Inhibición del crecimiento de Bacillus subtilis por mercurio Sánchez Millán, E. Facultad de ciencias naturales Universidad Autónoma de Querétaro RESUMEN El mercurio es altamente toxico para organismos procariotas y eucariotas. Aunque no se conoce en su totalidad la manera en la cual afecta a las encimas encargadas de la síntesis de proteínas y RNA. En este trabajo se uso a B. subtilis para medir la resistencia al mercurio usando concentraciones que van de 1 µg/ml de HgCl2 hasta 5 µg/ml de HgCl2 siendo concentraciones que inhiben el crecimiento celular se encontró que en la concentración 1 µg/ml de HgCl2 el crecimiento se recupera. INTRODUCION El mercurio es un elemento ambientalmente tóxico, aunque con especies químicas de toxicidad muy variada , desde relativamente inerte, como puede ser su principal forma el HgS, hasta de toxicidad muy elevada, como son por lo general todos sus compuestos orgánicos, y en particular los complejos metilados, como metolmercurio (Ch3Hg) y dimetil mercurio (CH3HgCH3), o el mercurio gaseoso (Higeras et.al. 2007). El mercurio es un agente activo de la oxido reducción, que ataca directamente antioxidantes y encimas ricas en grupos sulfhídrico. Cuando el mercurio es absorbido por las células se une covalentemente a los residuos de cisteína de proteínas y moléculas pequeñas. Bundell reporto que la síntesis de RNA y proteínas se ve inhibida por HgCl2, pero no se tiene la suficiente evidencia para demostrar como afecta a todo el mecanismo de transcripción (Dixit V. et. al. 2004). El crecimiento bacteriano de define como un aumento en el numero de células microbianas en una población, también puede medirse como el aumento en la masa celular. Durante el ciclo de división celular todos los componentes celulares se duplican. El tiempo de generación es el que le toma a una célula se formen 2 células, el tiempo de generación varia en los microorganismos de 1 a 3 horas, además el tiempo de generación de un organismo es determinado por el medio de cultivo y las condiciones de incubación (Brock, 2004). Aunque se conoce perfectamente que el mercurio y sus compuestos son sustancias sumamente tóxicas, sus mecanismos de acción aún se encuentran en discusión y deben ser detenidamente estudiados. METODOLOGIA Se trabajo con B. subtilis (cepa PY79) proporcionada por el CINVESTAV Irapuato fue crecida en 20ml de medio LB aproximadamente 3 horas a 350C y en agitación (120 rpm) (Sambrook y Russell, 2001). Cuando pasaron las 3 horas se adicionó diferentes concentración de HgCl2, como se indica en la figura 1, la densidad bacteriana y la cuenta viable (CFU´s) se midió durante 5 horas adicionales en intervalos de 1hora como se muestra en la (figura 1y 2). DISCUSIÓN DE RESULTADOS El efecto del mercurio sobre el crecimiento de B. subtilis, las células fueron tratadas con 1, 2, 3, 4 y 5 µg/ml de HgCl2, al pasar la 3 horas durante la fase exponencial de la bacteria, la densidad bacteriana fue monitoreada por 5 horas adicionales después del tratamiento. La adición de HgCl2 provoca una inhibición inmediata del crecimiento comparado con el cultivo sin tratar (Fig. 1). Los resultados muestran que en todas las concentraciones se inhibe el crecimiento y no se restablece, con la excepción del tratamiento 1 µg/ml de HgCl2 (Fig. 1). La cuantificación de las colonias o CFU demostró que en la ultima medición hay un ligero aumento en la viabilidad celular, específicamente en el tratamiento 1 µg/ml de HgCl2 en cambio en los demás tratamientos hay una muerte celular. F Figura 1. en la line azul se muestra el numero de CFU, en la linea rosa se muestra la recuperacion de CFU bajo el tratamiento 1 µg/ml de HgCl2 curva del crecimiento de bacillus en diferentes concentarciones de HgCl2 Densidad optica 1600 1400 0 Hg 1200 1000 1 Hg 2 Hg 800 600 400 3 Hg 4 Hg 5 Hg 200 0 T -1 T0 T1 T2 T3 T4 T5 Tiempo Figura 2. La barra azul muestra la densidad optica de B. subtilis libre de Mercurio, las demás barras como se indica en la leyenda de la derecha muestra a consentacion de mercurio CONCLUSIONES Es claro que B. subtilis se ve inhibido por la presencia de mercurio en su medio de cultivito, pero en la concentración de 1 mercurio, se puede notar una ligera recuperacion, lo cual no s da un indicio de que B. subtilis tiene una resisitencia a esta concentración permitiéndole aumentar el numero de FCU, en cambio en las concentraciones mayores 2, 3, 4 y 5 µg/ml de HgCl2, no se ve crecimiento alguno las células dejan de dividirse, lo cual no es revelado por la densidad óptica esta no hace distinción entre bacterias viva o muertas. Seria necesario la repetición del experimento en concentraciones mas bajas de mercurio para saber se B. subtilis podría recuperar su crecimiento normal o el numero de CFU, esto podría dar datos importantes sobre las encimas o proteínas que son inhibidas a concentraciones especificas de mercurio y poder conocer mas sobre la inhibicion de trascripción proteínas y RNA. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Bundell, M. R., D, Wild. “Inhibition of bacterial grow by metal salts”. Biochen. J. 115:207-212. 1969 Dixit V. et al “Mercury Inactivates Transcription and the Generalized Transcription Factor TBF in the Arcaeron Sulfolobus slofataricus”, Antimnicrobial Agents and Chemoterapy, University of Nebraska, 2004 Higueras P., Oyarzun R., Lorenzo S., Gray J. E., Biester H., Esbrí J.M., 2007, caso practico: mercurio en el medioambiente del distrito de almadem. Un fenómeno dinamico. disponible en línea www.aulados.net/Temas_ambientales/Almadem_PDF/Almadem.pdf.Consultado:23/06/ 09 Madigan T. M., Martinko M. J., Parker J. “Brock Biologia de los Microorganismos” Prentice hall, 10 edición, 2004 Sambrook, J. and Russell, D. “Molecular Cloning:a laboratory manual” 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA 2001.