EFECTO DEL CHOQUE TÉRMICO EN CANALES IÓNICOS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO
DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
MEMORIAS DEL VIII VERANO DE LA CIENCIA DE LA REGIÓN CENTRO Y V VERANO DE LA CIENCIA DE
LA UAQ
EFECTO DEL CHOQUE TÉRMICO EN CANALES IÓNICOS ENDÓGENOS EN
OVOCITOS DE Xenopus laevis
Salazar Soto, D. B. (1); Martínez Torres A. (2); Ochoa de la Paz L. (2);
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Neurobiología
Universidad Nacional Autónoma de México
RESUMEN
Se indujo la maduración de ovocitos de la rana Xenopus laevis por la acción de un choque
térmico a 40°C durante 10 minutos. Aplicando métodos electrofisiológicos se registraron los
cambios ocurridos en las corrientes eléctricas generadas por canales iónicos dependientes de
voltaje. Se estudiaron específicamente las corrientes iónicas inducidas por el flujo de cloro,
sodio y potasio.
Se encontró que el potencial de membrana en reposo de los ovocitos disminuye
dramáticamente de -25 a -14mV. Sin embargo, las corrientes generadas por los canales
dependientes de voltaje se mantuvieron relativamente constantes.
INTRODUCCIÓN
Los ovocitos de Xenopus laevis han sido empleados en estudios biológicos y farmacológicos,
dado su fácil manejo se han empleado para la expresión heteróloga de proteínas de transporte,
receptores y canales iónicos ya que al expresar la proteína exhiben las propiedades
farmacológicas y electrofisiológicas propias .
La ovogénesis se compone de seis estadios (I-VI), la principal diferencia entre ellos está en su
variación en el tamaño el cual va desde 100 μm hasta 1300μm. Por otra parte la coloración de
sus hemisferios se modifica ya que en las fases inmaduras hay una coloración casi homogénea
entre los hemisferios animal y vegetal hasta que se observa una diferenciación ecuatorial
entre los hemisferios donde el vegetal es claro y el animal es oscuro. Se pueden encontrar a un
mismo tiempo toda la diversidad de los estadios simultáneamente; sin embargo, al llegar al
estadio VI ya no crece el ovocito sino que se mantiene en la fase G2/M de la profase de la
meiosis.
La liberación de gonadotropina estimula a las células foliculares a producir progesterona, e
inicia el ciclo de la meiosis el cual es señalado unas horas después por la desintegración de la
vesícula germinal, (Weber, 1999), el cual se puede observar en el hemisferio animal a causa
de una decoloración. La maduración del ovocito puede producirse por variaciones en las
condiciones ambientales, como lo es la temperatura. En base a estudios realizados en el
laboratorio se ha encontrado que la temperatura de activación de dicha señal es optima a 40°C
durante una exposición de 10 minutos (Sánchez, no publicado).
Durante la maduración las propiedades bioeléctricas de la membrana plasmática cambian, el
potencial de membrana se despolariza, debido a que pocos son los sistemas que se mantienen
activados como el caso de los canales de cloro independientes de calcio, así como la
inactivación de la bomba de sodio-potasio la cual contribuye en el proceso de despolarización.
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El objetivo de este trabajo consistió en determinar si existen cambios en las propiedades de
los canales iónicos activados por voltaje durante la inducción de la maduración del ovocito.
METODOLOGÍA
Se operaron tres ranas hembras Xenopus laevis las cuales fueron anestesiadas por hipotermia
para extraer un folículo de ovocitos, posteriormente se dejaron para su recuperación en agua a
temperatura ambiente. Los ovocitos fueron desfoliculados y tratados con colagenasa (SIGMA,
lote 055K1676) a una concentración de 0.05 μM para eliminar las células foliculares durante
30 minutos y lavados con solución Barth (la cual contiene una concentración de: 88mM de
cloruro de sodio, 1mM de cloruro de potasio, 2.4mM de bicarbonato de sodio, 0.82mM de
sulfato de magnesio, 0.33mM de nitrato de sodio, 0.041mM de cloruro de calcio, 5mM de
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetano sulfónico (HEPES) y 50μg/ml de gentamicina) por
10 minutos dos veces; se almacenaron a 14ºC en solución Barth toda la noche para su
recuperación.
Posteriormente fueron separados en dos grupos: un control los cuales se hizo fijación de
voltaje directamente y el grupo tratado el cual fue sometido a un choque térmico en baño
María en solución Barth a 40º C durante 10 minutos, posteriormente fueron registrados
fijándose el potencial de membrana a -60mV y se corrieron los 4 protocolos respectivamente
a cada ovocito, cuyos programas se muestran en la tabla 1
Tabla 1: Programa de los protocolos para activar los voltajes
Nombre del
protocolo
Calcium
independent Cl
Canal iónico de estudio
Programa
Canal de cloro
independiente de calcio
Inicia en un voltaje de -140mV,
incrementando 20 veces 10 mV con
duración de 1 segundo cada uno
Inicia en un voltaje de 0mV,
incrementando 8 veces 20 mV con
duración de 2 segundos cada uno
Inicia en un voltaje de 0mV,
incrementando 11 veces 10 mV con
duración de 12 milisegundos cada uno
Inicia en un voltaje de 0mV,
incrementando 10 veces 10 mV con
duración de 5 milisegundos cada uno
Transient out
Canal de cloro activado por
calcio
Transient K
Canal de potasio
Sodium protocol
Canal de sodio
Posteriormente fueron analizados los datos en el programa ORIGIN 7.5.
RESULTADOS
Se registraron en total 30 ovocitos de los cuales 6 fueron controles y el resto fueron
registrados a diferentes tiempos a partir del momento en que finaliza el choque térmico
mientras que el resto fueron incubados a 14ºC, a cada uno de ellos se registro su potencial de
membrana inicial cuyo rango vario entre cada ovocito y los diferentes donadores.
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A continuación en la tabla 2 se muestra el rango del potencial de membrana clasificados por
ovocitos tratados y controles,
Tabla 2: Variación del potencial de membrana con respecto al tiempo después del choque
térmico
Potencial 1 hora
de
membrana
-15.27
+2.16
2
horas
3 horas
-24.98 -15.33
+0
+3.34863
4 horas
5 horas 6 horas
7 horas control
-15.3
+0.8660
-16.45
+ 3.5
-41.85
+21.20
-13.77
+4.96681
-23-38
+5,337
Así como los protocolos que se corrieron, la relación corriente-voltaje y el potencial dado al
punto más hiperpolarizante o despolarizante según sea el caso
Tiempo (min)
0
120
240
360
480
Fig. 1 Cambios morfológicos en un ovocito sometido a choque térmico entre 0 y 480 min. La
flecha indica la formación de la vesícula germinal.
A
Mean
B
C
0.4
0.2
intensidad nA
0.0
-0.2
0.25 s
-0.4
200 nA
-0.6
-0.8
-1.0
0.25 s
-1.2
-150
-100
-50
0
60 mV
50
voltaje mV
Figura 2: A) protocolo de los pulsos de voltaje para activar canal de cloro independiente de
calcio B) curva voltaje-corriente C) pulso hiperpolarizante a –140 mV
Mean
B
C
1.0
0.8
Intensidad nA
A
0.5 s
0.6
300 nA
0.4
70 mV
0.2
0.5 s
0.0
20
40
60
80
100
120
140
voltaje mV
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Figura 3: A) protocolo de los pulsos de voltaje para activar canal de cloro dependiente de
voltaje B) relación corriente-voltaje C) pulso despolarizante a 140 mV.
A
B
C
Mean
1.2
1.1
1.0
0.9
0.1 s
0.8
2200 nA
intensidad nA
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.1 s
0.0
50 mV
-0.1
-0.2
0
20
40
60
80
100
voltaje mV
Figura 4: A) protocolo de los pulsos de voltaje para canal de potasio B) relación corrientevoltaje C) pulso despolarizante a 100 mV
A
B
Mean
C
1.5
Intensidad nA
1.0
3600 nA
0.025 s
0.5
0.0
45 mV
0.025 s
-0.5
0
20
40
60
80
100
voltaje mV
Figura 5 A) protocolo de los pulsos de voltaje para canal de sodio B) relación corrientevoltaje C) pulso despolarizante a 90 mV
CONCLUSIONES.
Existe un cambio en la pigmentación del hemisferio animal después del choque térmico.
Este cambio corresponde al desplazamiento de la vesícula germinal.
Los cambios en el potencial de membrana en reposo indican que los ovocitos se
despolarizan eléctricamente.
No se encontraron cambios en las corrientes generadas por canales de cloro, sodio o potasio.
BIBLIOGRAFIA.
Parker, I. y Miledi, R. “A calcium independent chloride current activated by hyperpolarization
in Xenopus laevis”, Proc. R. Soc. Lond.,233, 191-199.
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Parker, I. y Miledi, R. “Transient potassium curent in native Xenopus laevis”, Proc. R. Soc.
Lond.,234, 45-53.
Weber, W. M. “Ion currents of Xenopus laevis oocytes: state of the art”, BBA., 1421, 213233.
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