Cromatografía de filtración en gel de la hemoglobina

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CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
1.- FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido
que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase
estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está
constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de
pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su
paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello
eluyen rapidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos
del gel. De esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden
decreciente de peso molecular.
Se definen los siguientes parámetros:
Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos
(máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
Volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.
Volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño
superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos
entre las partículas de gel.
Malla de partículas
entrecruzadas
en un gel hidratado
Muestra cargada
Las partículas pequeñas
pueden penetrar
Las partículas grandes
quedan excluidas
Partícula de gel
Molécula de la muestra de tamaño molecular inferior al poro del gel
Molécula de la muestra de tamaño molecular superior al poro del
1.2. - MATERIALES PARA LA FILTRACIÓN EN GEL
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados
como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan
hasta formar una red tridimensional.
Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta
práctica se utilizará el gel dextrano.
El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas
bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,
proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican
por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del
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gel multiplicada por 10.
Propiedades de algunos geles de Sephadex (gel dextrano)
Peso molecular, límites de fraccionamiento
Tipo
polisacáridos
700
agua retenida
vol. de gel
hidratado
(g/g gel seco)
(ml/g gel seco)
700
1.0
2
péptidos/proteínas
G10
hasta
hasta
G15
hasta 1 500
hasta 1 500
1.5
3
G25
100 - 5 000
1 000 - 5 000
2.5
5
G50
500 - 10 000
1 500 - 30 000
5.0
10
G75
1 000 - 50 000
3 000 - 80 000
7.5
12-15
G100
1 000 - 100 000
4 000 - 150 000
10.0
15-20
G150
1 000 - 150 000
5 000 - 400 000
15.0
20-30
G200
1 000 - 200 000
5 000 - 800 000
20.0
30-40
1.3. - APLICACIONES DE LA FILTRACIÓN EN GEL
Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o para la
purificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares de proteínas.
Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relación lineal entre el
volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las proteínas. Por lo tanto, es suficiente medir
el volumen de elución de una proteína desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada
con proteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular.
Ve-Vo
K=
Vs
Moléculas de peso
molecular desconocido
Ve = volumen de fase móvil necesario
para eluir la molécula de interés
Vo = volumen de exclusión
Vs = volumen de la fase estacionaria
Vs = Vt-Vo
Vt = volumen total de la columna
Log Pm
Esta técnica puede también proporcionar un método para el tratamiento de una
proteína con un determinado reactivo. Este será uno de los aspectos a ensayar en el
presente experimento.
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SEPARACIÓN DE LAS DISTINTAS FORMAS DE OXIGENACIÓN DE LA HEMOGLOBINA
En esta práctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25 (dextrano de alto
entrecruzamiento, pequeño tamaño de poro), aprovechándose la diferente velocidad de avance de la
hemoglobina frente a los reactivos de pequeño tamaño (ferricianuro y ditionito).
El ferricianuro (Fe[CN]63-) es un agente oxidante, capaz de oxidar el Fe2+ de la oxihemoglobina
(rojo vivo) a Fe 3+, transformándose en ferrocianuro Fe(CN)64- (amarillo). Esta forma de la hemoglobina
se denomina metahemoglobina (marrón). El ditionito (S2O42-) es un agente reductor, capaz de reducir
el Fe3+ de la metahemoglobina a Fe2+. A esta forma de la hemoglobina se le denomina
desoxihemoglobina (rojo pardo). La desoxihemoglobina capta el oxígeno disuelto en el tampón
transformándose en oxihemoglobina (rojo vivo).
Se aplicará a nuestra columna de sephadex G-25 una disolución de ditionito sódico y
posteriormente una muestra de metahemoglobina observándose una serie de bandas en función de las
reacciones que tienen lugar.
2. - MATERIAL Y REACTIVOS
Material
.- Columna de cromatografía
.- Pipetas Pasteur
.- Tubo graduado
.- Vaso o Erlenmeyer
Reactivos
.- Sephadex G-25
.- Tampón fosfato 20 mM, pH = 7.0
.- Ferricianuro potásico
.- Azul dextrano (2 mg/ml)
.- Ditionito sódico (=hidrosulfito sódico, Na2S2O4) (solución recién preparada de10 mg/ml en tampón
fosfato)
.- Muestra: Hemolizado
3. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1. - Preparación del hemolizado:
Se recoge la sangre de rata en tubos de vidrio graduados con heparina 1% como anticoagulante. Se
centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 minutos, aspirando el plasma con pipeta Pasteur. Se resuspenden
los hematíes en 4-5 ml de NaCl 0.9%, se agita y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones.
Esta operación de lavado se repite dos veces más. Los hematíes se hemolizan añadiendo 4 volúmenes
de agua destilada y 0,4 volúmenes de cloroformo, se agita y se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 20
minutos. Recoger el sobrenadante.
3.2. - Hinchado del gel:
Se añaden 25 ml de tampón fosfato por gramo de gel. Se deja hasta el día siguiente. De este modo, se
consigue la estructura de retícula tridimensional que permite la separación de las moléculas de la
muestra ya que cada bolita de gel seco absorbe el tampón, aumentando su volumen . Se partirá del gel
hinchado.
3.3. - Empaquetado de la columna:
Con la llave de la columna cerrada se comienza a añadir, usando una pipeta Pasteur, aproximadamente
15 ml de suspensión del gel, dejándola resbalar por la pared de la columna para evitar que se formen
burbujas de aire en el interior del gel. Con el tiempo, el gel va sedimentando. Cuando haya unos 2-3
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cm de gel sedimentado se abre la llave permitiendo la salida del exceso de tampón, facilitando de esta
manera el empaquetado. El gel empaquetado debe tener una altura de 10 cm. El lecho del gel debe
quedar perfectamente uniforme y plano.
IMPORTANTE: en todo momento debe evitarse, mediante el control de la llave y la adición de
tampón, que el gel llegue a secarse. La adición a la columna se hará siempre con pipeta Pasteur, con
cuidado y por la pared para evitar distorsionar el lecho del gel.
3.4. - Medida del volumen de exclusión:
.- Dejar fluir el tampón hasta que el menisco alcance el lecho del gel, evitando que éste se seque.
Cerrar la llave.
.- Añadir cuidadosamente con la pipeta Pasteur 2 gotas de la solución de azul de dextrano. Abrir la
llave hasta que la banda de azul dextrano entre completamente en el gel y cerrar de nuevo. Añadir a la
parte superior del gel un poco de tampón (2 mm de altura).
.- Poner un tubo graduado para recoger el líquido que sale de la columna (eluato). Abrir la llave, dejar
entrar la capa de tampón en el gel. Continuar añadiendo más tampón a la columna hasta que la banda
azul salga por abajo. Anotar el volumen recogido cuando salga de la columna el centro de la banda de
azul dextrano. Este es el volumen de exclusión de la columna.
.- Lavar la columna haciendo pasar tampón hasta la completa eliminación del azul dextrano.
3.5. - Tratamiento de la hemoglobina del hemolizado:
.- Se parte de unos 10 ml de hemolizado (de color rojo vivo). Añadir una punta de espátula de
ferricianuro potásico sólido y mezclar, con lo que la hemoglobina del hemolizado se transformará en
metahemoglobina (de color marrón).
.- Se debe tener preparada y a mano una pequeña cantidad de disolución recién preparada de ditionito
sódico y del hemolizado tratado con ferricianuro.
.- Dejar fluir el tampón justo hasta antes de que la superficie del gel quede seca. y cerrar la llave.
.- Añadir cuidadosamente con pipeta Pasteur unas 2-3 gotas de la disolución de ditionito sódico. Abrir
la llave y dejarlo fluir dentro de la columna, cerrando la llave justo cuando el menisco alcance la
superficie del lecho de gel.
.- Depositar con una pipeta 2 ml de tampón fosfato. Dejarlo entrar en el gel y cerrar la llave.
.- Pipetear sobre la columna cuidadosamente 6 gotas de hemolizado tratado con ferricianuro
(conteniendo la metahemoglobina). Abrir la llave y dejar fluir la muestra hasta que entre en el gel.
Cerrar la llave.
.- De nuevo añadir una pequeña cantidad de tampón y dejarlo entrar en el gel. Manteniendo la llave
abierta, llenar la columna con tampón para que continúe la elución de las distintas muestras añadidas.
.- Observar y anotar los cambios que se van produciendo en la hemoglobina a su paso por la columna,
así como la banda amarilla de ferricianuro que se observa. Ir añadiendo más tampón si es necesario
para evitar que se agote y el gel se llegue a secar.
.- Continuar la adición de tampón hasta que todo el gel quede blanco y proceder al desempaquetado
de la columna, recuperando el Sephadex para su posterior.
4. - TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
4.1. - ¿Cuál es el volumen de exclusión obtenido para la columna?
4.2. - Anotar y justificar lo que se ha observado durante la cromatografía e indicar en un dibujo las
bandas que han ido apareciendo y a qué molécula corresponden.
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