia enológica en la realización de la fermentación maloláctica A pesar de la intervención de los enólogos en el control de la fermentación maloláctica, muchas condiciones para su desarrollo aún son imprecisas. A continuación se describirán las distintas condiciones fisicoquímicas del vino y su influencia tanto en el desarrollo de las bacterias como en la realización de la fermentación maloláctica. El porcentaje de alcohol del vino es el primer factor limitante, siendo más rápida la FML en vinos con menor contenido alcohólico. Se considera un valor máximo de alcohol de 14% v/v para tener crecimiento bacteriano, aunque se ha informado de algunos lactobacilos que pueden resistir hasta 18 a 20% v/v, siendo ésta una causa de alteración en vinos licorosos (Britz y Tracey, 1990; Guerzoni et al., 1995). Otro factor limitante es la acidez, produciendo su aumento una inhibición en un gran número de bacterias lácticas. Por lo tanto, en condiciones de bajo pH, la fermentación maloláctica se hace más dificil, si bien al mismo tiempo se verifica que es menos probable el desarrollo de bacterias contaminantes, con el consecuente desvio sensorial en el producto final. Los pH óptimos para los cultivos de bacterias lácticas se encuentran entre valores de 4.2 y 4.5, siendo éstos valores mayores al rango de pH del vino. Se puede establecer arbitrariamente un pH límite de 2.9 para la realización de la FML, si bien a pH menores a 3.2 el proceso es muy lento y difícil en su comienzo (Britz y Tracey, 1990; Guerzoni et al., 1995; Wibowo et al., 1988). En cuanto a la temperatura óptima para el desarrollo de la FML, debe considerarse que ésta depende del contenido de alcohol del vino y se puede ubicar en la práctica entre los 20 y 25°C. Es por lo tanto indispensable mantener los vinos nuevos a una temperatura mínima de 18°C para poder realizar esta etapa (Britz y Tracey, 1990; Guerzoni et al., 1995; Wibowo et al., 1988). Por otra parte, es recomendable, para disminuir los riesgos de desviaciones y contaminación con ataque a otros componentes del vino, realizar la FML a las temperaturas más bajas posibles (18 a 20°C). Otro de los factores determinantes en la conducción de la FML es el sulfitado, debido a la alta sensibilidad de las bacterias lácticas a esta sustancia. El anhídrido sulfuroso interviene sobre las bacterias no solo en su forma libre, forma para la cual concentraciones mayores a 10 mg/L inhiben a O. oeni, sino que también es parcialmente activo en su forma combinada. En este caso, si esta forma se encuentra en concentraciones mayores a 30 mg/L de SO2, el anhídrido sulfuroso interviene retrasando el crecimiento y limitando 33 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos la densidad celular final obtenida. (Britz y Tracey, 1990; Wibowo et al., 1988). En consecuencia, la FML será difícil de realizar en vinos con un alto contenido de SO2 total, a pesar de que se encuentren pequeñas cantidades en forma libre. Es por esta razón que deben utilizarse pequeñas dosis de SO2 en el mosto, y evitar su uso en el descube hasta haber finalizado el proceso de degradación del ácido málico. Existen además otros factores que intervienen en el desarrollo de la fermentación maloláctica, como es el caso de posibles interacciones con las levaduras (Caridi et al., 1998; Gilis et al., 1996; Lonvaud-Funel et al., 1988), contenido de ácido málico (Guerzoni et al., 1995), población bacteriana inicial (Wibowo et al., 1988), limitación de nutrientes (Manca de Nadra y Saguir, 1999), concentración de compuestos fenólicos (Vivas et al., 1997a), presencia de bacteriófagos (Davis et al., 1985a; Henick-Kling et al., 1986a; Henick-Kling et al., 1986b; Sozzi et al., 1982), así como los efectos resultantes de las combinación de estos factores y los mencionados anteriormente (Britz y Tracey, 1990; Wibowo et al., 1988). Diferentes formas de inoculación del vino con bacterias lácticas para realizar la fermentación maloláctica El manejo de los distintos factores mencionados anteriormente, en especial la regulación de temperatura y la utilización de SO2, permiten que el vino nuevo se encuentre en óptimas condiciones para realizar la FML en forma espontánea, aunque en ningún caso se posee una certeza absoluta. Es común que en el proceso de vinificación se presente un determinado número de recipientes en los cuales la FML es muy difícil o en los que ni siquiera se inicia este proceso. Por lo tanto, es posible realizar una inoculación del vino con bacterias lácticas en los recipientes en los cuales la FML es difícil, o en los casos en que se quiera asegurar un final del proceso más rápido, reducir la potencial contaminación con otras bacterias lácticas, reducir posibles interferencias con bacteriófagos, y tener control sobre la cepa de bacteria responsable del proceso y por lo tanto su contribución a las características sensoriales del vino, siendo este úlimo, uno de los principales motivos en la enología actual y por lo tanto motivo de investigación en la actualidad (Henick-Kling y Edinger, 1994; Olsen, 1994). Las distintas opciones disponibles para realizar esta inoculación son: • inocular el mosto antes de la fermentación alcohólica con el fin de obtener un mayor crecimiento bacteriano como consecuencia de disponer de un medio sin eta34 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat nol. En este caso se presenta el riesgo, debido al medio rico en azúcares, de una producción de ácidez volátil como consecuencia del metabolismo de la glucosa en el caso del uso bacterias heterofermentativas (Prahl, 1989). Adicionalmente se presentará la incertidumbre de contar con la permanencia del cultivo utilizado hasta el fin de la fermentación alcohólica y por lo tanto de su actividad para realizar la FML; • utilizar una biomasa bacteriana en cantidad importante, suficiente para ser capaz de degradar el ácido málico sin necesidad de reproducción, cultivo no proliferante, con lo que el proceso se produce fundamentalmente por un aporte enzimático. Este sistema posee la variación de poder trabajar con las células, o con la preparación enzimática, fijas en un soporte sólido (Formisyn et al., 1997; Gao y Fleet, 1995); • inocular el vino, luego de la fermentación alcohólica, con un cultivo bacteriano, el cual requiere de una reactivación (Henick-Kling y Edinger, 1994; Lonvaud-Funel, 1986; Olsen, 1994); • finalmente existe la posibilidad de inocular el vino con un cultivo bacteriano adaptado para su agregado en forma directa (Nielsen et al., 1996). Otros métodos de realizar la desacidificación de un mosto o vino Se ha estudidado la posibilidad del uso de levaduras para realizar la desmalificación de los mostos, por metabolismo del ácido málico produciendo etanol según la denominada fermentación maloalcohólica (Radler, 1993). A diferencia de la fermentación maloláctica, en la cual sólo se produce la pérdida de una función ácida por intercambio de un ácido diprótico a uno monoprótico, la fermentación maloalcohólica produce un cambio más importante en la acidez como consecuencia de la pérdida de un ácido con formación de un alcohol, siendo este un factor negativo en muchos casos. Las levaduras del género Saccharomyces son capaces de metabolizar el ácido málico por esta vía, aunque sólo en pequeñas cantidades y dependiendo de la cepa. En ningun caso se han reportado valores de transformación mayores al 45% del contenido inicial del ácido málico contenido en el mosto (Radler, 1993). Sin embargo, se ha encontrado que algunas levaduras del género Schizosaccharomyces son muy eficientes en la metabolización del ácido málico, pudiendo llegar a una transformación prácticamente completa reduciendo su concentración a cero. Por lo tanto se han investigado estas levaduras Schizosaccharomyces para su uso en la desmalificación 35 Capítulo 1 – Introducción y antecedentes bibliográficos de mostos, pudiendo ser utilizadas además para realizar la fermentación alcohólica, o combinarse con el uso de Saccharomyces cerevisiae (Dharmadhikari y Wilker, 1998; Rodriguez y Thornton, 1988; Yang, 1973). Sin embargo se han encontrado dificultades en el uso de estas levaduras por sus malas características fermentativas, así como por la producción de aromas indeseables en los vinos resultantes. Algunos investigadores han desarrollado productos de fusión de Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, con lo que se han obtenido levaduras con características mejoradas frente a los problemas antes mencionados (Carrau et al., 1982). En términos generales, los resultados insuficientes obtenidos en la degradación del ácido málico como consecuencia de la actividad de Saccharomyces cerevisiae se deben, por un lado a que su sistema de transporte para la entrada de ácido málico está dominado por el fenómeno de difusión simple, y por otra parte por la baja afinidad de su enzima málica. Sin embargo, en los últimos años se han obtenido excelentes resultados por modificación genética de cepas de S. cerevisiae, mediante la introduccción de los genes que expresan la malato permeasa (mae1) provenientes de Schizosaccharomyces pombe, y el gen de la enzima maloláctica (mleS) proveniente de Lactococcus lactis (Volschenk et al., 1997). 36 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía Arthurs, C. E.; LLoyd, D. Kinetics, stereospecificity, and expression of the malolactic enzyme. Applied and Environmental Microbiology 1999, 65, 3360-3363. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. 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Además estos compuestos volátiles están incluidos en el vino, y por lo tanto en una solución hidroalcohólica, que contiene otros compuestos muy variados (neutros, iónicos y macromoléculas), todo lo que representa en definitiva una matriz muy compleja. Las técnicas extractivas y preseparativas disponibles, al igual que las técnicas cromatográficas de alta resolución acopladas a métodos de análisis estructural cada vez más sofisticados, han permitido acceder a un conocimiento más profundo de los constituyentes volátiles del aroma de un vino. Por otra parte, desde el inicio de los años ’80, se han puesto en evidencia e iniciado el estudio de los compuestos precursores de aromas. Estos compuestos inodoros, provenientes en la mayoría de los casos de la uva, son capaces de liberar moléculas aromáticas por efecto de factores biológicos, biotecnológicos y/o fisicoquímicos. Por lo tanto, los constituyentes del aroma de un vino se clasifican según su origen a lo largo de la cadena biotecnológica en: a – aromas varietales, provenientes de la uva. La mayor parte de estos componentes se encuentran al estado de precursores, b – aromas prefermentativos, formados en la etapa desde la cosecha hasta el inicio de la fermentación, c – aromas fermentativos, formados por las levaduras durante la fermentación alcohólica, y las bacterias lácticas durante la fermentación maloláctica, 47 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat d – aromas posfermentativos, entre los que se incluyen a todos los componentes formados durante la conservación del vino, la cual puede ser de algunos meses hasta decenas de años. Aromas varietales Entre los constituyentes del aroma, los compuestos provenientes de la uva contribuyen a la tipicidad aromática del vino, y tienen un rol determinante en la calidad de los vinos. Estos compuestos son característicos de la variedad considerada y su expresión varía según las condiciones climáticas, zona de cultivo y prácticas en el manejo del viñedo. Contrariamente a otras especies, la uva es un fruto poco aromático. Las sustancias aromáticas libres relacionadas con la tipicidad aromática de las uvas de las variedades Vitis vinifera pertenecen a los grupos de los alcoholes terpénicos (característicos de los Mos- cateles) y las pirazinas (característicos de la familia del Cabernet Sauvignon). En el caso de variedades no Vitis vinifera se han reportado compuestos típicos como el antranilato de metilo (Power y Chesnut, 1921), la 2-aminoacetofenona (Acree et al., 1990), y el furaneol (Rapp et al., 1980). La mayoría de las variedades son, sin embargo atípicas como fruta, pero entre ellas están las que permiten elaborar vinos de gran reputación y en los cuales la particularidad de su aroma juega un papel destacado. Esta característica se debe a que una parte mayoritaria de los aromas varietales se encuentra en forma de precursores, como es el caso de los compuestos glicosidados, carotenoides, ácidos fenólicos y precursores de aromas azufrados (característicos de Sauvignon blanc). Terpenos Los terpenos intervienen en la tipicidad de los Moscateles (Moscatel de Alejandría, Muscat Ottonel, Moscatel de Hamburgo, etc.) y de variedades aromáticas o florales (por ej. Gewürztraminer, Viognier y Albariño), pero también se encuentran presentes en menores cantidades en otras variedades (Marais, 1983; Ribéreau-Gayon et al., 1975; Strauss et al., 1986b; Versini et al., 1994a; Versini et al., 1987b). Linalol, geraniol y nerol son los tres principales alcoholes terpénicos encontrados en muchas variedades. Sus umbrales de percepción son muy bajos (Tabla 2.1), aunque sólo superados por las concentraciones reportadas en vinos de las variedades nombradas anteriormente (Bayonove et al., 1998). 48 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat En la uva y el vino se han identificado actualmente aproximadamente 70 compuestos terpénicos (Bayonove et al., 1998; Mateo y Jiménez, 2000; Strauss et al., 1986b), siendo algunos de estos compuestos citados los siguientes (Figura 2.1): a – hidrocarburos monoterpénicos (C10) como limoneno (i), α-terpineno (ii), γterpineno, p-cimeno y mirceno, o sesquiterpenos (C15) como farneseno y γ-cadieno, todos ellos de poco interés aromático, b – alcoholes monoterpénicos muy aromáticos (Tabla 2.1) como linalol (iii), α-terpineol (iv), nerol (v), geraniol (vi), citronelol (vii), 3,7-dimetil-1,5,7-octatrien-3-ol (ho-trienol) (viii), c – algunos alcoholes sesquiterpénicos como el farnesol y γ-cadinol, d – formas cis y trans de los óxido furánicos (ix, x) y piránicos de linalol (xi, xii), óxido de rosa (xiii) y óxido de nerol (xiv), no teniendo estos compuestos un fuerte impacto en el aroma de los vinos a excepción del óxido de rosa el cual es un compuesto importante en la componente floral del aroma de los vinos Gewürztraminer (Guth, 1997a; Schreier et al., 1976; Versini et al., 1999a), e – aldehídos como el geranial, neral y citronelal, los cuales son muy aromáticos pero con aromas menos florales que los alcoholes correspondientes, f – ácido transgeránico, así como el éster trans-geraniato de metilo (Versini et al., 1994b). Se han detectado además los acetatos de geranilo y nerilo, aunque estos compuestos pueden ser formados en las primeras etapas de la fermentación (Rapp y Knipser, 1980), g – dioles terpénicos, en los cuales la función alcohol adicional los hace más solubles y menos aromáticos. En este grupo se encuentra el trans-3,7-dimetil-1,5-octadien-3,7-diol (xv) y trans-3,7-dimetil-1,7-octadien-3,6-diol (xvi) (ho-diol I y II), 3,7-dimetil-1-octen3,7-diol (xvii) (endiol), 2,6-dimetil-7-octen-1,6-diol (8-hidroxi-6,7-dihidrolinalol) (xviii), trans- (xix) y cis-2,6-dimetil-2,7-octadien-1,6-diol (xx) (trans- y cis-8-hidroxilinalol), trans-3,7-dimetil-2-octen-1,7-diol (7-hidroxigeraniol) (xxi). Ha sido identificado además un triol, 3,7-dimetil-1-octene-3,6,7-triol (xxii). 49 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.1 Principales compuestos terpénicos reportados en uvas y vinos. Ver referen- cias en el texto. OH CH2OH (i) (ii) OH (iv) (iii) (v) OH CH2OH CH2OH O HO O HO (ix) (vi) (vii) HO (x) (viii) HO O O O O (xi) (xii) (xiii) (xiv) OH OH OH OH OH OH CH2OH OH (xv) (xvi) OH (xvii) OH (xviii) CH2OH OH OH CH2OH (xix) OH HOH2C OH (xx) (xxi) 50 (xxii) Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 2.1 Descriptores del aroma y umbral de percepción de los principales terpenos reportados en uvas y vinos. Compuesto linalol α-terpineol citronelol nerol geraniol hotrienol óxido de rosa óxido de nerol óxidos furánicos óxidos piránicos 1 6 descriptor umbral (µ µg/L) floral, coriandro, lavanda, 0.006 bergamota 0.01 0.05 0.08 floral, pino 0.28-0.35 0.40 2 dulce, floral 0.04 0.10 0.018 lima, rosa, jacinto 0.3 0.4 0.5 frutado, floral 0.075 0.03 0.13 flores de lima, tilo 0.11 geranio, rosa 0.0005 fragante, verde 0.10 floral, alcanfor 6 floral, alcanfor 3-5 medio referencia 4,7 agua sim.vino 3 vino 6 cerv. 1 agua 4,7 vino 6 cerv. 1 agua 5 sim.vino 3 vino 6 agua 5 vino 6 cerv. 1 agua 2 sim.vino 3 vino 6 vino 6,8 agua 5 agua 8 sim.vino 9 sim.vino 9 Meilgaard (1985); 2 Pyysalo et al. (1977); 3 Guth (1997b); 4 Buttery et al. (1971); 5 Ohloff (1978b); Ribereau-Gayon et al. (1998); 7 Ahmed et al. (1978); 8 Simpson (1979); 9 Terrier et al. (1972) Si bien la biosíntesis de los terpenoides no ha sido estudiada específicamente para el caso de la uva, si se ha estudiado para diversos vegetales mostrando un esquema consistente, por lo que es lógico pensar en el mismo proceso para el origen de estos compuestos en la uva. La biosíntesis de estos compuesto comprende dos rutas, las cuales se desarrollan en diferentes compartimientos celulares (Figura 2.2). En una de ellas, desarrollada en el citoplasma, se produce la tranformación de la glucosa hasta ácido mevalónico y finalmente difosfato de isopentenilo, con el acetil-CoA como producto intermedio, siendo este compuesto la unidad de base isoprénica de 5 carbonos, a partir de la cual se forman por condensación los sesquiterpenos y triterpenos (Bayonove et al., 1998; Vasserot et al., 1995). Mientras que en la otra ruta, que se desarrolla en los plastos, se produce la condensación de piruvato y 3-fosfato gliceraldehído, formándose finalmente por la vía de la 5-fosfato1-deoxi-D-xilulosa, el difosfato de isopentenilo que como en la ruta anterior, por condensación forma los monoterpenos, diterpenos y carotenos (Eisenreich et al., 1997; Lichtenthaler et al., 1997a; Rohmer et al., 1996; Schwender et al., 1997) 51 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat .Figura 2.2 Esquema de la vía biosintética de los mono, di, sesqui, y triterpenoides, y de los carotenoides. Plástido Citoplasma 3 Acetil-CoA G A-3P + Piruv ato HMG-CoA 1 -D eo xi-D-xilulosa-5-P DMAPP Mevalonato IPP I s o p r en o + IP P DMAPP IPP GPP (C10) Monoterpenos IP P + IPP + IPP ? FPP FPP (C15) 2x Diterpenos + IP P + IPP GGPP (C20) 2 x Carotenoides (C40) Sesquiterpenos (C15) Triterpenos (C30) IPP, difosfato de isopentenilo GPP, difosfato de geranilo GGPP, difosfato de geranilgeranilo DMAPP, difosfato de dimetil alilo FPP, difosfato de farnesilo HMG-CoA, hidroximetilglutaril-CoA GA-3P, 3-fosfato gliceraldehído 52 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.2 (Continuación) Obtención de monoterpenos a partir de la unidad de difosfato de isopentenilo. OPP OPP HR OPP HS HR HS pérdida estereoespecífica del protón OPP OPP geranil PP (GPP) el enlace simple en LPP permite la rotación OPP OPP E OPP Z OPP OPP OPP neril PP (NPP) linalil PP (LPP) geranil PP (GPP) catión alílico estabilizado por resonancia (catión geranilo) catión alílico estabilizado por resonancia (catión nerilo) 53 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.2 (Continuación) Obtención de carotenoides a partir de la condensación de diterpenos. OPP geranil geranil PP (C20) (GGPP) PPO GGPP adición electrofílica da un catión terciario catión alílico OPP H H pérdida de un protón con formación de un anillo ciclopropano H OPP H pérdida de PP da un catión primario excepto por la pérdida final del protón, esta secuencia es análoga a la de la formación del pre-escualeno H W-M desplazamineto 1,2-alquilo genera un catión secundario mas estable y un anillo ciclobutano menos tensionado H H ruptura del enlace forma un alqueno y un catión alílico mas favorable la pérdida de un protón genera un alqueno Z Z-fitoeno (C40) secuencia de reacciones de desaturación En plantas y hongos el doble enlace central también sufre isomerización Z → E E licopeno (C40) 54 H H Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Pirazinas Estos compuestos se relacionan generalmente a los aromas de la variedad Cabernet Sauvignon, siendo reportados en el vino las siguientes pirazinas: 2-metoxi-3-isobutil pirazina, 2-metoxi-3-sec-butil pirazina y 2-metoxi-3-isopropil pirazina (Figura 2.3). Si bien las concentraciones encontradas son muy bajas (0.5 a 50 ng/L) (Allen y Lacey, 1993; Allen y Lacey, 1999; Lacey et al., 1991), las mismas son muy superiores a los umbrales de percepción. Se ha demostrado que su concentración presenta una correlación positiva con las notas herbáceas (aromas descriptos como ‘morrón verde’, ‘espárrago’, ‘notas terrosas’) (Bayonove et al., 1998; Harris et al., 1987; Heyman et al., 1986). Estos compuestos han sido reportados además en vinos de diversas variedades, como es el caso de Merlot, Cabernet Franc, Sauvignon Blanc (Allen et al., 1994; Harris et al., 1987); si bien el umbral de percepción sólo es superado en los primeros cepajes. El contenido de metoxipirazinas disminuye durante la madurez, siendo la incidencia de la luz en el racimo un factor muy importante para esta variación (Allen y Lacey, 1993; Allen et al., 1994; Lacey et al., 1991). El origen de estos compuestos no es bien conocidos en la uva, ni en otros vegetales en general; siendo citados como posibles precursores algunos aminoácidos como leucina, isoleucina, valina y glioxal (Murrey y Whitfield, 1975). Figura 2.3 Principales pirazinas en las uvas y vinos. Se indica para cada compuesto el descriptor de su aroma y el umbral de percepción determinado en agua. N N N N OCH3 2-metoxi-3-isobutil pirazina Pimiento verde (2 ng/L) N OCH3 2-metoxi-3-secbutil pirazina Pimiento verde (1 ng/L) Adaptado de Ribereau-Gayon et al. (1998) 55 N OCH3 2-metoxi-3-isopropil pirazin Pimiento verde - terroso (2 ng/L) Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Carotenoides y derivados C13 norisoprenoides Muchas variedades no aromáticas producen vinos de alta calidad y se destinguen por sus características aromáticas bien diferenciadas. Esta particularidad aromática parece provenir en la mayoría de los casos de precursores no aromáticos como son los carotenoides, propios de cada variedad (Bayonove et al., 1998). Los carotenoides presentan el mismo origen bioquímico que los terpenos pero poseen un grado de polimerización más elevado (C40) (Spurgeon y Porter, 1981), siendo su contenido en los granos variable (15 a 2000 µg/kg), según la variedad, zona de cultivo, clima, etc., y disminuyendo su concentración durante la madurez (Guedes de Pinho et al., 2001; Razungles et al., 1988; Razungles et al., 1993). Estos compuestos presentan, por sus características lipofílicas, una baja solubilidad en agua, lo que determina que se encuentren localizados en los plastos de las células constituyentes de las partes sólidas de la pulpa y la película del grano (Razungles et al., 1988). Por otra parte se ha encontrado que el contenido en las hojas resultó ser 100 veces mayor que el determinado en las bayas (Baumes et al., 2002). El β-caroteno y la lutenina son los carotenoides más abundantes identificados en uvas y vinos, encontrándose en menor concentración la neoxantina, flavoxantina, violaxantina, 5,6-epoxiluteína y luteoxantina (Baumes et al., 2002; Guedes de Pinho et al., 2001; Razungles et al., 1988). El único hidrocarburo carotenoide (caroteno) es el β-caroteno, siendo todos los demás carotenoides oxigenados (xantofilas) (Baumes et al., 2002). Como se ha mencionado, la biosíntesis de los carotenos en las plantas se produce en los plastos, a partir del difosfato de isopentenilo, obtenido por condensación de piruvato y 3fosfato gliceraldehído por la vía de la 5-fosfato-1-desoxi-D-xilulosa (Figura 2.2) (Lichtenthaler et al., 1997b; Lichtenthaler et al., 1995; Schwender et al., 1996). En las últimas etapas de la biosíntesis de los carotenos cíclicos, el licopeno (caroteno no cíclico) puede formar dos ciclos en sus extremos, con insaturaciones en β para dar la molécula de β-caroteno, o formar una insaturación en β y una en ε para dar α-caroteno (Figura 2.4). El α-caroteno no es acumulado en los tejidos fotosintéticos y es hidroxilado en los carbonos 3 y 3’ dando lugar a la formación de luteína (Baumes et al., 2002). 56 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.4 Principales carotenoides de la uva y el vino, β-caroteno y luteína, esta última producto de la transformación del α-caroteno. Esquema de formación de los distintos tipos de anillo. licopeno β β β-caroteno ε β α-caroteno OH β ε HO luteina H a b H c H a c b anillo β anillo γ anillo ε 57 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.5 Ciclo de las xantofilas β-caroteno OH HO zeaxantina luz sombra OH O HO anteraxantina luz sombra OH O O HO violaxantina C O HO HO neoxantina 58 OH Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat En forma similar, una hidroxilación asimétrica en los carbonos 3 y 3’ del β-caroteno forma la zeaxantina. En condiciones de baja intensidad de luz, la zeaxantina se epoxida dando violaxantina; en cambio el camino inverso se produce en condiciones de máxima actividad de luz, realizándose la desepoxidación de la violaxantina (Figura 2.5). Este ciclo esta involucrado en el sistema de fotoprotección, mediante disipación del exceso de energía de excitación, y es llamado ciclo de las xantofilas (Baumes et al., 2002). Mediante la acción de la luz y de oxidasas (polifenoloxidasa, lipooxigenasa) los carotenoides son susceptibles de ser degradados en fragmentos más pequeños, de 9, 10, 11 y 13 átomos de carbono (norisoprenoides) (Figura 2.6), más solubles, volátiles y frecuentemente resposables de notas aromáticas diferentes (Enzell, 1981; Enzell, 1985). La fragmentación en compuestos C13 conduce en una primera etapa a compuestos con grupos cetona (β-ionona, 3-hidroxi-β-ionona, 3-hidroxi-5,6-epoxi-β-ionona, grasshopper cetona), para dar posteriormente una gran cantidad de compuestos del mismo origen y de estructura análoga (esqueleto megaestigmano) (Williams et al., 1992; Winterhalter, 1992). Figura 2.6 Productos de degradación de los carotenoides y formación de norisoprenoi- des. O O CHO O O C9 C10 C11 59 C13 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat La comparación de los centros asiméricos de los C13-norisoprenoides con los correspondientes centros asimétricos de los carotenoides de la uva, de los cuales pueden derivar, da soporte adicional al conocimiento de su orígen. De esta forma por ejemplo la 3-hidroxiβ-damascona se origina de la neoxantina via la grasshopper cetona, manteniendo la este- reoquímica de sus carbonos; de la misma forma la 3-oxo-α-ionol y los megastigmano3,9-diol se originan de la luteína (Baumes et al., 2002; Baumes et al., 1994). Dado que diferentes carotenoides dan origen a la formación de los compuestos norisoprenoides, y teniendo en cuenta la importancia de la luz en el proceso de interconversión por el ciclo de la xantofila, se ha observado que según la intensidad de luz que recibe la fruta durante la madurez, y en especial en las últimas etapas de esta, varían las cantidades formadas de los distintos norisoprenoides y las relaciones de concentración entre ellos. Dentro de los componentes de este grupo con mayor importancia desde el punto de vista sensorial, se encuentra la β-ionona con notas a ‘violetas’, y la β-damascenona con notas complejas a ‘flores’ y ‘fruta de la pasión’, ambas con umbrales de percepción al olfato muy bajos (valores determinados en agua, de 120 y 3.5 ng/L respectivamente, mientras que en mezcla hidroalcoholica los valores son 800 y 45 ng/L) (Ribereau-Gayon et al., 1998). Evidentemente estos compuestos, a pesar de encontrarse en baja concentración, aportan un número de unidades olfativas elevado y probablemente son responsables de un impacto importante sobre la nota aromática global de los vinos (Etiévant et al., 1983; Ohloff, 1978a). Otros norisoprenoides reportados en vinos son el 1,1,6- trimetildihidronaftaleno (TDN) con olor a ‘hidrocarburos’ o ‘keroseno, los vitispiranos con notas de ‘alcanfor’ y ‘eucaliptus’, los teaspirano con notas de ‘té’, la 3-hidroxi-βdamascona con notas de ‘rosa’, ‘tabaco’ y ‘fruta’, el 3-oxo-α-ionol con notas de ‘tabaco’, y los megastigma-5-eno-3,4,9-trioles con notas a ‘tabaco rubio’ (Figura 2.7 y Tabla 2.2) (Bayonove et al., 1998). La mayoría de los norisoprenoides no existen en estado libre en la uva, pero se encuentran en cantidades relativamente abundantes como precursores en forma glicosidada (Williams et al., 1992; Winterhalter y Skouroumounis, 1997). 60 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.7 Principales C13-norisoprenoides reportados en hojas, uvas y vinos. Ver refe- rencias en la Tabla 2.2. O O O HO ii i OH HO iii iv OH OH O C O OH HO HO O v O vi viii vii OH OH O O O ix x xi OH O HO xiv OH xviii O xx xix O OH OH O xxii xxi O HO O OH O xxiii OH xxiv OH O O HO xxv OH O xvii OH OH OH O OH xvi O OH HO HO xv OH OH OH O O xii OH xiii HO O HO OH O xxvi O xxvii 61 xxviii Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Tabla 2.2 Principales C13-norisoprenoides reportados en hojas, uvas y vinos. i - β-damascenona ii - β-ionona iii - 3-hidroxi-β-damascona iv - 3-hidroxi-β-ionol v - 3-oxo-α-ionol vi - 4-oxo-β-ionol vii - grasshopper cetona viii - 3-hidroxiteaspirano ix - vitispirano x - 3-oxoactinidol xi - 3-hidroxiactinidol xii - 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN) xiii - 3-oxo-4,5-dihidro-α-ionol xiv - 3-oxomegastigman-9-ol xv - 3-hidroxi-7,8-dihidro-β-ionol xvi - 3-hidroxi-7,8-dehidro-β-ionol xvii - vomifoliol xviii - dehidrovomifoliol xix - 4,5-dihidrovomifoliol xx - 7,8-dihidrovomifoliol xxi - 3-hidroxi-β-ionona xxii - 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol xxiii - 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol xxiv - 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-β-ionona xxv - 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-β-ionol xxvi - 3,4-dihidroxi-β-ionona xxvii - 9-hidroxi-7-megastigmen-3-ona xxviii - 3-hidroxi-5,6-epoxi-β-ionona Adaptado de Winterhalter et al. (1990a), Marais et al. (1992), Skouroumounis y Winterhalter (1994) 62 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Formas glicosidadas Las formas glicosidadas de diversos grupos de compuestos se encuentran frecuentemente en la naturaleza. Estos glicósidos no presentan olor, pero son una fuente potencial de aroma al liberar la aglicona que puede ser una molécula volátil, o que puede tranformarse en otra molécula volátil. En las uvas y vinos se ha identificado la unión de la aglicona con una molécula de glucosa dando β-D-glucósidos, o la unión con disacáridos formando el 6-O-(α-L-arabinofuranosil)-β-D-glucopiranósido, 6-O-(α-L-ramnopiranosil)-β-D-glucopiranósido (o β-rutinósido), y 6-O-(β-D-apiofuranosil)-β-D-glucopiranósido (Figura 2.8) (Marinos et al., 1994; Vasserot et al., 1995; Williams, 1993; Williams et al., 1982b; Winterhalter y Skouroumounis, 1997). Teniendo en cuenta la diversidad de agliconas posibles, se puede obtener un número enorme de compuestos, presentando en algunas variedades concentraciones muy abundantes, con valores que pueden alcanzar concentraciones de hasta 28 mg/L (como es el caso de ciertos Moscatos). Por su potencial aromático, en la mayoría de las cepas estudiadas, las formas glicosidadas son más importantes que las formas libres (Bayonove et al., 1998; Versini et al., 1999a; Versini et al., 1987b). Los distintos glicósidos se distribuyen en proporciones variables según la cepa estudiada, presentando los arabinosilglucósidos y apiosilglucósidos los mayores porcentajes (mayores a 50%). Las diversas agliconas posibles no se han encontrado presentes en todas las variedades estudiadas, siendo que dependiendo de la variedad se verifica su presencia o ausencia (Voirin, 1990). Estas sustancias representan en la uva un potencial de aroma ligado muy importante, que es función de la cepa. Este potencial es relativamente estable durante la vinificación, y evoluciona lentamente a lo largo del tiempo (Günata et al., 1985; Günata et al., 1990; Strauss et al., 1986b; Voirin, 1990; Williams et al., 1992). Estos glicósidos pueden ser liberados fundamentalmente por vía enzimática como se discutirá en el capítulo 6. 63 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.8 Compuestos glicosidados en las uvas y vinos R= HO (i) OH O CH3 Alcoholes alifáticos O OH C4, C5, C6, C8 OH (ii) R CH2 Alcoholes terpénicos O O Norisoprenoides OH OH OH O CH2OH OH O OH (iii) O HOH2C O OH OH (iv) (i)β -D-glucósido (ii) 6-O-(α-L-ramnopiranosil)-β-D-glucopiranósido (iii) 6-O-(α-L-arabinofuranosil)-β-D-glucopiranósido (iv) 6-O-(β-D-apiofuranosil)-β-D-glucopiranósido Adaptado de Williams (1993), Winterhalter y Skouroumounis (1997) 64 Derivados del metabolismo del ácido shiquímico Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Precursores de origen fenólico y sus derivados Los ácidos fenólicos se encuentran en la uva en forma esterificada (ésteres tartáricos). Son compuestos abundantes pero su contenido es muy variable dependiendo del ácido considerado, la variedad, la zona de cultivo y el año, constituyendo de esta forma, un factor de diferenciación útil para trabajos quimiotaxonómicos (Boursiquot, 1987; Boursiquot et al., 1986; Nagel et al., 1979; Ong y Nagel, 1978; Romeyer, 1984). La vía de formación de estos compuestos, fundamentalmente derivados del ácido cinámico, corresponde a la vía biosintética del ácido shiquímico, la cual es común en la mayoría de los vegetales y conduce a la formación de los aminoácidos fenilalanina y tirosina (Figura 2.9). Los principales ácidos fenólicos: cafeico, p-cumárico y ferúlico, no poseen olor por si mismos, pero pueden sufrir diversas reacciones enzimáticas de conversión (isomerización, oxidación, reducción, hidrólisis) que los transforman en otros compuestos fenólicos volátiles (Di Stefano, 1985). En el curso de la fermentación, gracias a la actividad descarboxilasa de la levadura, o por la intervención de otros microorganismos como las bacterias lácticas, se producen cantidades relativamente importantes de fenoles volátiles como el 4-vinil y 4-etilfenol, 4-vinil y 4-etilguayacol, vainillato de etilo (notas fenólicas, humo, madera) (Baumes et al., 1986; Di Stefano, 1985; Etiévant, 1981). Los vinil fenoles pueden encontrarse además en forma de precursores glicosidados en la uva, los cuales son liberados en la vinificación. Existen otros fenoles volátiles provenientes de la uva (Voirin, 1990), como el eugenol que posee una nota especiada de tipo clavo característica que puede encontrarse en ciertos vinos (Singleton y Trousdale, 1983), así como fenoles que estan presentes en cantidades relativamente importantes en forma glicosidada como la vainillina, propiovainillina o la zingerona. Estos últimos compuestos, que se encuentran en general en forma libre en la crianza de los vinos, son muy interesantes desde el punto de vista olfativo por sus aromas característicos (quemado, alquitrán, empireumático, vainillado), y sus bajos umbrales de percepción (Etiévant et al., 1989; Strauss et al., 1987; Voirin, 1990). Se ha determinado además la presencia de benzaldehído en forma ligada en vinos, este compuesto puede alcanzar valores importantes en algunas varideades como por ejemplo la Godello (Versini et al., 1994a; Versini et al., 1999b). 65 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.9 Bisíntesis de ácidos fenólicos. vía de las O C H H OH pentosas H HEXOSA COOH OH O CH2 H 2O OPO3H2 CH2 Pi HO D-eritrosa-4-fosfato (1) H H + OH H OH COOH CH2OPO3H2 C OPO3H2 CH2 (2) ácido fosfoenolpiruvato Pi HO COOH O OH OH (3) H 2O COOH COOH ADP O ATP (5) OH COOH NADP+ NADPH HO (4) OH O OH OH OH PO3H2 OH ác. D-shiquímico (6) fosfoenol piruvato Pi COOH COOH Pi COOH CH2 O O OH COOH HOOC O O (7) COOH OH PO3H2 (8) OH ácido prefénico (1) fosfo-2-oxo-3-desoxiheptanoato aldolasa; (2) deshidroquinato sintetasa; (3) 5-deshidroquinato deshidratasa; (4) shiquimato deshidrogenasa; (5) shiquimato quinasa; (6) piruvil shiquimatofosfato sintetasa; (7) corismato sintetasa; (8) corismato mutasa 66 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.9 (Continuación) Biosíntesis de ácidos fenólicos COOH HOOC O ácido prefénico NAD+ CO2 H2 O NADH CO2 OH (9) COOH COOH O O ác. p-hidroxi fenilpirúvico ác. fenilpirúvico OH glutarato (10) glutarato (10) α-cetoglutarato α-cetoglutarato COOH COOH NH2 NH2 fenilalanina tirosina OH (11) (12) NH3 NH3 COOH COOH + NADPH NADP ác. cinámico ác. p-cumárico (13) OH malonil-CoA OH HO COOH O OH O ác. cafeico OH OH flavonoides (9) prefenato deshidratasa; (10) transaminasa; (11) fenilalanina amonioliasa; (12) tirosina amonioliasa; (13) cinamato 4-hidrolasa 67 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Se identificaron por varios autores, ésteres de compuestos fenólicos, los cuales resultan interesantes desde el punto de vista sensorial. Entre ellos se encuentran el vanillato de metilo y salicilato de metilo, ambos presentes en forma glicosidada en uvas, o el vanillato de etilo y cinamato de etilo con notas a banana pasada y confitura, presentando un umbral de percepción de aproximadamente 10 µg/L según Versini y Tomasi (1983). Muchos de estos compuestos son susceptibles de modificar el aroma de un vino, y de jugar un rol fundamental en la tipicidad de ciertos vinos, como ha sido reportado para los vinos Merlot en Italia (Nicolini et al., 2001). Compuestos azufrados responsables de aromas varietales y sus precursores Los compuestos azufrados en los vinos son generalmente considerados como responsables de defectos organolépticos. Sin embargo, desde hace varios años se ha demostrado la importancia de algunos compuestos que poseen una función tiol en la calidad del aroma de ciertos frutos, plantas aromáticas y alimentos, como el cassis, el pomelo, la guayaba (Bayonove et al., 1998; Ribereau-Gayon et al., 1998). El primer tiol identificado en vinos de Sauvignon blanc fue la 4-mercapto-4-metil-2pentanona (Darriet et al., 1995; Tominaga et al., 1998), que posee un olor que recuerda al boj y la retama, y su umbral de percepción al olfato es muy bajo (0.1 ng/L en agua, y 0,8 ng/L en solución simil vino). Este compuesto puede contribuir al aroma de los vinos Sauvignon blanc, en los cuales se han reportado concentraciones de hasta 40 ng/L (Bouchilloux et al., 1996), y en vinos de la variedad Scheurebe (Guth, 1997a). Otros tioles han sido también identificados (Figura 2.10), como ser el 3-mercapto-1hexanol (Tominaga et al., 1998), que posee aroma a pomelo, con un umbral de percepción de 60 ng/L en solución modelo. Este compuesto puede además formar el ester, el acetato de 3-mercapto-1-hexilo (Tominaga et al., 1998), cuyo componente aromático dominante es el boj y su umbral de percepción es de 4 ng/L Está presente en los vinos en concentraciones de hasta algunos centenares de ng/L, por lo que se trata de una sustancia importante por su contribución aromática. El acetato de 3-mercapto-1-hexilo posiblemente se forme por acetilación del 3-mercapto-1-hexanol como consecuencia del metabolismo de las levaduras durante la fermentación alcohólica, y es degradado durante la conservación por hidrólisis química (Peyrot des Gachons et al., 2000). Otro compuesto identificado es el 4-mercapto-4-metil-1-pentanol, responsable de olor a cáscara de cítricos y umbral de percepción de 55 ng/L. Sin embargo la contribución de 68 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat este compuesto al aroma de los vinos no ha sido demostrada debido a las bajas concentraciones encontradas, las cuales raramente superan los 50 ng/L. Estos compuestos azufrados también han sido reportados en variedades tintas como el Merlot y el Cabernet Sauvignon, siendo especialmente importante la contribución al aroma del 3-mercapto-1-hexanol y su acetato, así como el 3-mercapto-2-metilpropanol (Bouchilloux et al., 1998). Figura 2.10 Compuestos azufrados responsables de aromas varietales. SH O SH 4-mercapto-4-metil-2-pentanona OH 4-mercapto-4-metil-2-pentanol SH SH OH O O 3-mercapto-1-hexanol acetato de 3-mercapto-1-hexilo Los tioles son compuestos muy reactivos, pudiendo estar implicados, durante la vinificación en combinaciones estables, con algunos compuestos fenólicos oxidados (principalmente quinonas del ácido cafeico) y con el cobre, lo que indicaría las consecuencias perjudiciales de los tratamientos anticriptogámicos con formulación cúprica en el período de madurez (Darriet et al., 2001). Paradójicamente, los jugos de uva de la variedad Sauvignon son en general poco aromáticos y no poseen el aroma típico de los vinos de esta variedad. Este aroma típico aparece durante de la fermentación alcohólica, a partir de formas precursoras de los tioles volátiles S-conjugados con cisteína, S-4-(4-metil-2-pentanona)-L-cisteína, S-4-(4-metil-2pentanol)-L-cisteína, y S-3-(1-hexanol)-L-cisteína (Figura 2.11). Estos compuestos pueden ser liberados por la acción β-liasa de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación alcohólica (Tominaga et al., 1998). 69 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.11 Compuestos derivados de la cisteína, precursores de los tioles volátiles. Ac- tividad β-liasa en la reacción de liberación de los compuestos ligados. S O S H2N OH H2N COOH COOH S-4-(4-metil-2-pentanona)-L-cisteína S-4-(4-metil-2-pentanol)-L-cisteína OH S H2N COOH S-3-(1-hexanol)-L-cisteína R S COOH β-liasa COOH R SH NH2 + NH3 + O Aromas prefermentativos Estos aromas se producen durante los tratamientos realizados a la uva desde el momento de la cosecha hasta el inicio de la fermentación (cosecha, transporte, descobajado, estrujado, prensado). Los efectos mecánicos de estos tratamientos producen una ruptura a nivel celular que permite a los sistemas enzimáticos entrar en contacto con los sustratos presentes en el grano. Por otra parte, la mayoría de estos tratamientos incorpora oxígeno en el medio, facilitando de esta forma la disponibilidad del segundo sustrato implicado en las reacciones de oxidación enzimática (Bayonove et al., 1998; Cordonnier, 1989). 70 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.12 Biosíntesis de compuestos C6 responsables de los aromas herbáceos. lípidos naturales o fosfolípidos de los plástidos (1) COOH COOH ácido linoleico ácido α-linolenico (2) O2 (2) OOH O2 OOH COOH COOH (3) (3) C 12 CHO C 12 (4) CHO OH cis-3-hexen-1-ol (4) FI CHO (4) OH trans-3-hexen-1-ol FI CHO (4) OH trans-2-hexen-1-ol (1) acil hidroliasa (2) lipooxigenasa (3) hidroperóxido liasa (4) alcohol deshidrogenasa FI factor de isomerización Adaptado de Hatanaka (1993) 71 FI OH 1-hexanol Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat De esta forma el sistema enzimático formado por acil hidrolasas, lipooxigenasas, hidroperóxidoliasas y alcohol deshidrogenasas (Hatanaka, 1993), son capaces de producir a partir de los ácidos linoléico y linolénico, sustancias que van a participar en el aroma prefermentativo como es el caso de los alcoholes y aldehídos con 6 átomos de carbono (Figura 2.12), responsables de los aromas y sabores verdes, herbáceos, y en algunos casos amargos (Joslin y Ough, 1978). Los factores que afectan la formación de estos compuestos son el estado de madurez de la uva, obteniéndose una mayor producción en cosechas realizadas antes de la madurez; y el manejo de la fruta en las etapas de transporte y recepción, siendo el efecto mecánico intenso un factor de aumento en su concentración (Cordonnier, 1989; Joslin y Ough, 1978). La etapa prefermentativa adquiere un rol preponderante en las vinificaciones por maceración carbónica, técnica que consiste en mantener la uvas enteras en una atmósfera de CO2, induciendo de esta forma a un metabolismo anaerobio del grano previo a la extracción de jugo y fermentación alcohólica. Entre los distintos fenómenos prefermentativos que ocurren en este tipo de vinificación se encuentra la formación de un número importante de compuestos aromáticos que marcan importantes diferencias respecto a los vinos vinificados en forma tradicional. Estos compuestos aromáticos, principalmente derivados del metabolismo del ácido shiquímico, han sido reportados por varios autores, encontrándose entre ellos el cinamato de etilo, salicilato de etilo, y otros como el estireno y el octanol (Dell'Oro y Di Stefano, 1990; Versini et al., 1984; Versini y Tomasi, 1983) Aromas fermentativos La fermentación es la etapa fundamental de la transformación de la uva en vino, y comprende dos transformaciones biológicas, la fermentación alcohólica y la maloláctica. La fermentación alcohólica es común a todos los vinos, y en la misma las distintas cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae producen la transformación de los dos azúcares principales de la uva (glucosa y fructosa) para dar etanol y anhídrido carbónico. La totalidad del etanol producido es retenido en el vino, en cambio solo una fracción residual del anhídrido carbónico permanece en los vinos “tranquilos”. El etanol interviene en el aroma del vino en forma directa debido a que las cantidades producidas son muy superiores a su umbral de percepción el cual ha sido reportado con valores de 8 a 200 mg/L en agua (Flath et al., 1967; Rothe et al., 1972; Sega et al., 1967; Siek et al., 1971). 72 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Asimismo tiene una influencia indirecta en el aroma de los vinos al disminuir la polaridad del medio, y por consiguiente los coeficientes de reparto aire/vino de la mayoría de los aromas constituyentes del vino (Bayonove et al., 1998). La levadura utiliza además parte de las azúcares de la uva para producir, mediante la fermentación glicero-pirúvica, glicerina y ácido pirúvico, siendo este último transformado en muchos metabolitos secundarios como son 2,3-butanodiol, etanal, acetoína, ácidos acético, láctico, succínico y citramálico (Ribéreau-Gayon et al., 1955). Durante esta etapa se forman una serie de compuestos aromáticos con diferentes funcionalidad como alcoholes, ácidos grasos y sus ésteres, compuestos azufrados, lactonas, compuestos carbonílicos, compuestos nitrogenados y fenoles volátiles. Alcoholes Los alcoholes superiores, reportados en mayor concentración en vinos, son el 2- y 3metilbutanol, propanol, 2-metilpropanol, butanol, pentanol, 2-feniletanol, 3-metiltio-1propanol, con valores medios totales de 400 a 500 mg/L, pudiendo producir defectos en el aroma a sus concentraciones más elevadas (Etiévant, 1991), excepto el 2-feniletanol. Su formación se relaciona con el metabolismo de los aminoácidos, y por lo tanto está directamente relacionado con las fuentes nitrogenadas del mosto. Se conocen dos vías biosintéticas para la formación de los alcoholes superiores: - una vía catabólica de aminoácidos producida por descarboxilación posterior a la reducción de los α-cetoácidos obtenidos por transaminación según la reacción de Ehrlich (Figura 3.5), - una vía anabólica de formación de los aminoácidos a partir de azúcares. Por lo tanto es posible demostrar que una carencia de nitrógeno asimilable por las levaduras (amonio y aminoácidos libres) produce una acumulación de α-cetoácidos, y cantidades importantes de alcoholes superiores (Jiranek et al., 1991). La formación del propanol es más compleja y está ligada al metabolismo del azufre por acción de las levaduras, tieniendo un comportamiento opuesto al comportamiento general descripto anteriormente. Otros factores que intervienen en la formación de los alcoholes superiores, aumentando su concentración, son: la turbidez del mosto, aereación, temperatura de fermentación y pH elevado (Monterio y Bisson, 1991; Ough et al., 1991). 73 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Además de los alcoholes superiores, en la fermentación se producen algunos polialcoholes como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiolo, 1,2-etanodiol y 2,3-butanodiol, obtenidos por reducción de los compuestos carbonílicos correspondientes producidos por la levadura, no teniendo un impacto directo en el aroma de los vinos (Bayonove et al., 1998). Si bien el papel de las levaduras en el incremento en alcoholes provenientes de precursores varietales ha sido un tema de discusión planteado por diferentes autores, su importancia se ha demostrado por Delfini et al. (2001). Ácidos grasos y sus ésteres Esta familia de compuestos está formada por ácidos grasos de cadena corta (C2 a C10), sus ésteres etílicos, y los acetatos de alcoholes superiores. Todos estos compuestos derivan de la acción de la acil-S-coenzimaA que genera los ácidos grasos por hidrólisis, y los ésteres etílicos de ácidos grasos o acetatos de alcoholes superiores por alcohólisis. Esta etapa de biosíntesis es regulada por sistemas enzimáticos comunes o análogos a la alcohol acetil transferasa (cataliza la alcoholisis de la acetil-ScoenzimaA). Los factores favorables para la formación de los ácidos grasos y sus ésteres durante la fermentación son: anaerobiosis total, bajas temperaturas de fermentación y mostos clarificados (Nykänen, 1986; Shinohara, 1984). El metabolismo de los azúcares por acción de las levaduras produce compuestos secundarios como los α-ceto ácidos y α-hidroxi ácidos mono- y di-carboxílicos como el pirúvico, succínico, citramálico y láctico. Solo el éster etílico de éste último ácido puede tener influencia en el aroma de los vinos (Shinohara, 1984), pero sólo es producido en cantidades pequeñas por las levaduras. Compuestos carbonílicos Un gran número de estos compuestos se forman en el metabolismo de las levaduras por descarboxilación de los ácidos α-cetónicos formados en la biosíntesis de alcoholes superiores, pero solo permanecen en los vinos en cantidades muy pequeñas. Esta disminución es debida por la fuerte actividad reductora de las levaduras, y por la presencia de anhídrido sulfuroso y etanol, que reaccionan con los compuestos carbonílicos para formar compuestos azufrados y acetales (Bayonove et al., 1998). 74 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Los principales compuestos carbonílicos capaces de tener influencia en el aroma de los vinos son: acetaldehído, acetoína, diacetilo, 3-hidroxi-2-pentanona, 2,3-pentanodiona y piruvaldehído. Compuestos azufrados Los compuestos azufrados producidos por las levaduras en la fermentación poseen los siguientes grupos funcionales: tiol (mercaptanos), tiolester, mono- y polisulfuros, comunicando todas estas funciones olores intensos y generalmente negativos. El efecto sensorial de estas funciones disminuyen al aumentar el peso molecular De esta forma estos compuestos pueden dividirse en dos grupos: compuestos “ligeros” entre los que se encuentran ácido sulfhídrico, sulfuro de carbonilo, disulfuro de carbono, metil y etil mercaptano, siendo asociados con aromas defectuosos a ‘reducción’, ‘huevo podrido’; y compuestos azufrados “superiores”, entre los que se encuentran el 2-mercaptoetanol, 3metiltio-1-propanol, ácido 3-metiltiopropanoico y sus ésteres, cis- y trans-2-metiltiofan3-ol, 4-metiltiobutan-1-ol y otros (Rapp et al., 1984; Rapp et al., 1985a), siendo estos compuestos asociados con aromas más complejos (Etiévant, 1991). Lactonas Las lactonas son compuestos formados por la esterificación intramolecular de hidroxiácidos. Las lactonas más abundantes en el vino son las γ-lactonas, dentro de las cuales se encuentran las γ-butirolactona, 4-carboetoxi-γ-butirolactona y 4-etoxi-γ-butirolactona en mayor concentración, mientras en concentraciones menores se encuentrn la 2-hidroxi3,3-dimetil-γ-butirolactona (pantolactona) y la 2-hidroxi-3-metil-2-penteno-γ-lactona (sotolon), ver Figura 2.13. La influencia de estos compuestos en el aroma de los vinos es muy baja (Etiévant, 1991), con excepción de la γ-nonalactona (umbral de percepción 30 µg/L) en los vinos de algunas variedades (Nakamura et al., 1988), y el sotolon (umbral de percepción 1-15 µg/L) en los vinos de Jerez (Guichard et al., 1992) y en otras vinificaciones oxidativas. 75 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.13 Principales lactonas del vino. O O O O γ-butirolactona 4-carboetoxi-γ-butirolactona OH OH O O O O O pantolactona O sotolon Fenoles volátiles Los principales fenoles volátiles producidos por las levaduras Saccharomyces cerevisiae son el 4-vinilfenol y el 4-vinilguayacol, con aromas a ‘caucho’, ‘elastómero’ y ‘flor de datura’ el primero, y ‘especiado’ y ‘clavo de olor’ el segundo. Estos compuestos se producen por descaboxilación de los ácido cumárico y ferúlico (Figura 4.1), los cuales se encuentran en forma libre en muy baja concentración, y deben ser hidrolizados a partir de su esterificación con ácido tartárico y formas glicosidadas (Grando et al., 1993). Los contenidos de compuestos fenólicos volátiles es mayor en los vinos blancos debido a que en los vinos tintos su mayor concentración fenólica total inhibe la actividad cinamildecarboxilasa de la levadura (Chatonnet et al., 1993; Chatonnet et al., 1997). Aromas postfermentativos El contenido en compuestos volátiles presentes en un vino varía en forma importante durante su conservación, disminuyendo los aromas frutados de los vinos jóvenes y evolucionando hacia aromas más complejos (Gonzalez-Viñas et al., 1998; Pérez-Coello et al., 1999). Las principales modificaciones sobre las sustancias volátiles involucran a los esteres, terpenos, norisoprenoides, fenoles volátiles, compuestos azufrados y los derivados del furfural. En el Capítulo 4 se describirá la evolución durante la conservación de estos grupos de compuestos. Sin embargo, en este capítulo se discutirá sólo la evolución en la 76 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat conservación de dos importantes grupos que aportan características varietales, los terpenos y los norisoprenoides. Evolución de los terpenos La composición terpénica del vino es modificada sustancialmente durante la conservación como consecuencia de reacciones ácido-catalizadas, y por la hidrólisis de los terpenos presentes en forma glicosidada. La hidrólisis ácida de los monoterpenos glicosidados provoca un enriquecimiento en estos compuestos, siendo mayor este aumento para los alcoholes terciarios como el linalol. Esta diferencia en la cinética de reacción se puede explicar por la intervención de un catión terciario alílico muy estable en el mecanismo de hidrólisis del linalol (Voirin, 1990). Paralelamente, el medio ácido que aporta el vino genera la modificación molecular de los monoterpenos por diferentes reacciones (isomerización, ciclación, hidratación, deshidratación, oxidación). Estas reacciones producen otros polioles terpénicos, como el αterpineol y la 1,8-terpina (Figura 2.14), los cuales son termodinámicamente más estables (Rapp et al., 1985b; Voirin, 1990; Williams et al., 1982c). Varios dioles monoterpénicos identificados en la uva (Williams et al., 1980), los cuales no son volátiles y no presentan influencia en el aroma, reaccionan en medio ácido para producir terpenos de mayor volatilidad y por lo tanto con potencial aromático (Figura 2.15). Se ha detectado la formación de etoxi derivados de los principales alcoholes terpénicos (Versini et al., 1999b), producidos por la vía del equilibrio de carbocatión durante la hidrólisis de la formas glicosidadas (Strauss y Williams, 1983). 77 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.14 Algunas modificaciones moleculares de los alcoholes terpénicos en medio ácido. OH OH H+/H2O + OH (i) OH (iii) OH (ii) H+ OH CH2OH H+ CH2OH H+ CH2OH (vi) (v) (iv) H+/H2O H+/H2O (vii) H+/H2O H+/H2O OH CH2OH CH2OH CH2OH OH (viii) OH OH (ix) (x) (i) α-terpineol; (ii) trans-1,8-terpina; (iii) cis-1,8-terpina; (iv) nerol; (v) linalol; (vi) geraniol; (vii) citronelol; (viii) 7-hidroxi-6,7-dihidro nerol; (ix) 7-hidroxi-6,7-dihidro linalol; (x) 7-hidroxi-6,7-dihidro geraniol; (xi) 7-hidroxi-6,7-dihidro citronelol Adaptado de Rapp et al. (1985b) 78 OH (xi) Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.15 Productos volátiles de la hidrólisis ácida de monoterpenos polioles OH OH pH 3.2 + O OH (I) (2) (1) OH pH 3.2 + OH O O (3) (4) (II) OH pH 3.2 + O OH HO O HO OH (6) (5) (III) OH OH pH 3.2 + 70°C, 15 min + + OH OH (IV) OH (7) (10) (9) (8) + OH + O O (12) (13) OH (11) (I) 3,7-dimetil-1,5-octadien-3,7-diol; (II) 3,7-dimetil-1,7-octadien-3,6-diol; (III) 3,7-dimetil-1-octen-3,6,7-triol; (IV) 3,7-dimetil-1-octen-3,7-diol; (1) hotrienol; (2) óxido de nerol; (3) y (4) cis y trans-óxido anhidrofuránico de linalol; (5) y (6) cis y trans-óxido furánico de linalol; (7) miercenol; (8) linalol; (9) cis-ocimenol; (10) α-terpineol; (11) trans-ocimenol; (12) 2,6,6-trimetil-2-viniltetrahidropirano; (13) 2,2-dimetil-5-(metil propenil) tetrahidrofurano Adaptado de Vasserot et al. (1995) 79 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Evolución de los norisoprenoides Estos compuestos, que se encuentran principalmente en forma glicosidada en la uva, estan sometidos a reacciones catalizadas por ácidos, análogas a las citadas para los terpenos pudiendo producir, en consecuencia, compuestos aromáticos (Sefton et al., 1993; Skouroumounis y Sefton, 2000; Versini et al., 1996; Winterhalter, 1992). Figura 2.16 Formación de β-damascenona y 3-hidroxi-β-damascona a partir de distintos precursores por reacciones ácido-catalizadas. . ∆, H+ OH HO O OH O + HO OH ∆, H+ 3-hidroxi-β-damascona β-damascenona HO La primer reacción es rápida en el pH del mosto y da origen a la β-damascenona en la etapa prefermentativa, en cambio la segunda es lenta y ocurre durante la crianza del vino. Adaptado de Bayonove et al. (1998) La hidrólisis de precursores glicosidados, y el posterior rearreglo molecular, es el mecanismo seguido en la formación de varios de los norisoprenoides aromáticos de los vinos. En la Figura 2.16 se presenta, a modo de ejemplo, las reacciones de formación de la βdamascenona y de la 3-hidroxi-β-damascona, siendo este último producto no aromático (Sefton et al., 1993; Skouroumounis et al., 1992; Winterhalter et al., 1990b), y en la Figura 2.17 la formación del 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN) con aroma a keroseno y Riesling acetal con aroma frutal (Versini et al., 1996; Winterhalter, 1993). 80 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.17 Formación de TDN y Riesling acetal. OH O HO (1) O TDN HO OH (2) O O OH Riesling acetal O HO (3) (1) 3,6-dihidroxi-7,8-dihidro-α-ionona (2) 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-β-ionona (3) 3,9-dihidroxiteaspirano 81 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.18 Incidencia de la glicoconjugación del precursor del vitispirano, en el porcen- taje obtenido de este compuesto. OH O O OH O HO ∆, (15%) H+ HO OH OH 3,4-dihidroxy-7,8-dihidro-β-ionol OH O O OH OH HOH2C HO HO ∆, H+ O O O OH OH (> 90%) 3-O-β-D-glucosido de 3,4-dihidroxy-7,8-dihidro-β-ionol En agliconas con más de una función hidroxilo, la glicoconjugación no sólo afecta la velocidad de reacción, sino que además la mayor posibilidad de rearreglos para la formación de estructuras relacionadas, también determina la proporción relativa de cada uno de los distintos productos obtenidos (Winterhalter y Skouroumounis, 1997) Un ejemplo es la formación de vitispirano a partir de su precursor el 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-β-ionol (Figura 2.18). Técnicas analíticas de cuantificación de los compuestos aromáticos libres y ligados en el mosto y el vino. Uno de los mayores problemas, en la investigación de los compuestos responsables del aroma de los vinos, es la elección de la técnica de extracción que represente cualitativa y cuantitativamente al aroma original. Se han desarrollado muchos métodos tratando de 82 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat obtener un extracto que contenga todos los compuestos volátiles del vino original, sin tener alteración, degradación, o formación de artefactos. Sin embargo todos estos métodos presentan alguna ventaja y desventaja frente a los otros, pudiendo ser necesario realizar la combinación de diferentes métodos para obtener una extracción completa de todos los componentes volátiles del vino (Ortega-Heras et al., 2002). Entre las técnicas de extracción utilizadas en el análisis de los aromas del vino se encuentran las extracciones líquido-líquido, técnicas de análisis de “headspace”, extracción en fase sólida (SPE), y actualmente microextracción en fase sólida (SPME). A continuación se describirán brevemente estas técnicas, las cuales han sido discutidas en varios trabajos (Carlin, 1998; Ferreira et al., 2000; Ortega-Heras et al., 2002) y se han evaluado y utilizado en este trabajo. La extracción líquido-líquido sigue siendo la técnica de referencia para la extracción de los componentes volátiles en vino. En éste método, todos los compuestos volátiles tienen altos coeficientes de partición hacia la fase orgánica, pero se requiere una posterior evaporación del solvente, lo cual puede causar pérdidas o degradación de algunos compuestos, y formación de algunos que no se encontraban en la muestra original (Ortega-Heras et al., 2002). Las técnicas de extracción líquido-líquido insumen entre 10 y 20-24 horas, utilizando solventes más livianos que el agua como por ejemplo la mezcla pentanodiclorometano (2:1 v/v) (Drawert y Rapp, 1968; Moret et al., 1984), o más pesados como el Freon 11 (Marais, 1986; Rapp y Hastrich, 1976). El primer solvente tiene limitantes para su utilización, como son la presencia de impurezas de bajo punto de ebullición y presencia de trazas de ácido clorhídrico en el diclorometano que puede producir la formación de algunos artefactos durante la extracción; mientras que el segundo tiene menores coeficientes de extracción para los compuestos de alta polaridad (Carlin, 1998). La extracción de algunos compuestos puede mejorarse con el agregado de electrolitos como el cloruro de sodio (Soufleros y Bertrand, 1979). Desde hace unos 20 años se ha comenzado a difundir la extracción de los compuestos volátiles previo adsorción sobre una fase sólida, ya sea del tipo poliestirénico como la resina XAD-2, específicamente activada previo a su uso (Günata et al., 1985; Günata, 1984; Versini et al., 1987a), o del tipo C18, empacados en columna o como cartucho tipo SepPak (Di Stefano, 1991; Williams et al., 1982a). Esta técnica permite mediante una desorción selectiva separar los compuestos aromáticos libres y ligados para su posterior análisis. Actualmente se han estudiado una gran cantidad de fases de adsorción comer83 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat cialmente disponibles como las resinas Amberlite XAD-4, 7, y 16, soportes de base silica con C8, y C18; y en los últimos años se han introducido resinas modificadas del tipo Isolute ENV+. Estas últimas han sido estudiadas en la retención de las distintas familias de compuestos, remplazando satisfactoriamente a la técnica líquido-líquido (Carlin, 1998; Ferreira et al., 2000). Una nueva variación de técnica de adsorción, llamada microextracción en fase sólida (SPME), ha sido desarrollada en los últimos años (Arthur et al., 1992a; Arthur y Pawliszyn, 1990; Arthur et al., 1992b; Potter y Pawliszyn, 1992), utilizando dispositivos comercialmente disponibles. El componente clave de la SPME es una pieza en silica fundida (de aproximadamente 1 cm de largo) con un adsorbente como por ejemplo polidimetilsiloxano. Cuando la fibra SPME es sumergida en la muestra acuosa se produce un reparto de los compuestos entre la fase acuosa y la superficie de la fibra. Los compuestos adsorbidos en la fibra, pueden posteriormente desorberse térmicamente en el injector de un GC. También se ha reportado ésta técnica para muestreo de “headspace” (Zhang y Pawliszyn, 1993). Esta técnica ha sido utilizada en diferentes alimentos (Yang y Peppard, 1994) y vino (Carlin, 1998; Vas et al., 1998; Whiton y Zoecklein, 2000). Extracción en fase sólida La extracción en fase sólida (SPE) se presenta, por sus beneficios y ventajas sobre las técnicas tradicionales como la extracción líquido-líquido, como la técnica más potente disponible para la preparación rápida y selectiva de muestras, particularmente en las aplicaciones que se plantearán en este trabajo. A modo de ejemplo, en la Figura 2.19 se esquematizan los procedimientos para conseguir la adsorción y desorción de los compuestos volátiles libres y ligados en una muestra de mosto o vino, mediante la utilización de un cartucho ISOLUTE ENV+. Las características de las dos fases utilizadas en este trabajo, resina Amberlite XAD-2 e Isolute ENV+, se describen a continuación. Amberlite XAD-2 Esta resina de base poliestirénica y tamaño de partícula 50-80 mesh presenta un excelente capacidad de adsorción de los terpenos libre en el jugo de uva, permitiendo además una separación de la fracción ligada (Günata et al., 1985). Esta resina, que presenta una capacidad de retención similar a las de tipo sílica C18, tiene la ventaja de tener un tamaño de 84 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat partícula mayor, y posibilitar por lo tanto el uso en columnas preparativas a presion atmosférica. Presenta rendimientos en la adsorción de glicosidos mucho mayor que las técnicas de extracción con solventes; siendo además posible eliminar numerosas sustancias interferencias como azúcares y ácidos por simple lavado con agua, sin pérdida de los analitos (Günata et al., 1985; Günata, 1984). La elección del solvente para la elución de la fracción libre debe tener en cuenta el compromiso entre solventes más polares, como el diclorometano con el que se obtiene una buena remoción pero que eluye además parte de los glicósidos, y en el otro extremo, el pentano, que no eluye glicósidos pero tampoco recupera totalmente las formas libres. Sin embargo este último solvente es igualmente recomendado por algunos autores para su utilización en las extracciones (Günata et al., 1985; Voirin et al., 1992), o con mejores resultados, la mezcla pentano-diclorometano, 2:1 v/v (Versini et al., 1987a; Versini et al., 1994a), que presenta mayor capacidad de elución. La recuperación de la fracción ligada se realiza con la mezcla acetato de etilo-metanol, 9:1 v/v, teniendo el acetato de etilo puro un buen porcentaje de recuperación de los glicósidos de los alcoholes terpénicos, pero una baja recuperación de los glicósidos de los alcoholes aromáticos (Voirin et al., 1992). Comparaciones realizadas entre los resultados obtenidos con extracción líquido-líquido con Freon 11 como solvente y extracción en fase sólida XAD-2 utilizando como eluyente de la fracción libre la mezcla pentano-diclorometano, obtuvieron valores de coeficiente de variación comparable para la mayoría de los compuestos, pero sin embargo valores menores de recuperación en el caso de la extracción en fase sólida, presentando una mejor recuperación los compuestos de cadena corta y mayor polaridad que los monoterpenoles (Boido et al., 1999; Carlin, 1998). En esta experiencia se verificó además la repetitibilidad del análisis de los compuestos glicosidados después de la hidrólisis enzimática, obteniéndose valores de los coeficientes de variación que oscilan entre 5 y 45% (Carlin, 1998), sin embargo otros autores han reportado coeficientes de variación menores (Voirin et al., 1992), aunque sin trabajar con algunos terpenos importantes como los óxidos furánicos y piránicos del linalol, o los dioles I y II. Cartucho ISOLUTE ENV+ En este caso, la resina polimérica del tipo estireno divinil benzeno, similar a la XAD-2, se presenta en la froma de cartuchos. Respecto a la resina XAD-2, presenta grandes modificaciones en su estructura, siendo un medio adsorbente muy hidrofóbico especialmente 85 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat derivatizado con la presencia de grupos fenoles (Figura 2.20), lo que le confiere una superficie fácilmente hidrofílica (“mojable”), eliminando la necesidad del acondicionamiento previo en el uso con soluciones acuosas, y presentando una gran capacidad de adsorción (IST, 2001). Figura 2.19 Esquema del procedimiento de retención y elución de los distintos compues- tos aromáticos del vino para el caso del cartucho ISOLUTE ENV+. 1 Interferencias 2/3 4 comp. libres 5 6 7 y ligados 1 – Pretratamiento de la muestra. En el caso del vino no es necesario, se utiliza la muestra diluída al medio. 2/3 – La fase ENV+ puede ser usada para el vino sin realizar la etapa de solvatación y equilibrio, sin embargo es recomendable realizar un lavado de la fase con solventes miscibles en agua como el metanol, con lo cual se logra la eliminación de interferencias, debiendo realizar un posterior lavado con agua. 4 – Pasaje de la muestra, 4-5 mL/min. 5 – Elución de interferencias con agua. 6 – Elución de los compuestos volátiles libres con diclorometano, recuperándose para su análisis. 7 – Elución de los compuestos glicosidados con metanol, recuperándose para su análisis. 86 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.20 Estructura de la fase utilizada en el cartucho ISOLUTE ENV+, con base en el polímero de poliestireno derivatizado. Adaptado de International Sorbent Technology (2001) Figura 2.21 Esquema de los mecanismos de retención y elución en el cartucho ISOLU- TE ENV+. RETENCIÓN ELUCIÓN Interacciones hidrofóbicas entre el analito y la superficie del polímero, retienen al analito durante la carga. Un solvente que puede interrumpir las interacciones hidrofóbicas, como el metanol, eluye al analito. Adaptado de International Sorbent Technology (2001) 87 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat El mecanismo de retención está dado principalmente por la acción de fuerzas de Van der Waals, mediante interacciones hidrofóbicas entre la molécula retenida y la superficie de la resina. En la elución, el solvente - por ejemplo metanol - interrumpe estas interacciones hidrofóbicas con la superficie, y permite la elución del analito (Figura 2.21). En este trabajo, dada la alta capacidad de retención de la resina, la elución de los compuestos aromáticos libres del vino con la mezcla pentano-diclorometano tiene un bajo porcentaje de recuperación, por lo que se optó por el diclorometano con el cual las pérdidas se reducen a un 2-5%, siendo del orden del valor de repetitividad. De igual manera fué necesario utilizar metanol, y no la mezcla acetato de etilo-metanol, como solvente para la elución de los compuestos glicosidados (Boido et al., 2001a; Boido et al., 2001b; Carlin, 1998). La comparación de las cantidades recuperadas de los compuestos volátiles libres utilizando resina XAD-2 y ENV+ ha sido realizada por Carlin (1998), teniendo los siguientes resultados principales: - los dos métodos son comparables en la recuperación de los compuestos poco polares, como ser los ésteres de cadena alifática, alcoholes monofuncionales de cadena alifática con número de átomos de carbono mayor a seis, monoterpenoles y alcohol β-fenil etílico. En este último caso con una mayor capacidad de saturación en XAD- 2, pudiendo producirse pérdidas importantes si se alcanza la saturación del soporte. - los compuestos polares presentaron un menor porcentaje de recuperación cuando se utilizó resina XAD-2, como son el lactato de etilo, ácidos grasos de cadena corta como el isobutílico y butílico, monoacetato de 1,3-propanodiol y 3-metiltio-1propanol, así como también para el 4-hidoxibutirato de etilo, succinato ácido de etilo, 4-carboetoxi-γ-butirolactona, alcohol isoamílico, ácido isovalérico y 2hidroxiglutarato de dietilo. En el caso de la comparación de la retención para los compuesto ligados, ambos métodos presentaron valores similares, con menores valores de retención para los ácidos alifáticos de 6 a 10 carbonos y el alcohol bencílico cuando se utiliza resina XAD-2. Objetivo El objetivo del trabajo en relación a esta etapa, ha consistido en evaluar una serie de técnicas extractivas y ajustar la metodología analítica con el objetivo de utilizarlas en el 88 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat desarrollo global del trabajo propuesto en el estudio de los aromas en el vino Tannat. En este sentido se propone: • ajustar las técnicas de extracción a utilizar en las investigaciones de los componentes volátiles de interés • crear una base de datos con los índices de retención linear y espectros de masa de compuestos volátiles del vino, de origen varietal y fermentativo, para facilitar la identificación y cuantificación de los compuestos aromáticos en las etapas siguientes de la tesis • determinar de esta forma el perfil característico de los compuestos aromáticos libres y ligados para los vinos de la variedad Tannat. Materiales y métodos Vinos utilizados para los análisis Se utilizaron vinos provenientes de la variedad Tannat, obtenidos en microvinificaciones en la vendimias 1998 y 1999. Los uvas utilizadas en todos los casos provienen de viñedos del sur del país (Canelón Chico y Santa Lucía, ambos del departamento de Canelones). En las distintas microvinificaciones se utilizaron uvas provenientes de los clones 398, 399 y 475 del ENTAV (Francia), y el clon #1 de la Foundation Plant Material Service (California, USA), todas las plantas se encuentran sobre portainjerto SO4, excepto el clon 399 que se encuentra sobre el protainjerto R110. Extracción de los compuestos volátiles Se utilizaron técnicas de extracción en fase sólida, mediante el uso de resina XAD-2 en columna y cartuchos ISOLUTE ENV+. Los resultados comparativos de estas dos técnicas en la retención de los distintos compuestos volátiles, libres y ligados, para vinos de la variedad Tannat se presentan en las Figuras 2.22 y 2.23. Estos resultados mostraron un comportamiento similar a los obtenidos en trabajos con la variedad Traminer (Carlin, 1998), presentando mejor retención para la mayoría de los compuestos el sistema de cartuchos ISOLUTE ENV+. A pesar de los mejores resultados obtenidos con los cartuchos ISOLUTE ENV+, no se disponía de este sistema al inicio del trabajo de tesis, por lo cual parte de los ensayos se realizaron mediante extracciones con resina XAD-2, y se describirán a continuación las dos técnicas. 89 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Extracción con resina Amberlite XAD-2 La extracción se realizó mediante resina XAD-2 en columna, utilizando el método puesto a punto por Günata et al. (1985) y modificado por Versini et al. (1994a). Para el fraccionamiento se utilizó una columna de vidrio de 1 cm de diámetro y aproximadamente 40 cm de alto, rellena con 5 g de resina Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas, Filadelfia, USA). La resina se activó mediante percolación sucesiva de 150 mL de metanol, 40 mL de eter etílico y 100 mL de agua destilada. Se extrajeron los aromas libres y ligados de 100 mL de vino adicionados de 0.2 mL de n-heptanol como estándar interno (solución hidroalcoholica al 50% con concentración 0.229 g/L) y diluidos a 200 mL con agua destilada. Se eluyeron posteriormente 100 mL de agua destilada para eliminar posibles residuos, y la fracción de compuestos en forma libre se eluyó con 100 mL de la mezcla azeotrópica de pentano-diclorometano 2:1 v/v. Se recogió el solvente orgánico, se anhidrificó con Na2SO4, se concentró hasta aproximadamente 3-4 mL en baño termostatizado a 40°C y previo al análisis cromatográfico se concentró hasta aproximadamente 0.5 mL mediante corriente de N2. Los compuestos en forma ligada se eluyeron con 100 mL de acetato de etilo-metanol, 9:1 v/v. Se anhidrificó con Na2SO4 y se llevó a sequedad en rotavapor, el residuo se retomó con 3 mL de buffer citrato (pH 5) y se adicionó una gota de enzima Cytolase PLC 5 (Gist-Brocades, Lille Cédex, France)). Se dejó reaccionar por 14 horas a 40°C, se agregó 0.1 mL de estandar interno (n-heptanol) y se extrajo con 3 x 2 mL de pentano-diclorometano, 2:1 v/v, centrifugando cada vez para facilitar la separación de las fases. El estrato se anhidrificó, y previo al análisis cromatográfico, se concentró hasta 0.5 mL mediante corriente de N2. Extracción con cartucho ISOLUTE ENV+ La extracción se realizó mediante cartucho ISOLUTE ENV+ según el método puesto a punto por Carlin (1998) y adaptado para vinos Tannat por Boido et al. (2001a; 2001b). 90 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.22 Comparación de los valores analíticos de los compuestos de la fracción libre, obtenidos mediante uso de las técnicas de extracción por columna con resina XAD-2 y cartucho ISOLUTE ENV+. Recuperación de los compuestos con XAD2, expresados como porcentaje respecto a los valores obtenidos en la extracción con cartucho. 39 38 37 36 35 34 1 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 Traminer (IT) 8 Tannat (UY) 7 6 5 4 3 2 1 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 91 33 0% Compuesto Tannat Traminer 1 acetato de isobutilo 92% 2 acetato de isoamilo 85% 103% 3 acetato de hexilo 90% 132% 4 acetato de β-feniletilo 124% 105% 5 caproato de etilo 98% 93% 6 caprilato de etilo 109% 72% 7 caprato de etilo 83% 59% 8 lactato de etilo 17% 22% 9 4-hidroxibutanoato de etilo 35% 33% 10 malato de dietilo 70% 11 succinato de dietilo 37% 92% 12 succinato ácido de etilo 25% 26% 13 alc. isobutilico 72% 14 1-butanol 18% 22% 15 alc. isoamílico 71% 80% 16 1-pentanol 65% 17 4-metil-1-pentanol 57% 18 3-metil-1-pentanol 20% 19 3-etoxi-1-propanol 13% 20 alc. bencilico 72% 82% 21 alc. β-feniletilico 91% 96% 22 3-metiltio-1-propanol 28% 23% 23 hexanol 102% 102% 24 trans-3-hexen-1-ol 84% 88% 25 cis-3-hexen-1-ol 88% 79% 26 ác. 2-metil propanoico 22% 21% 27 ác. 2- y 3-metil butanoico 49% 90% 28 ác. butanoico 21% 18% 29 ác. hexanoico 93% 98% 30 ác. octanoico 115% 98% 31 ác. decanoico 112% 89% 32 γ-butirolactona 13% 33 4-vinilguayacol 86% 98% 34 4-vinilfenol 91% 117% 35 linalol 87% 36 α-terpineol 93% 37 geraniol 100% 38 ho-diol (I) 82% 39 ácido trans-geránico 66% 1 datos obtenidos de 3 repeticiones para cada técnica 2 datos adaptados de Carlin (1998) 2 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.23 Comparación de los valores analíticos de los compuestos de la fracción ligada, obtenidos mediante uso de las técnicas de extracción por columna con resina XAD-2 y cartucho ISOLUTE ENV+. Recuperación de los compuestos, expresados como porcentaje respecto a los valores obtenidos en la extracción con cartucho. 20 19 18 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Compuesto alcohol isoamílico hexanol alcohol bencílico alcohol β-fenil etílico 3-oxo-α-ionol oxido A oxido B oxido C oxido D linalol α-terpineol citronelol nerol geraniol ho-diolo (I) hidroxi citronelol trans-8-hidroxilinalol cis-8-hidroxilinalol 7-hidroxigeraniol ac trans-geránico Tannat1 64% 39% 90% 86% 88% 110% 115% 92% 88% 96% 75% 72% Traminer2 63% 88% 46% 106% 107% 88% 87% 87% 77% 100% 90% 98% 106% 98% 118% 69% 82% 70% 80% 85% 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 1 datos obtenidos de 3 repeticiones para cada técnica 2 datos adaptados de Carlin (1998) 4 Traminer (IT) 3 Tannat (UY) 2 1 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 92 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Se fraccionaron los aromas libres y ligados de 50 mL de vino, diluidos a 100 mL y adicionados de 0.1 mL de n-heptanol como estandar interno (solución hidroalcoholica al 50% con concentración 0.229 g/L), con cartuchos Isolute (IST Ltd, Mid Glamorgan, UK) ENV+ con 1 g de SDVB (estireno divinil benzeno) polímero (40-140 mm, cod. n° 915-0100-C). Previo al pasaje de la muestra el cartucho se acondicionó eluyendo 15 mL de metanol, seguido de 20 mL de agua. La fracción libre se eluyó con 30 mL de diclorometano, adaptando un sistema de depresión controlada para tener un flujo de 4-5 mL/min. Se recogió el solvente orgánico con la fracción libre, se anhidrificó con Na2SO4, se concentró hasta aproximadamente 3-4 mL en baño termostatizado a 40°C y previo al análisis cromatográfico se concentró hasta aproximadamente 0.5 mL mediante corriente de N2. Los compuestos en forma ligada se eluyeron con 30 mL de metanol. Se recogió el solvente, se anhidrificó con Na2SO4 y se llevó a sequedad en rotavapor, el residuo se retomó con 3 mL de buffer citrato (pH 5) y se adicionó una gota de enzima Cytolase PLC 5 (Gist-Brocades, Lille Cédex, France). Se dejó reaccionar por 14 horas a 40°C, se agregó 0.1 mL de estandar interno (n-heptanol) y se extrajo con 3 x 2 mL de pentanodiclorometano 2:1 v/v, centrifugando cada vez para facilitar la separación de las fases. El extracto se anhidrificó y concentró hasta 0.5 mL mediante corriente de N2, previo al análisis cromatográfico Los cartuchos, de acuerdo a los ensayos de recuperación realizados con mezclas modelo, se utilizaron para la extracción de 10 muestras y luego se descartaron. Identificación de los compuestos aromáticos. La identificación se realizó mediante GC-MS con un gascromatógrafo Shimadzu GC-17 acoplado con un detector de espectrometría de masa Shimadzu QP 5050. Las condiciones de trabajor fueron: columna capilar de silica fundida (25 m x 0.25 mm d.i.), fase estacionaria BP 20 (film de 0,25 µm de espesor) (SGE, Australia); programa de temperatura 40°C (6 min), 40-180°C a 3°C/min, 180-220°C a 10°C/min, 220°C (20 min); temperatura del inyector, 250°C; modo de inyección split, relación de split 1:40, volumen inyectado, 1.0 µL. Gas portador He, 92.6 kPa (55.9 cm/seg); temperatura de interface 250°C; rango de masas 40-400 uma. La identificación se realizó mediante bibliotecas de espectros de referencia (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991) y librería propia realizada con estándares y datos reportados en la literatura. La identificación de los compuestos se confirmó por medio de 93 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat la determinación de índices de retención de Kovats, obtenidos mediante la inyección de un estandar del compuesto y la mezcla de n-alcanos. Cuantificación de compuestos aromáticos Se realizó por medio de HRGC, en un cromatógrafo Carlo Erba 2900, equipado con detector de ionización de llama (FID) y software de procesamiento de datos Shimadzu EZChrom. Se utilizaron las mismas condiciones descriptas en la identificación por GC-MS. Temperatura del inyector 250°C, temperatura del detector 280°C; modo de inyección split, relación de split 1:30, volumen inyectado 0.5 µL. Resultados y discusión En las Figuras 2.24a y 2.25 se muestran cromatogramas típicos obtenidos por GC-MS (TICs –corriente iónica total-) para las fracciones libre y ligada de vinos Tannat. En la Figura 2.26, se presenta el cromatograma obtenido de la extracción de los compuestos ligados en uva Tannat. En la Tablas 2.3 y 2.4 se presenta el listado de los compuestos identificados en el perfil de compuestos aromáticos libres y ligados respectivamente. Se indica además el índice de retención lineal para cada compuesto y el método por el cual se asignó la identificación a cada pico. En las condiciones utilizadas no se resuelve la separación de los alcoholes 2- y 3-metil-1-butanol, apareciendo ambos en un mismo pico, la relación de concentraciones es minoritaria para el 2-metil-1-butanol, por lo tanto en todos los resultados presentados en este trabajo la concentración determinada para este pico se informó como 3-metil-1-butanol o alcohol isoamílico. En la Figura 2.27 se muestran los espectros obtenidos para los principales norisoprenoides identificados en uvas y vinos. En las Tablas 2.5 y 2.6 se presentan los resultados obtenidos para los análisis de las fracciones libre y ligada de los vinos producidos con distintos clones de Tannat. Se presentan por separado los resultados obtenidos en las muestras del año 1998 y 1999, usándose diferente técnica de extracción en cada uno de estos años. 94 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.24a Perfil gascromatográfico de la fracción libre, extracción con cartucho ISO- LUTE ENV+, de un vino Tannat (clon 398), obtenido en columna capilar de silica fundida, fase estacionaria BP 20 (SGE, Australia). 95 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.24b Evidencia de la presencia de los compuestos norisoprenoides (a) 3-oxo-α- ionol y (b) vomifoliol en el perfil cromatográfico de la fracción libre. La identificación se realiza utilizando GC-MS, mediante la búsqueda de los iones específicos, m/z 108 para el primero y 124 para el segundo. (a) TIC m/z 108 TIC (b) m/z 124 96 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 2.3 Listado de los compuestos aromáticos libres identificados en vinos de la varie- dad Tannat. Pico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Compuesto acetato de isobutilo 2-metil-1-propanol acetato de isoamilo 1-butanol 2- y 3-metil-1-butanol caproato de etilo 1-pentanol acetato de hexilo 4-metil-1-pentanol 3-metil-1-pentanol lactato de etilo 1-hexanol trans-3-hexen-1-ol cis-3-hexen-1-ol 3-etoxi-1-propanol trans-2-hexen-1-ol caprilato de etilo 1-heptanol 3-hidroxibutanoato de etilo ácido 2-metilpropanoico lactato de isoamilo γ-butirolactona ácido butanoico caprato de etilo ácido 2- y 3-metil butanoico succinato de dietilo 3-metiltio-1-propanol acetato de β-feniletilo 4-hidroxibutanoato de etilo ácido hexanoico alcohol bencílico alcohol β-feniletílico pantolactona malato de dietilo ácido octanoico 4-carboetoxi-γ-butirolactona 4-vinilguaiacol 2-hidroxiglutarato de dietilo fenil lactato de etilo ácido decanoico succinato ácido de etilo 4-vinilfenol 1 IRL1 1015 1093 1125 1155 1221 1237 1260 1275 1328 1341 1353 1368 1374 1382 1395 1410 1436 1468 1527 1608 1614 1624 1670 1684 1705 1714 1725 1815 1822 1845 1882 1918 2028 2058 2072 2168 2180 2195 2249 2261 2370 2377 identificación2 A A A A A A B A B B A A A A B B A ESTANDAR A B B A B B A A B A B A A A B A A B A B B B B A índice de retención linear identificación por: A, comparación de los índices de retención y espectro de masa con estándares auténticos; B, comparación de los índices de retención y espectro de masa de bibliografía (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991). 2 97 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Figura 2.25 Perfil gascromatográfico de la fracción ligada, extracción con cartucho ISOLUTE ENV+, de un vino Tannat (clon 398), obtenido en columna capilar de silica fundida, fase estacionaria BP 20 (SGE, Australia). 98 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.26 Perfil gascromatográfico de la fracción ligada, extracción con resina XAD-2 en columna, de una muestra de uva Tannat (clon 398), obtenido en columna capilar de silica fundida, fase estacionaria BP 20 (SGE, Australia). 99 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Tabla 2.4 Listado de los compuestos aromáticos ligados identificados en uvas y vinos de la variedad Tannat. Pico Compuesto IRL1 identificación2 1 2-metil-1-propanol 1093 A 2 3-metil-1-butanol 1221 A 3 1-pentanol 1260 B 4 1-hexanol 1368 A 5 cis-3-hexen-1-ol 1382 A 6 trans-2-hexen-1-ol 1410 B 7 óxido A (óxido trans-furánico del linalol) 1449 A 8 1-heptanol (estandar) 1468 ESTANDAR 8ª óxido B (óxido cis-furánico del linalol) 1474 A 9 linalol 1558 A 10 1718 A α-terpineol 11 óxido C (óxido trans-piránico del linalol) 1739 B 12 salicilato de metilo (2-hidroxibenzoato de metilo) 1753 B 13 óxido D (óxido cis-piránico del linalol) 1763 B 14 nerol 1810 A 15 ácido hexanoico 1845 A 16 geraniol 1860 A 17 alcohol bencilico 1882 A 18 1916 A alcohol β-feniletilico 19 hodiol I (trans-3,7-dimetil-1,5-octadien-3,7-diol) 1969 B 19a endiol (3,7-dimetil-1-octen-3,7-diol) 1992 C 20 fenol + o-cresol 2000 B 21 ácido octanoico 2072 A 22 4-vinilguaiacol 2180 A 23 8-hidroxi-6,7-dihidrolinalol 2219 C 24 ácido decanoico 2261 B 25 trans-8-hidroxilinalol (trans-3,7-dimetil-1,6-octadien-3,8-diol) 2270 B 26 7-hidroxigeraniol 2300 C 27 cis-8-hidroxilinalol (cis-3,7-dimetil-1,6-octadien-3,8-diol) 2310 B 28 ácido transgeránico (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-oico) 2329 B 29 4-vinilfenol 2377 A 30/31 isómeros del 3,4-dihidro-3-oxoactinidol 2456/66 B 32 p-1-menten-7,8-diol 2528 C 33 2537 B 3-hidroxi-β-damascona 34 vanillato de metilo 2586 B 35 2651 B 3-oxo-α-ionol 36 2658 B 4-oxo-β-ionol 37 2694 B 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol 38 2726 B 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol 39 zingerona 2779 B 40 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1-propanol 2970 C 41 2,5-dihidroxibenzoato de metilo 2993 B 42 tirosol (2-(4-hidroxifenil)etanol) 2999 C 43 3,4,5-trimetoxifenol 3049 B 44 grasshoper cetona 3165 B 45 vomifoliol 3167 B 46 7,8-dihidrovomifoliol 3262 B 1 índice de retención linear 2 identificación por: A, comparación de los índices de retención y espectro de masa con estándares auténticos; B, comparación de los índices de retención y espectro de masa de bibliografía (Adams, 1995; Bureau et al., 2000; Marais et al., 1992; McLafferty y Stauffer, 1991; Wirth et al., 2001); C, tentativa por espectro de masa. 100 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 2.27 Espectros de masa de los principales norisoprenoides identificados en uvas y vinos de la variedad Tannat. O 3-hidroxi-β-damascona HO 3-oxo-α-ionol OH O OH 4-oxo-β-ionol O OH 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol O OH 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol O OH vomifoliol OH O . grasshopper cetona OH HO 101 O Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Tabla 2.5 Compuestos aromáticos en forma libre presentes en vinos experimentales producidos con uvas de distintos clones de la variedad Tannat, de las vendimias correspondientes a los años 1998 (resina XAD2) y 1999 (cartucho ISOLUTE ENV+). Valores medios de 6 muestras de vinos del clon 398 año 1998, y 3 muestras de todos los demás clones; solo se analizó 1 muestra del clon 399 año 1998. Valores en µg/L. Compuesto Esteres acetato de isobutilo acetato de isoamilo acetato de hexilo acetato de β-fenil etilo caproato de etilo caprilato de etilo caprato de etilo piruvato de etilo lactato de etilo lactato de isoamilo 3-hidroxibutanoato de etilo 4-hidroxibutanoato de etilo malato de dietilo succinato de dietilo succinato ácido de etilo fenil lactato de etilo 2-hidroxiglutarato de etilo Alcoholes alcohol isobutilico 1-butanol alcohol isoamílico 1-pentanol 4-metil-1-pentanol 3-metil-1-pentanol 3-etoxi-1-propanol alcohol bencilico alcohol β -fenil etilico 3-metiltio-1-propanol Compuestos C6 hexanol trans-3-hexen-1-ol cis-3-hexen-1-ol trans-2-hexen-1-ol Ácidos ácido propanoico ác.butanoico ác. 2-metil propanoico2 ác. 3-metil propanoico ác.hexanoico ác.octanoico ác.decanoico Terpenos α-terpineol citronelol nerol geraniol ho-diol (I) limoneno Otros compuestos benzaldehido acetoína 4-vinilguaiacol 4-vinilfenol γ-butirolactona pentolactona 4-carboetoxi-γ-butirolactona 1 475 398 vendimia 1998 399 #1 media (desv.est.) nd1 210 13 96 104 35 12 29 2249 nd 77 768 303 1140 9167 359 251 nd 245 21 78 148 76 21 43 1469 nd 66 609 128 413 3948 200 167 nd 146 24 182 307 89 104 46 796 nd 69 1569 244 972 7180 538 182 nd 151 14 32 151 33 5 26 1986 nd 94 1191 302 585 8158 311 221 nd 59 108855 31 19 76 13 89 56407 376 nd 52 58542 42 16 46 75 97 25919 223 nd 57 136764 139 28 119 0 92 88679 257 nd 83 99398 37 12 54 37 104 40200 241 1002 22 36 52 1734 33 62 48 1149 26 37 37 1235 17 39 48 1405 (537) 26 (10) 49 (18) 48 (14) nd 98 320 749 1020 767 43 nd 83 234 380 1200 1029 34 nd 44 203 773 831 906 nd nd 108 323 450 963 880 54 11 9 nd 0 14 nd 11 11 8 28 34 nd 12 13 nd 17 nd nd nd nd 24 nd 56 14 272 nd nd 20 nd 47 8 119 nd nd nd nd 69 nd 102 nd 208 (67) 18 (17) 79 (53) 150 (80) 58 (33) 22 (26) 36 (20) 1716 (983) nd 75 (18) 854 (351) 218 (97) 663 (395) 6372 (3194) 288 (126) 200 (69) 475 vendimia 1999 398 399 media (desv.est.) 748 893 42 195 362 196 93 30 16757 114 238 4445 135 205 10863 374 285 419 777 17 85 392 141 51 20 10755 88 153 2798 66 139 7627 278 142 445 635 22 123 308 142 66 18 15884 140 139 4810 124 214 9168 317 156 537 (237) 768 (258) 27 (16) 135 (54) 354 (120) 160 (38) 70 (24) 23 (19) 14465 (10724) 114 (43) 177 (50) 4018 (1095) 109 (49) 186 (47) 9219 (3849) 323 (139) 194 (112) nd 6610 61 (17) 899 85598 (29777) 168054 46 (35) 85 17 (11) 58 60 (25) 196 46 (52) 258 96 (29) 110 41078 (21002) 46870 265 (103) 1723 5058 262 89484 65 26 114 222 53 21865 933 9137 521 83097 83 28 84 377 11 27278 1071 6935 (2200) 561 (447) 113545 (54231) 78 (30) 37 (16) 131 (67) 285 (86) 58 (45) 32004 (12011) 1242 (396) 1132 32 64 122 682 20 37 39 898 21 46 68 904 (254) 24 (6) 49 (15) 76 (47) nd 90 (52) 272 (97) 512 (187) 1075 (246) 925 (252) 40 (15) 52 383 545 1044 1522 1673 81 56 293 428 621 1038 983 28 80 407 791 631 1175 1015 45 63 (18) 361 (80) 588 (193) 765 (223) 1245 (256) 1224 (361) 51 (41) 14 11 10 nd 35 nd 12 (6) 11 (3) 9 (6) 21 (18) 29 (16) nd nd nd nd 49 63 138 nd nd nd 20 29 64 nd nd nd 35 55 56 nd nd nd 35 (29) 49 (18) 86 (78) nd nd 29 nd 72 34 337 nd nd 23 (18) nd 57 (31) 16 (23) 203 (129) 44 35 33 112 389 78 131 41 20 19 22 305 48 96 130 30 35 48 694 104 116 71 (44) 29 (15) 29 (17) 61 (52) 463 (211) 76 (29) 114 (19) nd, no determinado; 2 suma de ácido 2-metil propanoico+lactato de isoamilo en las muestras del año 1998. 102 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 2.6 Compuestos aromáticos en forma ligada presentes en vinos experimentales producidos con uvas de distintos clones de la variedad Tannat, de las vendimias correspondientes a los años 1998 (extracción con resina XAD-2) y 1999 (extracción con cartucho ISOLUTE ENV+). Valores medios de 6 muestras de vinos del clon 398 año 1998, y 3 muestras de todos los demás clones; solo se analizó 1 muestra del clon 399 año 1998. Valores en µg/L. vendimia 1998 Compuesto vendimia 1999 475 398 399 #1 media 475 398 399 media linalol 2.1 1.7 2.0 3.2 2.1 (1.0) 10.3 6.7 7.2 8.2 (4.3) hotrienol 5.9 7.1 5.8 10.1 7.2 (3.6) 3.7 3.3 6.9 4.5 (2.2) α-terpineol 4.1 6.5 3.3 6.0 5.6 (3.8) 11.4 10.1 6.1 9.6 (5.9) oxido A nd 1 nd nd nd nd 15.2 11.0 11.8 12.8 (6.6) oxido B nd nd nd nd nd 39.9 41.3 24.1 35.8 (16.8) Terpenos oxido C nd nd nd nd nd 14.5 11.5 9.7 12.2 (6.0) citronelol 0.9 0.9 3.8 2.1 1.5 (1.0) 8.6 5.1 4.9 6.3 (4.1) nerol 5.0 9.7 2.6 9.0 7.7 (7.2) 30.8 25.5 31.7 29.3 (13.8) geraniol 10.0 8.8 37.5 12.5 12.1 (9.2) 31.7 28.2 18.1 26.0 (14.4) cis-8-hidroxilinalol 24.4 23.7 13.4 16.3 21.6 (12.0) 77.5 79.6 63.9 73.7 (37.0) trans-8-hidroxilinalol 24.3 23.1 39.1 31.1 26.8 (19.9) 108.4 138.6 61.9 103.0 (56.2) 7-hidroxigeraniol 7.4 7.2 nd 4.2 6.4 (5.3) 5.1 8.6 2.4 5.8 (2.9) ác. trans-geránico 30.5 13.2 8.8 17.9 15.7 (8.6) 6.4 5.6 6.9 6.3 (4.2) Derivados del ác.shiquímico alcohol bencílico 289.4 279.8 144.9 131.4 237.4 (138.5) 1232.4 1099.1 1194.8 1175.5 (552.0) alcohol β-feniletílico 314.5 234.0 269.8 193.4 245.9 (109.9) 1122.6 859.1 1139.3 1040.3 (602.2) 4-vinilguaiacol nd nd nd nd nd 6.9 8.2 4.0 6.7 (3.9) 4-vinilfenol 2,5-dihidroxibenzoato de metilo nd nd nd nd nd 25.1 18.7 7.8 18.3 (14.7) 15.7 17.0 nd nd 16.4 (6.5) nd nd nd 63.8 45.6 63.4 64.2 55.4 (24.1) trans-3-hexen-1-ol 1.1 0.8 1.0 1.6 1.1 (0.7) 5.5 9.5 5.7 6.7 (4.8) cis-3-hexen-1-ol 14.3 9.2 12.9 19.4 13.0 (7.3) 58.9 43.5 38.5 48.0 (26.3) trans-2-hexen-1-ol 15.7 9.7 14.1 15.8 12.9 (6.2) 27.8 29.7 23.7 27.5 (11.8) nd Alcoholes C6 hexanol 203.2 202.3 180.3 197.2 (88.7) Norisoprenoides 3-hidroxi-β-damascona 154.0 140.7 nd nd 147.4 (59.1) 496.0 407.4 407.1 436.8 (233.5) 3-oxo-α-ionol 153.0 149.9 nd nd 151.1 (56.7) 550.6 697.0 500.0 582.5 (276.4) 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol 74.3 66.0 nd nd 71.0 (46.3) 182.8 205.2 223.2 203.6 (137.5) 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol 66.5 59.6 nd nd 61.9 (15.7) 260.1 309.3 335.8 300.8 (232.1) 1 nd, no determinado 103 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Tabla 2.7 Compuestos aromáticos ligados determinados en vinos producidos con el clon 398 de la variedad Tannat (valores medios para cuatro muestras ± desviación estándar). Extracción mediante cartucho ISOLUTE ENV+, cuantificación por GC-MS mediante relación de áreas con la fragmentación m/z 70 del estandar interno (n-heptanol). Compuestos aromáticos Concentración 2 Alcoholes 3-metil-1-butanol 13.0 ± 3.6 1 1.4 ± 0.5 hexanol (m/z 56) cis-3-hexenol 1.2 ± 0.6 tans-2-hexenol 0.9 ± 0.1 Terpenos α-terpineol 0.3 ± 0.2 oxido A (m/z 59)1 0.1 ± 0.1 1 oxido B (m/z 59) 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.3 oxido C oxido D 0.3 ± 0.4 0.8 ± 0.8 nerol geraniol 1.1 ± 0.7 3.7 ± 2.2 trans-8-hidroxilinalol cis-8-hidroxilinalol 1.8 ± 1.1 1.6 ± 1.0 ác. trans-geránico p-1-menten-7,8-diol 3.3 ± 1.4 Derivados del ác.shiquímico alcohol bencilico 30.2 ± 11.7 alcohol β-feniletílico 24.2 ± 12.4 4-vinilguaiacol 5.3 ± 2.2 4-vinilfenol 12.3 ± 4.5 vanillato de metilo (m/z 151)1 0.2 ± 0.1 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1-propanol 17.9 ± 4.4 2,5-dihidroxibenzoato de metilo 2.8 ± 1.1 tirosol 37.8 ± 17.4 Norisoprenoides isómeros del 3,4-dihidro-3-oxo actinidol 0.4 ± 0.6 3-hidroxi-β-damascona 4.9 ± 2.1 3-oxo-α-ionol 8.9 ± 4.8 3-oxo-7,8-dihidro-β-ionol 0.6 ± 0.8 4-oxo-7,8-dihidro-α-ionol 4.4 ± 2.6 0.2 ± 0.1 grasshoper cetona (m/z 209)1 1 vomifoliol (m/z 124) 5.1 ± 2.9 7,8-dihidrovomifoliol (m/z 110)1 0.1 ± 0.1 1 2 cuantificación respecto al área de la fragmentación indicada entre paréntesis. concentración expresada como relación de áreas con la fragmentación m/z 70 del estandar. 104 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat La cuantificación de un número mayor de compuestos de la fracción ligada se presenta en la Tabla 2.7, para una serie de muestras de vinos Tannat producidos con uvas del clon 398. En el caso de picos con mala resolución, en general por superposición como por ejemplo los picos correspondientes a la grasshopper cetona y el vomifoliol, se cuantificaron trabajando en el GC-MS, mediante la busqueda de iones específicos a partir del cromatograma de corriente iónica total (TIC). En el estudio de los compuestos varietales , se observa un bajo valor para todos los terpenos libres, por debajo de los umbrales de percepción. Sin embargo se determinaron pequeñas concentraciones de algunos monoterpenos hidrocarbonados como el limoneno (Tabla 2.5). En el grupo de compuestos prefermentativos, la concentración de trans-3-hexen-1-ol prevalece en forma marcada sobre la forma cis-, estableciendo una relación cis/trans que resulta ser típica para la variedad Tannat. Por otra parte, la composición cualicuantitativa de los compuestos en C6 es fuertemente dependiente de los niveles y actividad de las enzimas involucradas en la vía de la lipoxigenasa, y el contenido de estas enzimas esta determinado genéticamente (Angerosa et al., 1998), por lo tanto la relación de estos componentes se puede considerar como una característica típica de la variedad Tannat. Para los compuestos fermentativos, se observa un alto contenido de alcohol β-feniletílico y un bajo contenido de acetatos de alcoholes superiores, lo que esta de acuerdo con el perfil de los vinos tintos y en especial para los resultados obtenidos de la evaluación sensorial de esta variedad (ver Capítulo 7). Se estudió además la presencia de norisoprenoides en estado libre mediante la búsqueda de los iones específicos por GC-MS, pudiéndose identificar pequeñas cantidades de 3oxo-α-ionol y vomifoliol (Figura 2.24b). Es predecible un aumento en la concentración de estos compuestos, y otros norisoprenoides, durante la conservación, lo que establece un factor positivo para la variedad, si bien esto debe demostrarse experimentalmente en condiciones de envejecimiento del vino. En los datos obtenidos para las agliconas luego de la reacción enzimática (Tabla 2.6 y 2.7), se observa la presencia de algunos monoterpenoles, en baja concentración, como los óxidos furánicos y piránicos del linalol, α-terpineol, nerol y geraniol, y un contenido muy bajo de linalol. Dentro de este grupo de compuestos, la concentración mayor la presentan los isómeros cis- y trans-8-hidroxilinalol, siendo los valores mayores correspondientes a 105 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat la forma trans. Nuevamente, y en relación a datos reportados en la literatura para otras variedades, este resultado determina la existencia de una relación cis/trans característica para la variedad Tannat, siendo posible considerarlo como un parámetro quimiotaxonómico (Versini et al., 1987a). También fue posible determinar una importante presencia de norisoprenoides, en particular la 3-hidroxi-β-damascona, 3-oxo-α-ionol y vomifoliol; y en menor concentración 4oxo-β-ionol, 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol, 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol y grasshopper cetona. Estos compuestos han sido identificados como heterósidos también presentes en otras variedades (Bureau et al., 2000; Williams et al., 1992; Wirth et al., 2001). En particular, la 3-hidroxi-β-damascona puede sufrir rearreglos en su molécula, en condiciones normales de la elaboración y conservación de los vinos, para producir βdamascenona (Skouroumounis et al., 1992). Este resultado hace posible además predecir la presencia del precursor 3-acetilénico, el cual es más eficiente que la 3-hidroxi-βdamascona para generar la β-damascenona (Figura 2.16), con su potente aroma a rosaheno (Baderschneider et al., 1997). Sin embargo se ha encontrado que la concentración de β-damascenona presenta un aumento importante durante la fermentación, para permanecer más o menos constante en la conservación (Kotseridis y Baumes, 2000), no siendo la misma identificada en ninguna de las muestras analizadas. Figura 2.28 Degradación del 3-oxo-α-ionol en las formas isoméricas del magastigmano- 4,6,8-trien-3-ona. OH O O O O O Adaptado de Strauss et al. (1986a) 106 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat El 3-oxo-α-ionol y 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol son precursores sintéticos de los isómeros del megastigman-4,6,8-trien-3-ona (Figura 2.28), compuesto aromático clave en el tabaco, sin embargo en las condiciones de pH normales esta reacción ácido catalizada sólo se produce con muy baja intensidad (Strauss et al., 1986a). Los derivados 4-oxigenados del β-ionol raramente son encontrados en la naturaleza, si bien han sido encontrados en otras variedades de Vitis vinifera (Williams et al., 1992). Teóricamente, estos compuestos no derivan de las xantofilas, siendo un posible origen, la oxidación alílica del β-caroteno (Versini et al., 1999a). El 4-hidroxi-β-ionol y 4-oxo-βionol han sido reportados previamente como componentes del aroma de Osmanthus absolute, fruta de la pasión roja (Passiflora edulis Sims) y membrillo (Cydonia oblonga Mill.) (Winterhalter, 1990; Winterhalter y Schreier, 1988). El 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol también ha sido reportado en Osmanthus absolute, guayaba (Psidium guajava, L.) (Idstein y Schreier, 1985), fruta de la pasión y membrillo (Winterhalter, 1990; Winterhalter y Schreier, 1988). Figura 2.29 Mecanismo propuesto para la formación de teaspirano a partir de 4-hidroxi- 7,8-dihidro-β-ionol. O H OH H H 2O O Adaptado de Winterhalter y Schreier (1988) 107 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat Estas formas 4-oxigenadas del β-ionol, han sido reportadas como posibles precursoras de los isómeros del teaspirano (Winterhalter y Schreier, 1988), según el mecanismo de deshidratación protonada de un alil-1,6-diol (Figura 2.29) (Ohloff et al., 1964). En particular, el 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol puede ser el precursor de dos isoméros de la megastigman-5,8-dien-4-ona, la cual es un conocido compuesto aromático de algunas plantas como Osmanthus absolute, fruta de la pasión amarilla y tabaco (Winterhalter, 1992). Figura 2.30 Formación de la teaspirona, y el rol del 7,8-dihidrovomifoliol en la forma- ción de precursores del vitispirano. OH OH OH O H+ OH O O vomifoliol O 7,8-dihidrovomifoliol teaspirona OH OH HO O OH HO OH 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-β-ionol Adaptado de Winterhalter y Schreier (1988), Full y Winterhalter (1995) 108 vitispirano Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Los norisoprenoides 7,8-dihidrovomifoliol y vomifoliol pueden ser precursores de la teaspirona (Figura 2.30), según los pasos de la síntesis química descripta por Heckman y Roberts (1969). Esta vía de degradación produce además 3,4-dihidroxi-7,8-dihidro-βionol, el cual es precursor del vitispirano (Figura 2.18). Otras agliconas interesantes identificadas, dentro del grupo de los norisoprenoides, son los isómeros del 3,4-dihidro-3-oxoactinidol, los cuales han sido reportados como posibles precursores de distintas formas actinidiólicas (Versini et al., 1999a). Finalmente se han identificado, luego de la hidrólisis enzimática, algunos compuestos derivados del ácido shiquímico, entre los cuales se encuentran en mayor concentración el 2,5-dihidroxibenzoato de metilo, alcohol bencílico, alcohol β-feniletílico, 3-(4-hidroxi-3metoxifenil)-1-propanol y tirosol. Conclusiones Los vinos obtenidos de la variedad Tannat tienen complejos aromas, los cuales podrían explicarse por algunas peculiaridades en las formas libre, y seguramente en las agliconas presentes en la forma ligada. En este sentido, los resultados obtenidos indican peculiaridades sobre todo en el grupo de los norisoprenoides, estando la gran mayoría de estos compuestos como agliconas en forma ligada, sólo identificándose algunos de ellos en forma libre, y en todos los casos en pequeñas cantidades. El contenido y número de norisoprenoides libres presenta un aumento durante la conservación del vino, siendo necesario futuros estudios para determinar la importancia de estas transformaciones en el aroma de los vinos Tannat. Por otra parte los resultados demuestran, por comparación del comportamiento reportado para otras variedades de Vitis vinifera, que es posible definir un perfil de composición y relaciones entre componentes que son característicos de la variedad Tannat y que permitirían disponer de elementos quimiotaxonómicos diferenciales para esta variedad. Este comportamiento debe ser profundizado en la medida de que este tipo de argumentos representa un elemento definitivo para el manejo de vinos varietales. Finalmente, los resultados encontrados para determinados componentes susceptibles de sufrir rearreglos químicos en sus estructuras hacia componentes aromáticos deseables en el vino, determinan la necesidad de avanzar sobre modelos de envejecimiento que permitan verificar este comportamiento y en consecuencia determinar el perfil de un vino Tan109 Capítulo 2 – Compuestos aromáticos libres y glicosidados en los vinos Tannat nat envejecido. El enfoque de este trabajo, sobre la base de la aplicación de la metodología analítica expuesta, permitiría planificar - hacia la presencia de componentes deseables - el desarrollo aromático de un vino Tannat en función del manejo del llamado potencial aromático de la variedad. 110 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía Acree, T.; Lavin, E. H.; Nishida, R.; Watanaba, S. O-aminoacetophenone: the foxy smelling component of Labruscana grapes. In 6th. Wuerman Symp., Geneva; Y. Bessiere and A. F. 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Introducción El aroma de un vino está determinado por numerosos factores (variedad de uva, vinificación, crianza, etc.), los cuales a su vez están condicionados por una serie de eventos biológicos y fisicoquímicos, involucrando actividad bacteriana en muchos de los casos (Bartowsky y Henschke, 1995). Las bacterias pueden encontrarse en las uvas y en el mosto, previo a la fermentación y durante la fermentación alcohólica (Lafon-Lafourcade et al., 1983; Wibowo et al., 1985). Sin embargo, en la mayoría de los casos, estos microorganismos producen los más importantes efectos en el aroma del vino luego de completarse la fermentación alcohólica, específicamente durante la fermentación maloláctica (FML) (Davis et al., 1985; Dittrich et al., 1980; Henick-Kling, 1993; Wibowo et al., 1985). La influencia de las bacterias en el aroma, y por lo tanto en el valor comercial del vino, debe ser considerada como un elemento determinate (Davis et al., 1985), pudiendo el vino adquirir una gran complejidad de aromas armoniosos o, en el otro extremo, tener que desecharlo por sus aromas defectuosos (Dittrich, 1970). Los cambios serán deseables o no, dependiendo de la concentración producida en los compuestos sensorialmente activos, el estilo y tipo de vino buscados (Davis et al., 1985). Las bacterias preferidas para realizar la FML son cepas seleccionadas de Oenococcus oeni, por su baja producción de compuestos aromáticos no deseados. Sin embargo, aún no ha sido posible estabecer claramente las diferencias producidas por las distintas cepas en el perfil aromático de los vinos, así como tampoco se ha profundizado sobre el estudio de otras especies bacterianas involucradas en el proceso de fermentación maloláctica, como es el caso de cepas de Lactobacillus y Pediococcus. El estudio de estas últimas especies reviste una importancia adicional si se tiene en cuenta que pueden representar una nueva fuente de modificaciones aromáticas por sus diferentes características metabólicas (Dittrich et al., 1980; Henschke, 1993; Lonvaud-Funel, 2000). 127 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni En términos generales, el aroma y sabor de un vino están determinados, en primer lugar, por los metabolitos secundarios de la uva y los producidos por las levaduras durante la fermentación alcohólica. La actividad bacteriana luego de la fermentación alcohólica también puede tener influencia en los compuestos aromáticos por diferentes mecanismos (Bartowsky y Henschke, 1995), ver Figura 3.1: i - remover compuestos aromáticos por acción de su propio metabolismo y por fenómenos de adsorción asociados a sus paredes celulares; ii - producción de nuevos compuestos volátiles (por ej. acetatos, lactato de etilo y diacetilo) por acción del metabolismo de los azúcares, aminoácidos y otros nutrientes presentes en el medio (Figura 3.2); iii – modificaciónes metabólicas o extracelulares sobre metabolitos secundarios provenientes de la uva y levaduras, para dar compuestos más o menos aromáticos. Figura 3.1 Interacción entre las bacterias y los aromas del vino. uva fenómenos prefermentativos y fermentación alcohólica (S. cerevisiae) metabolitos secundarios de la uva y de las levaduras azúcar aminoácidos ác. málico compuestos no aromáticos compuestos aromáticos metabolitos volátiles nuevos compuestos aromáticos compuestos no aromáticos FML (O. oeni) vino Adaptado de Bartowsky y Henschke (1995) 128 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 3.2 Actividad metabólica primaria de las bacterias lácticas heterofermentativas ácido cítrico 100-700 ppm glucosa/fructosa 300-1000 ppm L-ác. málico 1000 – 4000 ppm L-ác. láctico 670 – 2680 ppm ác. acético 100-200 ppm piruvato acetil-CoA diacetilo etanol lípidos acetoína diacetilo 2 – 8 ppm 2,3-butanodiol acetoína D-ác. láctico 2,3-butanodiol 100-200 ppm Adaptado de Bartowsky y Henschke (1995) Compuestos volátiles modificados como consecuencia de la FML Acetato de etilo Generalmente la concentración de ácido acético se incrementa hasta en 0.2 g/L durante la FML debido a la fermentación de las hexosas por la vía heterofermentativa (Davis et al., 1985; Henick-Kling, 1993; Ribereau-Gayon et al., 1998) y el metabolismo del ácido cítrico (Bartowsky y Henschke, 2000; Martineau, 1995; Nielsen y Richelieu, 1999). Relacionado con la formación de este ácido se produce además, un aumento en la concentración del acetato de etilo (Davis et al., 1985; de Revel et al., 1999a; Herjavec y Tupajic, 1998). La presencia de este compuesto, con un umbral de percepción al aroma de 10 mg/L, es deseable en baja concentración por su aroma frutal, pero aporta notas de aromas indeseables, descriptas como de ‘solvente/removedor de esmalte de uñas’, en altas concentraciones (Bartowsky y Henschke, 1995). 129 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Lactato de etilo Muchos autores han reportado el incremento en la concentración de este compuesto durante la FML (Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985; Herjavec y Tupajic, 1998), estando su concentración final correlacionada con el contenido de ácido málico degradado por la acción bacteriana (de Revel et al., 1999a). Otros esteres Varios autores han reportado un incremento, durante la FML, del succinato de dietilo (Davis et al., 1985; Wibowo et al., 1985). En cambio las modificaciones reportadas para otros ésteres etílicos y acetatos luego de la FML son, en muchos casos, contradictorias, habiendo sido reportados en algunos casos un incremento para el caproato de etilo, acetato de hexilo (Avedovech et al., 1992) y acetato de isoamilo (Laurent et al., 1994), mientras que se reportan disminuciones de estos esteres en otros trabajos (Davis et al., 1985). Delaquis et al. (2000) en un trabajo reciente han encontrado diferencias significativas para distintas cepas de O. oeni en la producción de varios compuestos volátiles, entre los que se encuentran los esteres acetato de isoamilo, acetato de hexilo, caproato de etilo y caprilato de etilo. En conjunto, la información es confusa y se percibe la necesidad de profundizar en el estudio de estos compuestos. Acetaldehído El acetaldehído es, por su contenido (7 – 250 mg/L), un componente importante del vino. Producido por el metabolismo de las levaduras (Etiévant, 1991), contribuye a los aromas descriptos como a ‘manzana oxidada’ y ‘nuez’, con un umbral de percepción al aroma de 100 mg/L (Etiévant, 1991; Shinohara, 1984); o con aroma a ‘hojas verdes’, ‘oxidado’ y ‘aroma similar a Jerez’ cuando se presenta en concentraciones más elevadas (Bartowsky y Henschke, 1995). Las concentraciones de acetaldehído y otros compuestos carbonílicos (piruvato y α-cetoglutarato) son reducidas durante la FML (Bartowsky y Henschke, 1995; Dittrich et al., 1980; Hood, 1983; Osborne et al., 2000). Estos compuestos en el vino, presentan enlaces con el grupo bisulfito y por lo tanto liberan SO2 al ser metabolizados, pudiendo de este modo producir una inhibición o detención de la FML (Dittrich y Barth, 1984; Osborne et al., 2000; Wibowo et al., 1985). Diacetilo (2,3-butanodiona) El diacetilo es el compuesto aromático más importante formado durante la FML (Bartowsky y Henschke, 1995; Bartowsky y Henschke, 2000; Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985; Henick-Kling y Martineau, 1994; Martineau, 1995; Martineau y Henick130 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Kling, 1995a; Martineau y Henick-Kling, 1995b; Martineau et al., 1995b; Nielsen y Richelieu, 1999), siendo considerado como indeseable en altas concentraciones (5 – 7 mg/L), mientras que en concentraciones de 1 – 4 mg/L se considera que contribuye favorablemente al aroma del vino, según el tipo y estilo, siendo asociado con los descriptores ‘manteca’ o ‘mantequilla’. Su umbral de percepción al aroma depende del vino considerado, determinándose valores de 0.2 mg/L en vinos de la variedad Chardonnay, 0.9 mg/L en Pinot Noir y 2.8 mg/L en Cabernet Sauvignon (Martineau et al., 1995a). Debido a la posibilidad de formación de enlaces con el SO2, la concentración de este compuesto en las muestras tiene un fuerte efecto en la volatilidad del diacetilo y por lo tanto en su impacto en la percepción sensorial (Bartowsky y Henschke, 2000; Nielsen y Richelieu, 1999). La biosíntesis del diacetilo en el vino presenta dos rutas (ver Figura 4.9): i – el metabolismo de las hexosas y pentosas, produciendo piruvato y acetolactato como compuestos intermediarios, dando este último diacetilo por oxidación química (Figuras 1.3 y 1.4); ii – el metabolismo del ácido cítrico, el cual es transformado por la enzima citratoliasa dando ácido acético y oxalacético. Este último a su vez es descarboxilado produciendo piruvato y acetolactato, que conduce al diacetilo por oxidación química como en el caso anterior (Figura 1.5), siendo esta la vía más usada por las cepas de Oenococcus oeni (Martineau, 1995; Ramos y Santos, 1996; Verhue y Tjan, 1990). La formación del diacetilo depende de varios factores, los cuales se muestran en la Tabla 3.1. Uno de los factores determinantes en la producción de este compuesto es la cepa de bacteria utilizada. En la Tabla 3.2 se presenta, a título de ejemplo, una clasificación de distintos preparados bacterianos comerciales según su capacidad para la producción de diacetilo. El diacetilo es un compuesto inestable en el vino, y luego de ser formado es degradado por las bacterias lácticas, produciendo acetoína y 2,3-butanodiol. Su concentración máxima coincide aproximadamente con el final del consumo de ácido málico, para disminuir en los días siguientes en forma más o menos importante (Bartowsky y Henschke, 2000). En este sentido, Martineau et al. (1995a) encontraron diferencias significativas en las cantidades degradadas de diacetilo luego de la FML por distintas cepas de O. oeni. También se ha reportado la formación de otros compuesto carbonílicos durante la FML, la 1,2-propanodiona (metilgilioxal) y sus formas reducidas, la 1-hidroxi-2-propanona y el 131 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni 1,2-propanodiol (de Ravel y Bertrand, 1993; de Revel et al., 1999a; de Revel et al., 1999b), asi como el glioxal y glicolaldehido formado presumiblemente por reducción del anterior (Flamini et al., 2002). Tabla 3.1 Factores presentes en la elaboración de un vino que pueden afectar su conte- nido de diacetilo. Factor Efecto en la concentración de diacetilo Cepa de bacteria utilizada varía según la cepa utilizada (ver Tabla 3.2) Nivel del inóculo de bacteria bajo nivel de inoculo (104 vs 106 ufc/mL) favorece la producción de diacetilo Temperatura a la que se realiza la FML 18°C vs 25°C favorece producción de diacetilo PH del vino al cual se realiza la FML bajo pH favorece formación de diacetilo Concentración de ácido cítrico favorece formación de diacetilo, pero también se produce ácido acético Concentración de azúcares información conflictiva, el azúcar residual puede reducir producción de diacetilo Contenido de SO2 - combina diacetilo y lo hace inactivo sensorialmente - su adición inhibe la actividad de bacterias y levaduras, y estabiliza el contenido de diacetilo Contacto con el aire durante la FML el oxígeno favorece la oxidación de αacetolactato formando diacetilo Contacto con levaduras activas (borras) reduce el contenido de diacetilo Adaptado de Martineau et al. (1995b), Bartowsky y Henschke (2000) 132 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 3.2 Resumen de la producción potencial de diacetilo por acción de las distintas cepas comerciales de bacterias malolácticas. Producción de diacetilo alta media baja Cepa de bacteria maloláctica MCWa, LP2b, EQ-77c Er1ad, Lo111e, Lo121e, Lo134e, Lo193 DSM 7008f, AWRI Lc 5pg, ML-34 a Vinquiry (Healdsburg, CA)/Lallemand (Toulouse, Francia) b L. plantarum, Condimenta (Stuttgart, Alemania) c componente de Lalvin OSU, Lallemand (Toulouse, Francia) d colección de Cornell Wine Research Group (NYSAES, Geneva, NY) e componente de Vino Mix, Condimenta (Stuttgart, Alemania) f Viniflora oenos, Chr. Hansen (Horsholm, Dinamarca) g componente de Lalvin MLFx4, Lallemand (Toulouse, Francia) Adaptado de Martineau et al. (1995b), Bartowsky y Henschke (2000) Otros compuestos Varios autores han informado sobre el efecto de la FML en los compuestos aromáticos para distintas variedades de Vitis vinifera (Avedovech et al., 1992; Bertrand et al., 1984; de Revel et al., 1999a; de Revel et al., 1999b; Delaquis et al., 2000; Henick-Kling et al., 1994; Herjavec y Tupajic, 1998; Laurent et al., 1994), sin embargo los resultados son contradictorios en muchos casos, posiblemente a causa del uso de diferentes cepas de O. oeni. En la Tabla 3.3 se presentan un resumen de los datos obtenidos por diferentes auto- res. 133 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Tabla 3.3 Modificaciones producidas en los compuestos volátiles como consecuencia de la FML. Compuesto Aumentan en la FML 2,3-butanodiona (diacetilo) 2,3-butanodiona (diacetilo) 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) 2,3-butanodiol 1,2-propanodiona (metilglioxal) 1-hidroxi-2-propanona (acetol) 1,2-propanodiol lactato de etilo lactato de etilo acetato de etilo acetato de etilo acetato de metilo acetato de hexilo acetato de isoamilo caproato de etilo succinato de dietilo 1-propanol 2-butanol 1-hexanol ác. 4-metil-3-pentanoico dimetoxitolueno 2-etoxi-3,5-hexadieno 2-acetil-1-pirrolina (ACPY) 2-acetil tetrahidropiridina (ACTPY) 2-etil tetrahidropiridina (ETPY) trans-3-metil-γ-octalactona isoeugenol vanillina Bajan en la FML acetato de isoamilo acetato de hexilo acetato de β-fenil etilo caproato de etilo decanoato de etilo 1-octanol 1-octen-3-ol compuestos cetónicos* Referencia Cepa Observaciones (1), (2), (3) (7) MCW (1), (2), (3) (4) Biotec D Viniflora oenos (1), (2), (3) (3) (3) (3) (4) Biotec D Viniflora oenos (2), (3) (4) Biotec D Viniflora oenos (2), (5) (6) Er1a (6) Er1a (7) MCW (6) Er1a (2), (5) (2) (2) (2) (6) Er1a (7) MCW (8) olor a geranio, producido a partir de ácido sórbico (9), (10) olor a ratón (9), (10) olor a ratón (9), (10) olor a ratón (3) FML en barrica (3) FML en barrica (3) FML en barrica (2) (2) (2) (2) (7) (7) (7) (5) MCW MCW MCW *(acetaldehído, ácido α-cetoglutárico, ácido pirúvico) 134 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 3.3 (Continuación) Compuesto No se modifican en la FML β-damascenona isoamilato de etilo isobutirato de etilo butirato de etilo pentanoato de etilo alcohol isoamílico cis-3-metil-γ-octalactona eugenol Varian su concentración según la cepa utilizada acetato de etilo isobutirato de etilo isoamilato de etilo acetato de isoamilo caproato de etilo acetato de hexilo heptanoato de etilo caprilato de etilo 1-propanol 2-metil propanol alcohol isoamílico 1-hexanol 2,3-propanodiona acetoína 3-metiltio-1-propanol Referencia Cepa (7) (7) (7) (7) (7) (7) (3) (3) MCW MCW MCW MCW MCW MCW (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) (11) X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter X-3, Inobacter Observaciones FML en barrica FML en barrica (1) Bertrand et al. (1984); (2) Davis et al. (1985); (3) de Ravel et al. (1999a); (4) Herjavec y Tupajic (1998); (5) Wibowo et al. (1985); (6) Avedovech et al. (1992); (7) Laurent et al. (1994); (8) Chisholm y Samuels (1992); (9) Costello (1998); (10) Grbin et al. (1996); (11) Delaquis et al. (2000) Finalmente, las diferencias en los compuestos volátiles producidos en medio sintético por distintas especies y cepas de bacterias láctica ha sido estudiado (Edwards y Peterson, 1994; Izuagbe, 1985; le Roux et al., 1989; Tracey y Britz, 1989), encontrándose grandes diferencias en el perfil de sustancias producidas, lo que ha llevado a sugerir este criterio como técnica para la diferenciación e identificación de bacterias lácticas. El conjunto de resultados es contradictorio y de indudable importancia, lo que reafirma la necesidad de profundizar en el estudio del impacto de la FML en la fracción volátil responsable del aroma de un vino. 135 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Objetivo En este capítulo se presentan los resultados de la variación producida por la fermentación maloláctica (FML) en los componentes volátiles libres y glicosidados presentes en vinos de la variedad Vitis vinifera L. cv. Tannat, y las diferencias detectadas como consecuencia del uso de distintas cepas de Oenococcus oeni durante el proceso de fermentación Materiales y métodos Preparación del vino Se realizaron microvinificaciones con cuatro lotes de 30 kg de uvas de la cosecha 1998 (v1, v2, v3, v4) de la variedad Tannat provenientes de diferentes viñedos y clones, cultivadas en la zona sur del país. Las uvas se despalillaron y estrujaron, obteniéndose contenidos de azúcar de 185 a 203 g/L, acidez total de 5.4 a 7.3 g/L (expresada en H2SO4) y pH de 3.2 a 3.5 (valores mínimos y máximos de las cuatro muestras). Se adicionaron 5 g/hL de SO2 y se inoculó cada lote con 5g/hL de levadura seca activa Saccharomyces cerevisiae, cepa CIVC 8130 (Alimentos Golondrina, Santiago, Chile). La fermentación se condujo a 22-25°C, se descubó con densidad 1000 g/L y se prensaron los orujos, uniéndose el vino obtenido del prensado con el vino de gota. Una vez terminada la fermentación alcohólica, el vino obtenido de cada lote se dividó en tres recipientes de 10 litros cada uno, uno de los cuales fue dejado como testigo, y los otros dos fueron inoculados con cultivos puros de Oenococcus oeni cepa D-11 (Malolactine O, Groupe OenoFrance, Francia) y cepa DSM 7008 (Viniflora, Chr. Hansen’s, Horsholm, Dinamarca). La FML se condujo a 20-22°C, y su desarrollo se controló mediante la determinación de los contenidos de ácido málico y láctico por cromatografía en capa fina (TLC) (Boido et al., 1999), considerándose finalizada la misma cuando se verificó la desaparición del primero. Para todos los lotes se conservó una alicuota de 200 mL del vino sin adición de SO2 para monitorear si la FML no se produce en forma espontánea. Para cada lote vinificado, el vino control (sin FML), y los vinos con FML luego que se completó la misma, se sulfitaron con 50 mg/L de SO2. 136 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 3.3 Esquema de la metodología seguida en las microvinificaciones 30 Kg de uva Despalillado y estrujado 50 mg/L SO2 siembra de 5 g/hL de levadura seca activa Saccharomyces cerevisiae fermentación descube a densidad 1000 g/L prensado de orujos 50 mg/L SO2 siembra de 2.5 g/hL de Oenoccocus oeni control de la FML por TLC hasta málico negativo estabilización a 4°C trasiego corrección de SO2 libre (40 mg/L) 50 mg/L SO2 estabilización a 4°C embotellado conservación a 10°C trasiego corrección de SO2 libre (40 mg/L) embotellado conservación a 10°C 137 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Los vinos se desborraron y estabilizaron a 4°C durante 20 días. Posteriormente se trasegaron y se corrigió el contenido de SO2 libre a 40 mg/L. El vino así obtenido, se envasó en botellas de 1 litro, conservándose a 10°C hasta su análisis 3 meses después. En la Figura 3.3 se presenta el esquema de vinificación seguido. Análisis de los vinos El análisis de acidez total y pH se realizó por los métodos usuales (Iland et al., 1993), los ácidos málico y láctico se determinaron por HPLC (Benassi y Cecchi, 1998; Tusseau y Benoit, 1988) utilizando un equipo Shimadzu, equipado con una bomba LC-10AT, un detector UV-VIS SPD-6AV y un registrador-integrador C-R3A. Se utilizó una columna Beckman Ultrasphere ODS C18 (150 x 4.6 mm d.i.) con tamaño de partícula de 5 µm. La fase móvil utilizada fue ácido sulfúrico 0.005 M; el volumen de inyección fue de 20 µL; la velocidad de flujo 0,6 mL/min; la presión de 30 atm; la temperatura de la columna 20°C y la detección se realizó en UV a 214 nm. Análisis de los compuestos volátiles Extracción La extracción de los compuestos volátiles libres y ligados se realizó mediante elución del vino a través de una resina de tipo XAD-2 (ver Capítulo 2). Identificación La identificación se realizó mediante GC-MS en las condiciones descriptas en el Capítulo 2, equipado con librerias de referencia (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991) y librería propia realizada con estándares. La identificación de los compuestos se confirma por medio de índices de retención de Kovats, utilizando una serie homóloga de n-alcanos (C9 – C26). Cuantificación Se realizó por medio de HRGC según las condiciónes descriptas en le Capítulo 2, equipado con detector de ionización de llama (FID) y usando n-heptanol como estándar interno. Análisis estadístico Las diferencias en las concentraciones de los compuestos volátiles libres y ligados se evaluaron mediante el análisis de varianza considerando los efectos muestra y FML sin 138 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat interacción. Las diferencias entre las medias para las muestras control y con FML utilizando diferentes cepas, se determinaron mediante el Least Significative Diferences test (LSD test). Los cálculos se realizaron con el programa Genstat 5 release 3.2, 2da. edición (Lawes Agricultural Trust, IACR – Rothamsted, 1996). Se realizaron además, análisis de componentes principales (PCA) con normalización de los datos por matriz de correlación y extracción de los componentes principales por rotación del espacio original de las variables con maximización de la varianza (varimax), y análisis discriminante (Stepwise Discriminant Function Analysis) utilizando el programa Statistica 5.1 (StatSoft Inc., USA, 1998). Resultados y discusión Los resultados del análisis de los parámetros de acidez en los vinos correspondientes a las vinificaciones de los cuatro lotes (v1, v2, v3, v4) y a los diferentes tratamientos, sin FML (control) y con FML usando las distintas cepas de O. oeni, se muestran en la Tabla 3.4. La fermentación maloláctica se completó en todas las muestras para las dos cepas utilizadas (contenidos de ácido málico menores de 0.1 g/L). La acidez total presenta las mismas disminuciones para las diferentes cepas utilizadas, dependiendo esta disminución del contenido de ácido málico inicial de cada muestra. Tabla 3.4 Parámetros analizados para las cuatro vinificaciones y los tres tratamientos. Ácido málicoa Ácido lácticoa Lote Tratamiento Acidez totala pH v1 control 6.3 3.45 4.6 0.8 v1 D-11 4.1 3.65 < 0.1 3.9 v1 DSM 7008 4.1 3.68 < 0.1 4.0 v2 control 4.6 3.34 3.0 0.7 v2 D-11 3.7 3.45 < 0.1 2.9 v2 DSM 7008 3.4 3.47 < 0.1 2.5 v3 control 5.2 3.28 2.0 < 0.1 v3 D-11 4.4 3.38 < 0.1 1.5 v3 DSM 7008 4.3 3.37 < 0.1 1.2 v4 control 5.5 3.42 2.7 < 0.1 v4 D-11 4.6 3.58 < 0.1 2.1 v4 DSM 7008 4.5 3.52 < 0.1 1.8 a Acidez total expresada en g H2SO4/L, ácido málico y láctico en g/L. 139 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Estudio de los compuestos aromáticos libres La Tabla 3.5 presenta los resultados del análisis de varianza, en los efectos muestra y FML, para los componentes volátiles libres. Un número importante de compuestos presentaron diferencias significativas entre los tratamientos para el efecto FML (cinco compuestos presentaron diferencias a nivel de significación p < 0.01). En la aplicación de la técnica de extracción basada en el uso de resinas de tipo XAD-2, se demostró una baja recuperación para algunos componentes como el piruvato de etilo, lactato de etilo, 3-metiltio-1-propanol, γ-butirolactona y pantolactona. Sin embargo, el diseño experimental aplicado, permitió utilizar las concentraciones determinadas para estos compuestos, con valores inferiores a los reales, con el único objetivo de comparar los distintos tratamientos. La Tabla 3.6 muesta los valores medios para las muestras control y con FML utilizando las diferentes cepas, determinándose las diferencias significativas según el LSD test. Se observó un aumento significativo para el 4-hidroxibutanoato de etilo, succinato de dietilo, γ-butirolactona, alcohol β-feniletílico, ácido butanoico y 3-metiltio-1-propanol luego de la FML para las muestras en las que se utilizó la cepa D-11, así como para el 4vinilguaiacol en las que se utilizó la cepa DSM 7008. Para las cepas empleadas en este trabajo no se detectó formación de etil fenoles como consecuencia de la actividad bacteriana. El 4-hidroxibutanoato de etilo, succinato de dietilo y la γ-butirolactona son productos del metabolismo del ácido α-cetoglutárico (van Vuuren y Dicks, 1993; Wurz et al., 1988), la diferencia detectada en la concentraciones de estos compuestos para las distintas cepas utilizadas en este experimento indican una posible diferencia en la intensidad de esta vía metabólica. Oenococcus oeni tiene la capacidad de descarboxilar al ácido αcetoglutárico, mediante la enzima α-cetoglutarato descarboxilasa, produciendo semialdehído succínico, como se presenta en la Figura 3.4. Este producto es inestable y es reducido por una deshidrogenasa a 4-hidroxibutirato en presencia de un dador de hidrógeno, mientras que en su ausencia los productos finales son 2-hidroxiglutarato y succinato en relación 1:1 (Kapol y Radler, 1990; van Vuuren y Dicks, 1993), produciendo finalmente los ésteres etílicos correspondientes. 140 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 3.5 Análisis de varianza, para los efectos muestra y FML sin interacción, para los componentes volátiles de la fracción libre. Valores de F para los tratamientos y cuadrados del error medio (MSE). MUESTRAa Compuesto Esteres acetato de isoamilo 4.33 acetato de hexilo 1.16 10.00 ** acetato de β-fenil etilo caproato de etilo 0.83 caprilato de etilo 10.00 ** caprato de etilo 19.76 ** piruvato de etilo 1.80 lactato de etilo 4.26 3-hidroxibutanoato de etilo 66.93 *** 4-hidroxibutanoato de etilo 43.60 *** malato de dietilo 16.09 ** succinato de dietilo 7.16 * succinato ácido de etilo 58.19 *** fenil lactato de etilo 2.07 2-hidroxiglutarato de etilo 3.42 Alcoholes 1-butanol 2.90 alcohol isoamílico 22.6 *** 1-pentanol 0.80 4-metil-1-pentanol 1.21 3-metil-1-pentanol 13.04 ** 3-etoxi-1-propanol 15.51 ** alcohol bencilico 0.15 52.76 *** alcohol β-feniletílico 3-metiltio-1-propanol 37.75 *** Compuestos C6 hexanol 20.75 *** trans-3-hexen-1-ol 4.53 * cis-3-hexen-1-ol 91.74 *** trans-2-hexen-1-ol 0.61 Ácidos ác. 2-metil propanoicob 7.41 * ác. 2- y 3-metil butanoico 193.71 *** ác.butanoico 1.45 ác.hexanoico 3.09 ác.octanoico 4.16 ác.decanoico 2.68 Otros 4.73 * γ-butirolactona 4-vinilguaiacol 0.83 pantolactona 1.21 8.25 * 4-carboetoxi-γ-butirolactona a b FMLa MSE 5.58 * 30.94 *** 1.74 5.06 * 1.44 0.03 12.65 ** 27.92 *** 8.56 * 8.21 * 0.21 3.25 7.25 ** 0.44 0.94 1.66 x 103 49 547 2.69 x 103 305 12 132 1.43 x 105 17 6.04 x 103 2.05 x 103 3.58 x 106 9.06 x 103 9.31 x 103 3.13 x 103 0.55 0.20 19.26 ** 3.24 0.20 0.03 1.83 6.16 * 25.52 *** 230 1.05 x 108 111 76 87 583 979 1.61 x 107 748 0.48 2.25 4.12 0.23 4.89 x 105 54 13 294 37.76 *** 0.75 11.88 ** 0.98 2.83 0.04 1.04 x 103 584 885 3.84 x 104 3.15 x 104 189 26.63 *** 17.53 ** 2.46 2.16 156 79 394 5.38 x 103 nivel de significación, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 ácido 2-metil propanoico + lactato de isoamilo 141 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Tabla 3.6 Concentración de los componentes volátiles de la fracción libre (µg/L), valores medios para los tratamientos (4 vinificaciones) y desviación estandar de la media (entre paréntesis). Valor de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos, letras cursivas distintas indican diferencias de las medias según LSD test (95 %). Compuesto Control FML DSM 7008 FML D-11 p Esteres acetato de isoamilo 195 (24) ab 176 (12) a 267 (44) b 0.043 acetato de hexilo 40 (1) b 5 (3) a 7 (5) a < 0.001 74 (26) 54 (15) 85 (28) 0.252 acetato de β-fenil etilo caproato de etilo 189 (39) b 149 (10) b 74 (17) a 0.052 caprilato de etilo 62 (23) 43 (11) 61 (17) 0.308 caprato de etilo 14 (4) 15 (3) 15 (6) 0.966 piruvato de etilo 50 (3) b 44 (5) b 12 (10) a 0.007 lactato de etilo 754 (115) a 1878 (266) b 2747 (374) c < 0.001 3-hidroxibutanoato de etilo 70 (9) a 75 (11) a 82 (9) b 0.017 4-hidroxibutanoato de etilo 719 (116) a 742 (156) a 922 (176) b 0.019 malato de dietilo 206 (43) 226 (65) 214 (56) 0.813 succinato de dietilo 568 (187) a 559 (194) a 785 (252) b 0.025 succinato ácido de etilo 5045 (1364) 5625 (1871) 8245 (1686) 0.111 fenil lactato de etilo 241 (38) 303 (88) 259 (17) 0.661 2-hidroxiglutarato de etilo 183 (38) 189 (50) 233 (16) 0.440 Alcoholes 1-butanol 56 (3) 60 (5) 67 (16) 0.602 alcohol isoamílico 80900 (12220) 79266 (12603) 83837 (18401) 0.821 1-pentanol 58 (2) b 42 (4) b 13 (7) a 0.002 4-metil-1-pentanol 9 (1) 13 (4) 25 (7) 0.111 3-metil-1-pentanol 57 (10) 53 (13) 56 (8) 0.822 3-etoxi-1-propanol 47 (29) 51 (38) 51 (17) 0.968 alcohol bencilico 73 (9) 114 (20) 102 (6) 0.240 33661 (7115) a 34857 (8593) ab 42816 (9775) b 0.035 alcohol β-feniletílico 3-metiltio-1-propanol 226 (41) a 225 (45) a 345 (61) b 0.001 Compuestos C6 hexanol 1473 (385) 1338 (311) 1468 (183) 0.640 trans-3-hexen-1-ol 32 (8) 26 (3) 21 (4) 0.186 cis-3-hexen-1-ol 54 (10) 47 (10) 48 (10) 0.075 trans-2-hexen-1-ol 51 (1) 51 (4) 43ª (17) 0.799 Terpenos 14.8 (0.5) 14 (2) 6 (3) 0.076 α-terpineol citronelol 11ª (3) 12 (1) 9 (1) nd nerol 7 (1) 11 (3) 8 (2) 0.298 geraniol 25 (6) 26 (5) 24 (4) 0.706 Ácidos ác. 2-metil propanoicod 206 (26) a 236 (26) a 391 (33) b < 0.001 ác. 2- y 3-metil butanoico 485 (99) 483 (93) 502 (101) 0.513 ác.butanoico 64 (5) a 64 (2) a 153 (27) b 0.008 ác.hexanoico 1078 (161) 1009 (88) 1200 (124) 0.430 ác.octanoico 882 (168) 804 (54) 1093 (132) 0.136 ác.decanoico 39 (13) 41 (4) 42 (9) 0.961 Otros 36 (4) a 38 (8) a 93 (13) b 0.001 γ-butirolactona 4-vinilguaiacol 12 (2) a 45 (7) b 13 (1) a 0.003 pantolactona 6 (0.8) 8 (1.1) 34 (18) 0.166 153 (65) 222 (67) 259 (71) 0.197 4-carboetoxi-γ-butirolactona a media para 3 determinaciones; b media de 2 determinaciones; c valor para una sola determinación; d ácido 2-metil propanoico + lactato de isoamilo; nd = no determinado 142 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 3.4 Vía metabólica hipotética del α-cetoglutárico por Oenococcus oenia. O OH O C CO2 C O H C CH2 CH2 CH2 (1) CH2 CH2OH NAD(P)H2 NAD(P) O OH semialdehído succínico O OH ác. α-cetoglutárico OH OH C CHOH CH2 CH2 CH2 CH2 C O OH ác. succínico C O OH ác. 2-hidroxiglutárico 2 CH3CH2OH 2 CH3CH2OH (4) (4) 2 H2O 2 H2O OCH2CH3 C O OCH2CH3 C CHOH CH2 CH2 CH2 CH2 C O C OCH2CH3 OCH2CH3 succinato de dietilo 2-hidroxiglutarato de dietilo (1) α-cetoglutarato descarboxilasa (2) 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (3) semialdehído succínico deshidrogenasa (4) esterificación a (4) H2O CH2 CH2 C O OCH2CH3 4-hidroxibutanoato de etil (3) O C O O O γ-butirolactona CH3CH2OH C O OH ác. 4-hidroxibutanoico H2O NAD(P) O (4) CH2OH NAD(P)H2 O CH2 (2) C C CH2 adaptado de Van Vuuren y Dicks (1993), Kapol y Radler (1990) 143 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Figura 3.5 Reacción de Ehrlich de formación de los alcoholes β-feniletílico y 3-metiltio- 1-propanol a partir de los aminoácidos fenil alanina y metionina respectivamente. O O C H H C OH C NH 2 OH C O CH 2 O metionina H OH C O CH 2 CH 3 alcohol β-fenil etílico C OH C NH 2 S NA DH NA D+ CO 2 O CH 2 CH 2 CH 2 ác. 3-fenil-2-cetopropionico C H CH 2O H CH 2 NH 3 fenilalanina O C CH 2 S CH 2O H CH 2 CH 2 CH 2 NH 3 O C CH 2 CH 2 CO 2 S CH 3 NA DH NA D+ S CH 3 CH 3 ác. 2-ceto-4-metiltiobutanoico 3-metiltio-1-propanol También indicarían diferencias metabólicas las distintas concentraciones de alcohol βfeniletílico y 3-metiltio-1-propanol, siendo su posible origen los aminoácidos fenilalanina y metionina respectivamente, produciendo los alcoholes por la reacción de Ehrlich según puede verse en la Figura 3.5. En trabajos donde se ha determinado la producción de compuestos volátiles por diferentes bacterias lácticas en medio sintético, se ha encontrado diferencias significativas para varios alcoholes dependiendo de la cepa de Oenococcus oeni utilizada (Edwards y Peterson, 1994; Tracey y Britz, 1989). Esto estaría de acuerdo con los resultados obtenidos en los vinos Tannat. La formación de 4-vinilguaiacol estaría de acuerdo con lo determinado por Chatonnet et al. (1995) para algunas cepas de O. oeni que fueron capaces de producir vinil fenoles a partir de los ácidos hidroxicinámicos. Para las cepas utilizadas en este experimento se observó, luego de la FML, un aumento para el lactato de etilo, resultados similares han sido reportados por varios autores (Bartowsky y Henschke, 1995; Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985; de Revel et al., 144 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat 1999a; Herjavec y Tupajic, 1998). Este aumento fue significativamente mayor para la cepa D-11, lo que implica un comportamiento diferente para las dos cepas utilizadas en esta experiencia. Este resultado se opone a lo descripto por Delaquis et al. (2000), quienes no encontraron diferencias significativas trabajando con otras dos cepas. El acetato de hexilo y caproato de etilo presentaron una disminución en su concentración luego de la FML, para las dos cepas utilizadas. En la bibliografía se citan resultados contradictorios para los cambios en la concentración de estos dos compuestos, según distintos autores, reportándose una disminución por Davis et al. (1985), y un aumento en cambio por Avedovech et al. (1992). Dada la importancia sensorial de estos compuestos, los resultados obtenidos en la variedad Tannat, indicarían una disminución de los descriptores del aroma asociados con ellos. En la variedad Tannat, el acetato de isoamilo tuvo un comportamiento diferente según la cepa utilizada, presentando un aumento para la cepa D-11 y una disminución para la cepa DSM 7008. Delaquis et al. (2000) también encontraron diferencias significativas en la concentración de este acetato trabajando con dos cepas diferentes de O. oeni, en vinos de otra variedad. Esta diferencia encontrada en los resultados obtenidos para las distintas cepas puede explicar las contradicciones que se encuentran reportadas en la bibliografía para el comportamiento de este éster durante la FML, determinándose una disminución por algunos autores (Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985), y un importante aumento por otros (Laurent et al., 1994). Estos resultados indican la importancia de la elección de la cepa de Oenococcus oeni para cada comportamiento, según la variedad de Vitis vinifera utilizada y el estilo de vino a obtener. Debido a la dificultad de comparar directamente las concentraciones que varian desde algunos µg/L para algunos de los compuestos, hasta cientos de mg/L en otros, se estudió el rango de variación tomando el mínimo (a) y el máximo (b) para cada compuesto, y se definió la abundancia relativa (valores entre 0 y 100%) como ha sido utilizada por otros autores (Cantagrel y Carles, 1978). La formula de cálculo para la abundancia relativa es la siguiente: abundancia relativa = donde: Ω−a x 100 b−a a = mínima concentración determinada para un compuesto en las muestras analizadas 145 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni b = máxima concentración determinada para un compuesto en las muestras analizadas Ω = concentración del compuesto estudiado en cada muestra En la Figura 3.6 pueden verse en forma gráfica las variaciones de los compuestos volátiles en los distintos tratamientos. Figura 3.6 Perfiles de los compuestos volátiles con diferencias significativas para las muestras control y con FML utilizando dos cepas de Oenococcus oeni expresados como abundancia relativa (%). % abundancia 0 20 40 60 Compuesto 1 acetato de isoamilo 2 acetato de hexilo 3 acetato de β-feniletilo 4 caproato de etilo 5 lactato de etilo 6 4-hidroxibutanoato de etilo 7 γ-butirolactona 8 succinato de dietilo 9 alcohol bencilico 10 alcohol β-feniletilico 11 3-metiltio-1-propanol 12 4-vinilguaiacol 1 2 3 4 5 compuesto No. 6 7 8 9 10 11 12 control 146 DSM 7008 D-11 80 100 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Estudio de los grupos de compuestos aromáticos libres Con el objetivo de visualizar más claramente el posible efecto de las variaciones detectadas para los diferentes componentes analizados, se realizó un analisis de varianza de los componentes volátiles libres agrupados según su relación como descriptores de las distintas notas sensoriales: - - - aromas frutales - Σ acetatos (acetato de isoamilo + acetato de β-fenil etilo + acetato de hexilo) - Σ esteres etílicos (caproato de etilo + caprilato de etilo + caprato de etilo) - Σ acetatos + Σ esteres etílicos fruta manzana y banana - acetato de isoamilo - Σ acetatos fruta tropical y mazana madura - floral - Σ esteres etílicos alcohol β-feniletílico vegetal verde - Σ alcoholes C6 (hexanol + t-3-hexen-1-ol + c-3-hexen-1-ol + t-2-hexen-1-ol) Entre los distintos grupos estudiados no se incluyó la suma de alcohol y acetato de βfeniletílo, los cuales se relacionan con notas florales, debido a las importantes diferencias en concentración presentadas por estos compuestos, y por lo tanto al baja influencia del acetato en el resultado de la suma. En este análisis se consideraron además los siguientes compuestos y grupos por su importancia sensorial y metabólica: - lactato de etilo - Σ alcoholes superiores (1-butanol + alcohol isoamilico + 1-pentanol + 4-metil-1- pentanol + 3-metil-1-pentanol) - Σ ácidos grasos (ác. hexanoico + ác. octanoico + ác. decanoico) - compuestos derivados del metabolismo del α-cetoglutarato (γ-butirolactona + 4hidroxibutanoato de etilo + succinato de etilo) En la Tabla 3.7 se presentan los resultados de los valores medios para este análisis, indicándose las diferencias significativas entre las muestras control y con FML utilizando las 147 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni diferentes cepas. La variación de los perfiles de los compuestos volátiles agrupados para los distintos tratamientos se presenta en la Figura 3.7. Tabla 3.7 Valores medios de concentración de los componentes volátiles pertenecientes a la fracción libre (µg/L), agrupados según los criterios descriptos en el texo, para los tratamientos (4 vinificaciones) y desviación estandar de la media (entre paréntesis). Valor de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos, letras cursivas distintas indican diferencias de las medias según LSD test (95 %). FML DSM 7008 FML D-11 p 308 (30) ab 235 (21) a 359 (57) b 0.018 Σ esteres 265 (61) 207 (9) 150 (32) 0.141 Σ acetatos + Σ esteres 574 (73) 442 (25) 509 (85) 0.231 acetato de isoamilo 195 (24) ab 176 (12) a 267 (44) b 0.043 33661 (7115) a 34857 (8593) ab 42816 (9775) b 0.035 Compuesto Control Σ acetatos alcohol β-fenil etílico 1462 (324) 1582 (201) 754 (115) a 1878 (266) b 2747 (374) c < 0.001 81081 (12229) 79435 (12613) 83998 (18418) 0.822 Σ ácidos 1999 (329) 1854 (138) 2335 (254) 0.248 metab. del α-cetoglutarato 1323 (196) a 1340 (264) a 1801 (296) b 0.003 Σ alcoholes C6 lactato de etilo Σ alcoholes superiores 1610 (396) 0.631 Mediante este análisis, se observó una disminución de los acetatos y esteres para la cepa DSM 7008, estando estos compuestos relacionados con las notas frutales. En forma opuesta, para la cepa D-11 se observó un aumento del acetato de isoamilo, explicando en parte las diferencias encontradas en las notas frutales de los vinos como consecuencia de la cepa utilizada para realizar la FML (ver Capítulo 7). Para la cepa D-11 se observó un aumento en la concentración de alcohol β-feniletílico, el cual se relaciona con los aromas florales. Paralelamente, sólo para esta cepa se produjo un aumento significativo en la concentración de compuestos derivados del metabolismo del α-cetoglutárico. 148 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 3.7 Perfiles medios de los compuestos volátiles agrupados para las muestras con- trol y con FML utilizando dos cepas de Oenococcus oeni, calculados a partir de la abundancia relativa (%) de cada compuesto. Se indica la diferencia mínima significativa (lsd) entre tratamientos para cada grupo de compuestos. Σ acetatos lsd = 14 metab.del α-cetoglutarato lsd = 13 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Σ esteres lsd = 27 acetato de isoamilo lactato de etilo lsd = 23 lsd = 36 lsd = 13 alcohol β-fenil etílico control DSM 7008 D-11 Estudio de los compuestos aromáticos ligados En la Tabla 3.8 se observa que la mayoría de los compuestos ligados estudiados presentaron una disminución significativa luego de la FML, lo cual puede explicarse como consecuencia de la actividad β-glicosidasa de Oenococcus oeni, reportada en experiencias “in vitro” por otros autores (Grimaldi et al., 2000; Guilloux-Benatier et al., 1993). Todos los grupos de compuestos ligados, presentaron valores medios menores en las muestras con FML (Figura 3.8). Sin embargo, se comprobó que esta liberación de aromas ligados no produjo el aumento correspondiente en los compuestos libres. La magnitud de este problema y las dificultades encontradas en su resolución, determinaron que las posibles 149 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni causas de esta diferencia en el balance de masa para los componentes ligados se estudien por separado en el Capítulo 6. Tabla 3.8 Concentración de los componentes volátiles pertenecientes a la fracción ligada (µg/L), valores medios para los tratamientos (4 vinificaciones) y desviación estandar de la media (entre paréntesis). Valor de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos, letras cursivas distintas indican diferencias de las medias según LSD test (95 %). Compuesto Control Terpenos linalol 2.1 (0.4) 7.4 (2.8) α-terpineol citronelol 1.3a (0.4) nerol 12.2 (4.3) geraniol 15.5 (2.7) a cis-8-hidroxilinalol 30.1 (5.0) trans-8-hidroxilinalol 33.7 (10.3) 7-hidroxigeraniol 4.5a (0.5) ác. transgeránico 22.4 (4.6) Derivados del ácido shiquímico alcohol bencílico 310.5 (83.5) a 367.1 (49.0) a alcohol β -feniletílico 2,5-dihidroxibenzoato de 21.9b (0.04) metilo Alcoholes C6 hexanol 82.2 (8.6) a trans-3-hexen-1-ol 1.7a (0.5) cis-3-hexen-1-ol 18.9 (4.7) a trans-2-hexen-1-ol 18.4 (2.9) a Norisoprenoides 207.6 (6.1) a 3-hidroxi-β-damascona 211.9 (7.7) a 3-oxo-α-ionol 82.6b (20.0) 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol b 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol 70.6 (4.1) a b media para 3 determinaciones; media de 2 ción; nd = no determinado FML DSM 7008 1.1a (0.3) 3.1a (1.3) 0.7c (nd) 6.0 (1.9) 9.3 (1.4) ab 30.1b (2.6) 33.6a (15.5) 13.2b (3.8) 12.3b (0.0) 225.8 (83.7) ab 225.2 (26.1) b 12.1c (nd) 47.6 (9.3) b 1.2c (nd) 12.3 (3.0) ab 12.3 (2.8) ab FML D-11 2.7 6.1 1.2 6.4 5.2 11.0 11.6 2.5b 9.1b (0.6) (1.1) (0.3) (3.4) (0.1) b (3.9) (4.6) (0.9) (1.7) 199.1 (46.7) b 139.6 (12.0) b 9.6c (nd) 34.6 0.6 7.9 7.5 (3.4) b (0.1) (1.2) b (1.3) b p 0.261 0.220 nd 0.072 0.022 0.078 0.529 nd nd 0.031 0.001 nd 0.003 nd 0.045 0.013 134.8 (16.6) b 102.7 (10.7) b 0.003 139.9 (14.2) b 95.9 (9.2) c < 0.001 81.2b (51.8) 27.1c (nd) nd c 44.5 (nd) nd nd c determinaciones; valor para una sola determina- 150 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 3.8 Valores medios de los compuestos aromáticos ligados agrupados (mg/L) para las muestras control y con FML usando diferentes cepas. La desviación de la media se indica mediante barras de error para cada valor. 0.45 0.40 concentración (mg/L) 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 te e rp no s a h lco ol b o lic cí n e a h lco b ol - fe t le ni ílic o al h co es ol C6 control DSM 7008 D-11 terpenos: linalol + α-terpineol + nerol + geraniol alcoholes C6: 1-hexanol + cis-3-hexen-1-ol + trans-2 hexen-1-ol Análisis de componentes principales Los resultados obtenidos muestran que los tres primeros componentes principales, del análisis para los datos de los compuestos volátiles libres en las doce muestras, explican el 74.7% de la varianza de los mismos (40.4% con el primero, 18.3% con el segundo y 16.0% con el tercero). En la Tabla 3.9 se presentan las cargas para los distintos factores en los componentes principales, extraídos del espacio de las variables originales, mediante el método de rotación con maximización de varianza. Como puede verse en la Figura 3.9, el factor 2 es el que separa mejor los tratamientos de control y con FML utilizando las distintas cepas. Las variables con mayor carga en este factor son con valores positivos el lactato de etilo, γ-butirolactona, ácido 2-metil propanoico + lactato de isoamilo, ácido butanoico, 4- hidroxibutanoato de etilo y pantolactona, estando desplazadas las muestras con FML 151 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni hacia estos valores (con mayores valores para los casos en los que se ha usado la cepa D11), y por otra parte con valores negativos el acetato de hexilo, caproato de etilo, piruvato de etilo y 1-pentanol, siendo en este caso las muestras de control desplazadas en este sentido (ver Tabla 3.9 y Figura 3.9). El factor 1 separa los distintos lotes pudiendo verse las variables con mayor peso para este factor en la Tabla 3.9. Existe una separación importante para la muestra v1 desplazada hacia valores negativos, siendo las variables con mayor carga en este sentido el hexanol, cis-3-hexenol y 3-etoxi-1-propanol. Este comportamiento puede explicarse teniendo en cuenta que esta muestra fue la preparada a partir de uva con menor grado de madurez, siendo los dos primeros compuestos alcoholes en C6, los cuales se correlacionan inversamente con el nivel de madurez de la fruta, tal como se ha descripto (Cordonnier, 1989). En el análisis de componentes principales para los compuestos volátiles agrupados, los tres primeros factores explican el 86.8% de la varianza de los datos (39.1% con el primer factor, 26.1% con el segundo y 21.6% con el tercero). El factor 3 separa las muestras control desplazadas hacia valores negativos, y las muestras con FML hacia valores positivos, como se ve en la Figura 3.10. Las variables con mayor carga en este factor son la sumatoria de esteres para los valores negativos, desplazándose hacia estos valores las muestras control, y el lactato de etilo para valores positivos, hacia donde se desplazan las muestras con FML, como se presenta en la Tabla 3.10. En el factor 2 se observa una buena separación para las muestras con FML usando distintas cepas, desplazándose las muestras en las que se utilizó la cepa DSM 7008 hacia valores negativos, y hacia valores positivos las muestras en las que se utizó la cepa D-11; presentando las variables Σ acetatos + Σ esteres y acetato de isoamilo las cargas más importantes en este sentido (ver Tabla 3.10 y Figura 3.10). 152 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 3.9 Cargas de los factores 1, 2 y 3 del análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres. Se listan las variables con cargas mayores a 0.7 (negrita y cursiva) en alguno de los factores. Compuesto alcohol isoamilico caproato de etilo 1-pentanol piruvato de etilo acetato de hexilo 4-metil-1-pentanol 3-metil-1-pentanol lactato de etilo hexanol 3-etoxi-1-propanol cis-3-hexenol caprilato de etilo 3-hidroxibutanoato de etilo ác. 2-metil propanoico γ-butirolactona ác. butanoico caprato de etilo ác. 2- y 3-metil butanoico succinato de dietilo 3-metiltio-1-propanol acetato de β-feniletilo 4-hidroxibutanoato de etilo ác. hexanoico alcohol β-feniletílico malato de dietilo ác. octanoico 2-hidroxiglutarato de etilo succinato ácido de etilo pantolactona Factor 1 .86761 .06243 -.13782 -.22756 -.17098 .17011 .90399 .07923 -.93865 -.90534 -.93516 -.11066 .74370 .29428 -.08480 .23072 -.77325 .87396 .86285 .69880 .43446 .12050 .05686 .89917 .84606 .01953 .77664 .72768 .19092 153 Factor 2 .285457 -.804664 -.885672 -.880024 -.653686 .501052 -.062021 .902164 .056847 .111352 -.182104 -.346168 .305395 .870378 .896711 .807733 -.242056 .092201 .252642 .432408 -.102225 .659076 .084844 .323047 .294952 .219234 .282141 .594262 .801874 Factor 3 -.194980 -.122349 -.347247 -.259258 -.029546 .700527 .208328 -.007105 -.025296 -.155736 -.027823 .849948 .071970 .096919 .000439 .480923 .266477 .109721 .307846 .503371 .862193 -.601512 .866937 .140626 -.382477 .811928 .108226 -.103535 -.017309 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Figura 3.9 Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres. Proyección de las muestras en los componentes principales (a) 1 y 2, y (b) 1 y 3. Se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML. 2.5 (a) v4 fml2 2.0 1.5 v3 fml2 + fml2 1.0 PC 2 (18.3%) v1 fml2 v2 fml2 0.5 v4 fml1 0.0 -0.5 v1 fml1 v3 fml1 + fml1 v1 control v3 control v4 control v2 fml1 + control -1.0 v2 control -1.5 -2.0 -1.8 -1.4 -1.0 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0 1.4 PC 1 (40.4%) 2.5 (b) v2 fml2 2.0 1.5 v2 control v3 fml2 + fml2 PC 3 (16.0%) 1.0 v2 fml1 0.5 + control 0.0 v1 control v1 fml2 + v4 fml2 v1 fml1 v3 fml1 v3 control fml1 -0.5 v4 control -1.0 v4 fml1 -1.5 -2.0 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 PC 2 (18.3%) control: muestras sin FML; fml1: muestras con FML usando la cepa DSM 7008; fml2: muestras con FML usando la cepa D-11; v1, v2, v3 y v4: diferentes lotes de uva vinificados. 154 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 3.10 Cargas de los factores 1, 2 y 3 del análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres agrupados. Se listan las variables con cargas mayores en alguno de los factores. Variables con cargas mayores a 0.7 se indican en negrita y cursiva. Compuesto Σ acetatos Σ esteres Σ acetatos + Σ esteres acetato de isoamilo alcohol β-feniletílico lactato de etilo Σ alcoholes C6 Factor 1 .065058 .063093 .085147 .400880 -.944695 -.217544 .910108 155 Factor 2 .972982 .153608 .753340 .811940 .040154 .082712 .160141 Factor 3 -.014859 -.942057 -.630163 .297207 .273623 .872452 .109689 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Figura 3.10 Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles agrupados. Proyección de las muestras en los componentes principales (a) 1 y 2, y (b) 2 y 3. Se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML. 2.5 (a) 2.0 v2 fml2 1.5 v3 fml2 v1 fml2 PC 2 (26.1%) 1.0 v2 control + fml2 v1 control 0.5 0.0 v3 fml1 -0.5 + control v2 fml1 v3 control v4 fml2 v1 fml1 + v4 control fml1 -1.0 v4 fml1 -1.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 PC 1 (39.1%) 2 v3 fml2 v4 fml2 (b) PC 3 (21.6%) 1 0 +v1 fml2 fml2 v1 fml1 v3 fml1 v3 control v4 fml1 v2 fml2 + fml1 v1 control v2 fml1 + control v4 control -1 -2 -3 -2.0 v2 control -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 PC 2 (26.1%) control: muestras sin FML; fml1: muestras con FML usando la cepa DSM 7008; fml2: muestras con FML usando la cepa D-11; v1, v2, v3 y v4: diferentes lotes de uva vinificados. 156 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Análisis discriminante En la Figura 3.11 se muestra el análisis discriminate para el estudio de los componentes volátiles pertenecientes a la fracción libre. Las variables que discriminan entre el tratamiento control y los dos tratamientos con FML son el acetato de hexilo (achex), alcohol bencilico (benc), 4-vinilguayacol (4vg), ácido 2-metil propanoico + lactato de isoamilo (m2pro), ácido butanoico (oico4), piruvato de etilo (piret) y 1-pentanol (penol). En la Figura 3.12 se muestra el análisis discriminante para las variables agrupadas según el criterio antes establecido. En este caso puede verse que las variables que discriminan los grupos con diferente tratamiento son lactato de etilo (lacet), Σ acetatos (sace) y compuestos provenientes del metabolismo del α-cetoglutarato (mace). Figura 3.11 Análisis discriminate para los grupos control y FML usando las cepas DSM 7008 y D-11, utilizando los compuestos volátiles libres. Los factores que descriminan entre los grupos se presenta en forma de vectores. 35 30 25 20 15 Root 2 oico4 10 m2pro 5 0 benc -5 achex -10 4vg piret control -15 penol -20 -150 -100 -50 DSM 7008 0 50 Root 1 benc = alcohol bencilico achex = acetato de hexilo 4vg = 4-vinilguaiacol piret = piruvato de etilo m2pro = lactato de isoamilo + ác. 2-metil propanoico penol = alcohol β-feniletílico oico4 = ác. butanoico 157 100 150 D-11 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Figura 3.12 Análisis discriminate para los grupos control y FML usando las cepas DSM 7008 y D-11, utilizando los compuestos volátiles agrupados. Los factores que descriminan entre los grupos se presenta en forma de vectores. 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 lacet Root 2 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 mace -1.5 control -2.0 DSM 7008 sace -2.5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 D-11 Root 1 lacet = lactato de etilo mace = compuestos del metabolismo del α-cetoglutarato sace = sumatoria de acetatos Conclusiones En las condiciones experimentales seleccionadas, se encontró que un importante número de compuestos aromáticos presenta diferencias significativas entre las muestras de control y con FML. En las muestras en las que se realizó la fermentación maloláctica con la cepa D-11, se encontró además un incremento significativo en el 4-hidroxibutanoato de etilo, succinato de dietilo, γ-butirolactona, alcohol β-feniletílico, ácido butanoico y 3-metiltio-1propanol. En cambio, en las muestras en las que se utilizó la cepa DSM 7008 se detectó un incremento significativo del 4-vinilguaiacol . En ninguno de los casos se observó formación de etil fenoles. 158 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Estas diferencias en los incrementos de las concentraciones de los compuestos volátiles según la cepa de O. oeni utilizada puede explicarse por diferencias en las intensidades de las distintas vias metabólicas bacterianas involucradas. El comportamiento de los esteres es variable, encontrándose un incremento en la concentración de lactato de etilo y una disminución del hexanoato de etilo y caproato de etilo para las dos cepas utilizadas. El acetato de isoamilo, en cambio, varia su comportamiento según la cepa utilizada, presentando un aumento en el caso de la cepa D-11, y una diminución en las muestras en las que se utiliza la cepa DSM 7008. Las diferencias encontradas en estos compuestos, los cuales estan relacionados con los distintos aromas frutales de los vinos, indican la existencia de posibles diferencias sensoriales en las muestras en las cuales la fermentación maloláctica se produce por la acción de diferentes cepas de O. oeni. La fermentación maloláctica produce además una disminución en la mayoría de los compuestos aromáticos ligados, lo cual puede explicarse como consecuencia de la actividad β-glicosidasa propia de Oenococcus oeni. Las variaciones encontradas para algunos de los componentes de la fracción libre pueden superar sus umbrales de percepción y por lo tanto su variación, como consecuencia del proceso de fermentación maloláctica, puede modificar el perfil sensorial de los vinos. Este aspecto, relacionado en particular con las consecuencias derivadas de las modificaciones químicas producidas durante la FML, será estudiado en detalle en el capítulo 8. 159 Capítulo 3 – Efecto de la cepa de Oenococcus oeni Bibliografía Adams, R. P. Identification of essential oils by gas chromatography/mass spectroscopy, 1st. ed.; Allured Publ. Corp.: Illinois, 1995. Avedovech, R. M.; McDaniel, M. R.; Watson, B. T.; Sandine, W. E. An evaluation of combinations of wine yeast and Leuconostoc oenos strains in malolactic fermentation of Chardonnay wine. American Journal of Enology and Viticulture 1992, 43, 253-260. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Malolactic fermentation and wine flavour. The Australian Grapegrower & Winemaker 1995, 378a, 83-94. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Management of malolactic fermentation for the 'buttery' diacetyl flavour in wine. The Australian Grapegrower & Winemaker 2000, 438a, 58-67. Benassi, M. T.; Cecchi, H. M. 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En este sentido, los métodos de conservación para un vino se pueden clasificar en dos formas, con efectos totalmente opuestos sobre el vino: conservación en botella (condiciones no oxidativas) conservación en barrica (condiciones oxidativas). La crianza de un vino en botella se produce con un potencial de óxido reducción muy bajo lo que determina que las modificaciones principales sobre las sustancias volátiles involucren a los esteres, terpenos, norisoprenoides, fenoles volátiles, compuestos azufrados y los derivados furfurales (Günata, 1998). Esteres y alcoholes superiores Durante la conservación del vino se producen reacciones de hidrólisis/esterificación (formación de ésteres etílicos) muy lentas, tendiendo a un estado de equilibrio entre los componentes. El porcentaje máximo teórico de esterificación para muchas sustancias no se alcanza a pesar de que transcurran muchos años de conservación, como es el caso de valores de esterificación determinados para vinos con 50 años de edad, en los que se ha encontrado una esterificación que alcanza solo al 75% de este porcentaje máximo teórico (Ribéreau-Gayon y Peynaud, 1936). Los esteres etílicos y acetatos en general disminuyen su concentración durante la crianza, presentando comportamientos muy diversos, con disminuciones importantes en el caso de los acetatos, y menores para los esteres etílicos. La velocidad de esta disminución en la concentración está muy influenciada por el pH del vino, siendo los acetatos los más sensibles (Marais, 1978; Ramey y Ough, 1980). Por ejemplo para una variación de pH de 165 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella 3.58 a 2.95 la velocidad de hidrólisis de los esteres etílicos de ácidos grasos (C4 - C8) se multiplica por 2 o 3, mientras que los acetatos de alcoholes superiores son mucho más afectados, multiplicandose su hidrólisis aproximadamente 5 veces (Ramey y Ough, 1980). Esta hidólisis de los distintos ésteres puede ser enlentecida por la conservación a baja temperatura (Marais, 1978; Marais et al., 1992; Ramey y Ough, 1980). Los ésteres de los ácidos orgánicos son producidos durante la conservación, presentando una reacción más rápida los ácidos monocarboxílicos (acético y láctico), que los dicarboxílicos (tartárico, málico y succínico), siendo mayor para estos últimos la producción de ésteres ácidos que neutros (Edwards et al., 1985; Ribéreau-Gayon y Peynaud, 1936). Esta esterificación en la mayoría de los casos no contribuye directamente a los aromas de crianza del vino (bouquet) debido a que los ésteres formados no alcanzan sus umbrales de percepción (Edwards et al., 1985; Etiévant, 1991). Los alcoholes superiores, en cambio, evolucionan muy poco durante la conservación, principalmente por reacción con otros compuestos. Terpenos y norisoprenoides Estos compuestos varían su concentración durante la crianza debido a transformaciones químicas y a la hidrólisis ácida de sus formas glicosidadas, como se discutió en el Capítulo 2. Fenoles volátiles Luego de la fermentación alcohólica se encuentran cantidades más o menos importantes de vinil fenoles (4-vinilfenol y 4-vinilguaiacol), siendo los vinos blancos los que poseen las mayores concentraciones como consecuencia de la inhibición de la actividad cinamil descarboxilasa por los pilifenoles en los vinos tintos, ver Figura 4.1 (Chatonnet et al., 1997). Estos compuestos fenólicos pueden provocar aromas desagradables si son producidos en altas concentraciones, por encima del umbral de preferencia que se ha determinado en 725 µg/L para las suma de ambos compuestos (Chatonnet et al., 1993; Dugelay et al., 1993), estando definido este umbral como la máxima concentración a partir de la cual el aroma de un compuesto es juzgado negativamente (Ribereau-Gayon et al., 1998b). 166 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 4.1 Formación de fenoles volátiles durante los procesos de vinificación y conser- vación del vino. R COOH O HO CHOH Éster p-cumaroil tartárico R = H Éster feruloil tartárico R = OCH3 C O CH COOH (1) R Ácido p-cumárico R = H Ácido ferúlico R = OCH3 HO COOH (2) S. cerevisiae / bacterias lácticas R 4-vinil fenol R=H 4-vinil guaiacol R = OCH3 HO C2H5OH H+ Conservación Brettanomyces (3) R R OCH2CH3 HO HO 4-(1-etoxietil) fenol R=H 4-(1-etoxietil) guaiacol R = OCH3 4-etil fenol R=H 4-etil guaiacol R = OCH3 (1) cinamil esterasa (2) cinamato descarboxilasa (3) vinilfenol reductasa Adaptado de Günata (1998) 167 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Durante la conservación se observa una disminución en la concentración de estos compuestos, la que puede ser explicada por la adición ácido-catalizada del etanol sobre el doble enlace formando el 4-(1-etoxietil) fenol y 4-(1-etoxietil) guaiacol, como se muestra en la Figura 4.1. Estos compuestos no presentan influencia en el aroma de los vinos para las concentraciones detectadas (Dugelay et al., 1995). Por otra parte, un aumento en la concentración de etil fenoles (4-etil fenol y 4etilguaiacol) puede producirse como consecuencia de la actividad de algunas bacterias lácticas. Sin embargo, un aumento excesivo de estos compuestos en la conservación sólo se explica en un vino por un desarrollo de levaduras contaminantes del genero Brettanomyces/Dekkera (Chatonnet et al., 1995; Chatonnet et al., 1997). Estas levaduras son ca- paces de producir estos compuestos a partir de los ácidos p-cumárico y ferúlico por la acción secuencial de una cinamato decarboxilasa, dando los vinil fenoles correspondientes; donde la acción posterior de una vinilfenol reductasa reduce el doble enlace vinílico, como puede verse en la Figura 4.1 (Heresztyn, 1986). Una mayor extracción de los compuestos fenólicos por la técnica de maceración carbónica (Flanzy et al., 1987), también puede explicar la presencia de tenores excesivos de etilfenoles en los vinos obtenidos por esta técnica de vinificación (Etiévant, 1989; Etiévant et al., 1989), aunque siempre relacionada con la presencia de Brettanomyces y bacterias lácticas particularmente favorecidas por este tipo de elaboración (Versini et al., 1984; Versini y Tomasi, 1983). Objetivo En el capítulo anterior se determinaron las variaciones en el contenido de compuestos volátiles producidas por la FML en los vinos, y la influencia de las diferentes cepas de Oenoccocus oeni sobre estas variaciones. En el presente capítulo se estudia la variación del perfil de la composición aromática del vino Tannat producidas durante la conservación en botella de las muestras control y con FML. Se determina además la modificación en el contenido de los compuestos aromáticos ligados durante este proceso. 168 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Materiales y métodos Preparación del vino Se cosecharon tres lotes (l1, l2, l3) de uvas Vitis vinifera L. cv Tannat de la región de Santa Lucía, Canelones, en Marzo de 1999, y se realizaron las microvinificaciones según el procedimiento descripto en el Capítulo 3, y la Figura 3.1. En la Tabla 4.1 se presentan los valores de contenido de azúcar, acidez total y pH de los lotes de fruta procesados. Tabla 4.1 Datos analíticos de los lotes de fruta procesados. Muestraa lote 1 lote 2 lote 3 a azúcar (g/L) 193 193 203 acidez total (g/L en H2SO4) 6.0 5.4 6.5 pH 3.19 3.34 3.50 lote 1: clon 475; lote 2: clon 398; lote 3: clon 399 Se utilizó un cultivo puro de Oenococcus oeni cepa DSM 7008 (Viniflora, Chr. Hansen’s, Dinamarca), realizándose la FML en las muestras por duplicado. Todas las muestras y los distintos tratamientos con sus duplicados se envasaron en botellas de 1 litro, una parte de los mismos se conservó a 10°C hasta ser analizados 2 meses después, y la otra parte de las muestras se mantuvo a 18°C y se analizaron luego de un año de conservación. En la Tabla 4.2 pueden verse los datos de la composición química de las muestras luego de la FML. Los análisis se realizaron según las técnicas convencionales (Iland et al., 1993), y los ácidos málico y láctico se determinaron por HPLC (Benassi y Cecchi, 1998; Tusseau y Benoit, 1988) en las condiciones descripta en en Capítulo 3. Análisis de los compuestos volátiles Extracción Se fraccionaron los aromas libres y ligados por extracción en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos Isolute (IST Ltd, Mid Glamorgan, UK) ENV+ conteniendo 1g de polímero SDVB (estireno divinil benzeno) (40-140 µm, cod. n° 915-0100-C), según lo descripto en el Capítulo 2, usando n-heptanol como estandar interno. 169 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Identificación La identificación de los componentes de la fracción aromática se realizó mediante GCMS en las condiciones descriptas en el Capítulo 2, equipado con librerías de referencia (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991) y librería propia realizada con estándares. La identificación de los compuestos se confirmó por medio de la determinación de los índices de retención de Kovats. Tabla 4.2 Composición química de los vinos luego de la fermentación maloláctica (valo- res medios de las dos vinificaciones para las muestras con FML). Muestraa alcohol (% v/v) control 1 Fml 1 control 2 Fml 2 control 3 Fml 3 11.6 11.6 11.6 11.6 11.7 11.7 a b acidez total acidez volátil (g/L en H2SO4) (g/L en H2SO4) 5.5 4.2 5.4 4.1 5.4 3.9 0.10 0.21 0.10 0.24 0.12 0.39 málico (g/L) láctico (g/L) pH azúcar (g/L) 3.4 ndb 3.9 nd 3.9 nd 0.8 3.2 1.1 3.5 0.4 3.1 3.31 3.44 3.52 3.66 3.65 3.86 1.89 1.83 1.94 1.89 2.17 2.10 corresponden a los lotes 1, 2 y 3. nd: menor al umbral de detección que posee el equipo. Cuantificación Se realizó por medio de HRGC según las condiciónes descriptas en el Capítulo 2, equipado con detector de ionización de llama (FID) y usando n-heptanol como estandar interno. Análisis estadístico Las diferencias en las concentraciones de los compuestos volátiles libres se determinó mediante un análisis de varianza para las muestras control y con FML, antes y después de su conservación por un año. Las diferencias significativas entre las medias se calcularon según el LSD test. Todos los cálculos se realizaron con el programa Genstat 5 release 3.2, 2da. edición (Lawes Agricultural Trust, IACR – Rothamsted, 1996). Se realizaron además, análisis de componentes principales principales (PCA) con normalización de los datos por matriz de correlación y extracción de los componentes principales por rotación del espacio original de las variables con maximización de la varianza (método varimax), y análisis discriminante (Stepwise Discriminant Function Analysis) de las distintas muestras utilizando el programa Statistica 5.1 (StatSoft Inc., USA, 1998). 170 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Resultados y discusión Todas las muestras inoculadas con bacterias completaron la fermentación maloláctica, presentándose en la Tabla 4.2 la composición química de las muestras de los distintos tratamientos, control y con FML. Se puede ver, como en el capítulo anterior, una disminución de la acidez total y un incremento del pH, siendo estas variaciones dependientes de la concentración de ácido málico inicial. Se aprecia también un incremento en la acidez volátil de 0.14 g/L, promedio para las distintas muestras, que puede ser explicado por el metabolismo de los azúcares o del ácido cítrico como ha sido reportado en otros trabajos (Costello et al., 1985; Henick-Kling, 1993; Ribereau-Gayon et al., 1998a), así como una disminución en el contenido de azúcares posiblemente por su utilización por el metabolismo bacteriano (Costello et al., 1985; Davis et al., 1986; Henick-Kling, 1993). Estudio de los compuestos volátiles libres El análisis de varianza para los compuestos volátiles libres (Tabla 4.3) muestra, como se vio en el capítulo anterior, diferencias significativas en la concentración de un número importante de compuestos por el efecto de la fermentación maloláctica, obteniéndose resultados similares a los obtenidos en la experiencia anterior con la misma cepa (O. oeni cepa DSM 7008). En esta experiencia puede verse además una variación de un número aún mayor de compuestos por el efecto del tiempo de conservación, la mayor parte de los mismos con nivel de significación p < 0.001. En la Tabla 4.4 pueden verse los valores medios de los componentes volátiles para las muestras control y con FML, con diferentes tiempos de conservación. Luego de la FML se observa un importante aumento en el contenido de lactato de etilo. La variación de este compuesto está de acuerdo con lo determinado en la experiencia anterior, y también con lo reportado en la bibliografía (Bartowsky y Henschke, 1995; Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985; de Revel et al., 1999; Herjavec y Tupajic, 1998). 171 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Tabla 4.3 Análisis de varianza de los componentes volátiles libres para los efectos muestra, FML y tiempo de conservación (con interacción FML x tiempo). Valores de F para los tratamientos y cuadrados de error medio (MSE) MUESTRAa FMLa TIEMPOa Esteres acetato de isobutilo 3.99 * 6.94 * 29.02 *** acetato isoamilo 5.30 * 14.12 ** 102.12 *** acetato de hexilo 3.22 6.25 * 25.50 *** 9.73 ** 1.01 24.32 *** acetato de β-feniletilo caproato de etilo 0.94 3.18 0.15 caprilato de etilo 6.04 * 1.38 11.82 ** caprato de etilo 4.18 * 2.33 8.24 * piruvato de etilo 7.91 ** 20.12 *** 0.31 lactato de etilo 2.40 97.75 *** 110.80 *** lactato de isoamilo 0.85 33.54 *** 27.86 *** 3-hidroxibutanoato de etilo 14.39 *** 0.05 1.00 4-hidroxibutanoato de etilo 5.88 * 2.42 60.84 *** malato de dietilo 1.99 92.71 *** 40.94 *** succinato de dietilo 0.46 0.03 351.76 *** succinato ácido de etilo 0.38 1.65 18.11 ** Alcoholes alcohol isobutilico 6.35 * 2.41 0.74 alcohol isoamilico 13.51 *** 5.46 * 0.03 1-butanol 1.55 1.05 5.07 * 1-pentanol 0.82 4.79 * 1.44 4-metil-1-pentanol 23.26 *** 0.16 7.55 * 3-metil-1-pentanol 15.11 *** 9.81 ** 3.98 3-etoxi-1-propanol 6.40 * 0.01 0.85 alcohol bencilico 4.29 * 1.42 2.76 15.18 *** 0.04 5.97 * alcohol β-feniletilico 3-metiltio-1-propanol 15.29 *** 0.15 1.03 Compuestos C6 1-hexanol 4.16 * 0.85 3.19 trans-3-hexen-1-ol 1.19 0.94 0.37 cis-3-hexen-1-ol 1.20 0.05 0.19 trans-2-hexen-1-ol 4.31 * 1.12 9.79 ** Ácidos ác. Propanoico 1.31 0.18 20.90 *** ác. Butanoico 0.66 0.10 0.77 ác. 2-metil propanoico 5.87 * 0.03 0.75 ác. 2- y 3-metil butanoico 18.65 *** 0.01 5.64 * ác. Hexanoico 3.36 0.05 8.42 * ác. Octanoico 9.80 ** 0.00 8.70 * ác. Decanoico 1.02 3.53 1.88 Otros compuestos 18.73 *** 1.16 38.26 *** γ-butirolactona Benzaldehido 31.75 *** 3.17 3.61 Acetoína 1.02 6.82 * 48.43 *** 4-vinilguayacol 4.88 * 50.05 *** 8.31 * 4-vinilfenol 16.62 *** 41.76 *** 0.94 pantolactona 20.18 *** 0.13 35.64 *** fenil lactato de etilo 1.42 0.70 0.21 0.69 2.94 18.78 *** 4-carboetoxi-γ-butirolactona 2-hidroxiglutarato de dietilo 5.00 * 2.50 41.69 *** a nivel de significación: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 172 FML X TIEMPOa MSE 3.26 14.69 ** 3.80 1.35 0.35 3.20 1.25 13.99 ** 46.01 *** 6.44 * 1.19 0.29 70.69 *** 0.00 0.23 1.69 x 104 1.11 x 104 81 878 1.88 x 104 546 203 67 1.60 x 108 1.39 x 103 787 4.79 x 105 9.86 x 103 2.53 x 104 2.95 x 108 1.27 9.57 ** 0.89 1.06 2.07 8.53 * 1.17 2.73 2.24 1.48 2.06 x 106 5.36 x 108 9.49 x 104 560 52 776 3.12 x 103 1.03 x 103 3.26 x 107 4.12 x 104 1.16 1.20 1.53 0.60 2.62 x 104 104 153 829 0.07 0.78 0.94 0.75 1.70 2.26 1.91 1.29 x 104 4.22 x 104 1.93 x 104 1.15 x 104 3.42 x 104 4.10 x 104 807 7.58 * 6.19 * 26.90 *** 4.06 2.09 11.64 ** 4.87 * 2.51 0.03 2.76 x 104 305 393 125 539 199 1.06 x 104 8.54 x 103 3.61 x 104 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 4.4 Valores medios de los componentes volátiles de la fracción libres (µg/L), valores medios para cada tratamientoa (3 vinificaciones) y desviación estandar de la media (entre paréntesis). Letras cursivas distintas indican diferencias de la medias según LSD test (95%). control - 2 meses fml - 2 meses control - 1 año fml – 1 año Esteres acetato de isobutilo 730 (69) c 441 (92) bc 243 (46) ab 189 (38) a acetato isoamilo 1034 (121) c 635 (65) b 264 (42) a 268 (30) a acetato de hexilo 41 (10) c 21 (4) b 7 (5) a 5 (2) a 124 (22) b 64 (13) a 67 (14) a 156 (34) b acetato de β-feniletilo caproato de etilo 463 (56) 300 (38) 433 (54) 352 (78) caprilato de etilo 183 (22) 148 (14) 117 (14) 124 (10) caprato de etilo 82 (11) 64 (10) 52 (2) 50 (3) piruvato de etilo 45 (4) b 11 (4) a 27 (12) ab 24 (4) a lactato de etilo 1366 (193) a 21015 (2218) b 6938 (1832) ab 112476 (9176) c lactato de isoamilo 74 (16) a 134 (14) b 103 (4) ab 259 (20) c 3-hidroxibutanoato de etilo 185 (30) 173 (22) 151 (26) 169 (17) 4-hidroxibutanoato de etilo 3782 (605) b 4135 (488) b 989 (308) a 1713 (222) a malato de dietilo 149 (31) b 88 (14) a 1005 (154) c 110 (12) ab succinato de dietilo 198 (20) a 180 (22) a 1598 (95) b 1590 (92) b succinato ácido de etilo 13849 (442) a 6905 (835) a 53789 (23675) c 38641 (3571) b Alcoholes alcohol isobutílico 8218 (1220) 6294 (864) 6555 (582) 6250 (764) alcohol isoamílico 155438 (22354) b 92599 (20520) a 105667 (16012) ab 114437 (11159) ab 1-butanol 358 (62) 662 (216) 225 (25) 238 (21) 1-pentanol 103 (9) 65 (11) 74 (12) 60 (9) 4-metil-1-pentanol 40 (11) b 36 (7) b 24 (8) a 30 (4) ab 3-metil-1-pentanol 187 (36) b 103 (21) a 107 (30) a 104 (14) a 3-etoxi-1-propanol 304 (56) 276 (36) 240 (19) 272 (24) 3-metiltio-1-propanol 1298 (257) 1214 (168) 1037 (172) 1200 (105) alcohol bencilico 53 (22) a 60 (21) a 113 (12) b 68 (12) a 34469 (6907) b 30772 (5293) ab 22195 (1669) a 27042 (2817) ab alcohol β-feniletilico Compuestos C6 1-hexanol 1012 (133) 850 (109) 760 (95) 772 (23) trans-3-hexen-1-ol 25 (3) 24 (3) 20 (6) 31 (6) cis-3-hexen-1-ol 55 (8) 46 (6) 47 (2) 54 (5) trans-2-hexen-1-ol 59 (9) ab 85 (23) b 31 (1) a 35 (6) a Ácidos ác. Propanoico 69 (10) a 59 (8) a 333 (122) b 294 (57) b ác. Butanoico 387 (49) 348 (34) 322 (33) 341 (6) ác. 2-metil propanoico 640 (125) 562 (80) 607 (68) 663 (69) ác. 2- y 3-metil butanoico 801 (133) 748 (98) 618 (126) 659 (51) ác. Hexanoico 1311 (126) 1212 (117) 898 (84) 1039 (56) ác. Octanoico 1321 (213) b 1175 (156) b 836 (57) a 995 (96) ab ác. Decanoico 82 (38) b 36 (5) a 37 (14) a 30 (4) a Otros compuestos 556 (149) ab 416 (79) a 735 (117) b 1053 (179) c γ-butirolactona Benzaldehido 75 (32) 69 (18) 31 (10) 68 (15) Acetoína 46 (7) a 20 (3) a 42 (0.4) a 119 (13) b 4-vinilguayacol 10 (4) a 38 (4) b 10 (3) a 61 (8) c 4-vinilfenol 22 (19) a 80 (20) b 7 (4) a 99 (18) b pantolactona 91 (21) a 69 (10) a 98 (17) ab 125 (10) b fenil lactato de etilo 428 (62) 271 (53) 298 (40) 369 (37) 118 (9) a 112 (9) a 405 (91) c 252 (45) b 4-carboetoxi-γ-butirolactona 2-hidroxiglutarato de dietilo 306 (67) b 138 (24) a 861 (186) d 728 (135) c a control (muestras sin FML) y fml (muestras con FML por duplicado), analizados luego de la FML y con un año de conservación. 173 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Este compuesto presenta además un incremento significativo en su concentración luego de la conservación por un año, lo cual también ha sido observado en trabajos con otras variedades, pero sin estudiar el efecto de la FML (Cantagrel y Carles, 1978; Pérez-Coello et al., 1999; Versini y Margheri, 1981). El aumento de la concentración del lactato de etilo como consecuencia del envejecimiento del vino, se produce con una fuerte interacción entre los factores fermentación maloláctica y tiempo de conservación (p < 0.001), con un aumento más importante de la concentración en los vinos con FML. Este fenómeno es debido posiblemente a una mayor velocidad de esterificación química como consecuencia de la mayor concentración de ácido láctico, aumentando por lo tanto las diferencias entre los tratamientos. Se observó también una disminución de los ésteres etílicos y acetatos luego de la FML, lo cual ya fue observado en la experiencia anterior para la misma cepa, siendo el acetato de hexilo el compuesto que presentó la mayor disminución. Luego de un año de conservación en botella se produce otra importante disminución de los acetatos, en cambio para algunos de los ésteres etílicos esa disminución es en menor intensidad o nula, al igual que lo observado en vinos blancos por varios autores (Guth, 1998; Marais y Pool, 1980; Pérez-Coello et al., 1999). Este descenso en la concentración de los ésteres etílicos y acetatos, debida a una hidrólisis ácida normal de estos ésteres, presentó una disminución mayor en las muestra control, posiblemente por su mayor acidez, lo que provocó que desaparezcan las diferencias significativas para las muestras de los tratamientos control y con FML a lo largo de la conservación. La pérdida de estos compuestos fue más importante para los acetatos que para los ésteres etílicos, y esta diferencia durante la conservación es más importante para las muestras control, posiblemente debido al valor de pH más bajo, efecto que ha sido demostrado para estos compuestos en soluciones modelo (Marais, 1978; Ramey y Ough, 1980). Los datos obtenidos para el grupo de los alcoholes superiores presentaron un comportamiento que no puede ser explicado como consecuencia del metabolismo bacteriano, lo que se ve reforzado por los resultados obtenidos, para diferentes cepas, en el Capítulo 3. Por otra parte, el diseño de experiencia utilizado (número de muestras y repeticiones para los distintos tratamientos) permite asegurar que los valores no se ven afectados por desviaciones instrumentales, las que en caso de ocurrir, provocarían un valor de desviación estandar mayor. En consecuencia, es razonable plantear un diseño experimental que per- 174 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat mita un estudio en mayor profundidad de este fenómeno, lo que escapa a los alcances de este trabajo de tesis. Respecto a otros componentes, se detectó un pequeño incremento del 4-vinilguaiacol y 4vinilfenol en los vinos estudiados con FML, aunque en ninguna de las muestras se observó la formación de 4-etilguaiacol y 4-etilfenol durante la FML. Este resultado se opone a lo reportado por Cavin et al. (1993) que demostraron que solo células permeabilizadas de O. oeni, creciendo en medio sintético con ácidos fenólicos, son capaces de realizar la descarboxilación de estos ácidos. Esto podría indicar la ausencia de sistema de transporte para estos ácidos en la célula de las cepas de microorganismos utilizados. Sin embargo, Chatonnet et al. (1995) encontraron que algunas cepas son capaces de formar vinil fenoles a partir de ácidos hidroxicinámicos, pero no formar etil fenoles, lo que establece un márgen de discusión pendiente sobre este fenómeno. En los vinos con FML y un año de conservación se encontró una concentración significativamente alta de acetoína, lo que no ocurrió para las muestras con FML sin conservación. El aumento en la concentración de acetoína durante la FML ha sido reportado por otros autores (Bertrand et al., 1984; Ui et al., 1986; Wibowo et al., 1985). El incremento en la concentración de este compuesto, determinado en esta experiencia durante la conservación, puede explicarse por la reducción parcial del diacetilo el cual es un compuesto producido normalmente en la FML (Martineau y Henick-Kling, 1995; Martineau et al., 1995). Tanto el diacetilo como la acetoína, son productos del metabolismo del ácido cítrico, dependiendo sus concentraciones de las condiciones redox de los vinos ya que la producción de diacetilo depende de una oxidación química como se muestra en la Figura 4.2 (Bartowsky y Henschke, 2000; Nielsen y Richelieu, 1999). 175 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Figura 4.2 Metabolismo de formación de diacetilo, acetoína y 2,3-butanodiol por O. oeni a partir de ácido cítrico y/o azúcar. El diacetilo necesita una oxidación química para su formación. ácido cítrico ácido acético ácido oxalacético azúcar CO 2 ácido pirúvico CO 2 ácido α-acetoláctico oxid. química diacetilo CO 2 acetoína 2,3-butanodiol Adaptado de Bartowsky y Henschke (2000), Nielsen y Richelieu (1999) En los vinos control luego de un año de conservación, aparece un incremento significativo en la concentración de malato de dietilo. Este aumento, durante la conservación, no es significativo en las muestras con FML, teniendo una interacción significativa FML y conservación (p < 0.001). Estos resultados provocan un aumento en las diferencias de la composición de los vinos control y con FML, pueden explicarse por la esterificación química del ácido málico contenido en las muestras control. Durante la conservación se observó un incremento en la γ-butirolactona en las muestras, el cual también ha sido reportado en otros estudios (Pérez-Coello et al., 1999). En esta experiencia se observa un mayor incremento de este compuesto en las muestras con FML, posiblemente por una mayor concentración de productos del metabolismo del α176 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat cetoglutarato a partir de los cuales se forma esta lactona (van Vuuren y Dicks, 1993). La formación de la γ-butirolactona por esta vía permitiría explicar además la correlación encontrada analizando los datos obtenidos en esta experiencia, con la disminución del 4hidroxibutanoato de etilo que es uno de los compuestos de los cuales deriva. Se observó además un incremento durante la conservación de las muestras de los distintos tratamientos, control y con FML, en otros compuestos como el succinato de dietilo, succinato ácido de etilo y 2-hidroxiglutarato de dietilo. Estos resultados caracterizan el comportamiento de los compuestos volátiles en los vinos de la variedad Tannat durante el proceso de envejecimiento, mientras que varios autores describen tendencias similares en las variaciones de algunos de estos compuestos para vinos de otras variedades (Cantagrel y Carles, 1978; Herjavec y Tupajic, 1998; Pérez-Coello et al., 1999). En la Figura 4.3 se presenta graficamente la variación de los perfiles en las concentraciones de los compuestos con diferencias significativas para los distintos tratamientos, expresados en porcentajes de abundancia relativa para evitar el problema de representar compuestos con diferencias muy grandes en sus concentraciones (ver Capítulo 3). 177 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Figura 4.3 Perfiles medios de los compuestos volátiles con diferencias significativas expresados como abundancia relativa (%), para las muestras control y con FML, con distintos tiempos de conservación. % abundancia 0 No. Compuesto 20 40 60 80 1 1 acetato de isobutilo 2 acetato isoamilo 2 3 acetato de hexilo 3 4 acetato de β-feniletilo 5 caproato de etilo 6 caprilato de etilo 5 7 lactato de etilo 6 8 lactato de isoamilo 9 malato de dietilo 4 etilo 11 succinato de dietilo 12 γ-butirolactona compuesto 10 4-hidroxibutanoato de 7 8 9 10 13 alcohol bencilico 11 14 alcohol β-feniletilico 12 15 4-vinilguayacol 16 4-vinilfenol 13 14 15 16 control (2 meses) 178 fml (2 meses) control (1 año) fml (1 año) 100 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Estudio de los grupos de compuestos aromáticos libres Como en el capítulo anterior, se realizó el analisis de varianza de los componentes volátiles libres agrupados según su relación con distintas notas sensoriales. A diferencia del anterior, en el grupo Σ acetatos se incluyó al acetato de isobutilo el cual no se determinó en el experimento anterior. El efecto de la FML en los distintos grupos fue similar al obtenido para la misma cepa en el experimento anterior, con una disminución significativa de los acetatos y esteres, ambos relacionados con notas frutales, y un aumento significativo del lactato de etilo (Tabla 4.5). En la Figura 4.4 se presentan graficamente los perfiles medios, expresados en porcentaje de abundancia relativa, de los compuestos agrupados para las muestras control y FML, con distintos tiempos de conservación. Tabla 4.5 Concentración de los componentes volátiles libres (µg/L) agrupados según los criterios descriptos anteriormente, valores medios para los tratamientosa (3 vinificaciones, en duplicado para las muestras con FML) y desviación estandar de la media (entre paréntesis). Letras cursivas distintas indican diferencias de las medias según LSD test (95 %). Compuesto Σ acetatos Σ esteres Σ acetatos + Σ esteres acetato de isoamilo alcohol β-fenil etílico Σ alcoholes C6 lactato de etilo Σ alcoholes superiores Σ ácidos metab. del α-cetoglutarato Control – 2 meses 1961 (215) c 728 (87) 2689 (302) c 1034 (121) c 34469 (6907) b 1151 (151) 1366 (193) a 163986 (22316) b 2714 (367) b 4535 (766) FML – 2 meses Control – 1 año 1221 (150) b 579 (101) a 512 (37) 603 (67) 1732 (175) b 1182 (161) a 635 (65) b 264 (42) a 30772 (5293) ab 22195 (1669) a 1005 (139) 858 (103) 21015 (2218) b 6938 (1832) ab 99097 (20294) a 112426 (16471) ab 2422 (271) ab 1771 (151) a 4732 (569) 3322 (519) a FML – 1 año 529 (65) a 526 (89) 1054 (131) a 268 (30) a 27042 (2817) ab 892 (26) 112476 (9176) c 120881 (11206) ab 2064 (145) ab 4356 (337) control (muestras sin FML) y fml (muestras con FML por duplicado), analizados luego de la FML y con un año de conservación. 179 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Figura 4.4 Perfiles medios de los compuestos volátiles agrupados para las muestras con- trol y con FML, analizadas luego de la FML y con un año de conservación, calculados a partir de la abundancia relativa (%) de cada compuesto. Σ acetatos lsd = 17 80 Σ alcoholes superiores Σ esteres 60 lsd = 17 lsd = 25 40 20 0 Σ acetatos + Σ esteres lactato de etilo lsd = 17 lsd = 19 lsd = 26 alcohol β-fenil etílico lsd = 21 acetato de isoamilo control (2 meses) fml (2 meses) control (1 año) fml (1 año) Estudio de los compuestos aromáticos ligados En la Tabla 4.6 se presentan los valores medios para las concentraciones de los compuestos volátiles ligados, pudiendo observarse en la mayoría de ellos, como en el experimento anterior, una disminución significativa en las muestras luego de la FML lo cual puede deberse a la actividad β-glicosidasa de Oenococcus oeni demostrada “in vitro” por otros autores (Grimaldi et al., 2000; Guilloux-Benatier et al., 1993). Nuevamente se observa una disminución de concentración de todos los grupos de compuestos ligados en las muestras con FML (Figura 4.5). Esta liberación de aromas ligados no produce el aumento correspondiente de los compuestos libres, lo cual se ejemplifica con el alcohol bencilico en la Figura 4.6, en el cual se obtuvo una disminución de más de 1 mg/L en la forma li180 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat gada para las muestras luego de la FML, pero un incremento no significativo para la forma libre. Las posibles causas de esta diferencia trascienden esta discusión y se estudian en detalle en el capítulo 6. Tabla 4.6 Valores medios de la concentración y desviación estandar de la media (entre paréntesis) de las agliconas (µg/L) para los tratamientos control y con FML (3 vinificaciones, con duplicado en las muestras con FML). Valor de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos, letras cursivas distintas indican diferencias de las medias según LSD test (95 %). Compuesto Terpenos oxido A oxido B linalol hotrienol α-terpineol oxido C citronelol nerol geraniol ác. transgeránico trans-8-hidroxilinalol 7-hidroxigeraniol cis-8-hidroxilinalol Derivados del shiquímico alcohol bencilico alcohol β-feniletílico Alcoholes C6 hexanol trans-3-hexen-1-ol cis-3-hexen-1-ol trans-2-hexen-1-ol Norisoprenoides 3-hidroxi-β-damascona 3-oxo-α-ionol 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol a Control FML p 21.8ª (5.4) 59.1ª (2.9) 14.2ª (2.4) 4.9ª (0.9) 18.8ª (1.7) 21.4ª (3.4) 12.2ª (3.0) 46.1 (5.7) 41.5 (9.2) 10.5 (2.7) 133.0 (41.1) 6.6ª (0.7) 114.0 (11.9) 9.8 (0.9) 26.5b (2.7) 6.2 (0.8) 4.3b (1.1) 6.5 (0.5) 9.1 (0.4) 4.4 (0.5) 21.0 (1.4) 18.3 (1.4) 4.2 (0.8) 87.9 (19.2) 5.5 (1.3) 53.5 (9.6) 0.006 0.006 0.001 0.081 < 0.001 < 0.001 0.001 0.002 0.007 0.050 0.254 0.719 0.020 1893.2 (103.8) 1797.3 (211.2) 816.6 (42.8) 661.8 (42.8) < 0.001 < 0.001 336.8ª (9.6) 13.0a (2.7) 86.8ª (2.8) 46.3ª (2.4) 150.6b (10.0) 4.2 (0.8) 35.1 (5.2) 21.2 (0.9) < 0.001 0.008 0.002 < 0.001 736.3 (42.6) 861.7 (87.6) 326.3 (89.2) 516.7 (141.1) 287.0 (26.8) 443.0 (84.5) 129.9b (24.8) 171.3b (41.2) < 0.001 0.031 0.075 0.057 media de 2 muestras; b media de 5 muestras 181 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Figura 4.5 Valores medios de los compuestos aromáticos ligados agrupados (µg/L) para las muestras control y con FML. La desviación de la media se indica con las barras de error para cada valor. concentración (mg/L) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 no ris op re no id es 6 C al co ho le s al co ho lb en ci lic o bfe ni le til ic o al co ho l te rp en os 0.0 control fml terpenos, linalol + α-terpineol + citronelol + nerol + geraniol alcoholes C6, 1-hexanol + cis-3-hexen-1-ol + trans-2 hexen-1-ol norisoprenoides, 3-hidroxi-β-damascona + 3-oxo-α-ionol + 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol + 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol 182 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 4.6 Valores medios (3 vinificaciones) del alcohol bencilico libre y ligado. La desviación de la media se indica con barras de error para cada valor. alcohol bencilico libre (mg/L) 0.20 0.15 0.10 0.05 alcohol bencilico ligado (mg/L) 0.00 2.0 1.6 ∆ = 1.08 mg/L 1.2 0.8 0.4 0.0 control fml 183 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Análisis de componentes principales El análisis de componentes principales para los datos de los compuestos volátiles libres en las muestras control y con FML para los distintos tiempos de conservación, explicó con los tres primeros componentes principales el 78.7% de la varianza de los datos (46.5% con el primero, 17.1% con el segundo y 15.1% con el tercero). En la Tabla 4.7 se presentan las cargas para los distintos factores de los componentes principales, extraídos mediante el método de rotación con maximización de varianza. Tabla 4.7 Cargas de los factores 1, 2 y 3 del análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres. Se listan las variables con cargas mayores a 0.7 (negrita y cursiva) en alguno de los factores. acetato de isobutilo butanol alcohol isoamilico piruvato de etilo acetato de hexilo 4-metil-1-pentanol 3-metil-1-pentanol lactato de etilo caprilato de etilo lactato de isoamilo caprato de etilo ác. 2- y 3-metil butanoico succinato de dietilo acetato de β-feniletilo 4-hidroxibutanoato de etilo ác. hexanoico alcohol β-feniletílico malato de dietilo 4-vinilguaiacol fenil lactato de etilo 4-vinilfenol 4-carboetoxi-γ-butirolactona 2-hidroxiglutarato de etilo acetoína Factor 1 .70197 .34335 .97255 .77807 .72279 .91900 .92825 -.12748 .86138 -.11721 .82915 .90987 -.21498 .80753 .21060 .81181 .90023 -.07334 -.08939 .80089 .28735 -.20476 .19615 .06192 184 Factor 2 -.457995 .047093 -.063816 -.275243 -.446340 .057098 -.299482 .941981 -.274984 .961269 -.232977 -.029574 .491121 -.194651 -.140169 -.032924 .111682 -.341778 .942675 .173404 .801287 .186822 .328442 .793671 Factor 3 .478616 .704245 -.092401 -.298511 .431871 .250914 -.010786 -.116588 .376650 -.062322 .382485 .201054 -.819611 .504050 .911530 .522805 .336242 -.747157 .243172 -.165199 .343865 -.746385 -.865700 -.300679 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 4.7 Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres. Proyección de las muestras en los componentes principales (a) 1 y 2, y (b) 2 y 3. Se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML, analizadas luego de 2 meses (cm, fm) y 1 año de conservación (ca, fa). 2.5 (a) l1 fa 2.0 l3 fa 1.5 + fa l2 fa Factor 2 (17.1%) 1.0 l1 fm 0.5 l3 fm + fm + ca 0.0 l3 ca -0.5 l2 fm -1.0 l2 ca l3 cm l1 cm l1 ca + cm l2 cm -1.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Factor 1 (46.5%) 2.0 (b) l3 fm 1.5 Factor 3 (15.1%) 1.0 + fm l2 fm l3 cm 0.5 l2 cm l1 fm cm + l3 fa l1 cm 0.0 l2 fa -0.5 -1.0 l1 ca l1 fa 1.5 2.0 l3 ca l2 ca -1.5 -2.0 -2.0 ca + + fa -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 Factor 2 (17.1%) l1, l2 y l3, lotes vinificados 1, 2 y 3 185 1.0 2.5 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Como puede verse en la Figura 4.7, el factor 1 separó los tres lotes vinificados y separa además las muestras control sin conservación del resto de las muestras. Las variables con mayor carga en este factor en el sentido positivo fueron los acetatos de isobutilo, hexilo y β-feniletilo, el piruvato, caprilato y caprato de etilo, los alcoholes isoamílico, 3- y 4- metil-1-pentanol y β-feniletílico, y los ácidos hexanoico, 2- y 3-metil butanoico. El desplazamiento en este sentido de las muestras control sin conservación puede explicarse por su mayor contenido en acetatos y esteres respecto a las otras muestras, mientras que el resto de las variables puede explicar la separación entre los distintos lotes vinificados. En cambio el factor 2 separó las muestras control de las muestras con FML, siendo esta separación mayor para los tratamientos luego de un año de conservación. Las variables con mayor peso en este factor son el lactato de etilo, lactato de isoamilo, 4-vinil guaiacol, 4-vinil fenol y acetoína, estando las muestras con FML desplazadas en este sentido. El factor 3 separa las muestras con distintos tiempos de conservación, estando las muestras sin conservación desplazadas hacia valores positivos y siendo las variables con mayor peso en este sentido el 4-hidroxibutanoato de etilo y el butanol, mientras que las muestras conservadas durante un año se desplazan a valores negativos correspondiendo a las variables succinato de dietilo, malato de dietilo, 4-carboetoxi-γ-butirolactona y 2hidroxiglutarato de etilo el mayor peso en este sentido. Tabla 4.8 Carga de los factores 1 y 2 del análisis de componentes principales para los compuestos volátiles libres agrupados. Se listan las variables con cargas mayores a 0.7 (negrita y cursiva) para alguno de los factores. Factor 1 .808315 .756616 .771641 .721242 -.392458 .133883 -.878596 Σ acetatos Σ acetatos + Σ esteres acetatos de isoamilo Σ alcoholes C6 lactato de etilo Σ alcoholes superiores metab. del α-cetoglutárico 186 Factor 2 -.375727 -.423182 -.422540 .042552 .862632 .963496 .030629 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 4.8 Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles agrupados. Proyección de las muestras en los componentes principales 1 y 2, se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML analizadas luego de 2 meses (cm, fm) y un año de conservación (ca, fa). 2.2 l1 fa 1.6 1.0 Factor 2 (22.8%) l1 fm + l3 fa fa l2 fa l3 fm + fm 0.4 -0.2 l2 fm l2 ca l3 ca + ca -0.8 l1 cm l1 ca l3 cm l2 cm -1.4 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 + cm 1.0 1.5 2.0 Factor 1 (56.0%) l1, l2 y l3: lotes vinificados 1, 2 y 3 En el análisis de componentes principales para los compuestos volátiles agrupados, los dos primeros factores explican el 78.8% de la varianza de los datos (56.0% con el primer factor y 22.8% con el segundo). El factor 1 separa las muestras según su tiempo de conservación (Figura 4.8), siendo las variables con mayor carga para valores positivos, hacia los cuales se desplazan las muestras sin conservación, la Σ acetatos, Σ acetatos + Σ esteres, acetato de isoamilo y Σ alcoholes C6, mientras que los compuestos del metabolismo del α-cetoglutárico es la variables con mayor carga para valores negativos (Tabla 4.8). El factor 2 separa las muestras control y con FML, teniendo la mayor carga el lactato de etilo y la Σ alcoholes superiores ambos en sentido positivo hacia los cuales de ubican las muestras con FML. 187 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Análisis discriminante Figura 4.9 Análisis discriminante para los grupos control y FML analizados luego de una conservación de 2 meses y un año, utilizando los compuestos volátiles libres. Los factores que descriminan entre los grupos se presentan en forma de vectores. 30 sucet lacet 25 20 15 Root 2 10 suchet 5 malet 0 -5 piret -10 c8et -15 control (1 mes) fml (1 mes) -20 -25 -80 control (1 año) -60 -40 -20 0 20 40 60 fml (1 año) Root 1 lacet = lactato de etilo malet = malato de dietilo sucet = succinato de dietilo suchet = succinato ácido de etilo piret = piruvato de etilo c8et = caprilato de etilo En la Figura 4.9 se muestra el análisis discriminate de las muestras para los compuestos volátiles pertenecientes a la fracción libre. Las variables que discriminan entre el tratamiento control y con FML, y para los distintos tiempos de conservación, son lactato de etilo (lacet), succinato de dietilo (sucet), succinato ácido de etilo (suchet), malato de dietilo (malet), piruvato de etilo (piret) y caprilato de etilo (c8et). El lactato de etilo presenta la mayor correlación con el grupo de muestras con FML y un año de conservación, el succinato de dietilo y el succinato ácido de etilo correlacionan con los dos grupos de muestras conservadas 1 año, el malato de dietilo con las muestras control conservadas un 188 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat año, mientras que el piruvato de etilo y el caprilato de etilo con las muestras control y sin conservación. Figura 4.10 Análisis discriminante para los grupos control y FML analizados luego de una conservación de 2 meses y un año, utilizando los compuestos volátiles libres agrupados. Los factores que descriminan entre los grupos se presentan en forma de vectores. 8 6 4 acisoam lacet Root 2 2 0 sest -2 -4 control (1 mes) -6 -8 -10 fml (1 mes) control (1 año) -8 -6 -4 -2 0 2 Root 1 lacet = lactato de etilo acisoam = acetato de isoamilo sest = Σ esteres 189 4 6 8 10 fml (1 año) Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella En la Figura 4.10 se muestra el análisis discriminante para las variables agrupadas según el criterio antes establecido. En este caso puede verse que las variables que disciminan los grupos con diferente tratamiento son lactato de etilo (lacet), acetato de isoamilo (acisoam) y Σ esteres (sest). El lactato de etilo, nuevamente en este análisis, presenta la ma- yor correlación con las muestras con FML conservadas 1 año, el acetato de isoamilo correlaciona con los dos grupos de muestras sin conservación, y la Σ esteres con los grupos sin fermentación maloláctica. Conclusiones Al igual que en el capítulo anterior, se observó un gran número de compuestos volátiles presentes en el vino de la variedad Tannat, cuya concentración varia con la fermentación maloláctica, pero un número mayor de compuestos varia su concentración durante la conservación en botella. Estos cambios durante la conservación provocan, en algunos casos, diferencias mayores entre los vinos control y con FML, mientras que en otros casos provoca la desaparición de las diferencias significativas. Dentro de las variaciones más importantes detectadas durante la conservación, y que provocan una desaparición de las diferencias entre los tratamientos (control y con FML), se encontró una disminución de los acetatos y esteres etílicos. En cambio otros ésteres como el lactato de etilo y el malato de dietilo presentaron un comportamiento opuesto, aumentando su concentración en los vinos con FML el primero, y el segundo aumentando su concentración en los vinos control (sin FML). El comportamiento de estos compuestos provoca un aumento de las diferencias entre los tratamientos. Durante la conservación se observó un aumento en la γ-butirolactona por formación a partir del 4-hidroxibutanoato, en este caso los valores de estas variaciones son mayores para los vinos con fermentación maloláctica, un comportamiento que puede ser explicado posiblemente por el metabolismo del α-cetoglutarato durante esta fermentación. Por otra parte, varios compuestos como el succinato de dietilo, succinato ácido de etilo y 2-hidroxiglutarato de dietilo, presentaron incrementos similares en todas las muestras durante la conservación. En el caso de los compuestos ligados, nuevamente se observó una disminución importante de un gran número de estos compuestos durante la FML. Sin embargo esta diminución 190 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat no provocó un incremento de la concentración de las agliconas correspondientes en la fracción libre, lo cual se demostró para un compuesto con buena estabilidad como es el alcohol bencílico. En conclusión, durante la FML y la conservación posterior, se observan cambios en la concentración para un gran número de compuestos volátiles. La magnitud de estos cambios en algunos compuestos puede ser mayor que su umbral de percepción y por lo tanto provocar modificaciones en el perfil sensorial de esos vinos. 191 Capítulo 4 – Efecto de la crianza del vino en botella Bibliografía Adams, R. P. Identification of essential oils by gas chromatography/mass spectroscopy, 1st. ed.; Allured Publ. Corp.: Illinois, 1995. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Malolactic fermentation and wine flavour. The Australian Grapegrower & Winemaker 1995, 378a, 83-94. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. 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Estudio de la variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo. Introducción Los compuestos quirales en la naturaleza Los compuestos quirales responsables de aromas de orígen natural se caracterizan por una distribución específica y definida de sus enantiómeros. La bioquímica de las plantas produce un número elevado de metabolitos cuyas configuraciones estereoquímicas se encuentran determinadas por transformaciones enzimáticas precisas. Como resultado, la mayor parte de los compuestos orgánicos encontrados en la naturaleza poseen una quiralidad definida. Algunos de estos componentes existen sólo en una forma enantiomérica, mientras que en otros casos la distribución enantiomérica del metabolito puede variar según el taxón de que se trate. Un comportamiento particularmente interesante está relacionado con el reconocimiento quiral de las moléculas por los organismos vivos, a través de mediadores (enzimas, receptores), provocando diferencias en el efecto relativo sobre el organismo de cada enantiómero presente en las mezclas isoméricas de drogas, herbicidas, pesticidas, factores de crecimiento, así como en compuestos responsables del aroma y sabor, y sus precursores (Ohloff, 1994; Pickenhagen, 1989). En este sentido, la discriminación quiral es considerada como un principio importante vinculado con la percepción de aroma, por lo que la determinación de la distribución enantiomérica permite la clasificación y validación de las matrices complejas responsables de aroma y sabor. Esta situación ve incrementada su importancia en matrices en las que se encuentran involucrados procesos fermentativos que, por lo tanto, se relacionan con el metabolismo microbiano y aumentan la posibilidad de formación de metabolitos con centros asimétricos en su estructura, o la transformación de los existentes a otros con nuevos centros asimétricos. Debido a las diferencias en las propiedades sensoriales, y en base al conocimiento de que las enzimas catalizan reacciones dando lugar a moléculas quirales generalmente con alta enantioselectividad, la determinacion de la configuración estereoquímica de aromas qui197 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo rales incluyendo sus precursores y metabolitos, se ha transformado en un campo de intensa actividad de investigación (Schreier, 1992; Werkhoff et al., 1993). A su vez, la relación de esta herramienta con técnicas bioquímicas particulares, ha facilitado el estudio de los mecanismos asociados a la biosíntesis de diferentes metabolitos, particularmente terpenoides (Kreck et al., 2002; Lorenzo et al., 2002). Por otra parte, el desarrollo de fases quirales estables para cromatografía gaseosa ha permitido estudiar la distribución enatiomérica de terpenoides y un importante número de otros componentes volátiles presentes en matrices de diferente origen y naturaleza (Bicchi et al., 1999). En los últimos años este tipo de análisis se ha utilizado también como una herramienta analítica y una herramienta de investigación en la detección de adulterantes, caracterización de perfiles de composición para certificar la genuinidad y origen de las matrices. De este modo, la evaluación quiral de los componentes en mezclas ha sido introducida como un indicador de genuinidad fundamental y novedoso lo que determinó su adopción en el control de calidad por la industria de sabores y fragancias. Desarrollo de nuevas técnicas para la determinación del exceso enantiomérico La determinación del exceso enantiomérico de los compuestos quirales volátiles en las matrices en estudio puede hacerse por GC con columnas quirales, ya sea mediante prefraccionamiento para obtener compuestos puros y separar luego ambos enantiómeros, o utilizando un sistema GC-GC multidimensional (MDGC). Inicialmente se utilizó como selectores quirales a derivados de aminoácidos. Las técnicas de cromatografía gaseosa quiral disponibles en la actualidad cubren un amplio espectro de compuestos, utilizando diferentes fenómenos (formación de enlaces de hidrógeno, fases unidas a polisiloxano, fases basadas en la formación de complejo metálicos quirales, fases basadas en efectos de inclusión). La técnica que utiliza selectores quirales que actúan mediante la formación de complejos de inclusión con los analitos parece ser la más versátil. Las fases con ciclodextrinas alquiladas presentan enantioselectividad hacia un amplio espectro de analitos, siendo prácticamente únicas en su capacidad de separar enantiómeros de hidrocarburos saturados las columnas que contienen ciclodextrinas disueltas en la fase estacionaria. Las ciclodextrinas son una serie homóloga de oligosacáridos cíclicos no reductores constituídos de 6 ó mas unidades de D-glucopiranósidos unidos entre si por uniones α-(1,4) glucosídicas. Se han identificado y aislado (α-, β-, γ-, δ-) ciclodextrinas, con 6 a 9 unida198 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat des glucopiranósicas. Debido a su origen biotecnológico a partir del almidón natural, se han encontrado sólo los enantiómeros dextrorotatorios. Las separaciones quirales son posibles debido a la gran flexibilidad de este tipo de ciclodextrinas, en comparación con las ciclodextrinas no modificadas que son conformacionalmente más rígidas. Soluciones de ciclodextrinas peralquiladas en polisiloxanos moderadamente polares, utilizados en columnas empacadas o en columnas capilares, han resultado útiles para la separación de enantiómeros por cromatografía gaseosa. La gran complejidad en la composición de las mezclas volátiles demanda de la mejor resolución posible, pero aun en los sistemas de HRGC más eficientes, la resolución completa no puede ser lograda. Una aproximación eficiente al problema puede darse mediante el acoplamiento de dos cromatógrafos resultando en la aplicación de una técnica cromatográfica bidimensional. El primero equipado con una precolumna con la fase estacionaria en la cual se ha estudiado la composición química de la mezcla en cuestión, y un segundo cromatógrafo unido por una interfase a través de la cual solo aquellos compuestos que interesan son transferidos (heart-cut) a una columna quiral que permita la resolución de los enantiómeros en estudio. Esta aproximación ha dado muy buenos resultados en el caso de los aceites esenciales utilizando una precolumna con SE-52 como fase estacionaria y una columna analítica quiral con una ciclodextrina modificada como fase estacionaria. En la Figura 5.1 se muestra la configuración de un sistema bidimensional con dos cromatógrafos de gases acoplados a través de una interfase que permite la transferencia de los componentes de interés mediante la técnica de heart-cut. En resumen, la cromatografía gaseosa enantioselectiva en sus diferentes formas ha encontrado posibilidades de aplicación muy amplias (Marriott et al., 2001). La estereoisomería óptica y la percepción de los aromas Desde comienzos del siglo XX, la investigación en aromas ha reconocido que los enantiómeros de algunas sustancias, tales como el mentol y la carvona, tienen diferentes propiedades sensoriales. Sin embargo, este concepto no fue aceptado por muchos autores hasta mediados de los años ’70, principalmente debido a la dificultad de obtener hasta ese momento un exceso enantiomérico o la pureza suficiente para las evaluaciones sensoriales (Leffingwell, 2001). 199 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo Figura 5.1 Esquema del sistema utilizado con acoplamiento de dos GC, GC1 y GC2, estando equipado el último con una con columna quiral. Separación de compuestos de la muestra en GC1 Transferencia del compuesto quiral al GC 2 Separación quiral en el GC 2 El mecanismo de percepción del olor es muy complicado y continúa aún siendo discutido. Sin embargo se ha aceptado que previo al reconocimiento en el cerebro, tienen lugar la siguiente serie de eventos (Pickenhagen, 1989); estímulo → receptor → transducción → procesado En estos diferentes pasos es interesante, para este trabajo específicamente, la interacción del estímulo (molécula que tiene olor) y el receptor. Los receptores se encuentran en una pequeña porción de la mucosa nasal o pituitaria, donde se ubican las células nerviosas cuyas dendritas terminan en prologaciones filiformes o cilios olfatorios, siendo estos excitados por los estímulos químicos. 200 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 5.1 Descriptores sensoriales y umbrales de percepcióna (µg/L) al olfato, en agua, para los enantiómeros de algunos compuestos volátiles que se pueden encontrar en los vinos. Compuesto Descriptor Umbral de percepción 200 500 ndb nd (R)-(+)-limoneno citrus fresco, similar a naranja (S)-(-)-limoneno aspero, similar a trementina, notas de limón olor a coníferas (S)-(-)-α-terpineol floral pesado, similar a lirios (R)-(+)-α-terpineol (4R,2S)-(-)-cis-óxido de rosa floral verde, liviano, notas a rosa verde, fuerte; tam0.5 bién a sido descripto como fruta potente (4S,2R)-(+)-cis-óxido de hierba, floral verde, heno verde, tierra, pesado; tam50 rosa bién ha sido descripto como dulce, floral (4R,2R)-(-)-trans-óxido de floral verde, hierba 160 rosa (4S,2S)-(+)-trans-óxido de hierba verde, floral frutoso, rosa hebáceo, citrus (cás80 rosa cara amarga) (S)-(-)-óxido de nerol verde, especiado, geranio nd (R)-(+)-óxido de nerol verde, floral, menos complejo que el (S)-enantiómero nd (S)-(+)-linalol dulce, floral; olor que recuerda a lavanda 35-40 (R)-(-)-linalol floral, notas a lavanda leñosa 9-11 (S)-(-)-citronelol floral, similar a rosa, recuerdos a aceite de geranio; también descripto como muy liviano y fresco, y hojas 40-50 de rosa, similar a pétalos (R)-(+)-citronelol similar a aceite de citronela; también descripto como aceite débil de hojas de rosa, similara a pétalos con 50 nota irritante encima similar a violeta, frutoso, similar a frambuesa, fuerte (R)-(+)-(E)-α-ionona 0.03 – 328 impacto leñoso, similar a madera de cedro, similar a frambuesa (S)-(-)-(E)-α-ionona 0.1 – 656 y β-ionona (R)-(+)-2-metil butanol fermentado, untuoso nd (S)-(-)-2-metil butanol sutil, fresco nd (S)-(+)-ác. 2-metil butanoico frutoso, dulce nd (R)-(-)-ác. 2-metil butanoico queso, transpirado nd (S)-(+)-2-metilbutanoato de fruta fresca, similar a manzana 0.006 etilo (R)-(-)-2-metilbutanoato de fruta, caprílico ~1 etilo (S)-(+)-1-octen-3-ol mohoso, pastoso, artificial; también descripto como nd herbáceo, verde, viejo (R)-(-)-1-octen-3-ol fruta, similar a hongos; también descripto con intensas nd notas a hongos, futa, suave a b adaptado de Leffingwell (2001). nd, no disponible 201 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo En analogía con otros sistemas receptores, es generalmente aceptado que los receptores del aroma son proteínas, produciendo pequeños cambios en las moléculas estímulo, grandes cambios tanto cualitativos como cuantitativos en la percepción del olor. Las proteínas pueden interactuar en forma diferente con las distintas formas enantioméricas de una mólecula quiral, y por lo tanto resultar eventualmente en una diferencia en la percepción del aroma. Se han escrito varias revisiones sobre los estudios de la percepción de los aromas de las moléculas quirales (Ohloff, 1994; Pickenhagen, 1989), y en estos últimos años se han agregado muchas descripciones de los aromas de los enantiómeros para nuevos compuestos (Frater et al., 1998; Frater et al., 1999; Gautschi et al., 2001; Kraft et al., 2000; Kraft y Frater, 2001). Varios de los compuestos ópticamente activos reportados en la bibliografía, y con diferencias sensoriales entre sus isómeros ópticos, pueden encontrarse en los vinos. En la Tabla 5.1 se presentan algunos de ellos, incluidos algunos alcoholes superiores y esteres, donde se muestra también las diferencias en los descriptores del aroma para los distintos enantiómeros, y las variaciones en los umbrales de percepción al olfato (en agua) para las distintas formas enantioméricas. Algunos autores han estudiado la relación enantiomérica de varios compuestos aromáticos en la uva y el vinos como ser el linalol y α-terpineol en la variedad moscatel (Doglia, 1993; Garcia Moruno, 1999; Tateo y Bononi, 1997), varias lactonas en vinos producidos bajo “velo de flor” (por ej. vinos de Jerez) y vinos botritizados (Brueche et al., 1991; Guichard et al., 1992; Hollnagel et al., 1991), vitispiranos en el cv Riesling (Full y Winterhalter, 1995), y compuestos cedidos por la madera durante la conservación como la βmetil-γ-octalactona (Guichard et al., 1995; Masson et al., 1997). Los compuestos enantioméricos en la fermentación maloláctica En el mosto fresco, los isómeros D(-) y L(+) del ácido láctico [enantiómeros (R)-(-)- y (S)-(+)-] están ausentes, mientras que en el vino son producidos por las levaduras y las bacterias lácticas (Oenococcus, Pediococcus y Lactobacillus), que pueden sintetizar ambos isómeros a partir de glucosa, fructosa y pentosas (Ribereau-Gayon et al., 1998). Generalmente se forman 0.3-0.7 g/L de ácido láctico durante una “correcta” fermentación alcohólica, mientras que una concentración mayor a 0.5 g/L del isómero (S)-(+)-ácido 202 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat láctico, representa un índice de la presencia de vias de fermentación anormales (Bandion y Valenta, 1977; Delfini et al., 2001). Durante la fermentación maloláctica, las bacterias lácticas metabolizan el ácido L-(-)málico, formando solamente ácido L-(+)- láctico [(S)-(+)-ácido láctico] y CO2 (HenickKling, 1993). La estereoisomería de algunos compuestos volátiles producidos por distintas cepas de bacterias lácticas durante esta etapa del proceso de vinificación, como el 2,3butanodiol y la acetoína, , ha sido estudiada por varios autores (Herold et al., 1995; Ui et al., 1986). En particular, el lactato de etilo es un compuesto aromático del vino importante producido durante la FML (Bartowsky y Henschke, 1995; Bertrand et al., 1984; Davis et al., 1985; Herjavec y Tupajic, 1998), pudiendo incrementarse su concentracion a valores que exceden el umbral de percepción de 60-110 mg/L (Dittrich, 1987), y dando un paladar “más gordo” y “más lleno” al vino (Henick-Kling, 1993). Los descriptores aromáticos que lo definen son “dulce”, “fruta” y notas de “ananá con caramelo castaño” (Mosciano et al., 1993). El lactato de etilo es también un producto de la fermentación de las levadu- ras, y su nivel puede caracterizar la presencia de algunas cepas, por ej. el Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum, por su alta producción de este metabolito (Ciolfi y Di Stefano, 1983). Mientras que el isómero (R)- del lactato de etilo ha sido caracterizado como un compuesto quiral genuino de los vinos, debido a su presencia por la fermentación de levaduras, el correspondiente enantiómero (S)- se ha reportado como un indicador de FML o contaminación con bacterias lácticas (LAB) (Kaunzinger et al., 1996). La modificación sensorial del perfil aromático producida por la FML en los vinos tintos ha sido reportada por algunos autores (McDaniel et al., 1987; Sauvageot y Vivier, 1997), y se estudiará en profundidad para vinos de la variedad Tannat en el Capítulo 7. Esta modificación sensorial puede deberse a cambios en la concentración de varios compuestos volátiles, interacciones con otras sustancias, y posiblemente además para el caso de notas particulares, a cambios en la relación entantiómerica de algunos compuestos volátiles presentes y con actividad quiral. 203 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo Objetivo En el presente capítulo se estudia la variación en los contenidos del lactato de etilo en vinos control y con FML, su relación enantiomérica en las muestras de los distintos grupos de muestras, y las diferencias sensoriales de los distintos enantiómeros, por su posible participación en las modificaciones producidas por la FML sobre las características sensoriales de los vinos Tannat. Materiales y métodos Muestras utilizadas Se analizaron las muestras control y con FML (usando la cepa DSM 7008) en los tres lotes vinificados en 1999 (l1, l2, l3), las muestras con FML (usando la cepa D-11) de los cuatro lotes vinificados en 1998 (v1, v2, v3, v4), y dos muestras de una vinificación a escala industrial en el año 2000 (c1), de uvas de la varidad Tannat, clon 398, cultivadas en la zona de Canelón Chico (suministrada por Bodega y Viñedos Améndola Hnos. y Boido S.C.). En este último caso, las muestras fueron extraídas, una previo a la fermentación maloláctica (control), y la otra luego de la misma, siendo inoculado el vino con O. oeni cepa DSM 7008. Todas las muestras se analizaron en el mes de abril de 2000, teniendo por lo tanto parte de las muestras un año y otras dos años de conservación, solo las muestras de la vinificación del 2000 fueron analizadas sin conservación. Hasta el momento de ser analizadas, todas las muestras se conservaron a 18°C. Aislamiento del lactato de etilo La extracción de los componentes volátiles no glicosidados se realizó utilizando cartuchos Isolute ENV+ según lo descripto en el capítulo 2, obteniéndose por esta metodología una mayor recuperación de lactato de etilo, que con la tradicional extracción con resina XAD-2 (Carlin, 1998). El lactato de etilo y el resto de los compuestos aromáticos libres se eluyeron con diclorometano, se anhidrificó con Na2SO4 y concentró hasta 0.3 mL mediante corriente de N2. 204 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Identificación y cuantificación La identificación se realizó mediante GC-MS en las condiciones descriptas en el Capítulo 2, equipado con librerias de referencia (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991) y librería propia realizada con estándares. La identificación del lactato de etilo se confirmó por medio de índices de retención de Kovats, determinados mediante la inyección de un estandar del compuesto y la mezcla de n-alcanos correspondiente según se describió en el Capítulo 2. De esta forma se obtuvo un valor de índice de retención para el lactato de etilo de 1353 para las condiciones de trabajo. La cuantificación se realizó por medio de HRGC según las condiciónes descriptas en el Capítulo 2, equipado con detector de ionización de llama (FID) y usando n-heptanol como estandar interno. Análisis de la relación enantiomérica para el lactato de etilo La relación enantiomérica del lactato de etilo fue obtenida por cromatografía multidimensional (MDGC), usando el modelo desarrollado por Mondello et al. (1998), mediante el acoplamiento de dos cromatógrafos con una interfase calentada, una válvula rotativa y un sistema para asegurar el flujo constante durante la transferencia (Figura 5.1). El primer GC fue equipado con una columna capilar de sílica fundida, de 25 m x 0.25 mm i.d. y film de 0.25 µm de espesor, con fase estacionaria BP 20 (SGE, Australia), y el segundo con una columna capilar, de las mismas dimensiones que la anterior, con la fase estacionaria quiral 2,3-di-O-etil 6-O-t-butildimetilsilil-β-ciclodextrina en PS 086 (13 % fenilmetil-polisiloxano). Con este sistema es posible realizar un “heart-cut” de las picos seleccionados y transferir los componentes desde la pre-columna (no quiral) a la columna analítica (quiral) en las condiciones experimentales. previamente descritas (Loayza et al., 1999). En la Figura 5.2 se puede ver un ejemplo de los cromatogramas obtenidos indicando el corte del pico correspondiente al lactato de etilo, y la separación de los enantiomeros en la columna quiral para muestras control y con FML. 205 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo Figura 5.2 Análisis de los enantiómeros del lactato de etilo en las muestras de vino Tan- nat; (a) muestras con FML en la precolumna y (b) “heart-cut” del pico correspondiente al lactato de etilo; (c) separación en la columna quiral de los isómeros para las muestras con FML y (d) control (sin FML). GC1 a GC2 OH O O 1- (R)(+)-lactato de etilo GC1 b GC2 OH O heart-cut O 2- (S)(-)-lactato de etilo mV GC1 GC2 c mV 1 2 d 1 2 206 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Reactivos utilizados El enantiómero puro, (S)-lactato de etilo, se obtuvo de Aldrich (98%, Aldrich E3, 410-2, USA). El racemato fue obtenido por síntesis a partir de ácido láctico (85%, Aldrich W261106, USA) y etanol en medio sulfúrico, la relación enantiomérica se verificó por cromatografía gaseosa multidimensional usando una fase estacionaria quiral como se describe más arriba. Determinación de los descriptores aromáticos El enantiómero puro (S)-lactato de etilo y el racemato sintetizado fueron agregados a una mezcla de agua/etanol (90 + 10, v/v) en concentraciones similares a las determinadas en vinos Tannat luego de la FML (90-120 mg/L). Luego de agitar las mezclas por 30 minutos, las mismas fueron comparadas por tres jueces (enólogos) de forma de evaluar los atributos de aroma para cada compuesto. Determinación del umbral de percepción al olfato Los valores del umbral del aroma para el (S)-lactato de etilo fueron determinados mediante un test triangular usando una muestra sin FML como blanco. Se presentó un volumen de 60 mL de las muestras a 20 ± 1°C, en copas normalizadas (ISO3591, 1977), identificadas con dos digitos aleatorios y cubiertas con un vidrio de reloj. Los test se realizaron presentando las muestras en forma individual, en orden creciente de concentración (50, 80, 110, 140, 170 mg/L) a seis jueces entrenados para identificar las posibles diferencias. La concentración a la cual el 50% de los jueces respondió correctamente al test triangular se tomó como el valor de umbral del aroma (Marchand et al., 2000; Nakamura et al., 1988). Resultados y discusión Los resultados obtenidos en el análisis de las muestras con los distintos tratamientos se presentan en la Tabla 5.2 y Figura 5.3. Los valores presentados en la Tabla 5.2 para las muestras con FML utilizando la cepa D-11 son mayores a los presentados en el Capítulo 3, Tabla 3.6, lo cual se explica por el mayor tiempo de conservación lo que causó un incremento en la concentración de lactato de etilo, como se determinó en el Capítulo 4. Otro factor a tener en cuenta es el empleo de una diferente técnica de extracción, ya que 207 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo como se discutió en el Capítulo 2, el uso de cartuchos ENV+ presenta un incremento de la retención de muchos compuestos volátiles cuando se compara los resultados con los obtenidos por extracción con la resina XAD-2 (Carlin, 1998). Tabla 5.2 Resultados de los análisis de composición quiral para el lactato de etilo en las distintas muestras. Valores medios (± desviación de la media) en mg/L, para el lactato de etilo total y los dos enantiómeros; y rango de porcentajes para los enantiomeros. Letras en cursiva diferente indican diferencias en las medias para el test LSD (95%). control a lactato de etilo (mg/L) 6.3 ± 1.7 a (S)- (mg/L) 1.96 ± 0.98 a (R)- (mg/L) 4.34 ± 0.86 a (S)- c 6 – 42% (R)- c 58 –94% DSM 7008 a D-11 a Fb 99 ± 18 b 144 ± 20 c 20.49 72 ± 15 b 111.8 ± 9.1 c 31.25 27.3 ± 6.5 b 32 ± 11 b 3.87 57 – 86% 68 – 89% 14 – 43% 11 – 32% - pb < 0.001 < 0.001 0.061 - a control, muestras sin FML; DSM 7008 y D-11, muestras con FML usando cada una de las cepas valores de F y p del análisis de varianza para los distintos tratamientos (control y con fermentación maloláctica para las dos cepas utilizadas) c valor mínimo y máximo para las muestras analizadas en cada tratamiento. b Las muestras con FML presentaron concentraciones de lactato de etilo 15 a 20 veces mayores que las muestras control. Este incremento es mayor en las muestras que han tenido un período mayor de conservación previo al análisis, debido al incremento producido en este compuesto durante la misma como se demostró en el Capítulo 4, y a sido reportado por otros autores (Cantagrel y Carles, 1978; Pérez-Coello et al., 1999; Versini y Margheri, 1981). Las muestras sin FML - con contenidos de lactato de etilo entre 5-10 mg/L - poseen un exceso enantiomérico para el (R)-lactato de etilo en el rango de 58 – 94% para las muestras analizadas. En cambio para las muestras con FML- los contenidos totales de lactato de etilo fueron entre 60-180 mg/L - pero con un exceso para el (S)-lactato de etilo en porcentaje dependientes de la cepa utilizada: 57 – 86% para la cepa DSM 7008 y 68 – 89% para la cepa D-11. 208 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 5.3 Concentración de los enantiomeros (S)- y (R)-lactato de etilo en las muestras control y con FML utilizando diferentes cepas de O. oeni. Cada valor representa la media para cada tratamiento; las barras de error indican la desviación de la media para cada valor. 120 Concentración (mg/L) 100 S(-)-lactato de etilo R(+)-lactato de etilo 80 60 40 20 0 control DSM 7008 D-11 Este incremento en el exceso enantiomérico para el (S)-lactato de etilo se explica por un aumento significativo (p < 0.001) de las concentraciones de este isómero en las muestras con FML, mientras que el isómero (R)-lactato de etilo presenta un menor valor de incremento, con bajo nivel de significación (p = 0.061). Los valores de concentración de lactato de etilo determinados para las muestras con FML presentan diferencias en la concentración del isómero (S)-, dependiendo de la cepa utilizada, con valores menores (47 – 106 mg/L) en las muestras que se utilizó la cepa DSM 7008, que en las que se utilizó la cepa D-11 (87 – 128 mg/L). Estas diferencias, si bien pueden adjudicarse al mayor tiempo de conservación hasta el momento del análisis, para las muestras en las que se usó la cepa D-11, también se encontraron en la determinación del lactato de etilo en los análisis luego de la FML (Tabla 3.6). Por lo tanto, las variaciones detectadas se explican, al menos en parte, debido a una mayor producción de lactato de etilo por una de estas cepas. 209 Capítulo 5 – Variación en la relación enantiomérica del lactato de etilo Por comparación al olfato utilizando soluciones alcohólicas del enantiómero (S)- puro y el racemato sintetizado, se establecieron diferencias que indican un predominio de notas frutales, fruta ácida y ciruela para el enantiómero (S)-. La determinación del umbral de percepción en vino base para este isómero resultó en 90 mg/L, lo cual es coincidente con datos de bibliografía para la forma racémica (Dittrich, 1987). Este valor es superado por muchas muestras, en particular para las sometidas a fermentación con la cepa D-11, lo cual puede explicar - al menos en parte - las diferencias sensoriales encontradas en las distintas muestras, y que serán discutidas en profundidad en el Capítulo 7. Conclusiones Durante la fermentación maloláctica se produce un incremento en la concentración de lactato de etilo, encontrándose además diferencias en su distribución enantiomérica. Los vinos control (sin FML) presentan un contenido mayor para el isómero (R)-, mientras que en la FML se produce un incremento significativo de la forma (S)- pasando a ser el isómero predominante. Este incremento resultó ser dependiente de la cepa utilizada, en las condiciones experimentales. Los enantiómero del lactato de etilo presentaron, en el análisis sensorial, diferencias en los descriptores aromáticos; describiéndose la forma (S)- como fruta ácida, ciruela, más frutado que la forma racémica. La determinación del umbral de percepción en vino base para el isómero (S)- resultó en 90 mg/L, lo cual es coincidente con datos de bibliografía para la forma racémica El incremento significativo en el enantiómero (S)- del lactato de etilo puede ser el responsable, en parte, de los cambios sensoriales en los vinos al producirse la fermentación maloláctica. Estos cambios pueden ser mayores durante la crianza del vino debido al incremento del lactato de etilo tal como se demostró en el Capítulo 4. 210 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía Adams, R. P. Identification of essential oils by gas chromatography/mass spectroscopy, 1st. ed.; Allured Publ. Corp.: Illinois, 1995. Bandion, F.; Valenta, M. Zur Beurteilung des D(-) und L(+)-Milchsäuregehaltes in Wein. Mitteilungen Klosterneuburg 1977, 27, 4-9. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Malolactic fermentation and wine flavour. The Australian Grapegrower & Winemaker 1995, 378a, 83-94. 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Introducción Compuestos glicosidados en enología Muchos compuestos coloreados tales como antocianinas, o compuestos importantes por su impacto aromático como los terpenos, C13-norisoprenoides y compuestos derivados del ácido shikímico, se encuentran presentes en los jugos de uva y otras frutas en forma conjugada. Los compuestos volátiles se unen a una molécula de glucosa dando β-Dglucósidos, o se unen con disacáridos formando glicósidos más complejos. En uvas y vinos se han identificado el 6-O-(α-L-arabinofuranosil)-β-D-glucopiranósidos, 6-O-(αL-ramnopiranosil)-β-D-glucopiranósidos (o β-rutinósidos), y 6-O-(β-D-apiofuranosil)-βD-glucopiranósidos (Marinos et al., 1994; Vasserot et al., 1995; Voirin et al., 1990b; Williams, 1993; Williams et al., 1982a; Winterhalter y Skouroumounis, 1997). En el caso de las antocianinas, la unión a la glucosa se realiza como β-D-glucopiranósidos, pudiendo también la unidad de glucosa estar acilada con ácido acético, cumárico o cafeico (Albach et al., 1965; Fong et al., 1974; Hrazdina y Franzese, 1974; Ribereau-Gayon et al., 1998). La hidrólisis de las antocianinas glicosidadas da como resultado una disminu- ción en la estabilidad de estas moléculas, provocando como consecuencia una pérdida de la intensidad colorante del producto (Ribereau-Gayon et al., 1998). Sin embargo, desde el punto de vista del perfil aromático de un vino, la liberación de los compuestos aromáticos glicosidados, tales como los monoterpenoles, es importante por la contribución de las agliconas al aroma característico de ciertas variedades como los Moscateles (Bayonove y Cordonnier, 1971; Ribéreau-Gayon et al., 1975). El análisis sensorial de los productos de hidrólisis ha demostrado la contribución de otros compuestos glicosidados al aroma de variedades como por ejemplo el Semillón (Francis et al., 1996), o algunas variedades de origen italiano (Nicolini et al., 1994a). 217 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni Actividad β-glicosidasa en el proceso de vinificación La hidrólisis en medio ácido y temperatura de los glicósidos de la uva ha sido estudiada como un método para liberar los compuestos ligados y aumentar de esa forma el aroma del jugo de uva por formación de compuestos volátiles libres. Sin embargo, este proceso de hidrólisis puede producir también cambios en las agliconas como consecuencia de rearreglos sobre la molécula, los cuales pueden ser favorables o desfavorables (Williams et al., 1982b). Como alternativa, se han propuesto diferentes métodos enzimáticos para transformar estos precursores en compuestos aromáticos activos con cambios mínimos sobre las agliconas (Cordonnier y Bayonove, 1974; Williams, 1993; Winterhalter y Skouroumounis, 1997). Esta metodología aparece como una propuesta viable en el proceso de elaboración del vino, si bien las posibles diferencias en la actividad enzimática pueden variar el perfil aromático y tipicidad de los vinos. La hidrólisis de los glucósidos requiere de la acción de una β-glucosidasa, mientras que la hidrólisis de los glicósidos disacarídicos necesita de una exoglicosidasa para remover la molécula de azúcar externa, y a continuación una β-glucosidasa para remover la glucosa remanente unida al hidroxilo en la aglicona (Günata et al., 1988). Sin embargo, se ha demostrado la existencia de una endoglicosidasa capaz, y actuando por sí sola, de hidrolizar el enlace glicosídico y liberar en una etapa el disacárido de la aglicona correspondiente (Günata et al., 1998). La actividad β-glicosidasa es virtualmente ausente en el jugo de uva por su bajo pH y la presencia de glucosa, inhibidores de esta actividad enzimática (Ayran et al., 1987; Biron et al., 1988; Günata et al., 1990a; Günata et al., 1998; Lecas et al., 1991; Williams, 1993). Por otra parte, la actividad glicosidasa relacionada con Saccharomyces cerevisiae si bien es poco afectada por la presencia de azúcar, es muy reducida en el pH del mosto y el vino (Darriet et al., 1988; Delcroix et al., 1994; Williams, 1993). Finalmente, varias levaduras no-Saccharomyces han demostrado poseer actividad glicosidasa, aunque con una gran inhibición frente a la concentración de glucosa (Charoenchai et al., 1997; Gueguen et al., 1995; Vasserot et al., 1989). Los mejores resultados reportados han sido obtenidos trabajando con cepas de Debaryomyces y Candida (Gueguen y Chemardin, 1996; Rosi et al., 1994; Yanai y Sato, 1999). Muchas β-glicosidasas fúngicas comerciales han sido reportadas para realizar la hidrólisis de compuestos glicosidados, pero en la práctica enológica se presentan problemas por 218 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat inhibición producida por la glucosa (Ayran et al., 1987; Günata et al., 1990b; Shoseyov et al., 1990; Williams, 1993). Se ha demostrado además que estas enzimas comerciales - que estan constituídas por mezclas impuras de glicosidasas, esterasas y oxidasas - pueden causar transformaciones indeseables en las agliconas libres produciendo compuestos no aromáticos o modificaciones no buscadas ni deseadas (Nicolini et al., 1994b; Sefton y Williams, 1991). Actividad β-glicosidasa de Oenococcus oeni La actividad β-glicosidasa para una cepa de Oenococcus oeni fue estudiada por GuillouxBenatier et al. (1993), resultando activa en el pH del mosto (pH 3.5), reteniendo en estas condiciones un 78% de su actividad máxima. En un trabajo reciente con cultivos de 11 preparados comerciales de Oenococcus oeni, se determinó la respuesta de la actividad βglucosidasa respecto a distintos valores de pH (3.0 – 4.0), concentaciones de glucosa/fructosa (0 – 150 mM) y etanol (10 – 14% v/v), y al efecto combinado de estos factores, obteniéndose diferentes comportamientos para las distintas cepas, pero reteniendo varias de ellas una importante actividad en las condiciones desfavorables del vino (Grimaldi et al., 2000). Sin embargo, es de destacarse que a pesar de que la actividad β-glicosidasa del O. oeni ha sido demostrada para distintas condiciones en medio sintético, la actividad sobre los compuestos ligados durante la fermentación maloláctica en el transcurso de la vinificación no ha sido investigada. Objetivo En este capítulo se evalúa la actividad β-glicosidasa desarrollada en vinos de la variedad Tannat durante la fermentación maloláctica, en condiciones de producción de vinos tintos, mediante la medida de la concentración de los compuestos volátiles libres y ligados. Se estudió además el posible rearreglo de los compuestos liberados en un medio de cultivo con glicoconjugados sintetizados, y la producción de un arreglo estable de los compuestos aromáticos con los polisacáridos producidos por las bacterias lácticas. 219 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni Materiales y métodos Cepas, medios y condiciones de cultivo Se utilizaron las siguientes cepas comerciales de Oenococcus oeni: Viniflora (cepa DSM 7008, Chr. Hansen), Malolactine O (cepa D-11, Groupe Oeno-France) y Lalvin 31 (Lallemand). Los preparados bacterianos secos fueron inoculados en 5 mL de medio Malo Lactic Basal (MLB) (Cox y Henick-Kling, 1995), e incubados durante 4 o 5 días a 25°C. Estos cultivos fueron utilizados como inóculos para los experimentos en medio sintético. Vinificaciones Se utilizaron las cuatro vinificaciones del año 1998 (v1, v2, v3, v4) elaboradas según se describe en el capitulo 3, y las tres vinificaciones del año 1999 (l1, l2, l3). En la Tabla 6.1 se presenta un esquema con los cultivos (cepas y fabricante) utilizadas en cada vinificación. Los datos de los lotes de uva utilizados en las vinificaciones correspondientes a las distintas experiencias, dentro de la dispersión natural de las muestras, presentaron valores mínimos y máximos para el contenido de azúcar de 185 a 203 g/L, acidez total de 5.4 a 7.3 g/L (expresada en H2SO4), y pH 3.2 a 3.5. Los datos de los vinos obtenidos fueron presentados en la Tabla 3.4 y Tabla 4.2. Todas las determinaciones analíticas se realizaron siguiendo las técnicas usuales (Iland et al., 1993). Tabla 6.1 Vinificaciones y cultivos de Oenoccocus oeni utilizados en la fermentación maloláctica durante las distintas experiencias. Año 1998 Vinificación v1, v2, v3, v4 1999 l1, l2, l3 Cultivo Viniflora Malolactine O Viniflora Cepa DSM 7008 D-11 DSM 7008 220 Fabricante Chr. Hansen Groupe Oeno-France Chr. Hansen Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Síntesis de los glicoconjugados Los glicoconjugados sintetizados se seleccionaron siguiendo dos criterios: el contenido de los diferentes componentes presentes en la fracción ligada de los vinos Tannat de acuerdo a los resultados previos de composición disponibles. Con este criterio, se seleccionó el glicósido del alcohol bencilico (presente en cantidades razonables, y químicamente estable en las condiciones del vino); verificar la ocurrencia de posibles rearreglos químicos producidos como consecuencia de la eventual degradación en el medio sintético, para lo cual se eligió el glicósido del geraniol (también en cantidades razonables, pero inestable como aglicona). Se sintetizó el 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glucopiranósido de bencilo según el método modificado de Köenigs and Knorr (Flowers, 1972), a partir de bromuro de 2,3,4,6-tetraO-acetil-α-D-glucopiranósido sintetizado según Lemieux (1972). El producto acetilado del 6-O-α-L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido de geranilo fue facilitado por el Dr. Versini (Istituto Agrario di San Michele all’Adige, Italia). Ambos productos fueron desacetilados mediante tratamiento con NaOCH3 en metanol a temperatura ambiente, según la técnica de Voirin et al. (1990a), obteniéndose β-D-glucopiranósido de bencilo y 6-Oα-L-ramno-piranosil-β-D-glucopiranósido de geranilo. La estructura del β-D-glucopiranósido de bencilo fue confirmada por espectoscropía 1HNMR y 13 C-NMR en CD3OD (Figura 6.1), utilizando un equipo Bruker Avance DPX400. El espectro 13 C-NMR mostró, entre otras señales, las correspondientes a un carbono anomérico a δ 102.3 (Voirin et al., 1990a). La señal del protón anomérico en el espectro de 1H-NMR con un desplazamiento δ 4.37, posee una constante de acoplamiento JH1-H2 = 7.7 Hz, lo que indica una configuración β del carbono anomérico (Agrawal, 1992; Voirin et al., 1990a). Ensayo en medio sintético Se inocularon por duplicado cultivos de los tres preparados de Oenococcus oeni, según lo descrito anteriormente, con una relación de 0.1 % (v/v) en 75 mL de medio MLB a pH 4.5. Se adicionó al medio los glicósidos sintetizados, β-D-glucopiranósido de bencilo y 6O-α-L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido de geranilo. 221 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni Figura 6.1 Espectros NMR en CD3OD del β-D-glucopiranósido de bencilo obtenido por síntesis. (a) espectro 13 C-NMR, (b) espectro 1H-NMR y (c) sección del espectro 1H- NMR. a) b) c) 222 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat El medio fue incubado a 22°C durante 10 a 14 días. Luego de verificar el crecimiento del cultivo, el medio se centrifugó y filtró a través de membrana de nitrato de celulosa 0.45 µm (Sartorius, Alemania). Los compuestos volátiles libres y ligados fueron analizados en el sobrenadante siguiendo la metodología descrita mas abajo. Para el caso del cultivo de O. oeni cepa DSM 7008 , no se obtuvo crecimiento en uno de los duplicados, por lo que los resultados para este cultivo no fueron considerados. Análisis de los compuestos aromáticos Extracción. Se aislaron los aromas libres y ligados por percolación a través de una resina XAD-2 en las vinificaciones del año 1998 como se describió en el Capítulo 2, y con cartuchos Isolute ENV+ en las vinificaciones del año 1999, según lo descrito también en el Capítulo 2, utilizando n-heptanol como estandar interno en ambos casos. El análisis de los compuestos libres y ligados en el medio de cultivo se realizó mediante extracción con cartuchos Isolute ENV+. Identificación. La identificación de los componentes en las fracciones aisladas, se realizó mediante GC-MS en las condiciones descritas en el Capítulo 2, equipado con librerías de referencia (Adams, 1995; McLafferty y Stauffer, 1991) y librería propia realizada con estándares. La identificación de los compuestos se confirmó por medio de la determinación de los índices de retención de Kovats. Cuantificación. Se realizó por medio de HRGC para las muestras de las vinificaciones del año 1998 y 1999, y el medio de cultivo, según las condiciones descritas en el Capítulo 2, mediante detector de ionización de llama (FID) y usando n-heptanol como estandar interno. Análisis estadístico Las diferencias en las concentraciones de los compuestos volátiles libres y ligados se evaluaron mediante análisis de varianza para los efectos muestra y FML sin interacción. Diferencias entre las medias para las muestras control y con FML utilizando diferentes cepas se determinaron mediante el LSD test. Los cálculos se realizaron con el programa Genstat 5 release 3.2, 2da. edición (Lawes Agricultural Trust, IACR – Rothamsted, 1996). 223 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni Resultados y discusión Efecto de la FML sobre los compuestos aromáticos libres y ligados El efecto de la FML sobre los compuestos aromáticos libres y glicosidados en las muestras de las distintas vendimias se reporta en las Tablas 6.2 y 6.3. Tabla 6.2 Efecto de la FML en los compuestos aromáticos libres y glicosidados (mg/L). Concentración media (± desviación de la media) para cuatro muestras en cada tratamiento, datos de la vendimia 1998. Método de extracción por resina XAD-2, cuantificación respecto al n-heptanol como estandar interno. Compuestos control a DSM 7008 a D-11 a Fb pb Glicosidados geraniol 0.016 ± 0.003 a 0.009 ± 0.002 ab 0.0052 ± 0.0001 b 7.62 0.023 alcohol bencílico 0.311 ± 0.084 a 0.226 ± 0.084 b 0.199 ± 0.047 b 6.58 0.031 alcohol β-feniletílico 0.367 ± 0.049 a 0.225 ± 0.026 b 0.140 ± 0.012 c 26.37 0.001 terpenos c 0.037 ± 0.007 a 0.015 ± 0.007 b 0.021 ± 0.004 b 10.11 0.012 norisoprenoides d 0.420 ± 0.011 a 0.275 ± 0.030 b 0.199 ± 0.017 c 31.15 < 0.001 alcoholes C6 e 0.103 ± 0.027 a 0.061 ± 0.024 b 0.043 ± 0.009 b 13.66 0.006 Libres geraniol 0.025 ± 0.007 0.026 ± 0.006 0.024 ± 0.004 0.37 0.706 alcohol bencílico 0.073 ± 0.009 0.115 ± 0.020 0.102 ± 0.006 1.83 0.239 33.7 ± 7.1 b 34.9 ± 8.6 b 42.8 ± 9.7 a 6.16 0.035 0.038 ± 0.005 b 7.81 0.021 1.54 ± 0.19 0.51 0.624 alcohol β-feniletílico terpenos c alcoholes C6 e 0.046 ± 0.007 ab 0.051 ± 0.002 a 1.56 ± 0.39 1.41 ± 0.32 a control: muestras sin FML; DSM 7008 y D-11: muestras con FML con cada cepa respectivamente F y p: valores del análisis de varianza; diferencias significativas (p<0.05) según LSD test se indican usando diferentes letras en cursiva (a, b, c). c linalool + α-terpineol + nerol + geraniol d 3-hidroxy-β-damascone + 3-oxo-α-ionol e 1-hexanol + cis-3-hexen-1-ol + trans-3-hexen-1-ol b 224 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 6.3 Efecto de la FML en los compuestos aromáticos libres y glicosidados (mg/L). Concentración media (± desviación de la media) para tres muestras en cada tratamiento, datos de la vendimia 1999. Método de extracción por cartucho ENV+, cuantificación respecto al n-heptanol como estandar interno. control a DSM 7008 a Fb pb 0.041 ± 0.009 0.009 ± 0.002 19.83 0.007 alcohol bencílico 1.89 ± 0.10 0.817 ± 0.043 126.94 < 0.001 alcohol β-feniletílico 1.79 ± 0.21 0.662 ± 0.043 73.97 < 0.001 0.140 ± 0.022 0.056 ± 0.002 91.78 < 0.001 2.44 ± 0.34 0.987 ± 0.17 313.09 < 0.001 0.470 ± 0.009 0.207 ± 0.014 13.47 0.021 geraniol 0.022 ± 0.006 0.041 ± 0.014 0.76 0.423 alcohol bencílico 0.053 ± 0.022 0.60 ± 0.021 1.85 0.267 alcohol β-feniletílico 34.5 ± 6.9 30.8 ± 5.3 2.98 0.183 alcoholes C6 e 1.15 ± 0.15 1.01 ± 0.14 2.12 0.241 Compuestos Glicosidados geraniol terpenos c norisoprenoides d alcoholes C6 e Libres a control: muestras sin FML; DSM 7008: muestras con FML con la cepa indicada F y p: valores del análisis de varianza c linalol + α-terpineol + citronelol + nerol + geraniol d 3-hidroxy-β-damascone + 3-oxo-α-ionol + 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol + 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol e 1-hexanol + cis-3-hexen-1-ol + trans-2-hexen-1-ol b En los datos de la vendimia 1998, Tabla 6.2, se observa una disminución de la concentración de todos los compuestos glicosidados luego de la FML con un nivel de significación p < 0.05. Para el alcohol β-feniletílico y la suma de los C13-norisoprenoides medidos se observan diferencias en los cambios según la cepa utilizada. En esta tabla puede verse además que las concentraciones de los compuestos volátiles libres fue débilmente modificada por la acción de la FML. La ruptura del enlace glicosídico no produjo un incremento significativo en el contenido de las agliconas. Solo se observó un incremento significativo en la concentración del alcohol β-feniletílico cuando se utilizó la cepa D-11. Este incremento no puede ser explicado por el cambio en la concentración de la forma glicosidada - el cual no es suficientemente para justificar las diferencias obtenidas - pero 225 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni si por metabolismo bacteriano del aminoácido fenilalanina, como se ha nombrado en los capítulos anteriores, y ha sido previamente reportado en estudios en medio sintético inoculados con bacterias lácticas (Edwards y Peterson, 1994; Soufleros et al., 1998; Tracey y Britz, 1989). En la Tabla 6.3 se presentan los datos para la vendimia 1999, en la cual se trabajó solo con la cepa DSM 7008, observándose nuevamente una disminución significativa de los compuestos ligados, pero no un incremento en las respectivas agliconas. En este caso no se observó tampoco un aumento en la concentración del alcohol β-feniletílico libre, lo cual esta de acuerdo con los datos del año anterior para la misma cepa, posiblemente como consecuencia del diferente comportamiento metabólico. Estudio de posibles modificaciones químicas en las agliconas Una hipótesis de trabajo, para explicar las diferencias encontradas en el balance de los cambios de concentración de los compuestos aromáticos en las formas libre y ligada, puede ser las transformaciones químicas de las agliconas en las condiciones ácidas del vino. Para evaluar la liberación de los compuestos volátiles glicoconjugados en un medio más simple que el vino, se repitió el experimento en medio MLB con adición de los glicósidos del alcohol bencílico y del geraniol, en concentraciones similares a las reportadas para vinos de distintas variedades (Salinas et al., 1998; Sefton, 1998; Sefton et al., 1996; Versini et al., 1994; Williams et al., 1983; Wirth et al., 2001). Al igual que en las muestras de vino analizadas, el nivel de compuestos glicosidados disminuyó luego de 9 días de actividad bacteriana (Tabla 6.4), sin observarse el correspondiente aumento cuantitativo de los alcoholes libres. Por otra parte, el incremento detectado en las concentraciones de linalol y α-terpineol (Tabla 6.4), ambos producidos por rearreglos en medio ácido del geraniol (Skouroumounis y Sefton, 2000; Williams et al., 1982b), no fue suficiente para explicar las diferencias en el contenido esperado de geraniol libre obtenido como resultado de la ruptura del enlace glicosídico. 226 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 6.4 Influencia de la actividad bacteriana en las formas libre y glicosidada de los compuestos aromáticos en medio MLB. Valores medios de la concentración (mg/L) para dos replicaciones en cada tratamiento. Compuestos Control D-11 Lalvin 31 geraniol 3.703 2.336 1.315 alcohol bencílico 2.119 1.576 0.416 linalol 0.000 0.067 0.025 α-terpineol 0.005 0.042 0.024 geraniol 0.022 0.206 0.140 alcohol bencílico 0.099 0.218 0.285 Glicosidados Libre Estudio del efecto del polisacárido bacteriano sobre la fijación de los compuestos aromáticos Es muy conocido que muchas cepas de bacterias son productoras de polisacáridos extracelulares, entre las que se encuentra el Oenococcus oeni (Ribereau-Gayon et al., 1998; van Vuuren y Dicks, 1993). Por otra parte se han estudiado los fenómenos de retención, oclusión en la estructura molecular, y adsorción de los compuestos aromático frente a los distintos polisacáridos normalmente aislados del vino (Dufour y Bayonove, 1999). Con el objetivo de evaluar esta hipótesis, los polisacáridos producidos por las bacterias durante la FML, se precipitaron mediante el agregado de 9 volúmenes de alcohol (con 1% de HCl) por cada volumen de medio de cultivo, de acuerdo con Vivas et al. (1997). El polisacárido precipitado se separó por centrifugación, se le agregaron 4 mL de diclorometano y se mantuvo en un baño de ultrasonido durante 10 minutos. Se buscó, de esta forma, facilitar la liberación de los componentes aromáticos desde la estructura del polisacárido. El sobrenadante se separó, se concentró y analizó, mediante la búsqueda de iones específicos por GC/MS para el geraniol y alcohol bencílico (m/z 69 y m/z 108). La 227 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni presencia de estos componentes se confirmó por sus tiempos de retención de acuerdo a la información obtenida previamente del análisis cromatográfico (Figura 6.2). Figura 6.2 Análisis de los compuestos volátiles extraídos del polisacarido producido por las LAB. (A), TIC; (B), búsqueda de iónes específicos por GC/MS para geraniol (1, m/z 69) y alcohol bencílico (2, m/z 108). Se acepta que las bacterias pueden romper el enlace de los compuestos aromáticos glicosidados y usar la glucosa como fuente de carbohidratos, mientras que la aglicona es absorbida en los polisacáridos producidos y liberada luego al medio externo. Este comportamiento esta de acuerdo con el encontrado en otros glicoconjugados, tales como los antocianos, cuya concentración disminuye durante la FML como consecuencia de la actividad β-glicosidasa del O. oeni, produciéndose por ejemplo un arreglo estable polisacáridomalvidina (Vivas et al., 1997). Por otra parte, en experimentos realizados en condiciones 228 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat “in vitro”, se ha demostrado la existencia de interacciones fuertes entre los compuestos aromáticos y los polisacáridos (Dufour y Bayonove, 1999). Finalmente, la posible retención de los compuestos volátiles libres dentro de la célula de O. oeni también se investigó como otra posible causa de las diferencias encontradas en el balance de masa de las agliconas. Con este objetivo, se separaron del medio de cultivo, las células al final de la fase de crecimiento por centrifugación (20 min, 6500 g a 5ºC), se sometieron a ultrasonido por 3 minutos para lograr su ruptura (Guilloux-Benatier et al., 1993), y el líquido sobrenadante se extrajo dos veces con 3 mL de diclorometano. El extracto obtenido se concentró hasta 0.2 mL, y se analizó por GC/MS mediante la búsqueda de iónes específicos como se describió anteriormente. La ausencia de geraniol, alcohol bencílico u otros compuestos derivados de estos componentes en el análisis descarta su retención en la célula. Por otra parte, este resultado permitió confirmar la localización parietal de la enzima glicosidasa correspondiente (Guilloux-Benatier et al., 1993). Conclusiones La actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni sobre los compuestos aromáticos ligados, durante la FML, ha sido probada en condiciones de vinificación. Se observó que el nivel de componentes aromáticos libres fue solo débilmente modificado por la acción de la FML, por lo que se concluye que la ruptura del enlace glicosídico no incrementa significativamente el contenido de las agliconas. Este fenómeno se puede explicar asumiendo un enlace estable entre los compuestos aromáticos con las macromoléculas de polisacáridos normalmente producidos por O. oeni durante la FML. Este fenómeno de retención de los compuestos aromáticos por las macromoléculas, ha sido observado por Dufour and Bayonove (1999) en un modelo de simil vino, indicando que la producción de polisacáridos por las bacterias lácticas puede también, al menos en parte, producir una reducción en las agliconas liberadas mediante una interacción producida por fenómenos de adsorción y/u oclusión. Este modelo propuesto contribuye a soportar el rol hipotetizado de los polisacáridos en retener las agliconas aromáticas. El modelo se verificó utilizando un medio sintético para el inóculo, y las condiciones experimentales de un proceso de vinificación en tinto. Por lo tanto desde un punto de vista enológico, para aumentar la liberación de aromas en vinos Tannat, futuros trabajos deberían enfocarse en la selección de cepas bacterianas 229 Capítulo 6 – Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni que muestren baja capacidad en la biosíntesis de polisacáridos durante la FML. Por otra parte, dada la dificultad que se presenta para purificar el polisacárido, se debería encarar un trabajo con mayor detalle, que permita clarificar el tipo de enlace involucrado en las interacciones moleculares polisacárido-aglicona. 230 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía Adams, R. P. Identification of essential oils by gas chromatography/mass spectroscopy, 1st. ed.; Allured Publ. Corp.: Illinois, 1995. Agrawal, P. K. NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligosaccharides and glycosides. Phytochemistry 1992, 31, 3307-3330. Albach, R. F.; Kepner, R. E.; Webb, A. D. Structures of acylated anthocyanins in Vitis vinifera variety Tinta Pinheira. Journal of Food Science 1965, 30, 69-76. Ayran, A. P.; Wilson, B.; Strauss, C. R.; Williams, P. J. The properties of glycosidases of Vitis vinifera and a comparison of their β-glucosidase activity with that of exoge- nous enzymes. 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De esta forma se tienen las siguientes definiciones (Ribereau-Gayon et al., 1998): umbral de percepción, concentración mínima a partir de la cual, mediante un test triangular, un 50% de los degustadores reconocen la presencia de una sustancia aromática umbral de reconocimiento, umbral de percepción y de identificación de un compues- to aromático específico umbral de preferencia, concentración máxima a partir de la cual el olor de un com- puesto es juzgado negativamente Debido a los diferentes umbrales de percepción de los compuestos que sufren modificaciones durante la fermentación maloláctica, y a las interacciones producidas entre ellos y con los demás componentes del vino, modificándose los valores de estos umbrales (Meilgaard, 1985), es importante determinar en particular las modificaciones que se producen en el perfil aromático de los vinos durante este proceso, fenómeno que no ha sido estudiado en profundidad (Davis et al., 1985; Henick-Kling, 1993; Wibowo et al., 1985). Como antecedente concreto de este problema, se encontró información en la literatura de autores (Davis et al., 1985) que realizaron una revisión de los primeros estudios en la evaluación del perfil sensorial de los vinos luego de la FML. En estudios primarios, diferentes autores no encontraron modificaciones (Kunkee et al., 1964), o solo se han encontrado diferencias en muestras en las cuales el contenido de diacetilo supera el umbral de percepción (Rankine, 1972). Otros autores a pesar de encontrar diferencias, determinaron 237 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial que éstas desaparecen al ajustar las muestras al mismo pH con carbonato de potasio (Castino et al., 1975). Sin embargo estudios más recientes encuentraron diferencias en las muestras antes y después de la fermentación maloláctica, y diferencias en las muestras en las cuales esta fermentación es inducida por distintas cepas de Leuconostoc, Lactobacillus y Pediococcus (Pilone y Kunkee, 1965; Webb, 1962; Zeeman et al., 1982). Más recientemente se han encontrado diferencias en el aroma debido a la FML, utilizando técnicas de análisis descriptivo, en vinos de las variedades Pinot Noir y Chardonnay (Laurent et al., 1994; Rodriguez et al., 1990; Sauvageot y Vivier, 1997). Actualmente se acepta al O. oeni como la especie que produce las mejores modificaciones en el aroma de los vinos (Bartowsky y Henschke, 1995), sin embargo, según lo reportado en trabajos con distintas variedades, estas modificaciones varían según la cepa de O. oeni utilizada (Bartowsky y Henschke, 1995; McDaniel et al., 1987). En la Tabla 7.1 pueden verse los resultados de diferentes trabajos con distintas cepas de bacterias y en distintas variedades tanto blancas como tintas. Este universo de información, muchas veces contradictoria entre sí, y la ausencia de información generada para variedades tintas como el Tannat, refuerzan la necesidad y el interés en encarar un enfoque como el propuesto en este capítulo. Objetivo En los capítulos anteriores se determinaron las diferencias (en naturaleza y contenido) para los componentes volátiles de los vinos luego de la fermentación maloláctica, lo cual seguramente producirá diferencias en el aroma de los mismos. En el presente capítulo, se estudian los efectos producidos por este proceso en el perfil sensorial descriptivo del aroma de los vinos Tannat, y los efectos de las distintas cepas de O. oeni utilizadas en el proceso, lo que implica necesariamente tomar en consideración las situaciones con y sin FML 238 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 7.1 Descriptores del perfil aromático de los vinos modificados por acción de la fermentación maloláctica realizada por diferentes cepas de O. oeni Descriptor Bacteria Cambia la magnitud del descriptor a Manteca Lb110 = Pc > Lo107 Caramelo (miel, ER-1A > PSU-1 = MLT > EY-20 = manteca) ML-34 ER-1A > ML-34 Químico PSU-1 > ML-34 Fruta ER-1A = MLT >EY-2D Lc5m > ER-1A = Lc5c Lc74 = MCW = Lb110 > Lo42 > Pc Microbiológico MLT > ML-34 (láctico) Especia (pimienta ML-34 > MLT negra, cavo) Especia/Tierra MCW = Lc74 > Lo42 = Pc Vegetal MLT > ER-1A ML-34 > EY-2D PSU-1 = EY-2D > Lc5c Lo107 > Pc = MCW = Lc74 = Lb110 Incrementa la magnitud del descriptor Quemado-dulce No especificado Manteca X-3 X-3 = ER-1A = Vf-LP > BiotecVino B1, B16 MCW No especificado Citrus No especificado Tierra MCW Fruta X-3 B16 Fruta roja B16 Jarabe de maple No especificado Roble MCW Sudado PSU-1 > Lc5m = Lc5p = Lc5c = ER-1A > EY-2D MCW Levadura MCW Avellana B1, B16 Pan fresco B1, B16 239 Tipo de muestra Referencia Cab. Sauvignon Pinot Noir 2 4 Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Chardonnay Cab. Sauvignon Pinot Noir 1 4 4 2, 9 2 1 Pinot Noir 1 Cab. Sauvignon Pinot Noir Pinot Noir Chardonnay Cab. Sauvignon 2 4 1 2, 9 2 Chardonnay Chardonnay b Chardonnay b Chardonnay Chardonnay Sauvignon Blanc Chardonnay Chardonnay Chardonnay b Pinot Noir Pinot Noir Riesling Chardonnay Chardonnay 2, 9 5 2, 9 6 3 8 2, 9 3 2, 9 7 7 2, 9 3 2, 9 Chardonnay Chardonnay Chardonnay Chardonnay 3 3 6 6 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Tabla 7.1 Continuación Descriptor Bacteria Incrementa la magnitud del descriptor Pasto cortado B1, B16 Sotobosque B1, B16 Cuero B1, B16 Almizcle B1, B16 Especiado B16 Químico B16 Especiado No especificado Vainilla No especificado Tostado No especificado Ahumado No especificado Disminuye la magnitud del descriptor Banana No especificado Quemado-dulce No especificado Manteca PSU-1 Citrus No especificado Fruta MCW Floral MCW Vegetal MCW Ajo cocido MCW Manzana B1, B16 Pomelo/Naranja B1, B16 Cassis B1, B16 Fresa/Frambuesa B1, B16 Violeta/Rosa B1, B16 Fruta con carozo B16 Vegetal B16 Fruta de la pasión No especificado Vegetal No especificado a b Tipo de muestra Referencia Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Chardonnay Chardonnay Sauvignon Blanc Sauvig. Blanc b Sauvig. Blanc b Sauvig. Blanc b Chardonnay Riesling Chardonnay Riesling Chardonnay Chardonnay Chardonnay Chardonnay Chardonnay Chardonnay Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Pinot Noir Sauvig. Blanc b Sauvig. Blanc b 6 6 6 6 7 7 8 8 8 8 2, 9 2, 9 2, 9 2, 9 3 3 3 3 6 6 6 6 6 7 7 8 8 magnitud evaluada sin considerar muestras control sin fermentación maloláctica fermentado en barrica 1 Henderson y McDaniel (1987); 2 Henick-Kling et al. (1993); 3 Laurent et al. (1994); 4 McDaniel (1986); Rodriguez et al. (1990); 6 Sauvageot y Vivier (1997); 7 Laaboudi et al. (1995); 8 de Ravel et al. (1999); 9 Henick-Kling et al. (1994) 5 Adaptado y ampliado de Bartowsky y Henschke (1995). 240 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Materiales y métodos Muestras utilizadas 1er. experiencia Se utilizaron muestras de la vendimia 1998, de la variedad Tannat, clon 398 (vinificación v1, ver capítulo 3). La FML se realizó mediante siembra de un cultivo comercial de Oe- nococcus oeni cepa D-11 (Malolactine O, Groupe Oeno-France, Francia). Luego del em- botellado, las muestras se conservaron a 10°C por 3 meses, previo al análisis sensorial. La composición química de las muestras antes del análisis sensorial puede verse en la Tabla 3.4. Los resultados se obtuvieron por la aplicación de las técnicas usuales, según Iland et al. (1993). Como parte del experimento, se realizó un test triangular para determinar la existencia de diferencias en el aroma de la muestra control y con fermentación maloláctica, y posteriormente un análisis sensorial descriptivo para determinar el perfil aromático de las mismas. 2da. experiencia Se utilizaron las muestras obtenidas en las vinificaciones del año 1999, vinificaciones l1, l2 y l3 (ver capítulo 4), inoculándose un cultivo comercial de Oenococcus oeni cepa DSM 7008 (Viniflora, Chr. Hansen's, Denmark) a las que se le realizó FML. Luego del embotellado, las muestras se conservaron a 10°C por 3 meses, previo al análisis sensorial. La composición química de las muestras antes del análisis sensorial se presentó en la Tabla 4.2, los resultados se obtuvieron por aplicación de las técnicas usuales, según Iland et al. (1993). En este experimento, se determinó el perfil descriptivo de los aromas para las distintas muestras y tratamientos (control y con FML). Test triangular Este ensayo se realizó con un panel de 20 jueces seleccionados y entrenados en la Cátedra de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Sección Evaluación Sensorial de la Facultad de Química. Los vinos se presentaron a los jueces en cabinas individuales con luz roja para enmascarar las diferencias en color. Se utilizaron copas normalizadas para la degustación del vino (ISO, 1977), sirviéndose 40 mL de muestra a temperatura ambiente (20 ± 1ºC). Cada juez realizó dos pruebas, empleándose para el ensayo una sola sesión. 241 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Entrenamiento del panel sensorial para realizar el perfil descriptivo de aromas El vocabulario de los términos descriptivos para vinos Tannat fue realizado por un grupo de tres enólogos, seleccionando 27 descriptores de nivel terciario, basados en la Rueda de Aromas desarrollada por Noble et al. (1984) y modificada por Noble et al. (1987). La rueda de aromas es dividida en grupos de terminos que describen características aromáticas similares. El grupo principal (descriptores primarios) es luego dividido en caracteristicas más específicas (descriptores secundarios y terciarios). Con esta metodología, se entrenó en el reconocimiento de estos descriptores a 12 integrantes del panel de jueces sensoriales de la Facultad de Química, sin experiencia previa en vinos. Se siguieron las siguientes etapas: a. Entrenamiento en el reconocimiento de los aromas simples Se utilizaron estándares aromáticos de Le Nez du Vin (Lenoir, 1990) o se obtuvieron por maceración de diferentes componentes en solución hidroalcohólica al 12%, según se muestra en la Tabla 7.2. b. Entrenamiento en el reconocimiento de los aromas simples en vino tinto neutro, al que se le adicionaron los estándares aromáticos anteriores, Tabla 7.2. c. Una vez que los jueces fueron capaces de identificar los 27 aromas, se les entrenó en la evaluación de la intensidad con una escala estructurada de 10 puntos (0 = no percibe; 1 = umbral; 9 = muy intenso). d. El entrenamiento se completó realizando un análisis descriptivo de 12 muestras de vino Tannat obtenidas del mercado local, permitiendo a los jueces disponer de los estándares antes de la evaluación. La selección de los términos usados se discutió con el panel en esta etapa (Damasio y Costell, 1991). Con los datos obtenidos se estableció la concordancia de juicio del panel, calculando el coeficiente de correlación (R2) entre las calificaciones de cada juez y el valor medio del grupo. Se seleccionó a un grupo de 9 jueces en la 1er. experiencia, y 8 jueces en la 2da., utilizando como criterio aquellos que presentaron un R2 mayor a 0.6 242 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 7.2 Tabla de composición de los estandares aromáticos de referencia Frambuesa Cassis Cereza Damasco Membrillo Pasa de higo Pasa de ciruela Nuez Avellana Almendra Menta Pasto cortado Morrón verde Té Tabaco Miel Manteca Regaliz Pimienta negra Rosa Violeta Vainilla Café Trufa Alquitran Almizcle Levadura Una gota del estándar de Le Nez du Vin Dos gotas del estándar de Le Nez du Vin Una cereza cortada, macerada por 10 horas y luego filtrada Una gota del estándar de Le Nez du Vin Un trozo de 2x1cm de dulce, macerado por 3 horas y luego filtrado Una pasa cortada, macerada por 3 horas y luego filtrada Una pasa cortada, macerada por 3 horas y luego filtrada Una nuez entera, macerada por 3 horas y luego flitrada Dos gota del estándar de Le Nez du Vin Seis gotas de solución alcohólica de benzaldehido Una gota del estándar de Le Nez du Vin Seis hojas de pasto verde, maceradas por una hora y luego filtradas Una gramo de morrón verde fresco cortado en cubitos, macerando por una hora y luego filtrado Un gramo de hojas de te, maceradas por 12 horas y luego filtradas Un gramo de tabaco, macerado por 12 horas y luego filtrado Una cuchara de miel pura, macerada por 2 horas y luego filtrada Una gota de esencia de manteca (R. Chiavetta, aroma cod. 533) Un trozo de 1x1cm de regaliz, macerado por 2 horas y filtrado Una gota del estándar de Le Nez du Vin Una gota del estándar de Le Nez du Vin Una gota del estándar de Le Nez du Vin Dos gotas de esencia de vainilla Dos granos de café, macerados una hora y luego filtrados Una gota del estándar de Le Nez du Vin Un trozo de 2x2cm macerado una hora a 40 ºC y luego filtrado Una gota del estándar de Le Nez du Vin Un gramo de levadura, macerando por 2 horas y luego filtrado Los estandares se prepararon en 15 mL de una solución hidroalcohólica (12% v/v) en la primer etapa del entrenamiento del panel, y en 15 mL de vino base en la segunda etapa. Evaluación de las muestras para la determinación del perfil descriptivo de aromas 1er. experiencia Se siguió un diseño de experiencia de bloques balanceados completos (Box et al., 1978) para evaluar las dos muestras de vino (control y con FML) en triplicado por los ocho jueces, lo que determinó que el diseño utilizado esté compuesto por 9 jueces x 3 repeticiones x 2 muestras. Las muestras se presentaron en cabinas individuales con luz “normal daylight”, sirviéndose un volumen de 60 mL a 20ºC ± 1ºC en copas normalizadas de degustación de vino 243 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial de aproximadamente 250 mL (ISO, 1977), identificadas con un codigo de dos digitos aleatorios y cubiertas con placas de Petri. Se evaluaron las características aromáticas de dos muestras durante cada sesión. Los jueces clasificaron los niveles de los terminos secundarios y terciarios según la escala de 10 puntos referida más arriba. En los casos de no clasificar los descriptores secundarios, se le asignó el mayor valor de los descriptores terciarios correspondientes. Una muestra de la boleta de evaluación utilizada se presenta en la Figura 7.1. 2da. experiencia Se siguió un diseño de experiencia de bloques balanceados completos para evaluar las seis muestras de vino (tres vinificaciones con dos tratamientos, control y con FML) en duplicado por los ocho jueces. En resumen, el diseño fue 8 jueces x 2 repeticiones x 3 vinificaciones x 2 tratamientos. La presentación y evaluación de las muestras se realizó de la misma forma que en la primer experiencia. Análisis de los datos 1er. experiencia Se compararon las medias de las tres repeticiones de cada juez para cada descriptor en las distintas muestras, con la media total. Se descartaron los jueces en los cuales las medias se alejaran una vez y media del rango interquartílico (Malek et al., 1986). En cada descriptor se retuvieron entre siete y nueve jueces. Con los datos obtenidos se realiza un ANOVA para los efectos juez, repetición y muestra, tomándose los dos primeros como aleatorios, para establecer diferencias significativas entre los descriptores sensoriales evaluados. Todos los análisis se realizaron por separado para los descriptores secundarios y terciarios. Los cálculos se realizaron con el programa Genstat 5 release 3.2, 2da. edición (Lawes Agricultural Trust, IACR – Rothamsted, 1996). Se realizó un análisis de componentes principales para reducir el número de variables, e identificar la relación entre los términos sensoriales y el aroma relativo de las muestras individuales. Para este análisis se consideró cada repetición como muestra independiente y se realizó utilizando el programa Statistica 5.1 (StatSoft Inc., USA, 1998). 244 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 7.1 Ficha de trabajo de los jueces desarrollada para la evaluación del aroma de vinos Tannat. Nombre__________________________________ Fecha__________ MUESTRA_____________ Puntaje 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PRIMER NIVEL Fruta_____ ESCALA DE INTENSIDAD Descripción No percibe Umbral Muy leve Leve Leve a Moderado Moderado Moderado a Intenso Intenso Intenso a Muy intenso Muy intenso SEGUNDO NIVEL Baya_____ Fruta_____ Fruta deshidratada_____ Fruta seca_____ Fruta seca_____ Vegetal_____ Fresco_____ Seco_____ Caramelo_____ Caramelo_____ Especias_____ Especias_____ Floral_____ Floral_____ Madera_____ Fenólico_____ Quemado_____ Tierra_____ Petróleo_____ Animal_____ Levadura_____ Tierra_____ Químico_____ Animal_____ Microbiológico_____ 245 TERCER NIVEL Frambuesa_____ Cassis_____ Cereza_____ Damasco_____ Membrillo_____ Pasa de higo_____ Pasa de ciruela_____ Nuez_____ Avellana_____ Almendra_____ Menta_____ Pasto cortado_____ Morrón verde_____ Té_____ Tabaco_____ Miel_____ Manteca_____ Regaliz_____ Pimienta negra_____ Rosa_____ Violeta_____ Vainilla_____ Café_____ Trufa_____ Alquitrán_____ Almizcle_____ Levadura_____ Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial 2da. experiencia La matriz de correlación del valor medio estimado de los descriptores para cada panelista, respecto al valor estimado por todo el panel, fue tomado como criterio para retirar jueces de los análisis que se realizaron a continuación. Se seleccionaron los jueces con correlación positiva en cada término (McDaniel et al., 1987). Se retuvieron entre seis y ocho jueces dependiendo del descriptor. Las diferencias para cada término se calcularon mediante ANOVA para los efectos juez, repetición, vinificación y tratamiento (control y con FML), con interacción de los efectos vinificación x tratamiento. Las diferencias significativas entre las medias se calcularon según el LSD test. Todos los análisis se realizarón por separado para los descriptores secundarios y terciarios. Los cálculos se realizaron con el programa Genstat 5 release 3.2, 2da. edición (Lawes Agricultural Trust, IACR – Rothamsted, 1996). El análisis de componentes principales fue utilizado para reducir el número de variables, e identificar la relación entre los términos sensoriales y el aroma relativo de las muestras individuales. Este análisis se basó en la matriz de correlación de los valores medios para cada descriptor del aroma con diferencias significativas entre los tratamientos (control y con FML) en los seis vinos evaluados. El análisis se realizó utilizando el programa Statistica 5.1 (StatSoft Inc., USA, 1998) Resultados y discusión Resultados obtenidos en la 1er. experiencia Los jueces pudieron distinguir entre las muestras control y con FML en el test triangular a un nivel de 99.9% de probabilidad (36 respuestas correctas en un total de 40 evaluaciones), demostrando las diferencias en el aroma de los vinos Tannat producidos por la FML. El ANOVA de los resultados del análisis descriptivo mostró que los vinos Tannat control y con FML presentaron diferencias significativas en los descriptores secundarios ‘fruta baya’ y ‘floral’ (p < 0.05), ‘vegetal seco’ (p < 0.01), ‘microbiológico’ (p < 0.001), y en los descriptores terciarios ‘levadura’ (p < 0.001), ‘cereza’ y ‘pasa de ciruela’ (p < 0.01), ‘pasa de higo’ y ‘pasto cortado’ (p < 0.05), ‘rosa’ y ‘pimienta negra’ (p < 0.10), como se reporta en la Tabla 7.3 y Figura 7.2. 246 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 7.3 Valores medios y desviación estandar de la media (entre paréntesis) de los descriptores secundarios (mayúscula) y terciarios (minúscula), para los tratamientos de la 1er. experiencia en la cual se utilizó O. oeni cepa D-11 en las muestras con FML. Nivel de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos. Se indica para cada descriptor en cada tratamiento el número de jueces aceptado. FRUTA BAYA FRUTA FRUTA SECA VEGETAL FRESCO VEGETAL SECO CARAMELO ESPECIAS FLORAL TIERRA MICROBIOLOGICO Frambuesa Cassis Cereza Pasa de higo Pasa de ciruela Dulce de membrillo Nuez Menta Pasto cortado Té Tabaco Miel Manteca Regaliz Pimienta negra Rosa Violeta Trufa Levadura control Media jueces 4.19 (0.74) 9 3.07 (0.54) 9 0.75 (0.30) 8 0.58 (0.41) 8 0.76 (0.50) 7 0.37 (0.24) 9 0.37 (0.24) 7 0.52 (0.17) 8 0.87 (0.36) 9 0.26 (0.53) 8 1.96 (0.54) 9 1.00 (0.36) 8 2.11 (0.49) 9 0.78 (0.52) 9 1.44 (0.35) 9 0.35 (0.26) 8 0.00 (0.03) 7 0.00 (0.14) 9 0.04 (0.27) 8 0.83 (0.48) 9 0.08 (0.21) 8 0.30 (0.22) 9 0.00 (0.17) 9 0.37 (0.19) 7 0.00 (0.08) 9 0.37 (0.17) 9 0.13 (0.06) 8 0.65 (0.34) 9 0.26 (0.53) 8 247 con fml p Media jueces 2.76 (0.74) 9 0.014 2.22 (0.54) 9 0.182 0.46 (0.30) 8 0.368 0.96 (0.40) 9 0.383 2.13 (0.54) 9 0.008 0.38 (0.25) 8 0.988 0.46 (0.22) 8 0.759 0.00 (0.16) 9 0.012 1.08 (0.38) 8 0.655 2.48 (0.51) 9 < 0.001 1.31 (0.54) 9 0.298 0.38 (0.36) 8 0.183 0.50 (0.51) 8 0.008 0.17 (0.52) 8 0.053 0.15 (0.40) 7 0.009 0.56 (0.24) 9 0.491 0.04 (0.03) 8 0.353 0.22 (0.14) 9 0.177 0.81 (0.25) 9 0.044 1.54 (0.48) 9 0.134 0.42 (0.21) 8 0.196 0.52 (0.22) 9 0.483 0.30 (0.17) 9 0.120 0.25 (0.17) 8 0.593 0.19 (0.08) 9 0.096 0.00 (0.17) 9 0.082 0.00 (0.06) 9 0.161 1.08 (0.36) 8 0.318 2.48 (0.51) 9 < 0.001 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Figura 7.2 Perfil descriptivo de las muestras control y con FML usando la cepa de O. oeni D-11. Valores medios de los descriptores del aroma de nivel secundario (en mayús- cula) y terciario (en minúscula), con diferencias significativas entre los tratamientos. Cada valor es la media de tres repeticiones presentadas a 9 jueces según Materiales y métodos. FRUTA BAYA * 4.00 Levadura *** VEGETAL SECO ** 3.00 Rosa + FLORAL * 2.00 1.00 Pimienta negra + 0.00 MICROBIOLOGICO *** Manteca (ns) Cereza ** Pasto cortado * Pasa de higo * control Pasa de ciruela ** con fml *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05; + p < 0.1; (ns) no significativo En el análisis de componentes principales, los tres primeros componentes explicaron respectivamente el 43.0, 18.8 y 16.6% de la varianza para el análisis de los descriptores secundarios; y el 40.0, 17.9 y 17.4% respectivamente para el análisis de los descriptores terciarios. Las Figuras 7.3 y 7.4 presentan los resultados para los dos primeros componentes principales en el análisis con los descriptores secundarios y terciarios respectivamente. Como puede verse en estas figuras, el primer componente principal separa en dos grupos las repeticiones de las muestras control, desplazados hacia valores positivos, y con FML, desplazados hacia valores negativos, tanto para los descriptores secundarios 248 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat como para los terciarios. Para los descriptores secundarios, este componente principal explicó el 43.0% de la variación entre muestras, en el cual los atributos ‘fruta baya’, ‘fruta’ y ‘floral’ (valores positivos, relacionados con las muestras control); y ‘vegetal seco’, ‘quemado’, ‘microbiológico’ y ‘tierra’ (valores negativos, relacionados con las muestras con FML) contribuyen con mayor peso sobre la variabilidad. Para los descriptores terciarios, el primer componente principal explicó el 40.0% de la variación entre muestras, siendo los atributos ‘pasa de ciruela’ y ‘violeta’ (valores positivos, relacionados con las muestras control), y ‘té’, ‘pimienta negra’, ‘trufa’ y ‘levadura’ (valores negativos, relacionados con las muestras con FML) los que contribuyen con mayor peso sobre la variabilidad. Figura 7.3 Análisis de componentes principales para los descriptores secundarios. Pro- yección de las muestras en los dos primeros componentes, así como la posición de los atributos con mayor carga (mayúsculas) en componentes 1 y 2. 1.4 fml 1 1.0 PC2 (18.8%) 0.6 control 2 control 3 V. SECO 0.2 TIERRA MICROBIOLOGICO FRUTA -0.2 BAYA fml 3 QUEMADO fml 2 -0.6 control 1 -1.0 -1.4 -1.0 -0.6 -0.2 0.2 PC1 (43.0%) 249 0.6 1.0 1.4 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Figura 7.4 Análisis de componentes principales para los descriptores terciarios. Proyec- ción de las muestras en los dos primeros componentes, así como la posición de los atributos con mayor carga (mayúsculas) en componentes 1 y 2. 1.2 0.8 control 3 fml 1 0.4 PC2 (17.9%) control 2 fml 3 P.CIRUELA TRUFA PIM. NEGRA 0.0 VIOLETA TE LEVADURA -0.4 fml 2 -0.8 -1.2 -1.4 control 1 -1.0 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0 1.4 PC1 (40.0%) Como antecedente de este diseño experimental, Laurent et al. (1994) en trabajos con la variedad Chardonnay encontraron una disminución significativa de los descriptores ‘fruta’ y ‘floral’ luego de la FML, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo. Dicho trabajo determina un aumento del descriptor ‘tierra’, lo que ocurrió en el vino Tannat. Este descriptor no presentó diferencias significativas en el análisis de varianza, si bien es uno de los descriptores que contribuyeron a la variabilidad en el primer eje del análisis de componentes principales. El descriptor ‘manteca’ presentó un incremento en el perfil sensorial de los vinos Tannat luego de la FML, para el diseño de experiencia utilizado en este estudio, aunque no en forma significativa. Sin embargo, varios autores han encontrado incrementos significativos trabajando con variedades blancas (de Revel et al., 1999; Henick-Kling et al., 1994; Laurent et al., 1994; Rodriguez et al., 1990). El descriptor ‘manteca’ se ha relacionado fundamentalmente con el contenido de diacetilo, y su intensidad de expresión depende de 250 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat la cepa de bacteria utilizada en la FML, y el contenido de SO2 presente en la muestra (Bartowsky y Henschke, 2000; Martineau y Henick-Kling, 1995). Se adicionó SO2 a las muestras previo a la evaluación sensorial, por ser una práctica necesaria en el envasado para asegurar la perfecta conservación de las mismas; esta práctica pudo haber producido enlaces químicos con el diacetilo y no permitir la detección por el panel del carácter ‘manteca’ asociado, justificando por lo tanto los resultados obtenidos (Bartowsky y Henschke, 2000; Nielsen y Richelieu, 1999). En esta experiencia con vinos Tannat se encontró un aumento en los descriptores ‘levadura’, ‘vegetal seco’ y ‘pasto cortado’ para las muestras luego de la FML. Estos resultados son similares a los determinados por Sauvageot y Vivier (1997) en descriptores que pueden relacionarse con los anteriores como es un aumento en el descriptor ‘pan fresco’ encontrado al trabajar con la variedad Chardonnay, y el aumento en los descriptores ‘pasto’ y ‘sotobosque’ encontrados en vinos de la variedad Pinot Noir luego de la FML. También se ha encontrado una disminución en los descriptores ‘fruta baya’ y ‘floral’ en los vinos Tannat luego de la FML. El resultado obtenido para estos descriptores secundarios, puede relacionarse con la disminución encontrada en los descriptores terciarios ‘cassis’, ‘frutilla-frambuesa’ y ‘violeta-rosa’ reportadas en vinos de Pinot Noir por Sauvageot y Vivier (1997). Sin embargo otros autores han encontrado resultados opuestos, trabajando también con vinos de las variedades Pinot Noir y Chardonnay, lo cual se podría explicar por la utilización, en las experiencias, de distintas cepas de O. oeni. Resultados obtenidos en la 2da. experiencia En la Tabla 7.4 se presentan los resultados del ANOVA de los datos obtenidos en el analisis descriptivo para los términos secundarios y terciarios. El efecto vinificación fue significativo para los descriptores secundarios ‘quemado’ (p < 0.001), ‘floral’ (p < 0.01), y ‘caramelizado’ y ‘microbiológico’ (p < 0.10). Los descriptores terciarios que presentan diferencias significativas son ‘café’ (p < 0.001), ‘levadura’ (p < 0.01), ‘frambuesa’ (p < 0.05), y ‘rosa’ (p < 0.10). 251 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Tabla 7.4 Valores de F y cuadrados del error medio (MSE) del análisis de varianza de los efectos juez (J), repetición (R), vinificación (V) y tratamiento (FML), y la interacción vinificación x tratamiento, para los descriptores secundarios (letra mayúscula) y terciarios (letra minúscula) del perfil aromático. Datos obtenidos en la 2da. experiencia. Descriptor FRUTA BAYA FRUTA FRUTA DESHIDRATADA FRUTA SECA VEGETAL FRESCO VEGETAL SECO CARAMELIZADO ESPECIA FLORAL FENOLICO QUEMADO TIERRA PETROLEO ANIMAL LEVADURA Frambuesa Cassis Cereza Damasco Membrillo Pasa de ciruela Pasa de higo Nuez Avellana Almendra Menta Pasto verde cortado Morrón verde Té Tabaco Miel Manteca Regaliz Pimienta negra Rosa Violeta Vainilla Café Trufa Alquitrán Almizcle Levadura J 3.09 ** 20.49 *** 35.16 *** 6.45 *** 3.25 ** 11.04 *** 1.28 1.55 4.88 *** 3.23 * 1.48 5.76 *** 3.61 ** 10.28 *** 13.29 *** 3.24 ** 1.73 17.44 *** 1.59 8.85 *** 33.11 *** 101.34*** 1.80 + 6.39 *** 0.65 1.48 2.30 * 2.77 * 5.65 *** 5.39 *** 1.74 1.15 1.37 0.74 12.74 *** 3.13 ** 2.23 * 1.48 5.76 3.61 ** 10.28 *** 14.56 *** R 4.30 * 4.21 * 2.26 0.24 0.26 0.85 0.00 2.75 3.23 + 0.36 0.02 0.03 0.07 1.11 2.27 3.61 + 0.80 2.52 0.02 1.02 5.71 * 3.75 + 0.00 0.29 2.18 0.09 0.00 1.68 0.51 0.08 1.55 0.97 1.14 0.31 0.16 2.80 + 0.36 0.02 0.03 0.07 1.11 2.73 + *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05; + p < 0.1 252 FML 18.46 *** 1.27 0.42 0.24 5.33 * 0.85 3.12 + 0.02 0.03 0.36 3.82 * 1.18 0.66 2.65 + 0.31 2.42 + 10.34 ** 1.65 4.00 * 2.29 + 2.54 + 0.60 1.05 1.17 0.40 0.84 4.02 * 3.42 + 0.91 2.05 0.04 2.69 + 0.13 0.31 1.44 0.45 0.36 3.82 * 1.18 0.66 2.65 + 0.13 V 0.94 0.40 0.15 0.11 1.92 0.63 2.65 + 0.30 4.89 ** 0.82 8.97 *** 0.65 1.40 0.36 2.38 + 3.81 * 0.89 2.08 1.62 0.40 0.37 0.15 0.26 0.02 0.93 1.21 1.04 2.33 0.06 0.39 1.00 0.51 0.88 1.34 3.03 + 2.88 0.82 8.97 *** 0.65 1.40 0.36 5.37 ** V x FML 1.42 0.95 1.49 1.37 0.94 6.35 ** 0.60 1.11 1.31 0.63 3.82 * 0.02 2.87 + 1.55 0.95 2.89 + 0.29 0.98 1.65 0.02 1.00 1.05 0.26 0.89 1.73 0.28 0.09 0.42 1.08 3.46 * 0.27 0.19 0.13 1.96 0.48 1.71 0.63 3.82 * 0.02 2.87 + 1.55 1.83 MSE 2.48 2.38 0.90 1.23 2.53 0.78 2.18 0.60 0.39 0.11 1.09 1.66 0.14 1.13 2.16 1.40 1.71 2.38 0.77 1.92 1.05 0.28 0.36 0.74 0.23 0.11 2.18 1.22 0.73 0.51 1.72 0.51 0.33 0.30 0.07 0.37 0.11 1.09 1.66 0.14 1.13 2.20 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 7.5 Valores medios y desviación estándar de la media (entre paréntesis), de los descriptores secundarios (mayúscula) y terciarios (minúscula), para los tratamientos de la 2da. experiencia en la cual se utilizó O. oeni cepa DSM 7008 en las muestras con FML. Nivel de significación (p) calculado por ANOVA para la diferencia entre los tratamientos. Se indica el número de jueces aceptado para cada descriptor. Descriptor FRUTA BAYA FRUTA FRUTA DESHIDRATADA FRUTA SECA VEGETAL FRESCO VEGETAL SECO CARAMELIZADO ESPECIA FLORAL FENOLICO QUEMADO TIERRA PETROLEO ANIMAL LEVADURA Frambuesa Cassis Cereza Damasco Membrillo Pasa de higo Pasa de ciruela Nuez Avellana Almendra Menta Pasto verde cortado Morrón verde Té Tabaco Miel Manteca Regaliz Pimienta negra Rosa Violeta Vainilla Café Trufa Alquitrán Almizcle Levadura Jueces 7 8 8 6 8 7 5 7 8 8 6 7 8 8 7 8 7 7 7 7 8 6 8 7 8 8 8 8 8 8 6 7 8 8 8 8 8 6 7 8 8 6 control 2.17 (0.32) 2.29 (0.27) 0.96 (0.16) 0.75 (0.14) 1.40 (0.39) 0.43 (0.13) 0.83 (0.32) 0.24 (0.11) 0.27 (0.10) 0.04 (0.03) 0.11 (0.11) 0.69 (0.11) 0.10 (0.07) 0.23 (0.13) 1.79 (0.26) 0.60 (0.32) 0.98 (0.22) 1.69 (0.19) 0.40 (0.11) 0.71 (0.17) 0.83 (0.14) 1.08 (0.18) 0.19 (0.08) 0.29 (0.10) 0.06 (0.06) 0.08 (0.06) 1.06 (0.25) 0.58 (0.12) 0.63 (0.09) 0.19 (0.18) 0.44 (0.05) 0.05 (0.08) 0.15 (0.08) 0.19 (0.26) 0.15 (0.05) 0.13 (0.08) 0.04 (0.03) 0.11 (0.11) 0.69 (0.11) 0.10 (0.07) 0.23 (0.13) 1.97 (0.36) *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05; + p < 0.1; ns = no significativo 253 con fml 0.52 (0.16) 1.71 (0.22) 0.98 (0.15) 0.83 (0.18) 0.69 (0.33) 0.55 (0.20) 1.10 (0.22) 0.36 (0.12) 0.29 (0.14) 0.08 (0.06) 0.53 (0.34) 0.40 (0.19) 0.04 (0.04) 0.58 (0.20) 1.95 (0.21) 0.23 (0.13) 0.12 (0.09) 1.29 (0.27) 0.05 (0.07) 1.14 (0.15) 0.75 (0.03) 1.42 (0.15) 0.06 (0.06) 0.48 (0.16) 0.13 (0.10) 0.02 (0.02) 0.46 (0.16) 0.17 (0.14) 0.46 (0.14) 0.40 (0.15) 0.39 (0.12) 0.29 (0.07) 0.19 (0.06) 0.13 (0.17) 0.08 (0.03) 0.21 (0.12) 0.08 (0.06) 0.53 (0.34) 0.40 (0.19) 0.04 (0.04) 0.58 (0.20) 2.08 (0.24) p *** ns ns ns * ns + ns ns ns * ns ns + ns + ** ns * + ns + ns ns ns ns * + ns ns ns + ns ns ns ns ns * ns ns + ns Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Figura 7.5 Perfil descriptivo de las muestras control y con FML usando la cepa de O. oeni DSM 7008. Valores medios de los descriptores del aroma de nivel secundario (en mayúscula) y terciario (en minúscula), con diferencias significativas entre los tratamientos. Cada valor es la media de tres vinificaciones presentadas a 8 jueces en duplicado. lsd; diferencia mínima significativa (p < 0.05) FRUTA BAYA *** (lsd=0.64) Almizcle + (lsd=0.44) VEGETAL FRESCO * (lsd=0.65) 2 Café * (lsd=0.43) CARAMELIZADO + (lsd=0.61) 1.5 1 Manteca + (lsd=0.29) QUEMADO * (lsd=0.43) 0.5 0 Morrón verde + (lsd=0.45) ANIMAL + (lsd=0.43) Pasto cortado * (lsd=0.60) Frambuesa + (lsd=0.48) Pasa de Ciruela + (lsd=0.42) Cassis ** (lsd=0.53) Membrillo + (lsd=0.56) Damasco * (lsd=0.36) control FML *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05; + p < 0.1 El efecto FML fue significativo para los descriptores secundarios ‘fruta baya’ (p < 0.001); ‘vegetal fresco’ y ‘quemado’ (p < 0.05); y ‘caramelizado’ y ‘animal’ (p < 0.10). Para los descriptores terciarios, presentaron diferencias significativas ‘cassis’ (p < 0.01), ‘damasco’, ‘pasto cortado’ y ‘café’ (p < 0.05); ‘frambuesa’, ‘membrillo’, ‘pasa de ciruela’, ‘morrón verde’, ‘manteca’ y ‘almizcle’ (p < 0.10). Presentaron interacción vinificación x FML significativas los descriptores ‘vegetal seco’, ‘quemado’, ‘petróleo’, ‘frambuesa’, ‘alquitrán’, ‘tabaco’ y ‘café’. 254 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Los valores medios para los descriptores aromáticos secundarios y terciarios se muestran en la Tabla 7.5, y la representación gráfica de aquellos que presentan diferencias significativas entre las muestras control y con FML se muestra en la Figura 7.5 . Sólo tres descriptores presentaron diferencias significativas (p < 0.05) en los duplicados, por lo tanto se trabajó con los promedios en el análisis de componentes principales. Los dos primeros componentes principales del análisis para los descriptores secundarios explican respectivamente el 46.8% y 30.0% de la varianza para las seis muestras. El primer componente principal contrasta los descriptores ‘fruta baya’ y ‘vegetal fresco’ con ‘animal’; mientras que el segundo componente principal contrasta los aromas ‘floral’ con ‘quemado’, según se muestra en la Tabla 7.6. En el análisis para los descriptores terciarios, los dos primeros componentes principales explican respectivamente el 46.5% y 27.1% de la varianza. El primer componente principal está definido por los descriptores ‘membrillo’ y ‘manteca’, contrastados con ‘cassis’, ‘pasto cortado’ y ‘morrón verde’; mientras que el segundo componente principal está definido por los aromas ‘frambuesa’, ‘rosa’ y ‘levadura’ (Tabla 7.7). Los valores de las muestras en los dos primeros componentes principales se grafican en las Figuras 7.6 y 7.7 (descriptores secundarios y terciarios respectivamente). Como se ve en ambas figuras, el primer componente principal separa las muestras control de las muestras con FML. Las muestras control (sin FML) se situan a la izquierda del primer componente principal en ambas figuras, dirección es hacia la que presentan mayor carga los descriptores secundarios ‘fruta baya’ y ‘vegetal fresco’, y los terciarios ‘cassis’, ‘pasto cortado’ y ‘morrón verde’. En cambio las muestras con FML se situan a la derecha de las representaciones, hacia donde tienen mayor carga el descriptor secundario ‘animal’ y los terciarios ‘membrillo’ y ‘manteca’. De los resultados obtenidos se puede concluir que la FML produce cambios en la intensidad de varios descriptores aromáticos de los vinos Tannat. En esta experiencia se encontró una disminución significativa luego de la FML para los descripores secundarios ‘fruta baya’ y ‘vegetal fresco’, y los descriptores terciarios relacionados ‘cassis‘, ‘frambuesa’, ‘damasco’, ‘pasto verde cortado’ y ‘morrón verde’. Esta reducción en los descriptores secundarios y terciarios debido a la FML estaría vinculado con comportamientos estudiados para otras variedades que mostraron la disminución en los descriptores ‘cassis’ y ‘frutilla-frambuesa’ encontrados por Sauvageot y Vivier (1997) en Pinot Noir, y por Laurent et al. (1994) en Chardonnay. 255 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Tabla 7.6 Cargas de los factores 1 y 2 del análisis de componentes principales para los descriptores secundarios del perfil descriptivo del aroma. Descriptor FRUTA BAYA VEGETAL FRESCO FLORAL QUEMADO ANIMAL Factor 1 -0.901549 -0.641388 0.125036 0.521705 0.824526 Factor 2 0.165592 0.208663 0.898169 -0.812545 0.332060 Figura 7.6 Proyección del valor medio de las muestras en los componentes principales 1 y 2, para el análisis de los descriptores secundarios en la 2da. experiencia. Se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML, así como la posición de los atributos con mayor carga (mayúsculas) en componentes 1 y 2. 2.0 FLORAL 1.5 fml 3 1.0 FRUTA PC2 (30.0%) 0.5 BAYA ANIMAL control 3 fml 1 control 2 + control 0.0 control 1 + fml -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -1.6 QUEMADO -1.0 -0.4 0.2 PC1 (46.8%) 256 0.8 fml 2 1.4 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 7.7 Cargas de los factores 1 y 2 del análisis de componentes principales para los descriptores terciarios del perfil descriptivo del aroma. Descriptor Frambuesa Cassis Damasco Membrillo Pasa de ciruela Pasto cortado Morrón verde Manteca Rosa Café Almizcle Levadura Factor 1 0.002242 -0.937180 -0.241417 0.958697 0.529435 -0.858187 -0.871740 0.731112 -0.062236 0.244126 0.499591 0.331449 257 Factor 2 -0.958707 0.086399 -0.608704 0.050542 0.122674 -0.371332 0.043494 0.634053 -0.980047 0.640821 0.566262 -0.832037 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial Figura 7.7 Proyección del valor medio de las muestras en los componentes principales 1 y 2, para el análisis de los descriptores terciarios en la 2da. experiencia. Se indican las posiciones promedio (+) para las muestras control y con FML, así como la posición de los atributos con mayor carga (subrayados) en componentes 1 y 2. 1.6 fml 2 control 2 1.0 Manteca Membrillo + fml PC2 (27.1%) 0.4 Morrón Cassis control 1 verde -0.2 Pasto -0.8 fml 3 fml 1 + control cortado Levadura -1.4 Frambuesa control 3 Rosa -2.0 -1.6 -1.0 -0.4 0.2 0.8 1.4 PC1 (46.5%) Se encontró un incremento del descriptor ‘manteca’ luego de la FML, aunque con baja significación (p < 0.10). Como se mencionó al estudiar los resultados obtenidos en la 1er. experiencia, este incremento que fue encontrado por varios autores para algunas variedades (de Revel et al., 1999; Henick-Kling et al., 1994; Laurent et al., 1994; Rodriguez et al., 1990), esta relacionado fundamentalmente con el contenido de diacetilo, y su intensi- dad de expresión esta condicionado por la cepa de bacteria utilizada en la FML y el contenido de SO2 presente en la muestra (Bartowsky y Henschke, 2000; Martineau y Henick-Kling, 1995; Nielsen y Richelieu, 1999). Contradictoriamente Sauvageot y Vivier (1997) encontraron un incremento en los descriptores ‘pasto cortado’ y ‘sotobosque’, lo cual se opone a la disminución en el descriptor ‘vegetal fresco’ que se produjo en esta experiencia. De igual forma es importante observar que estos descriptores aumentaron en la primer experiencia trabajando con una 258 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat cepa diferente de O. oeni, lo cual puede demostrar los diferentes resultados obtenidos utilizando diferentes cepas como ha sido reportado por otros autores (McDaniel et al., 1987; Rodriguez et al., 1990). Por lo tanto, el efecto de la FML en las muestras parece estar particularmente determinado por la cepa o microorganismo utilizado, además del efecto por el sustrato sobre el cual se esta trabajando o sea la variedad y tipo de vino. Por otra parte, en los otros descriptores terciarios relacionados con el descriptor ‘fruta’ se observó que el descriptor ‘membrillo’ presentó un incremento en ambos experimentos, aunque solo significativo en el último. Por el contrario, las notas a ‘pasas de ciruela’ presentaron un aumento significativo en el último experimento, contrastando con su disminución en el anterior. Este resultado refuerza la idea de que la participación de distintas cepas de O. oeni en el proceso de fermentación condicionan las diferencias obtenidas al realizar la FML y por lo tanto transforman a esta etapa de la vinificación en un paso determinate de las características del vino, independientenmente de la variedad de que se trate. Debido a la diversidad de resultados encontrados en la bibliográfia, los cuales llegan a ser en algunos casos contradictorios, resulta muy importante conocer el efecto de la FML, y las variaciones obtenidas con distintas cepas, para el perfil sensorial de los vinos de la variedad Tanant. Conclusiones La FML produce importantes cambios en el aroma de los vinos Tannat, lo cual se demuestra por las diferecias encontradas en las muestras en el test triangular, y las diferencias encontradas posteriormente en el perfil sensorial. Esto coincide a grandes razgos con los resultados obtenidos para otras variedades. Las variaciones en el perfil descriptivo fueron diferentes dependiendo de la cepa de O. oeni utilizada en la fermentación maloláctica. Trabajando con la cepa D-11 se encontró una disminución significativa en los descriptores ‘fruta baya’, ‘floral’, ‘cereza’, ‘pasa de higo’, ‘pasa de ciruela’ y ‘rosa’; y un incremento en los descriptores ‘vegetal seco’, ‘microbiológico’, ‘pasto cortado’, ‘pimienta negra’, y ‘levadura’. En cambio, con la cepa DSM 7008 se encontró una disminución significativa de los descriptores ‘fruta baya’, ‘vegetal fresco’, ‘frambuesa’, ‘cassis’, ‘damasco’, ‘pasto cortado’ y ‘morrón verde’; y un aumento en los descriptores ‘caramelizado’, ‘quemado’, ‘animal’, ‘membrillo’, ‘pasa de ciruela’, ‘manteca’, ‘café’ y ‘almizcle’. 259 Capítulo 7 – Modificaciones en el perfil sensorial En resúmen, los resultados obtenidos ponen de relevancia el papel de la FML en el perfil de los vinos tintos, demostrando la importancia del efecto según la selección de la cepa utilizada. Se puso de manifiesto la necesidad de profundizar en los mecanismos de fermentación y sus efectos, fundamentalmente a través de la relación entre las herramientas sensoriales, los descriptores y su explicación a través del estudio de la composición de las fracciones volátiles. Este enfoque y la metodología correspondiente fue la aplicada a la variedad Tannat y los resultados obtenidos se presentarán en el Capítulo 8. 260 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Bibliografía Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Malolactic fermentation and wine flavour. The Australian Grapegrower & Winemaker 1995, 378a: 83-94. Bartowsky, E. J.; Henschke, P. A. Management of malolactic fermentation for the 'buttery' diacetyl flavour in wine. The Australian Grapegrower & Winemaker 2000, 438a: 58-67. Box, G.; Hunter, W. G.; Hunter, J. S. Statistics for experimenters: and introduction to design, data analysis, and model building; 1er. ed.; Wiley: New York, 1978. Factors which affect the spontaneous initiation of the malolactic fermentation in wines. The possibility of transmission by inoculation and its effect on organoleptic qualities; Castino, M.; Usseglio-Tomasset, L.; Gandini, A., Eds.; Academic Press: London, 1975, pp 139-148. Damasio, M. 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Por otra parte, el umbral de percepción de estos compuestos es muy diverso, lo que determina que el impacto en el aroma de los distintos compuestos volátiles dependa de las unidades de aroma, que se definen como la relación entre dicho umbral y la concentración de una sustancia (ambos expresados en las mismas unidades), tal como se muestra en la siguiente ecuación: unidades de aroma = concentración umbral de percepción Por lo tanto, compuestos que estan presentes en un vino en concentraciones del orden de ng/L pueden tener un impacto notable en el aroma, mientras que otros con concentraciones de varios cientos de mg/L pueden prácticamente no intervenir en las características sensoriales de la muestra, dependiendo de sus respectivos umbrales de percepción (Ribereau-Gayon et al., 1998). En la Tabla 8.1 se presentan los descriptores relacionados con los principales compuestos volátiles determinados en los vinos, y su umbral de percepción en distintos medios (agua, vino, solución simil vino, cerveza). 265 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Tabla 8.1 Descriptores del aroma y umbrales de precepción para los principales com- puestos volátiles encontrados en las muestras de vino Tannat analizadas. descriptor Esteres acetato de isobutilo frutado, banana, manzana, frambuesa, pera frutado fresco, pera, banana, manzana umbral (mg/L) 0.073 1.6 acetato isoamilo 0.019 0.03 1.0 1.6 acetato de hexilo frutado dulce, recuerdo a ba0.002 yas y peras 0.67 2.4 3.5 0.25 acetato de β-feniletilo rosa, miel, manzana, azucarado 3.8 caproato de etilo dulce, vinoso, frutado 0.0003-0.008 0.005-0.08 0.22 caprilato de etilo frutado-vinoso, durazno, ba0.02-0.032 nana, ananá 0.002-0.58 0.9 caprato de etilo dulce, recuerdo a aceite de 0.02-0.49 avellana, vinoso 0.51 1.5 piruvato de etilo grasoso, pintura al aceite, 85 forraje lactato de etilo frutilla artificial, frambuesa, 60-110 perfumado 250 4-hidroxibutanoato de caramelo etilo malato de dietilo manzana succinato de dietilo vino succinato ácido de agrio, amargo, frutado 1200 etilo 266 medio referencia agua cerv. agua sim.vino vino cerv. agua sim.vino vino cerv. sim.vino cerv. agua sim.vino cerv. agua sim.vino cerv. agua sim.vino cerv. cerv. 1 2 1 10 3 2 4 5 3 2 10 2 6,7,8 5,10 2 8,7 5,10 2 8,7 5 2 2 vino cerv. 9 2 cerv. 2 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 8.1 Continuación descriptor Alcoholes alcohol isobutilico aceite de fusel, químico alcohol isoamilico alcoholico, en baja concentración frutado y vinoso 1-butanol aceite de fusel, químico 1-pentanol desagradable, químico, aceite de fusel 3-metil-1-pentanol 4-metil-1-pentanol 3-etoxi-1-propanol alcohol bencilico frutado verde, hojas, recuerdo a geranio verde grasoso, penetrante frutado floral, dulce alcohol β-feniletilico caliente, floral, rosa, miel Compuestos C6 3-metiltio-1-propanol repollo fermentado 1-hexanol vinoso químico, graso y frutado trans-3-hexen-1-ol cis-3-hexen-1-ol verde, notas grasas verde, grasoso umbral (mg/L) medio referencia 0.565-12.5 40-228 500 200 0.25-4 30-310 300-330 70 0.50-10 450 2.5-5 64 80 8,11,17 agua sim.vino 5,10 vino 15 cerv. 2 agua 7,8,13,15 sim.vino 10,15 vino 15 cerv. 2 agua 4,7,8,13 cerv. 2 1,7,8 agua 5 sim.vino cerv. 2 159 900 0.75 0.9-10 30-200 125 sim.vino cerv. agua sim.vino vino cerv. 0.50 1.2 0.50-4.8 1-5 4-30 4 sim.vino 10 vino 20 agua 4,7,8,13 sim.vino 5 vino 16 cerv. 2 0.070 0.40 13 267 agua sim.vino cerv. 17 2 18 10,17 19 2 12,13 10 2 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Tabla 8.1 Continuación descriptor Terpenos linalol floral, coriandro, lavanda, bergamota α-terpineol floral, pino citronelol dulce, floral nerol lima, rosa, jacinto geraniol frutado, floral Acidos ác. propanoico ác. butanoico vinagre, leche manteca, queso, sudado ác. 2-metil propanoico sudado, amargo, agrio ác. 3-metil butanoico queso, sudado ác. hexanoico cabra, aceite vegetal, sudado ác. octanoico ác. decanoico cabra, aceite vegetal ceroso, sebáceo, rancio, jabonoso 268 umbral (mg/L) medio referencia 0.006 0.01 0.05 0.08 0.28-0.35 0.40 2 0.04 0.10 0.018 0.3 0.4 0.5 0.075 0.03 0.13 agua sim.vino vino cerv. agua vino cerv. agua sim.vino vino agua vino cerv. agua sim.vino vino 21,13 10 20 2 21,13 20 2 18 10 20 18 20 2 6 10 20 150 10 2.2 200 30 3 1.5 3 8 13 15 10 cerv. sim.vino cerv. sim.vino cerv. sim.vino cerv. sim.vino cerv. cerv. sim.vino cerv. 2 10 2 10 2 10 2 10 2 2 10 2 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Tabla 8.1 Continuación descriptor umbral medio referencia (mg/L) Otros compuestos γ-butirolactona caramelo benzaldehido almedra amarga, quemado 350 agua 13 0.055-0.75 agua 6,8 150 vino 22 0.03 agua 23 0.04-0.13 sim.vino 10,23 0.44 vino 23 0.30 cerv. 2 caucho, elastómero, flor de 0.085 agua 23 datura 0.18 sim.vino 23 0.77 vino 23 dulce acetoína 4-vinil guayacol 4-vinil fenol cremoso, grasoso, mantecoso especiado, clavo Sega et al. (1967); 2 Meilgaard (1985); 3 Simpson (1979); 4 Flath et al. (1967); 5 de Wet (1978); Pyysalo et al. (1977); 7 Siek et al. (1971); 8 Rothe et al. (1972); 9 Dittrich (1987); 10 Guth (1997); 11 Amoore et al. (1976); 12 Buttery et al. (1968); 13 Buttery et al. (1971); 14 Eriksson et al. (1976); 15 Rankine (1967); 16 Rankine et al. (1969); 17 Lindeman et al. (1982); 18 Ohloff (1978); 19 Rankine y Pocock (1969); 20 Ribereau-Gayon et al. (1998); 21 Ahmed et al. (1978); 22 Shinohara et al. (1979); 23 Darriet (1994) 1 6 Por otra parte en bebidas como el vino, cuya matriz de composición es muy compleja, existen interacciones entre los distintos compuestos pudiendo en muchos casos modificarse los umbrales de las sustancias volátiles contenidas en la muestra. De esta forma se ha definido como criterio el denominado grado de sinergismo, que se expresa según la siguiente ecuación (Meilgaard, 1985): d sinergismo = c m /t m c1 /t 1 + c 2 /t 2 + ..... + c n /t n 269 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales donde cm/tm es la concentración de la mezcla dividido por el umbral de percepción de la misma mezcla, y c1/t1, c2/t2, ..., cn/tn son las unidades de aroma, definidas previamente, para los distintos compuestos que forman la mezcla. Al tratar de investigar los compuestos responsables de los distintos aromas encontrados en una muestra, se presenta por un lado la dificultad de obtener los valores del umbral de percepción para un importante número de compuestos volátiles, estudiados en una muestra de la misma naturaleza de la que se está trabajando. Por otro lado según lo dicho anteriormente, esta dificultad es mayor porque el impacto de estos compuestos en forma individual no es el percibido sensorialmente debido a las interacciones que aparecen en mezclas complejas como son las bebidas y en especial el vino. En consecuencia, uno de los problemas de la investigación en la química de los vinos es conocer las características químicas y físicas básicas que causan la percepción de la calidad o los diferentes cambios en los descriptores sensoriales. Se necesita que sea posible la relación “producto - persona”, y esto implica que se debe relacionar los datos instrumentales con datos sensoriales (Martens y Martens, 1986). Aplicación del análisis de datos a los problemas de relación instrumental-sensorial En las medidas realizadas durante la investigación sensorial en el área de alimentos, se deben tener en cuenta dos premisas: - en general se necesitan muchos datos para poder cubrir la complejidad de los problemas - se necesitan herramientas de análisis que, por un lado puedan ayudar a presentar estos datos de una forma más fácil para su interpretación, pero por otro lado no deben realizar esta simplificación quitando datos que produzcan una pérdida importante de información. El análisis de los datos involucra, por lo tanto, la búsqueda de modelos matemáticos y la estimación de los parámetros involucrados mediante un ajuste con los datos con los cuales se está trabajando, y seguidamente la evaluación de los parámetros obtenidos y sus residuales (diferencias con los datos originales) (Martens y Martens, 1986). Se tiene por lo tanto la siguiente relación general: datos experimentales = modelo (con parámetros) + residual En resumen, cualquier análisis de datos, ya sea simple o complejo, implica: - elegir un modelo matemático para los datos experimentales 270 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat - ajustar este modelo a los datos mediante la estimación de los parámetros involucrados - validación de los resultados obtenidos experimentalmente - presentación de los resultados del análisis de los datos, o sea los parámetros y residuales. Para el caso de buscar la información o estructura principal en una matriz de datos se utilizan técnicas de análisis multivariante como por ejemplo análisis de componentes principales, análisis factorial, analisis de cluster, algunos de los cuales fueron aplicados en capítulos anteriores. Sin embargo, para el problema que se esta tratando, en el cual deben establecerse relaciones entre dos matrices de datos (ej. datos químicos y/o físicos con sensoriales), se utilizan otras estrategias para su análisis. Se puede disponer de un número muy grande de datos obtenidos a partir de un grupo de muestras mediante instrumentación medianamente sofisticada como espectrómetros y cromatógrafos. Si se desea saber cuál es la correlación de estas medidas con las medidas sensoriales en las mismas muestras, se debe descartar un número muy importante de estos datos ya que los métodos de regresión no pueden usar un número de variables mayor que el número de objetos. Sin embargo, es posible utilizar un método relativamente nuevo de análisis multivariante que es la regresión por mínimos cuadrados parciales (Parcial Least Squares regression, PLS). Este concepto básico fue originariamente desarrollado por el estadístico Herman Wold (1982), y ha sido muy utilizado tanto para calibraciones, para las cuales fue creado inicialmente, como para interpretaciones de datos en general (Martens y Martens, 1986). El PLS difiere de otros métodos de análisis multivariante de dos bloques de datos, en un aspecto fundamental de gran importancia práctica. Una familia de métodos, tal como la regresión linear múltiple (MLR), se basa en regresiones de un grupo de datos (Y) sobre el otro (X), una explicación gráfica de lo dicho anteriormente se puede ver en la Figura 8.1. En cambio otra familia de métodos, como los basados en PLS, realizan la regresión de Y en una variable latente T, la que representa las variaciones principales que son comunes a la variable X. Estas dos familias de análisis de datos dan resultados similares cuando se tiene un número de muestras muy alto, pero en el caso de tener un número pequeño de muestras, los métodos tradicionales pueden dar errores graves en la estimación. 271 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Figura 8.1 Concepto de la diferencia entre (a) la regresion lineal múltiple (MLR) y (b) los mínimos cuadrados parciales (Parcial Least Squares regression, PLS) en este caso ejemplificado usando PLS1. En MLR, todas las variables X (en el ejemplo son cuatro) modelan simultaneamente a la variable Y (en el ejemplo es solo una). En PLS1, Y se utiliza como guía en la extracción de la variable latente T a partir de X. Esta variable T es luego usada para modelar ambas variables X e Y. X Y X Y T (a) (b) Adaptado de Martens y Martens (1986) El sistema de regresión por PLS es un sistema de análisis de datos que fue diseñado principalmente para el uso con bloques de datos sobredeterminados, con la ventaja adicional de ser más eficiente computacionalmente que sus competidores, como es el caso del método de regresión por componentes principales. Si Y y X son las matrices de las variables dependientes e independientes respectivamente, el método de PLS realiza el ajuste a un modelo bilinear con la forma T = X.W, X = T.P’ + E, e Y = T.Q’ + F, donde W es la matriz de coeficientes, en la cual las columnas son los factores del PLS que están definidos por una combinación linear de las variables independientes. Los sucesivos factores del PLS contenidos en las columnas de T son seleccionados para minimizar el residual en E y simultáneamente para tener un alto cuadrado de la covarianza con la variable Y. 272 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Debido a su flexibilidad, los sistemas de análisis por ajuste de PLS tienen un número de diferentes algoritmos que han sido desarrollados para situaciones analíticas diferentes. Inicialmente estos métodos se pueden clasificar en métodos predictivos o correlativos, mientras que a su vez los métodos predictivos se dividen en PLS1 y PLS2. Para el caso de regresiones PLS1, se predice la variable Y, siendo una variable sencilla para este caso, desde un bloque de variables X. El método de PLS1 es comparable a los métodos de MLR. Por el contrario, en la regresión por PLS2 se predice un bloque de variables múltiples Y desde otro bloque de variables múltiples X. El método de PLS2 es comparable a la versión predictiva de la correlación canónica. Este método predictivo de análisis de datos por PLS, así como otros (regresión de componentes principales, regresión múltiple multivariable) son métodos asimétricos, ya que predicen un bloque de datos a partir del otro, y tratan ambos bloques en forma diferente. En cambio, otros métodos predictivos son simétricos y por lo tanto tratan ambos bloques de datos en forma idéntica, pudiendo cualquiera de los bloques predecirse a partir del otro. Ejemplos de estos métodos son el análisis de correlación canónica y el análisis procrustes (Dijksterhuis, 1994). En resumen, la introducción del método de regresión PLS ha demostrado ser de gran utilidad para el estudio de las relaciones entre distintas variables químicas y físicas con variables descriptivas sensoriales en investigaciones con diferentes tipos de alimentos (Hough et al., 1996). Objetivo En este capítulo se estudiará, mediante cálculo de las unidades de aroma para los distintos compuestos volátiles, basados en datos de umbral de percepción encontrados en la bibliografía, y mediante técnicas de análisis multivariante como es el caso del PLS, la relación entre los cambios en los componentes volátiles en el vino Tannat sometido a FML, y su perfil sensorial descriptivo. 273 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Materiales y métodos Cálculo de las unidades de aroma Se trabajó con los datos obtenidos de las muestras control y con FML correspondientes a las cosechas 1998 y 1999. En la primer experiencia las muestras con FML fueron sembradas con dos cultivos puros de Oenoccocus oeni cepa D-11 (Malolactine O, Groupe Oeno-France, Francia) y cepa DSM 7008 (Viniflora, Chr. Hansen’s, Dinamarca). En cambio en la experiencia del año 1999 solo se utilizó la cepa DSM 7008 en las muestras con FML. Los detalles de las experiencias fueron presentaron en los capítulos 3 y 4. El cálculo de las unidades de aroma presenta dificultades por los motivos descriptos anteriormente, así como por el hecho de no disponer del umbral de percepción para los distintos compuestos en un medio similar a las muestras, encontrándose en general, una bibliografía mayor de umbrales de percepción en agua, los cuales presentan valores menores a los determinados en vino u otras bebidas (Meilgaard, 1985). Por otra parte, las técnicas de extracción utilizadas para el análisis de los compuestos volátiles presentan diferentes grados de eficiencia en su recuperación según el método y el grupo de componentes considerado, por lo tanto la concentración calculada del análsis de la mezcla resulta ser siempre menor que el contenido real en la muestra. Por consiguiente el cálculo realizado debe ser considerado sólo como una estimación de la contribución de los distintos compuestos estudiados al perfil sensorial de las muestras. Este enfoque resulta de gran utilidad a los efectos de poder establecer el o los grupos de compuestos con posible contribución en el efecto sensorial, así como aquel grupo de compuestos que no sería necesario tener en consideración. Correlación de los datos químicos y sensoriales por PLS En esta etapa se trabajó sólo con los datos de las muestras correspondientes a la cosecha 1999, siendo las muestras con FML sembradas con un cultivo puro de Oenoccocus oeni cepa DSM 7008 (Viniflora, Chr. Hansen’s, Dinamarca). En los cálculos se utilizaron las medias de los datos obtenidos a partir de los duplicados, tanto para las variables instrumentales como para los sensoriales. Se estudió la matriz de correlación de los datos instrumentales agrupados e individualmente, descartándose algunos compuestos que presentaron una alta correlación para de esta forma eliminar problemas de “overfitting”. De la misma forma se eliminaron algunas 274 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat variables sensoriales estudiando la matriz de correlación de los descriptores secundarios y terciarios. Tabla 8.2 Variables utilizadas en en el análisis de datos por PLS Bloque X (variables instrumentales) Variable Observación AIB acetato de isobutilo AIA acetato isoamilo AHE acetato de hexilo ABF acetato de β-feniletilo C6E caproato de etilo C8E caprilato de etilo C1E caprato de etilo PET piruvato de etilo LAE lactato de etilo LAI lactato de isoamilo OH3 3-hidroxibutanoato de etilo OH4 4-hidroxibutanoato de etilo MDE malato de dietilo SDE succinato de dietilo SAE succinato ácido de etilo LIB alcohol isobutílico LIA alcohol isoamílico LBU 1-butanol LPE 1-pentanol M4P 4-metil-1-pentanol M3P 3-metil-1-pentanol E3P 3-etoxi-1-propanol MTP 3-metiltio-1-propanol BEN alcohol bencilico LBF alcohol β-feniletílico SC6 suma de compuestos C6 correlac. con 1-hexanol, trans-3-hexenol y cis-3-hexenol T2H trans-2-hexen-1-ol PARA ác. propanoico BUA ác. butanoico MPA ác. 2-metilpropanoico MBA ác. 2- y 3-metilbutanoico SAD Suma de ácidos correlaciona con ácido hexanoico, octanoico y decanoico GBL γ-butirolactona BEZ benzaldehido ACE acetoína V4G 4-vinilguayacol V4F 4-vinilfenol PLA pantolactona FLE fenil lactato de etilo C5G 4-carboetoxi-γ-butirolactona OHG 2-hidroxiglutarato de dietilo 275 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Tabla 8.2 Continuación Bloque Y (variables sensoriales) Variable Observación Fba Fruta baya fra Frambuesa cas Cassis Fru Fruta cer Cereza dam Damasco mem Membrillo Fdh Fruta deshidratada phi Pasa de higo pci Pasa de ciruela Fse Fruta seca correlaciona con nuez, avellana y almendra men Menta correlaciona con vegetal fresco pco Pasto cortado correlaciona con vegetal fresco mve Morron verde correlaciona con vegetal fresco te Té correlaciona con vegetal seco tab Tabaco correlaciona con vegetal seco mie Miel correlaciona con caramelo man Manteca correlaciona con caramelo Esp Especias reg Regaliz pne Pimienta negra Flo Floral ros Rosa vio Violeta vai Vainilla correlaciona con fenólico caf Café correlaciona con quemado tru Trufa correlaciona con tierra alq Alquitrán correlaciona con petróleo alm Almizcle correlaciona con animal lev Levadura El modelo a estudiar está definido por un bloque X, formado por 41 variables instrumentales, y un bloque Y con 30 variables sensoriales (Tabla 8.2). Las seis muestras analizadas se agrupan según dos variables de diseño (control y con FML). Para el análisis de los datos se utilizó el método PLS2 para extraer unas pocas combinaciones lineales (factores del PLS) de los datos químicos que predicen tanto como sea posible las variaciones sistemáticas de los datos sensoriales (Hough et al., 1996). Para determinar el número de factores significativos se aplicó el test F de Osten (1988). Este test compara la suma de cuadrados de validación cruzada para la dimensión en estudio, con los cambios en la suma de cuadrados de la validación cruzada para la dimensión previa. 276 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Resultados y discusión Diferencias en las unidades de aroma para los distintos compuestos determinados en las muestras. Para estimar la posible contribución de los distintos compuestos volátiles analizados en el perfil sensorial de las muestras correspondientes a las vinificaciones del año 1998 y 1999, se calcularon las unidades de aroma, las cuales son presentadas en la Tabla 8.3 y 8.4. Tabla 8.3 Cálculo de las unidades de aroma para los distintos compuestos volátiles en las muestras. Se presentan los valores medios para las 4 muestras y los valores mínimo y máximo entre paréntesis. Muestras vinificadas en el año 1998 utilizando diferentes cepas de O. oeni. Compuesto umbral (mg/L)a acetato de isoamilo 0.030 sv acetato de hexilo 0.002 a 0.250 sv acetato de β-feniletilo caproato de etilo 0.040 sv caprilato de etilo 0.025 a caprato de etilo 0.250 a piruvato de etilo 85 c lactato de etilo 80 v succinato ácido de etilo 1200 c alcohol isoamílico 15 sv 1-butanol 2.0 a 1-pentanol 3.0 a alcohol bencilico 159 sv 5.0 sv alcohol β-feniletílico 3-metiltio-1-propanol 0.50 sv hexanol 1.0 a cis-3-hexen-1-ol 0.070 a trans-2-hexen-1-ol 1.0 a ác.butanoico 10 sv ác. 2-metilpropanoico 200 sv ác. 3-metilbutanoicob 3.0 sv ác.hexanoico 3.0 sv ác.octanoico 13 c ác.decanoico 15 sv 4-vinilguaiacol 0.10 sv a control FML(DMS 7008) 6 (5- 9) 6 (5- 7) 20 (19- 21) 2 (<1- 6) <1 (<1- 1) <1 5 (3- 7) 4 (3- 4) 2 (1- 5) 2 (1- 3) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 1 (<1- 1) 1 (<1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 7 (3- 10) 7 (3- 11) <1 (<1- 1) <1 (<1- 1) 1 (1- 3) 1 (1- 2) 1 (1- 1) 1 (<1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 (<1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 (<1- 1) FML (D-11) 9 (5- 11) 3 (<1- 12) <1 (<1- 1) 2 (1- 3) 2 (1- 4) <1 <1 <1 <1 1 (<1- 1) <1 <1 <1 9 (4- 13) 1 (<1- 1) 1 (1- 2) 1 (1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 medio en el que se determina el umbral de percepción: a, agua; sv, simil vino; v, vino; c, cerveza se considera en el cálculo la concentración determinada para los ácidos 2- y 3-metilbutanoico b 277 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Tabla 8.4 Cálculo de las unidades de aroma para los compuestos volátiles en las distintas muestras vinificadas en el año 1999 utilizando la cepa DMS 7008 de O. oeni. Se presentan los valores medios para las 3 muestras, y los valores mínimo y máximo entre paréntesis. Compuesto acetato de isobutilo acetato isoamilo acetato de hexilo acetato de β-feniletilo caproato de etilo caprilato de etilo caprato de etilo piruvato de etilo lactato de etilo succinato ácido de etilo alcohol isobutilico alcohol isoamilico 1-butanol 1-pentanol alcohol bencilico alcohol β-feniletílico 3-metiltio-1-propanol 1-hexanol cis-3-hexen-1-ol trans-2-hexen-1-ol ácido propanoico ác.butanoico ác.2-metilpropanoico ác.3-metilbutanoicob ác.hexanoico ác.octanoico ácido decanoico benzaldehido acetoína 4-vinilguayacol 4-vinilfenol a b umbral (mg/L)a 0.073 a 0.030 sv 0.002 a 0.25 sv 0.040 sv 0.025 a 0.25 a 85 c 80 v 1200 c 5.0 a 15 sv 2.0 a 3.0 a 159 sv 5.0 sv 0.50 sv 1.0 a 0.070 a 1.0 a 150 c 10 sv 200 sv 3.0 sv 3.0 sv 13 c 15 sv 0.35 a 0.40 a 0.10 sv 0.18 sv sin conservación control fml 10 (8- 11) 6 (4- 10) 34 (29- 42) 21 (17- 23) 20 (14- 31) 10 (6- 17) 1 (<1- 1) <1 (<1- 1) 12 (10- 14) 7 (6- 10) 7 (6- 9) 6 (5- 7) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 2 (1- 2) 1 (1- 2) 1 (1 - 1) 1 (<1- 1) <1 <1 (<1- 1) <1 <1 <1 <1 7 (5- 10) 6 (4- 9) 3 (2- 4) 2 (2- 3) 1 (1- 1) 1 (1- 1) 1 (1- 1) 1 (1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 (<1- 1) <1 (<1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 (<1- 1) conservación 1 año control fml 3 (2- 4) 3 (2- 3) 9 (6- 10) 9 (6- 11) 4 (<1- 9) 3 (<1- 4) <1 <1 11 (9- 14) 9 (6- 10) 5 (4- 6) 5 (4- 5) <1 <1 <1 <1 <1 1 (1- 2) <1 <1 1 (1- 2) 1 (1- 2) 1 (<1- 1) 1 (1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 4 (4- 5) 5 (4- 7) 2 (1- 3) 2 (2- 3) 1 (1- 1) 1 (1- 1) 1 (1- 1) 1 (1- 1) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 1 (<1- 1) <1 1 (<1- 1) medio en el que se determina el umbral de percepción: a, agua; sv, simil vino; v, vino; c, cerveza se considera en el cálculo la concentración determinada para los ácidos 2- y 3-metilbutanoico 278 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat En las muestras correspondientes a las vinificaciones del año 1998, Tabla 8.3, se encuentran más de 10 compuestos con unidades de aroma mayores a la unidad y por lo tanto con una contribución más o menos importante en el perfil sensorial. Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los acetatos de isoamilo, hexilo y β-feniletilo, el caproato y caprilato de etilo, y los alcoholes isoamílico, β-feniletílico, 3-metiltio-1-propanol, 1hexanol y cis-3-hexen-1-ol. La FML provoca en el vino Tannat una variación de las unidades de aroma en varios de estos compuestos, observándose una disminución en los valores para los distintos acetatos y esteres, los cuales estan asociados a descriptores ‘frutado’, ‘ananá’, ‘pera’, ‘banana’, ‘manzana’, etc. Contrariamente a estos resultados generales, en las muestras en las cuales la FML se realiza con siembra de la cepa D-11, se observa un aumento en las unidades de aroma para el acetato de isoamilo, esta variación podría explicar diferencias en la componente frutal para los distintos tratamientos. Para la cepa D-11 se observan además aumentos en las unidades de aroma para el 3metiltio-1-propanol, descripto como aroma que recuerda al ‘repollo fermentado’; y el alcohol β-feniletílico, siendo su aroma descripto como ‘rosa’, ‘floral’ y ‘miel’. Estos aumentos no se observan para las muestras en las que se utilizó la cepa DMS 7008; por otra parte en algunas muestras en las que se utilizó esta cepa, se observan valores mayores a uno para el 4-vinilguayacol. Estos resultados demuestran la diferencia en el perfil de aromas de los vinos Tannat luegos de la FML, y la dependencia de estas modificaciones según la cepa utilizada en la misma. Estos resultados se repiten para la experiencia del año 1999, Tabla 8.4, utilizando en las muestras con FML la cepa de O. oeni DMS 7008. En esta experiencia se observa la importante disminución en las unidades de aroma de los acetatos luego de la conservación por un año, teniendo valores menores a la unidad en varias de las muestras. Esta disminución también se observa en los ésteres etílicos de los ácidos grasos aunque con una menor intensidad. Por el contrario, en el caso del lactato de etilo, asociado con los descriptores ‘frambuesa’, ‘frutilla’ y ‘ciruela’ (como se discutió en el Capítulo 5), se observa un aumento en las unidades de aroma por encima de la unidad en las muestras con FML y luego de un año de conservación. 279 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Nuevamente, como en la experiencia anterior con muestras sembradas con esta cepa, se observa en algunas muestras con FML un valor mayor que la unidad para el 4vinilguayacol y 4-vinilfenol. Este grupo de compuestos, que presentaron diferencias en las unidades de aroma para los distintos tratamientos, indican que son al menos algunos de los responsables de las diferencias sensoriales encontradas en las muestras. Análisis de datos por PLS El porcentaje de varianza explicada por la correlación de PLS se muestra en la Tabla 8.5. Se puede observar que el factor 1 es el único significativo (p < 0.05) para ambos bloques de variables, instrumentales y sensoriales. Tabla 8.5 Porcentaje de la varianza explicada por los tres primeros factores en el análisis de PLS de las variables instrumentales y sensoriales. (sensoriales) (instrumentales) Bloque Y Bloque X Variable Dimensión % de varianza % acumulado 1 (**) 48.2 48.2 2 23.9 72.1 3 24.8 96.9 1 (**) 24.5 24.5 2 24.1 48.6 3 21.4 70.0 (**) factor significativo según el test-F de Osten (p < 0.05) Sólo el 24.5% de la varianza de las variables sensoriales fue explicada por el factor 1 de la correlación con las variables instrumentales, y este factor separa las distintas muestras según los tratamientos control y con FML, como puede verse en la Figura 8.2. Las variables sensoriales que presentan las mayores cargas son ‘fruta baya’, ‘frambuesa’, ‘cassis’, ‘fruta’, ‘cereza’, ‘damasco’, ‘pasa de higo’ y ‘rosa’ que se desplazan hacia valores positivos como las muestras control, mientras que los descriptores ‘trufa’, ‘alquitrán’, ‘pasa de ciruela’, ‘manteca’, ‘café’ y ‘almizcle’ se desplazan hacia valores negativos como las muestras con FML, ver Figura 8.3. 280 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 8.2 Proyección de las muestras en los factores 1 y 2 del PLS para (a) el bloque X, y (b) el bloque Y de variables. 6 (a) l1 cfml 4 l2 cfml 2 l1 control PLS 2 l2 control 0 -2 l3 cfml -4 l3 control -6 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 PLS 1 4 (b) 3 l1 cfml l2 cfml 2 l1 control 1 l2 control PLS 2 0 -1 l3 cfml -2 -3 -4 l3 control -5 -4 -2 0 2 4 6 PLS 1 l1, l2 y l3, lotes 1, 2 y 3 vinificados en la vendimia 1999; control y cfml, corresponde a los tratamientos sin y con FML respectivamente (ver capítulo 4) 281 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Figura 8.3 Cargas de los factores 1 y 2 del PLS para (a) las variables químicas (bloque X) y (b) las variables sensoriales (bloque Y). 0.35 (a) BEN 0.25 OH3 V4F 0.15 MBA M4P MTP LBF SAD LBU LAE T2H PLS 2 0.05 V4G ABF C5G SC6 C1E M3P LIA C8E AHE AIA OHG AIB C6E FLE PET LAI -0.05 MDE SAE ACE LPE OH4 SDE -0.15 BUA PLA -0.25 BEZ -0.35 -0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 MPA GBL PRA E3P 0.00 LIB 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 PLS 1 0.4 reg (b) lev 0.3 Esp Flo mem 0.2 ros vio cer fra vai PLS 2 0.1 0.0 pci man alz phi alq pco Fse tab Fba Fru dam mve pne -0.1 -0.2 caf te Fdh cas mie -0.3 -0.4 -0.3 men -0.2 -0.1 0.0 0.1 PLS 1 282 tru 0.2 0.3 0.4 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Figura 8.4 Coeficientes de correlación entre los valores de PLS vs las variables senso- riales, y los valores de PLS vs las variables instrumentales (subrayadas). Las abreviaciones de las distintas variables corresponden a las presentadas en la Tabla 8.2 1.0 reg BEN lev 0.8 Esp mem 0.6 OH3 Flo V4F vio 0.4 cer LBU LAE ros MBA T2H vai M4P MTPfra LBF SAD pci PLS 2 0.2 0.0 C8E V4G man alz phi C5GSC6 alq pco Fse tab AIA AHE ABF C1E AIB OHG C6E Fba Fru LAI -0.2 damPET FLE SAE mve pne MDE ACE LPE te OH4 -0.4 SDE caf BUA cas Fdh -0.6 mie -0.8 E3P PRA BEZ -1.0 -0.8 M3P LIA -0.6 -0.4 -0.2 0.0 PLA MPA GBL 0.2 tru LIB men 0.4 0.6 0.8 1.0 PLS 1 El porcentaje de varianza para los descriptores sensoriales individuales explicada por la regresión de PLS indica que pueden ser razonablemente predichos los siguientes: ‘fruta baya’, ‘frambuesa’, ‘cassis’, ‘fruta’, ‘cereza’, ‘damasco’, ‘pasa de higo’, ‘pasa de ciruela’, ‘manteca’, ‘rosa’, ‘café’, ‘tabaco’, y ‘almizcle’. En la Figura 8.4 se pueden observar los coeficientes de correlación entre los valores de PLS vs las variables instrumentales, y los valores de PLS vs las variables sensoriales. Considerando los descriptores que explican los porcentajes mayores de varianza y que fueron nombrados anteriormente, se observa una correlación positiva entre ‘pasa de ciruela’ y lactato de etilo, asi como ‘almizcle’ y 4-vinilguayacol. También se observa correlación de la variable sensorial ‘manteca’ con el lactato de etilo e isoamilo, aunque en 283 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales este caso es posible que esta correlación se explique porque - como se ha dicho anteriormente - este descriptor se relaciona con el componente diacetilo, el cual presenta un aumento durante la FML (Bartowsky y Henschke, 1995), en forma similar al cambio de concentración determinada para los lactatos. Por otra parte los descriptores ‘fruta baya’, ‘fruta’, ‘cassis’, ‘frambuesa’, ‘damasco’, se realcionan con los contenidos de ésteres de ácidos grasos y acetatos determinados instrumentalmente. De la misma forma, el descriptor ‘rosa’ presentó una correlación con el contenido de alcohol β-feniletílico. En cambio los descriptores ‘tabaco’ y ‘café’ se correlacionan en forma opuesta con los contenidos en ésteres y acetatos. Este resultado posiblemente se encuentre relacionado con la pérdida de aromas frutales y en consecuencia este cambio produzca un aumento en la percepción de otros aromas que permanecían enmascarados por estas notas frutales. Conclusiones Muchos compuestos presentaron en el cálculo de las unidades de aroma, valores mayores a la unidad, lo que indica la contribución de estos componentes al perfil sensorial aromático de las distintas muestras de vino Tannat consideradas. Varios de estos componentes presentaron un cambio en su valor de unidades de aroma luego de la FML, y estas variaciones fueron diferentes para las muestras según la cepa de O. oeni utilizada. Estos resultados nuevamente indican la importancia de esta variable (cepa utilizada en la FML) sobre el impacto de los aromas resultantes de la FML. El análisis por regresión PLS resultó ser una importante herramienta para adjudicar compuestos responsables de la composición aromática capaces de explicar diferencias en los descriptores sensoriales. Entre los compuestos que presentaron diferencias en las muestras control y con FML, se observó que el contenido de acetatos y esteres presentaron una relación directa con varios descriptores a ‘fruta’ y ‘fruta baya’, como son ‘cassis’, ‘frambuesa’ y ‘damasco’. En las condiciones de la experiencia, el lactato de etilo se correlacionó con aroma a ‘pasas de ciruela’, este compuesto presentó valores de unidades de aroma por encima de la unidad en muestras en que se condujo la FML y se conservaron en botella por un año. Este resultado, conjuntamente con los anteriores, demuestra la modificación en el perfil de descripores frutales producido por la FML, con disminución de un número importante 284 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat de ellos, y aumento de algunos otros como ocurre con el correspondiente a ‘pasa de ciruela’. Se observó además que las variables sensoriales ‘floral’ y ‘rosa’ pueden predecirse mediante el contenido de alcohol β-feniletílico. Finalmente algunas muestras presentaron un aumento en la concentración de 4-vinilguayacol, compuesto que se correlaciona con el descriptor ‘almizcle’ (‘animal’), indicando un aumento en la complejidad de los aromas de los vinos en los que se ha producido la FML. 285 Capítulo 8 – Relación entre los datos instrumentales y sensoriales Bibliografía Ahmed, E. M.; Dennison, R. A.; Dougherty, R. H.; Shaw, P. E. Flavor and odor thresholds in water of selected orange juice components. 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Éste grupo de compuestos presentó una baja concentración también en su forma ligada, entre los que se detectó la presencia de los óxidos furánicos y piránicos del linalol, α-terpineol, nerol y geraniol, y un contenido muy bajo de linalol. Por otra parte, la mayor concentración en este grupo la presentaron los isómeros cis- y trans- del 8-hidroxilinalol, con valores más elevados para la forma trans. Esta relación resultó característica para la variedad Tannat, lo que hace posible considerarla como un marcador quimiotaxonómico. También desde el punto de vista quimiotaxonómico, resultó destacable la relación de las concentraciones de las formas cis- y trans- del 3-hexen-1-ol que se encuentra en forma libre, con una mayor concentración de la forma trans- de este compuesto. En relación al perfil de compuestos de origen fermentativo (alcoholes, esteres, etc.), su estudio determinó que el mismo presenta características similares a los correspondientes para vinos tintos de otras variedades. En lo que se refiere a otros componentes aromáticos de interes para variedades tintas, se detectaron en vinos Tannat jóvenes, la presencia de pequeñas cantidades de los norisoprenoides 3-oxo-α-ionol y vomifoliol en estado libre. En contraste, se encontró una importante concentración de este grupo de compuestos en forma ligada, siendo los más importantes 3-hidroxi-β-damascona, 3-oxo-α-ionol y vomifoliol, y en menor concentración 3-oxo-7,8-dihidro-α-ionol, 4-oxo-β-ionol y 4-oxo-7,8-dihidro-β-ionol. 289 Capítulo 9 – Conclusiones Estos compuestos, reportados también en la composición de otros frutos como la fruta de la pasión, guayaba, membrillo y tabaco, es predecible que presenten un aumento en su concentración de las formas libres durante la conservación, y por lo tanto puedan explicar los complejos aromas desarrollados por esta variedad durante la crianza del vino. Este aspecto representa una ventaja notable para la variedad Tannat en el concepto de potencial aromático, aspecto que representa uno de los factores determinantes en la definición de vintos tintos de calidad en la medida de que se comprenda la dinámica de su transformación en el tiempo. Por lo tanto, deberá estudiarse también la formación de otros norisoprenoides derivados de los precursores anteriores, en las condiciones de crianza de este tipos de vino. De acuerdo a los compuestos determinados, es posible la formación durante la crianza productos de rearreglos de estos, como son los teaspiranos con notas a ‘té’, vitispiranos con notas a ‘alcanfor’ y ‘eucaliptus’ o la megastigman-4,6,8-trien-3-ona con notas a ‘tabaco’. Se han identificado además en forma glicosidada algunos compuestos derivados del ácido shiquímico, entre los cuales se detectaron en concentraciones importantes el alcohol bencílico, alcohol β-feniletílico, y en menor concentración el 2,5-dihidroxibenzoato de metilo, 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1-propanol y tirosol. Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en el perfil de compuestos aromáticos libres y su efecto sobre las características sensoriales de los vinos Tannat. Trabajos previos sobre las modificaciones producidas en los vinos por acción de la fermentación maloláctica se han basado fundamentalmente en las variaciones en el contenido de diacetilo y, como consecuencia, en las modificaciones sensoriales sobre el descriptor ‘manteca’ producidos por este compuesto. En este trabajo, se realizó un estudio sobre la totalidad el perfil de compuestos aromáticos del vino, teniendo en cuenta que los cambios sobre este perfil será dependiente de la variedad con la que se trabaje, utilizándose en este caso vinos de la variedad Tannat. Se determinó que un número importante de compuestos aromáticos libres, participantes del perfil de los vinos Tannat, fueron modificados por la fermentación maloláctica. Se pudo demostrar que estas diferencias se correspondieron con diferencias en las características sensoriales determinadas por test triangular de las distintas muestras. Se demostró además que estas modificaciones son dependientes de la cepa de Oenococcus oeni que produzca la fermentación, encontrándose diferencias significativas en com- 290 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat puestos como el lactato de etilo, acetato de isoamilo, alcohol β-feniletílico y 3-metiltio-1propanol. Estos diferentes comportamientos también se observaron en el estudio de la descripción sensorial de las distintas muestras, encontrándose diferencias en las notas a ‘pasas de ciruelas’, ‘vegetal verde’, y algunos descriptores frutales, posiblemente por el distinto comportamiento en la variación de algunos ésteres como el acetato de isoamilo. Por otra parte, en todos los ensayos se produjo una disminución de los ésteres, y en particular del acetato de hexilo y caproato de etilo. Esta disminución se relacionó con la menor intensidad encontrada en algunos descriptores frutales para los vinos luego de la fermentación maloláctica, como ‘cereza’, ‘cassis’, ‘frambuesa’, y ‘damasco’. Estas correlaciones entre las variaciones encontradas en las variables sensoriales e instrumentales, se pudieron demostrar mediante el uso de modernas técnicas estadísticas de ánalisis de datos como es la aplicación del análisis por PLS. Mediante este análisis se determinó además una buena correlación entre el aumento encontrado para la concentración del lactato de etilo, en las muestras luego de fermentación maloláctica, con el descriptor ‘pasa de ciruela’, y del 4-vinilguayacol, el cual fue dependiente de la cepas bacteriana utilizada, con el descriptor ‘almizcle’. Al igual que los vinos producidos con diferentes variedades de Vitis vinifera, las muestras producidas a partir de la variedad Tannat presentaron importantes modificaciones en su perfil de compuestos aromáticos durante la crianza en botella. Estos cambios durante la conservación provocaron, en algunos casos, diferencias mayores entre los vinos control y con FML, mientras que en otros casos provocaron la desaparición de las diferencias que se encontraban en vinos jóvenes. El lactato de etilo y el malato de dietilo presentaron un comportamiento opuesto, aumentando el primero su concentración en las muestras con FML, y el segundo aumentando su concentración en las muestras control, provocando por lo tanto, mayores diferencias entre los tratamientos. La concentración de acetatos y esteres etílicos de ácidos grasos presentaron una disminución muy importante durante la crianza, en especial para los primeros. Esta disminución resultó ser más importante en las muestras en las que se evitó el desarrollo de la fermentación maloláctica, posiblemente por su menor pH, lo cual favoreció la hidrólisis. Esta disminución provocó la desaparición de las diferencias encontradas para estos compuestos entre las distintas muestras. 291 Capítulo 9 – Conclusiones Por otra parte, varios compuestos como el succinato de dietilo, succinato ácido de etilo y 2-hidroxiglutarato de dietilo, presentaron incrementos similares en todas las muestras durante la conservación. Modificaciones producidas en el contenido de los enantiómeros del lactato de etilo por la fermentación maloláctica y su posible efecto sensorial. Uno de los compuestos para los cuales se determinó la mayor variación en su concentración como consecuencia de la fermentación maloláctica, fué el lactato de etilo. Este compuesto presenta dos isómeros ópticos, siendo investigada en este trabajo las modificaciones en la concentración de los mismos producidas por este proceso. Los vinos control (sin FML) presentaron un contenido mayor para el isómero (R)- de este compuesto, mientras que en la FML se produjo un incremento significativo de la forma (S)- pasando a ser el isómero predominante. Este incremento resultó ser dependiente de la cepa utilizada en las condiciones experimentales. Los enantiómero del lactato de etilo presentaron, en el análisis sensorial, diferencias en los descriptores aromáticos; describiéndose la forma (S)- como ‘fruta ácida’, ‘ciruela’, más frutado que la forma racémica. Por otra parte, la determinación del umbral de percepción en vino base para el isómero (S)- resultó en 90 mg/L, lo cual es coincidente con datos reportados en la bibliografía para la forma racémica. El incremento significativo en el enantiómero (S)- del lactato de etilo, el cual presenta diferencias en los descriptores sensoriales del aroma, puede ser el responsable de alguno de los cambios aromáticos de los vinos al producirse la fermentación maloláctica. En efecto, se demostró experimentalmente que este compuesto presentó una muy buena correlación con el descriptor ‘pasa de ciruela’ en el analisis de PLS,. Por otra parte, estos cambios pueden incrementarse durante la crianza del vino debido al incremento producido del lactato de etilo en esta etapa. 292 Fermentación maloláctica, modificaciones en el aroma de los vinos Tannat Actividad β-glicosidasa del Oenococcus oeni. Modificaciones producidas por la fermentación maloláctica en los compuestos aromáticos glicosidados, y su efecto en el perfil de compuestos aromáticos libres. En este trabajo se estudió por primera vez en condiciones de vinificación la actividad βglicosidasa de Oenococcus oeni. Esta actividad se puso de manifiesto como consecuencia de detectarse una disminución de los compuestos glicosidados luego de la fermentación maloláctica, para las cepas de microorganismos estudiadas. Sin embargo, esta actividad no produjo el aumento correspondiente en las agliconas, lo cual no pudo ser explicado como consecuencia de posibles rearreglos en las estructuras de estas agliconas. Esta diferencia encontrada en el balance de masa de las agliconas pudo finalmente explicarse al demostrarse la existencia de fenómenos de retención, oclusión en la estructura molecular, y/o adsorción de los compuestos aromático frente a los polisacáridos extracelulares producidos por la bacteria Oenococcus oeni. Esta hipótesis debió demostrarse experimentalmente, donde los resultados indicaron que las bacterias son capaces de romper el enlace glicosídico de los compuestos aromáticos glicosidados y utilizar la glucosa como fuente de carbohidratos, mientras que la aglicona es retenida en los polisacáridos producidos y liberados con posterioridad al medio externo. La conclusión de estos experimentos indican que desde el punto de vista enológico, para aumentar la liberación de aromas en vinos Tannat, y por lo tanto evitar la pérdida de potenciales moléculas aromáticas ocluídas en el polisacárido bacteriano, el trabajo futuro debería enfocar la selección de cepas bacterianas que muestren baja capacidad en la biosíntesis de polisacáridos y por otra parte, diseñar experimentos que permitan clarificar el tipo de fenómeno involucrado en las interacciones moleculares polisacárido-aglicona. En resúmen, los resultados obtenidos pusieron de relevancia el papel de la FML en el perfil de los vinos tintos, demostrando la importancia de su efecto de acuerdo a la selección de la cepa utilizada. Por otra parte, los resultados demuestran - por comparación del comportamiento reportado para otras variedades de Vitis vinifera - que es posible definir un perfil de composición y relaciones entre componentes que son característicos de la variedad Tannat y que permitirían disponer de elementos quimiotaxonómicos diferenciales para esta variedad. Este comportamiento debe ser profundizado en la medida de que este tipo de argumentos representa un elemento definitivo para el manejo de vinos varietales. 293 Capítulo 9 – Conclusiones 294
