fcs355e - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad De Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
“Evaluación de la vía PI3K y ERK1/2 sobre el control de la
alcalinización intracelular inducida por PAF en neutrófilos
de bovino”
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de
Químico Farmacéutico.
Profesor Patrocinante: Dr. Rafael Burgos A. - Instituto de Farmacología - Facultad
de Ciencias Veterinarias.
Carlos Víctor Nicolás Smith Ríos
Valdivia Chile 2004
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Juan Luis Hancke O. - Instituto de Farmacología – Facultad de Ciencias Veterinarias
Dedicatoria
“ La verdadera ciencia enseña, sobre todo, a dudar y a ser ignorante”
Miguel de Unamuno
Esta tesis esta dedicada a mi madre y hermanos.
Agradecimientos
Agradezco a todas las personas que prestaron su apoyo para la realización de esta tesis, en
especial al Dr. Burgos, por su buena disposición en consultas y ayuda en los experimentos.
A todos los integrantes del Instituto de Farmacología, por mantener un ambiente grato de trabajo.
FONDECYT 1010204. Por el financiamiento de este trabajo.
1. RESUMEN
En esta tesis, se evaluaron las vías PI3K y ERK1/2 sobre el control de la alcalinización
intracelular inducida por PAF, para lo cual se utilizaron inhibidores específicos. Además se
evaluó el efecto antagonista de 14-deoxiandrografolido (14-DAP) sobre el cambio de pH
intracelular inducido por PAF en neutrófilos de bovino.
El factor activante plaquetario (PAF) es un fosfolípido biológicamente activo, producido por una
serie de células que incluyen a los leucocitos polimorfonucleares. PAF está implicado en el
proceso de inflamación aguda y crónica, produciendo hipotensión, broncoconstricción y aumento
de la permeabilidad vascular. Además, PAF estimula una variedad de actividades del neutrófilo
incluyendo quimiotaxis, fagocitosis, degranulación, producción de especies reactivas de oxígeno
e incremento de pH intracelular.
Los neutrófilos de bovino fueron aislados de sangre obtenida por punción de la vena yugular. Las
células aisladas fueron preincubadas con BCECF-AM, y la medición de los cambios
intracelulares de pH, se realizó mediante espectrofluorimetría.
La estimulación con PAF produjo alcalinización intracelular a una concentración de 100 nM,
precedida de una acidificación transitoria.
Wortmanina en concentraciones 100, 50 y 10 nM, LY294002 en concentraciones 30 y 10 μM
(inhibidores específicos de PI3K) y UO126 en concentraciones 1 y 0,1 μM (inhibidor específico
de MEK), y
Gö6850 en concentraciones 10, 5 y 0,5 μM (inhibidor específico de PKC),
inhibieron la alcalinización intracelular inducida por PAF. Por otra parte, 14-DAP a una
concentración 25 μM, inhibió el cambio de pH intracelular inducido por PAF. No se observó un
cambio significativo en la acidificación intracelular.
Se concluye que la estimulación con PAF induce alcalinización intracelular vía activación PI3KERK1/2 y PKC. Además, concluimos que 14-DAP reduce la alcalinización inducida por
PAF.Palabras claves: Factor activante plaquetario, alcalinización intracelular, neutrófilos,
intercambiador Na+/H+, ,MAPK, PI3K, 14-deoxiandrografolido.
SUMMARY
In this thesis, PI3K and ERK1/2 pathways were evaluated on the control of the intracellular
alkalinization induced by PAF, using specific inhibitors for these pathways. In addition ,we
evaluated the antagonistic effect of 14-deoxiandrographolide (14-DAP), on the intracellular pH
change induced by PAF in bovine neutrophils.
Platelet-activating factor (PAF) is a biologically active phospholipid, which is produced by a
number of cells, including polymorphonuclear leucocytes. PAF is implied in acute and chronic
inflammation
processes.
Its
effects
during
inflammation
include
hypotension,
bronchoconstriction and increased vascular permeability. Moreover, PAF stimulates a variety of
neutrophil activities, including chemotaxis, phagocitosis, degranulation, reactive oxygen species
production and intracellular pH increase.
Bovine neutrophils were isolated from blood obtained by puncture of the jugular vein. The
isolated cells were preincubated with BCECF-AM and the intracellular pH changes was made
with at spectrofluorimetric techniques.
The stimulation with PAF produced intracellular alkalinization to a concentration of 100 nM,
preceded by a transitory acidification.
Wortmanin in concentrations of 100, 50 and 10 nM, LY294002 in concentrations 30 and 10 μM
(specific inhibitors of PI3K) and UO126 in concentrations 1 and 0.1 μM (specific inhibitor of
MEK), and Gö6850 in concentrations 10, 5 and 0.5 μM (PKC inhibitor), inhibited the
intracellular alkalinization induced by PAF. On the other hand, 14-DAP at a concentration of 25
mM,
inhibited the intracellular pH change induced by PAF. Significant changes in the
intracellular acidificación were not observed.
It is concluded that the stimulation with PAF induces intracellular alkalinization via activation of
PI3K-ERK1/2 and PKC. In addition, we conclude that 14-DAP reduces the alcalinización
induced by PAF.
Key words: Platelet activating factor, intracellular alkalinization, neutrophils, Na+/H+ exchange,
MAPK, PI3K, 14-deoxyandrographolide.
2. INTRODUCCION
2.1. Neutrófilos
El sistema inmune posee componentes celulares y moleculares. Dentro de los componentes
celulares se encuentran células clasificadas como leucocitos polimorfonucleares (Edwards, 1994).
Dentro de estas células, los neutrófilos juegan un rol esencial y representan una de las primeras
líneas de defensa en contra de los microorganismos potencialmente dañinos (Swain y col., 1998).
Su principal función es degradar y destruir microbios, especialmente bacterias, para lo cual son
distribuidos a los tejidos por el sistema circulatorio (Kaneko y col., 1997), siendo estas las
primeras células en ser reclutadas en el sitio de infección y responder en forma rápida y potente.
Esto se debe a que poseen una alta movilidad dentro de los tejidos en respuesta a señales
quimiotácticas. Su mecanismo defensivo es complejo, incluyendo fagocitosis, producción de
oxígenos reactivos, enzimas proteolíticas y péptidos bactericidas (Swain y col., 1998).
Aunque los neutrófilos bovinos y humanos poseen una función semejante respecto a la defensa
del huésped, algunos estudios han demostrado ciertas diferencias que pueden reflejar variaciones
en los mecanismos regulatorios. Por ejemplo, en estudios con microscopia electrónica se
demostró que los neutrófilos de bovino poseen un gránulo de gran tamaño que no se encuentra
presente en los neutrófilos humanos (Gennaro y col., 1983). Además, los neutrófilos bovinos
poseen menor concentración de lisozima en comparación con los neutrófilos humanos. Debido a
estas diferencias es posible que la respuesta biológica en neutrófilos de bovinos frente a agentes
inflamatorios sea diferente a la respuesta de neutrófilos humanos y podría ser de utilidad
terapéutica el estudio de los diferentes tipos de respuesta celular en el bovino (Swain y col.,
1998).
En el bovino ha ido tomando importancia la caracterización de la función de neutrófilos en
diferentes patologías, como por ejemplo, en los cuadros de mastitis donde la migración de
neutrófilos al sitio de inflamación aguda es de extrema importancia para la defensa frente a
infecciones en la glándula mamaria y pezón (Persson y col., 1993).
2.2. Factor activante plaquetario
El factor activante plaquetario (PAF) es uno de los más potentes mediadores de la inflamación
que regula la función de los neutrófilos. PAF es un fosfolípido biológicamente activo, producido
por neutrófilos, plaquetas, basófilos, células citocidas naturales, monocitos, macrófagos,
eosinófilos, mastocitos y células del endotelio vascular (Edwards, 1994).
Henson en 1971, demostró que los leucocitos secretaban un factor soluble que generaba
agregación plaquetaria. Otros investigadores confirmaron las observaciones mencionadas y lo
llamaron factor activante plaquetario (Platelet-activating factor o PAF). PAF corresponde a 1-Oalquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina y su precursor es 1-O-alquil-2-acil-glicerofosfocolina,
lípido que se encuentra en gran concentración en membranas de varios tipos de células. PAF es
sintetizado a partir de dicho sustrato en dos fases. La primera comprende la acción de la
fosfolipasa A2 con la formación de liso-PAF y un ácido graso libre (ácido araquidónico). En
algunas células como los neutrófilos, está reacción es una fuente importante de ácido
araquidónico, el cual es metabolizado hasta dar prostaglandinas y leucotrienos. En una segunda
etapa, liso-PAF es acetilado por acetil-CoA para formar PAF. La síntesis de PAF puede ser
estimulada durante las reacciones antígeno-anticuerpo o por otras sustancias como agentes
quimiotácticos, trombina, colágeno y autocoides (Goodman y Gilman, 1996).
PAF está íntimamente implicado en el proceso de inflamación aguda y crónica, produciendo
agregación de polimorfonucleares (Edwards, 1994), liberación de leucotrienos y enzimas
lisosómicas,
generación
de
superóxido
(Goodman
y
Gilman,
1996),
hipotensión,
broncoconstricción y aumento de la permeabilidad vascular (Edwards, 1994). Esto último
estimula la salida de líquido desde los vasos sanguíneos; como ocurre con sustancias como
histamina y la bradicinina, pero PAF es mil veces más potente que las dos sustancias
mencionadas anteriormente. PAF es un factor quimiotáctico de los polimorfonucleares, también
estimula la adherencia de los neutrófilos a las células endoteliales y su diapédesis (Goodman y
Gilman, 1996).
Los receptores de PAF han sido encontrados en varias células y tejidos, como plaquetas humanas,
de conejo y perro, neutrófilos humanos, células musculares lisas de cobayo, tejido hepático
humano, células diferenciadas de leucemia humana, leucocitos mononucleares periféricos
humanos, cerebro, células de Küpffer y membrana plasmática de hígado de rata (Snyder, 1990).
El paso inicial en la actividad inflamatoria de los PMN modulada por PAF es la interacción de
este con un receptor específico de 7 dominios transmembranosos, lo cual luego activa la proteína
G heterotrimérica activando señales intracelulares y genera segundos mensajeros que activan la
enzima intracelular fosfolipasa C (PLC)-gamma encontrada en la gran mayoría de las células
mamíferas que estimula la formación de inositol fosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El efecto
neto de la activación de la enzima PLC-gamma es la fosforilación proteínica intracelular. (Chao
& Olson, 1993; Ishii & Shimizu, 2000).
2.3. Control de PH intracelular
PAF es también conocido por causar cambios en el pH en los microambientes dentro y fuera de
las células polimorfonucleares (PMN) (Naccache et al., 1986; Gronert et al., 1998).
El exceso de protones generados por la reacción 202- + H+ + NADP+, dependiente de la
activación de NADPH oxidasa, produce una acidificación intracelular transitoria. Esta es
revertida principalmente por la activación de un intercambiador de Na+/H+ (NHE), hasta generar
una alcalinización intracelular. La acidificación extracelular y alcalinización intracelular son
claves en el proceso de quimiotaxis, aumentan la vida media del neutrófilo, favorecen la
liberación de superóxido, y de metabolitos derivados de lipoxigenasa, lo que finalmente ayuda a
intensificar la respuesta inflamatoria aguda (Putney et al., 2002).
2.4. Vías de señalización
Se ha propuesto que PAF induce la activación de MAPK por PI3K en neutrófilos (Ferby et al.,
1994).
La PI3K es una enzima heterodimérica (formada por una subunidad de 85 kDa regulatoria y una
de 110 kDa catalítica) que fosforila la posición D-3 de la cabeza del inositol de los lípidos
fosfoinositidos. La familia PI3K comprende 3 clases (I, II, III) dependiendo de la especificidad
del sustrato y estructura proteínica (Vanhaesebroeck et al ., 1997; Fruman et al., 1998; Wymann
& Pirola, 1998). La familia I esta dividida en Ia y Ib subfamilias y 4 conocidas isoformas de
evidencias experimentales sugieren que PI3K es la clave en la quimiotaxis, producción de
superóxidos y fosforilación de ERK inducida por quimioatractantes en PMNs (Okada et al.,
1994; Hirsch et al., 2000; Sasaki et al., 2000).
ERK 1/2 MAPK pertenece a la familia de proteínas de 40-45 kDa, serina/treonina kinasas, que
son activadas por muchos estímulos extracelulares, incluyendo factores de crecimiento y
hormonas. MAPKs requiere fosforilación de ambos residuos de treonina y tirosina en thr183glu-tyr185 para llegar a ser activada ( Payne et al., 1991; Granot et al., 1993). En neutrófilos, la
vía MAPK controla varias respuestas incluyendo priming, expresión de genes (Yaffe et al.,
1999), fagocitosis y producción de superóxidos (Downey et al., 1998). Sin embargo, en contraste
con otros granulocitos , PAF tiene un efecto leve sobre la fosforilación de ERK1/2 en neutrófilos.
(Nick et al., 1997).
En neutrófilos humanos, se ha descrito que los quimioatractantes se unen a la superficie celular
del neutrófilo a través de 7 proteínas transmembrana acopladas a proteína G. Después de la
activación del receptor, la especificidad de la respuesta funcional podría ocurrir a través de la
activación de distintas y separadas vías, a través de mecanismos combinados. La activación de las
kinasas en esta vía es máxima entre 1-2 minutos después de la exposición a FMLP. Poco es
sabido sobre la vía de señalización intracelular utilizada por el neutrófilo humano en respuesta a
la estimulación con PAF.
Si la heterogeneidad de la respuesta del neutrófilo esta reflejada en la utilización selectiva de las
vías de señalización intracelular, esas diferencias podrían finalmente resultar en distintos patrones
de activación de MAP kinasa. Además de p42/44 (ERK) MAPk, a lo menos dos distintas familias
de MAP kinasas existen en células mamíferas. Se ha reportado que FMLP activa fuertemente
ambos p38 MAPk y p42/44 (ERK) MAPk, mientras que PAF activa preferencialmente p38
MAPk. La activación de p42/44 (ERK) MAPk por FMLP ocurre a través de la activación de p38
MAPk por FMLP y PAF aparece ocurrir a través de la activación de MAP kinasa kinasa 3
(MKK3). (Nick et al., 1997).
Estudios recientes han indicado que la unión de FMLP al receptor sobre la superficie del
neutrófilo humano da curso a una secuencia de fosforilación de proteínas, evento que incluye la
activación de kinasas dependientes de Ras (Raf y MAP/ERK kinasa kinasa-1 (MEKK-1)) lo cual
además fosforila y activa la MAP/ERK kinasa (MEK-1 y MEK-2) lo cual a su vez activa la
p42/44(ERK) mitogen activated protein kinasa (MAPk). La estimulación de neutrófilos con PAF
resulta en una menor utilización de esta vía de señalización intracelular, con solo una ligera
activación de p42/44 (MAP kinasas ERK), MEK1/MEK2, Raf o MEKK-1. La señal de
transducción intracelular después de la exposición de los neutrófilos a PAF ocurre a través de una
vía de señalización paralela resultando en la activación de MKK3 y la subsiguiente fosforilación
y activación de p38 MAPk. En adición, se ha reportado que la estimulación con FMLP también
resulta en la activación de MKK3 y p38 MAPk en un tiempo y concentración de manera
dependiente equivalente a PAF. (Nick et al., 1997).
2.5. NHE, intercambiador NA+/H+
El flujo de protones a través de membranas conducen a un numero de procesos fisiológicos,
incluyendo la comunicación dentro y entre células, migración celular, y la proporción en que las
células crecen, se dividen y diferencian. El flujo de protones en la membrana plasmática están
reguladas por varias familias de intercambiadores de iones, incluyendo los intercambiadores
Na+/H+ (NHEs).
La familia de las NHE incluye seis isoformas (NHE1-NHE6), de estas 6 isoformas la mas
expresada es la isoforma NHE1, la función de estas es electroneutralizar intercambiando H+
intracelulares por Na+ extracelulares, de esta forma regulando el pH(i) y volumen celular.
Hasta ahora, seis miembros de la familia NHE han sido identificadas. NHE1, NHE2, NHE3,
NH4 y NHE5 comparten aproximadamente del 34 al 60% de su identidad aminoacídica. NHE1
esta ampliamente expresada y juega un rol central en el pH intracelular y homeostasis. En
contraste, NHE2, NHE3, NH4 y NHE5 tienen una distribución en los tejidos mas limitada y
tienen una función mas especializada. NHE2 y NHE4 son expresadas predominantemente en el
riñón y tracto gastrointestinal, donde únicamente se encuentra función de NH2 primariamente en
la reabsorción de sodio, y puede actuar en coordinación con NH4, promoviendo la
osmoregulación renal células medulares. NH3 esta específicamente apuntada para la membrana
apical del epitelio tubular renal proximal y el borde cepillo del epitelio intestinal maduro. En el
riñón, NH3 es importante en la reabsorción de Na+ y HCO3-, lo cual contribuye
significativamente para mantener la osmolaridad sanguínea y el balance ácido base. NH5 es
expresada predominantemente en el cerebro y se piensa es importante en la regulación del pH(i)
en neuronas. El más recientemente miembro de la familia NHE identificado, NH6, es el más
divergente en secuencia, compartiendo solo el 20% de identidad con las otras isoformas. NH6 se
localiza exclusivamente en la mitocondria, con una gran expresión en tejidos metabólicos, tales
como corazón, cerebro y músculo esquelético (Putney et al., 2002).
En mamíferos, NHE1 esta comprendido de 813 a 822 aminoácidos, con una masa molecular
calculada de 91 kDa.
Una característica distinta del NHE1 es que su actividad está regulada por diversas clases de
receptores de la superficie celular, incluyendo receptor tirosina kinasas, receptores acoplados a
proteina G, y receptores integrina. Actuando a través de un número de redes de señalizacion bien
caracterizadas, señales mediadas por receptores que convergen en un número limitado de
proteínas NHE interactoras que regulan las modificaciones en el C-terminal citoplasmático que
regulan el dominio de NHE1. Estas modificaciones, incluyendo fosforilación, unión a proteínas
reguladoras, y cambios conformacionales, regulan la actividad transportadora por cambio de
afinidad de la transmembrana interna del sitio transportador de protones (Putney et al., 2002).
2.6. Antagonistas de PAF
Una amplia variedad de antagonistas específicos de PAF se han desarrollado por una variedad de
firmas farmacéuticas y muchos de estos medicamentos están siendo comúnmente ensayados
como fármacos potenciales en el tratamiento del asma y una variedad de desórdenes
inflamatorios y alérgicos (Snyder, 1990).
Los antagonistas de PAF evitan la unión de PAF a su receptor y bloquean selectivamente sus
acciones. Entre los antagonistas hay sustancias análogas a PAF (PAF modificado), diversos
productos vegetales naturales y las triazolbenzodiazepinas como apafan (WEB 2086), alprazolam
y triazolam (Goodman y Gilman, 1996). Sin embargo, todos los antagonistas de PAF presentan
partes características como una región lipofílica e hidrofílica que pueden interactuar con el
receptor (Snyder, 1990).
14-deoxiandrografolido (14-DAP) (Fig. 1), es un labdano diterpeno aislado de Andrographis
paniculata, que posee efectos antipiréticos y anti-inflamatorios. Además, de tener una potente
actividad para inducir diferenciación en células de ratón con leucemia mieloide. Experimentos
evidencian que 14-DAP relaja de manera considerable la presión arterial en ratas anestesiadas y
relaja las contracciones tónicas generadas por fenilefrina y KCl. Estos resultados sugieren que
14-DAP podría bloquear el flujo de calcio por interferencia de los canales de calcio operados por
voltaje y por receptores (Zhang y Tan, 1998).
Existen evidencias que 14-DAP podría ser un antagonista del receptor de PAF, ya que hay una
sustancia semejante estructuralmente a 14-DAP, llamada pinusolide (Fig. 2), la cual mediante
estudios de radioligando utilizando PAF-[H3] demostró ser un potente y específico antagonista de
PAF in vitro e in vivo (Yang y col., 1995).
FIGURA 1. Estructura química de 14-DAP.
FIGURA 2. Estructura química de pinusolide.
Andrografolide y 14-DAP (2 labdanos diterpenos aislados de andrographis paniculata) fueron
probados por su potencial como antagonista de receptor de PAF, y andrografólido fue capaz de
inhibir la agregación plaquetaria inducida por PAF en plaquetas humanas. En experimentos, la
fijación de 3H-PAF a membranas de neutrófilos, esta fue inhibida por 14-DAP pero no
andrografólido. En nuestro laboratorio, diferencias entre las actividades de 14-DAP y
andrografólido en neutrófilos de bovino y células HL-60 fueron corroborados por el
descubrimiento que la liberación de calcio inducido por PAF en células marcadas con FURA2AM fue significativamente reducida en la presencia de 50 μM de 14-DAP, pero no en la
presencia de 50 μM de andrografólido. En membranas de neutrófilos de bovino, 14-DAP redujo
la fijación de 3H-PAF con una pendiente de pseudo hill <1, lo cual sugiere diferentes sitios de
fijación de 14-DAP en neutrófilos (Burgos y col., 2004) . Se ha determinado que 14-DAP es un
efectivo bloqueador de canales de calcio, lo que explicaría la existencia de mas de un sitio de
unión en la membrana (Burgos y col., 2003).
Se ha sugerido que los antagonistas de PAF podrían ser potencialmente útiles en el tratamiento de
condiciones inflamatorias en el ganado. Por ejemplo, el aumento en el índice respiratorio
inducido por PAF, resistencia pulmonar total, y cambios máximos en la presion transpulmonar en
terneros, fue reducido o suprimido por la acción de WEB2086. Entre los varios antagonistas de
PAF evaluados en esta tesis, 14-DAP tiene una alta afinidad con receptores de PAF en
membranas de neutrófilos y pueden tener un potencial uso en el tratamiento de enfermedades
pulmonares (como pasteurelosis neumónica) en terneros (Burgos y col., 2004).
2.7. Hipótesis
- La activación de la vía PI3K y ERK1/2 controla la alcalinización intracelular inducida por PAF
en neutrófilos de bovino.
Para aceptar o rechazar esta hipótesis se realizarán los siguientes experimentos cuyos objetivos
son:
2.8. Objetivos

Evaluar el cambio de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo PI3K con Wortmanina y
LY294002, en neutrófilos de bovino.

Evaluar el cambio de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo MEK1/2 con UO126, en
neutrófilos de bovino.

Evaluar el cambio de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo PKC con Gö6850, en neutrófilos
de bovino.

Determinar el efecto antagonista de 14-DAP en el cambio de pH(i) inducido por PAF, en
neutrófilos de bovino.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales
3.1.1. Extracción de sangre:
-Agujas VacutainerR 21 G11/2.
-Tubos al vacío VacutainerR de 8,5 ml con 1,5 ml de anticoagulante (solución de citrato de sodio
dextrosa).
-Guantes de látex y algodón con alcohol.
3.1.2. Aislamiento de neutrófilos:
-Tubos FalconR de 15 ml.
-Pipetas Pasteur.
- Pipetas automáticas BOECOR de 1 ml, 200 μl, 50 μl, 10 μl.
-Centrífuga Mikro 22 R HettichR.
-Cámara de Neubauer.
-Microscopio óptico MoticR.
-Sales: fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, d-glucosa, fosfato monosódico de
MerckR.
-Balanza analítica de ScientechR.
3.1.3. Ensayos de medición de pH intracelular:
PAF (factor activante plaquetario) de CalbiochemR.
Etanol de MerckR.
Tubos Eppendorf de 1,5 ml.
Pipetas automáticas BOECOR de 1 ml, 200 μl, 50 μl, 10 μl.
Baño termoregulado MemmertR.
Sales: TRIS de Winkler Ltda, EGTA de Amersham Pharmacia BiotechR.
Balanza analítica de ScientechR.
Vortex V-1 de BOECOR.
Sonda BCECF-AM de Molecular ProbesR . Gö6850 de CalbiochemR.
Wortmanina de CalbiochemR.
LY294002 de CalbiochemR.
UO126 de CalbiochemR.
14-DAP de AMSAR Private Ltda R.
Espectrofluorímetro LS55 Perkin Elmer.
Incubadora Memmert.
3.2. Metodología
3.2.1. Aislamiento de neutrófilos de bovino.
Para obtener los neutrófilos de bovino se siguió el procedimiento utilizado por Roth y Kaeberle
(1981) con algunas modificaciones.
Se utilizaron bovinos Frisón Negro de 4 a 9 años de edad del Hospital del Instituto de Ciencias
Clínicas Veterinarias y Fundo Vista Alegre, ambos pertenecientes a la Universidad Austral de
Chile. La sangre se obtuvo por punción de la vena yugular utilizando tubos al vacío de 9 ml que
contienen citrato de sodio (VacutainerR). La muestra de sangre se centrifugó a 1.000 x g por 15
minutos. Se eliminó el plasma y capa flogística con pipeta Pasteur y se completó con medio
HBSS (Hanks balanced salt solution o solución salina de Hank, que contiene 0,0004 M de fosfato
de potasio; 0,00034 M de fosfato de sodio; 0,13 M de cloruro de sodio; 8,02 M de d-glucosa y
0,0053 M de cloruro de potasio). Se resuspendió el contenido figurado utilizando una pipeta
Pasteur y se traspasó a tubo Falcon de 15 ml. Se realizó el mismo método de centrifugación y
luego de eliminar el plasma y capa flogística, se aplicaron 2 volúmenes de medio de lisis (que
contiene 0,0048 M de fosfato monosódico y 0,0084 M de fosfato dipotásico) por un minuto,
homogenizando. Luego se agregó 1 volumen de medio hipertónico (que contiene 0,0048 M de
fosfato monosódico, 0,0084 M de fosfato dipotásico y 0,43 M de cloruro de sodio), se completó
con medio HBSS y se centrifugó a 600 x g por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se
resuspendió el precipitado en 1 ml de medio HBSS; se agregó 2 ml de medio de lisis por 1
minuto; se aplicó 1 ml de medio hipertónico; se completó con medio HBSS y se homogenizó. Se
realizó una segunda centrifugación a 600 x g por 10 minutos. Se lavaron los neutrófilos
precipitados dos veces con medio HBSS y se resuspendió en 5 ml de HBSS. A continuación se
estimó la viabilidad con azul de tripán 0,5% en PBS y se cuantificaron los neutrófilos. Ambas
estimaciones se realizaron con microscopio óptico utilizando cámara de Neubauer. Los ensayos
se realizaron con una viabilidad sobre el 95%. Para determinar el porcentaje de los neutrófilos
presentes después del aislamiento se utilizó la tinción de Giemsa, haciendo un frotis por
"citospin".
El proceso de aislamiento de neutrófilos demoró aproximadamente 3 horas e inmediatamente se
realizó la preincubación con BCECF-AM y medición de pH intracelular. La estandarización en
unidades de pH fue realizada usando el método de calibración de nigericina descrito
anteriormente (Grinstein et al., 1984).
3.2.2. Preincubación de neutrófilos con BCECF-AM.
En una concentración aproximadamente de 2 x107 / ml los neutrófilos fueron resuspendidos en un
buffer ph (140 mM NaCl, 10 mM Glucosa, 1 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM
Hepes, pH 7.2) e incubados con BCECF-AM (2,5 μM) por 30 min at 37 ºC. Las células fueron
lavadas dos veces con buffer pH y resuspendidas a 4 x106 / ml.
3.2.3. Evaluación de PI3K sobre los cambios de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo con
Wortmanina y LY294002, en neutrófilos de bovino.
Para obtener los resultados se siguió el procedimiento utilizado por Hidalgo y col. (2004).
Aproximadamente 4 millones de células en 2 ml de bufer pH, fueron depositadas en cubetas de
cuarzo, e incubadas con Wortmanina y LY294002 a concentraciones 10, 50 y 100 nM y 5, 10 y
30 μM respectivamente por 30 minutos, las mediciones de pH intracelular se realizaron con un
espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55 , con agitación magnética, a 37ºC, utilizando una
excitación de 440 nm y 495 nm, emisión de 535 nm. Luego de obtener los registros basales de
fluorescencia durante 2 minutos, se agregó 20 μl de PAF 1 x 10 -5 M en experimentos
individuales. Se utilizó como control el vehículo de PAF, etanol 0,001%.
3.2.4. Evaluación de MEK1/2 sobre los cambios de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo con
UO126, en neutrófilos de bovino.
Aproximadamente 4 millones de células en 2 ml de bufer pH, fueron depositadas en cubetas de
cuarzo, e incubadas con UO126 a concentraciones 0,1 y 1 μM por 30 minutos, las mediciones de
pH intracelular se realizaron con un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55 , con agitación
magnética, a 37ºC, utilizando una excitación de 440 nm y 495 nm, emisión de 535 nm. Luego de
obtener los registros basales de fluorescencia durante 2 minutos, se agregó 20 μl de PAF 1 x 10 -5
M en experimentos individuales. Se utilizó como control el vehículo de PAF, etanol 0,001%.
3.2.5. Evaluación de PKC sobre los cambios de pH (i) inducido por PAF, inhibiendo con
Gö6850, en neutrófilos de bovino.
Aproximadamente 4 millones de células en 2 ml de bufer pH, fueron depositadas en cubetas de
cuarzo, e incubadas con Gö6850 a concentraciones 0,5, 5 y 10 μM por 30 minutos, las
mediciones de pH intracelular se realizaron con un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55 , con
agitación magnética, a 37ºC, utilizando una excitación de 440 nm y 495 nm, emisión de 535 nm.
Luego de obtener los registros basales de fluorescencia durante 2 minutos, se agregó 20 μl de
PAF 1 x 10-5 M en experimentos individuales. Se utilizó como control el vehículo de PAF, etanol
0,001%.
3.2.6. Determinación del efecto antagonista de 14-DAP en el cambio de pH(i) inducido por
PAF, en neutrófilos de bovino.
Aproximadamente 4 millones de células en 2 ml de bufer pH, fueron depositadas en cubetas de
cuarzo, e incubadas con 14-DAP 25 μM por 30 minutos, las mediciones de pH intracelular se
realizaron con un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55 , con agitación magnética, a 37ºC,
utilizando una excitación de 440 nm y 495 nm, emisión de 535 nm. Luego de obtener los
registros basales de fluorescencia durante 2 minutos, se agregó 20 μl de PAF 1 x 10 -5 M. Se
utilizó como control el vehículo de PAF, etanol 0,001%.
3.2.7. Análisis estadístico.
Para evaluar las diferencias estadísticas de realizó un test ANOVA y un test de comparaciones
múltiples de Dunnett. El nivel de significancia usado fue de 5 %. Para todos los análisis se utilizó
el programa software GraphPad Prism versión 3.0.
4. RESULTADOS
4.1. Evaluación del rol de PI3K sobre los cambios de pH(i) inducido
por PAF, en neutrófilos de bovino
El cambio de pH intracelular en neutrófilos marcados con BCECF-AM fue inducido con distintas
concentraciones de PAF de manera dosis-dependiente. Los neutrófilos de bovino muestran un pH
intracelular de 7,20 ± 0,01. Concentraciones de 1 a 100 nM pueden iniciar un aumento de pH
intracelular que es máximo entre 5 a 10 minutos.
En la figura 3, se muestra un experimento donde se induce el cambio de pH intracelular
estimulada con distintas concentraciones de PAF. Se observa un rápido aumento de las unidades
de fluorescencia después de la aplicación de PAF.
FIGURA 3. Efecto de diferentes concentraciones de PAF en el pH intracelular en el tiempo,
monitoreado fluorimétricamente, en neutrófilos marcados con BCECF-AM.
El incremento del pH intracelular inducido por PAF fue analizado usando los inhibidores
específicos de PI3K, Wortmanina y LY294002, en concentraciones 100, 50 y 10 nM, y 30 y 10
μM respectivamente, para así evaluar el rol de esta vía. Los resultados obtenidos claramente
indican que inhibiendo con LY294002 y Wortmanina, no hay modificación en la acidificación,
mientras que la alcalinización inducida con 100nM de PAF fue inhibida (Fig. 4 y 5).
FIGURA 4. A. Efecto de LY294002 sobre la acidificación y alcalinización inducida por 100 nM
de PAF, cada barra representa el promedio ± error estándar, n = al menos 3 experimentos
independientes, * p < 0.05 comparado con el control. B. Registro representativo de cambios de
pH en neutrófilos estimulados por 100 nM de PAF y el efecto de 30 μM de LY294002.
FIGURA 5. A. Efecto de Wortmanina sobre la acidificación y alcalinización inducida por 100
nM de PAF, cada barra representa el promedio ± error estándar, n = al menos 3 experimentos
independientes, * p < 0.05 comparado con el control. B. Registro representativo de cambios de
pH en neutrófilos estimulados por 100 nM de PAF y el efecto de 100 nM de Wortamina.
4.2.
Evaluación del rol de MEK1/2 sobre los cambios de pH(i)
inducido por PAF, en neutrófilos de bovino
El incremento del pH intracelular inducido por PAF fue analizado usando un inhibidor específico
de MEK 1/2, el UO126 en concentraciones de 1 y 0,1 μM, para así evaluar el rol de esta vía. Los
resultados obtenidos indican que no hay modificación en la acidificación y la alcalinización
intracelular inducida con 100nM de PAF fue inhibida de manera dosis dependiente por UO126.
(Fig. 6).
FIGURA 6. A. Efecto de UO126 sobre la acidificación y alcalinización inducida por 100 nM de
PAF, cada barra representa el promedio ± error estándar, n = al menos 3 experimentos
independientes, * p < 0.05 comparado con el control. B. Registro representativo de cambios de
pH en neutrófilos estimulados por 100 nM de PAF y el efecto de 1 μM de UO126.
4.3. Evaluación del rol de PKC sobre los cambios de pH(i) inducido
por PAF, en neutrófilos de bovino
El incremento del pH intracelular inducido por PAF fue analizado usando un inhibidor específico
de PKC, Gö6850 en concentraciones de 10, 5 y 0,5 μM, para así evaluar el rol de esta vía. Los
resultados obtenidos indican que no hubo modificación en la acidificación y la alcalinización
intracelular fue inhibida de manera dosis dependiente por Gö6850.(Fig. 7)
FIGURA 7. A. Efecto de Gö6850 sobre la acidificación y alcalinización inducida por 100 nM de
PAF, cada barra representa el promedio ± error estándar, n = al menos 3 experimentos
independientes, * p < 0.05 comparado con el control. B. Registro representativo de cambios de
pH en neutrófilos estimulados por 100 nM de PAF y el efecto de 10μM de Gö6850.
4.4. Determinación del efecto antagonista de 14-DAP en el cambio
de pH(i) inducido por PAF, en neutrófilos de bovino
El efecto antagonista de 14-DAP y su efecto sobre el cambio de pH intracelular fue analizado
usando el antagonista en concentraciones de 25 μM. Los neutrófilos fueron marcados con la
sonda fluorescente BCECF-AM y posteriormente se analizó los cambios de pH intracelular
inducidos por PAF (100 nM) en ausencia o presencia de 14-DAP (25 μM). Los resultados
obtenidos indican que 14-DAP inhibe el cambio de pH intracelular inducido por PAF en
neutrófilos de bovino (Fig. 8).
FIGURA 8. A. Efecto de 14-DAP sobre la acidificación y alcalinización inducida por 100 nM
de PAF, cada barra representa el promedio ± error estándar, n = al menos 3 experimentos
independientes, * p < 0.05 comparado con el control. B. Registro representativo de cambios de
pH en neutrófilos estimulados por 100 nM de PAF y el efecto de 25 μM de 14-DAP.
5. DISCUSION
En este estudio, PAF produjo un cambio en el pH intracelular de una manera dosis-dependiente.
El mayor cambio de pH intracelular fue inducido con una concentración de PAF de 1 x 10 -7 M.
PAF causa cambios en el pH en los microambientes dentro y fuera de las células
polimorfonucleares (PMN). Intracelularmente hay un cambio bifásico de pH que se caracteriza
por una rápida acidificación y una gradual alcalinización dependiente del intercambiador Na+/H+,
y una acidificación en el medio extracelular (Naccache et al., 1986; Gronert et al., 1998).
El exceso de protones generados por la reacción 202- + H+ + NADP+, dependiente de la
activación de NADPH oxidasa, produce una acidificación intracelular transitoria. Esta es
revertida principalmente por la activación de un intercambiador de Na+/H+ (NHE), hasta generar
una alcalinización intracelular. La acidificación extracelular y alcalinización intracelular son
claves en el proceso de quimiotaxis, aumentan la vida media del neutrófilo, favorecen la
liberación de superóxido, y de metabolitos derivados de lipoxigenasa, lo que finalmente ayuda a
intensificar la respuesta inflamatoria aguda (Putney et al., 2002).
Los resultados claramente muestran que 100 nM de PAF causan un incremento significativo en
la alcalinización intracelular medida en células marcadas con BCECF-AM (Fig.3). Varios
experimentos usando diferentes quimioatractantes sugieren que el NHE es un componente
importante en la regulación de los cambios de tamaño celular y la migración, debido al hecho que
amiloride y sus derivados son capaces de reducir la quimiotaxis y el aumento del pH(i)
(Naccache et al., 1986; Simchowitz & Cragoe 1986 a,b). Las vías de señalización de
transducción involucradas en la alcalinización intracelular inducida por PAF son desconocidas en
neutrófilos.
La inhibición específica de PKC con Gö6850, resultó en una clara inhibición dosis dependiente
de la alcalinización intracelular del neutrófilo, esto sugiere que entre las vías de control de
alcalinización, al interior del neutrófilo, estaría bajo control de PKC. Ha sido descrito una mayor
-
-isoforma en neutrófilos de bovino (Stasia et
al., 1990).
Ha sido sugerido que la fosforilación de ERK1/2 está involucrada en la actividad del NHE
(Fukushima et al., 1996). Es sabido que la vía MAPK puede ser activada por receptores
acoplados a proteína G. La consecuencia de la activación de MAPK entre otras es la fosforilación
de ERK 1/2 que es regulada más arriba por PI3K y MEK 1/2 en eosinófilos (Miike et al., 2000).
El aumento del pH(i) controlado por NHE puede ser activada en neutrófilos por contracción
osmótica, lo cual induce alcalinización intracelular y aumenta la fosforilación de tirosina (Krump
et al., 1997). Los resultados también demostraron que el aumento de pH (i) está también bajo el
control de la actividad PI3K, dado que esta fue inhibida por Wortmanina y LY294002.
Es sabido que a concentraciones nanomolares (1-100 nM) de Wortmanina son capaces de inhibir
la clase I y II de PI3K y a concentraciones mayores a 100 nM inhibe la clase III (Ward et al.,
2003). A concentraciones submicromolares Wortmanina también inhibe otras kinasas tales como
PI4K entre otras(Nakanishi et al., 1995). Por esta razón se usó LY294002 el cual es un inhibidor
selectivo de PI3K (a rangos micromolares) y no tiene un efecto detectable sobre otras proteínas
kinasas o PI4K (Vlahos et al., 1994). LY294002 reduce sólo parcialmente la fosforilación de
ERK1/2 inducida por PAF, indicando que otra vía diferente de PI3K está involucrada en la
activación de MEK1/2, como se ha demostrado en el laboratorio. Por otro lado LY294002 redujo
la alcalinización inducida por PAF.
Esta evidencia experimental sugiere que PAF, a través de las vías de activación PI3K-MAPK,
pueden modular la actividad de NHE en neutrófilos de bovino.
Experimentos usando estimulación osmótica han demostrado un incremento en la actividad de
NHE y fosforilación de ERK 1/2, sin embargo, bajo esta condición, la inhibición de MEK no
reduce la alcalinización intracelular (Gillis et al., 2001). La alcalinización inducida por PAF en
neutrófilos de bovino fue precedida por un periodo leve y transitorio de acidificación intracelular.
Este patrón es también observado en neutrófilos activados con fMLP y TPA (Grinstein et al.,
1986; Sustak et al., 1997). Ha sido demostrado que una acidificación intracelular sostenida
incrementa la actividad NHE1 o la vía de activación ERK 1/2 (Haworth et al., 2003).
Quimioatractantes inducen el estallido respiratorio con NADPH oxidasa provocando un aumento
en la producción de H+ (Grinstein et al., 1986; Sustak et al., 1997), y es posible que la
acidificación intracelular inicial podría contribuir directamente en la actividad de NHE.
En la acidificación intracelular inducida por PAF no participarían las vías PI3K y ERK1/2, es
posible que en la producción de protones inducida por PAF no participe la NADPH oxidasa. PAF
activaría la producción de anión superóxido pero no sería controlada por PI3K, ERK1/2 o p38
(demostrado en el laboratorio), pero si participaría una vía dependiente de PKC.
14-DAP es un diterpeno aislado de A. paniculada, con efectos antipiréticos y anti-inflamatorios
(Zhang & Tan, 1998). Debido a que 14-DAP es estructuralmente semejante a pinusolide, un
labdano diterpenoide con actividad antagonista de PAF (Han y col., 1998), se realizaron
experimentos para evaluar el posible efecto antagonista de 14-DAP sobre PAF.
En esta tesis la preincubación de neutrófilos de bovino con 14-DAP 25 μM generó inhibición del
cambio de pH intracelular inducido por PAF en neutrófilos de bovino.
En conclusión, en neutrófilos de bovino, PAF aumenta el pH(i) vía NHE, involucrando la
actividad de un receptor de PAF acoplado a una proteina G. Este efecto esta más arriba regulado
por PI3K, MEK 1/2 y PKC. Esta regulación podría ser importante en la inflamación, debido al
hecho que NHE esta ampliamente expresado, es el blanco de múltiples vías de señalización y
participa en el proceso inflamatorio (Putney et al., 2002).
También se concluye que 14-DAP inhibe el cambio de pH intracelular inducido por PAF en
neutrófilos de bovino. El aislamiento de compuestos biológicamente activos presentes en plantas
medicinales con propiedades anti-inflamatorias, es un importante campo de estudio. Estas
sustancias serían una buena alternativa en el tratamiento sintomático de muchas patologías, ya
que no presentarían los múltiples efectos secundarios como los anti-inflamatorios actualmente
utilizados en medicina veterinaria. Además, estas sustancias podrían ser la base estructural para la
síntesis de sustancias antagonistas de PAF más potentes con fines terapéuticos específicos.
Si bien este trabajo aporta al conocimiento en el control de pH del neutrófilo y a los posibles
fármacos que puedan actuar en las diferentes vías que regulan el pH intracelular como
mecanismo antinflamatorio, deberán realizarse futuras investigaciones para demostrar cuales de
esas vías participan en la activación de NHE y cuales son los mecanismos que controlan la
acidificación intracelular inducida por PAF.
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