ANÀLISIS FENOMENOLÓGICO DE CARACTERES

ANÀLISIS FENOMENOLÓGICO DE CARACTERES
ESTRUCTURALES DE PROTEÍNAS PARA SU USO EN
CLASIFICACIÓN
Jeffrey Vega Aguilar
Facultad de Ciencias, Escuela de Biología, Sistemática, Universidad
Industrial de Santander. 2010
Introducción
La cantidad de datos estructurales de proteínas ha aumentado en
las últimas décadas y muchas de ellas no se han caracterizado
estructuralmente por la falta de un criterio sólido y universal para
ello. Los niveles de identidad usados en muchas ocasiones no
permiten que los métodos lineales encuentren similaridades entre
proteínas que se relacionan en 3D. Sin embargo cualquier
secuencia de aminoácidos tiene una alta probabilidad de que su
conformación sea similar a proteínas ya caracterizadas, lo que nos
induce a pensar en la posibilidad de determinar los fenómenos de
divergencia que han experimentado a través del tiempo. Partiendo
del hecho de que una hipótesis de relaciones filogenéticas es en
primera instancia generada por hipótesis de Homologia las cuales
deben ser sustentadas, debemos estimar que tan informativos son
los caracteres a utilizar y cuan probable es que se pueda reconocer
correctamente una Homologia entre dos patrones similares. La
probabilidad de reconocer una homologìa usando el criterio de
complejidad favorece técnicas como el HCA, Dominios tipo y
Análisis de LOOPS, donde una estimación de similaridad requiere
conocimiento sobre la estructura y el tamaño de los patrones, sobre
la frecuencia de cada aminoácido, incluso las fuerzas evolutivas que
operan sobre ellos.
Dado que la secuencia lineal deja abierto un mundo de
posibilidades en cuanto a la dirección de los eventos que han
generado los cambios, pretendo indagar en la estructuración en 2D
algún registro histórico en secuencias lineales que no son tan
conservadas.
Materiales y métodos.
Dominios: Se utilizo la base de datos Pfam que contiene los
dominios de familias de proteínas conservadas, y se creo la matriz
de caracteres presencia–ausencia de 22 dominios en la familia FeS
(Tabla 1). Se evalúo teóricamente y empíricamente si estos
caracteres constituían homologìas que permitieran resolver las
relaciones históricas al interior de la familia (Figura 1).
Análisis de LOOPS
Desde http://www.bmm.icnet.uk/loop/index.html se consideraron los
agrupamientos conformacionales y secuencias consenso que se
han establecido para los bucles de proteínas con menos del 25% de
homologìa de secuencia a través de rayos-X con resolución mejor a
2.5 Aº. Los LOOPS (bucles) han sido clasificados en cinco tipos de
acuerdo a las estructuras secundarias que abrazan (alfa-alfa, betaenlaces beta, beta-orquillas beta, alfa-beta y beta-alfa (figura 2).
Cuatro variables se han utilizado para describir la geometría de
bucle (3 ángulos y una distancia) y estas clases se dividen en
subclases basadas en la llave de la geometría. Se evalúo si tal
clasificación es congruente con las relaciones filogenéticas
encontradas en las secuencias de aminoácidos de 12 proteínas
pertenecientes a las clases alfa-alfa, beta-beta, alfa-beta (figura 3),
además se determino la consistencia teórica de caracteres con
similaridad y conjunción.
HCA
Se evalúo teóricamente la probabilidad de homologìa para los
caracteres derivados de un Análisis de clusters hidrofobitos (Tabla
3). Se tomo como referencia el trabajo realizado por Hernandez et
al, 2006 con Lacasas de bacterias, para crear la matriz de
caracteres de clusters hidrofóbicos (tabla 2) a partir de la cual se
realizo una búsqueda por MP en Winclada (Nixon 2002) de la
hipótesis de relaciones filogenéticas. Estos nuevos caracteres son
entidades propuestas con base en el alineamiento que se hace para
encontrar similaridad en la posición del cluster, su forma y el
número de aminoácidos hidrofóbicos que lo forman. Además se
utilizaron las secuencias de aminoácidos de las 5 proteínas, junto
con un out group de otra familia para la hipótesis de relaciones
filogenéticas con Mr.Bayes 3.1.2 (Huelsenbeck y Ronquist 2001)
que fue confrontada con la topología creada a partir de HCA. No se
evalúo a través del pesaje de caracteres la informatividad de los
mismos quedando tal propósito para un futuro análisis.
Los análisis filogenéticos con secuencias de aminoácidos para
testear las hipótesis de relación filogenética con caracteres
hidrofóbicos y para evaluar si la clasificación implementada con
Análisis de LOOPS guarda correspondencia con la topología, se
hicieron gracias al hecho de que las hipótesis de homologìa son
testeables como predicciones de relaciones filogenéticas las cuales
pueden ser verificadas con otros caracteres (Patterson, 1988).
Los conceptos teóricos a evaluar fueron:
Similaridad: Correspondencia topográfica y de transformación
ontogénica.
Conjunción: Dos estados de carácter no pueden estar en la misma
entidad.
Congruencia: Los agrupamientos propuestos deben ser
congruentes con los agrupamientos con otras homologìas.
Resultados y discusión
La topología generada con la matriz de caracteres de dominios,
presenta una politomía basal general, lo que indica que no hay
información para resolver las relaciones de la familia FeS (figura 1).
La contrastacion de hipótesis filogenéticas para HCA, dio como
resultados las topologías de las Figuras 3 y 4, con estas se
determino que los caracteres de clusters hidrofóbicos pasan el test
de congruencia, ya que las relaciones filogenéticas son las mismas
en su mayoría.
La topología generada para evaluar la clasificación LOOPS (Figura
5), no manifiesta relación alguna entre las familias, ya que estas no
se comportan como grupos monofiléticos. Esta clasificación no
obedece a relaciones históricas, así como tampoco realiza un
alineamiento de estructuras.
Test
Similaridad
congruencia
Conjunción
Patrones-Dominio
FALLA
SIN EVALUAR
Análisis de
LOOPS
FALLA
FALLA
FALLA
HCA
PASA
PASA
PASA
Tabla 3. Test de Patterson para los caracteres propuestos.
FALLA
Criterio de posición: el alineamiento nos asegura que existe un
patrón amplio que es reconocido como el escenario para que los
caracteres se ubiquen y mantengan relaciones similares de posición
respecto de todo el conjunto. Este alineamiento se hace bajo el
concepto de dominio, el cual funciona como unidad estructural para
todas las secuencias en 2D
a analizar.
Para caracteres
morfológicos la homologìa posicional es el resultado de identidad en
los mecanismos del desarrollo de la estructura, la construcción de
proteínas en un mecanismo uniforme y el orden en que aparecen
los animoácidos va a depender de la secuencia de ARN.
Los clusters hidrofóbicos (HCA) relacionándolos por su posición en
la estructura y su relación con la región funcional, pasan el test de
similaridad. Esto es; que cuando una mutación afecta un cluster
asociado al sitio activo de la proteína la probabilidad de que esta
novedad sea desarrollada y retenida es baja. Consecutivamente la
probabilidad de que este carácter se comporte como una homologìa
es mayor. Probablemente solo los caracteres que sean neutrales a
la selección de fuerzas son funcionalmente independientes y seria
un problema por que también serian muy variables, entonces la
mejor forma de rastrear la evolución de las proteínas quizás sea a
través del registro que ha quedado como resultado de la presión
selectiva sobre la función.
Sobre la independencia de los caracteres propuestos desde HCA,
hay que decir que considero que si una mutación en la secuencia
afecta varios caracteres es por el hecho de correr el marco de
lectura, luego considero que no se comportan independientemente
siempre.
Los LOOPS son un procedimiento de agrupación que capta la
mayor parte de los grupos analizados por parte de los métodos de
inspección visual y encuentra las similitudes sin alinear, ya que usa
ángulos de Ramachandran, es por esto que no pasa el test de
similaridad topográfica.
El criterio de calidad especifica: en HCA la secuencia de
aminoácidos especifica para determinar la estructura secundaria
Alfa o Beta correspondiente y sobre la cual se establece el marco
de homologìa, puede ser considerada como soporte para este
criterio ya que constituyen una unidad de conformación resultado de
la naturaleza de lo residuos de los aminoácidos y su polaridad.
Criterio de continuidad: El alineamiento con HCA de estructuras
relacionadas pero de secuencias divergentes hace posible delinear
precisamente las posiciones que siempre están ocupadas por
aminoácidos hidrofóbicos. Estos agregados sin embargo exhiben
diferentes propiedades
concernientes en particular con su
accesibilidad a determinados solventes, como a la importancia para
configurar una estructura secundaria. Las posiciones hidrofóbicas
conservadas son mas ocultas que las no conservadas y su cadena
son significantemente menos expuestas. El pequeño número de
posiciones conservadas o casi totalmente conservados constituye
un factor determinante para cada pliegue, permitiendo que
plegamientos encontrados en otras secuencias mantengan relación
con las observadas y exista relación ontogénica y de posición a
través de la existencia de agregados que presentan características
intermedias.
Conclusiones.
En esta inspección superficial sobre HCA considero los clusters
como valiosos para inferir relaciones genealógicas entre miembros
de una misma familia de proteínas. Con una mejor especificación de
caracteres se puede indagar sobre cuales de estos agrupamientos
de aminoácidos nos permiten delimitar patrones estructurales
informativos genealógicos.
Ante la falta de un registro fósil para proteínas , lo cual ha sido
planteado como un inconveniente para la consideración de
caracteres ancestrales comunes; me inclino hacia considerar la
posibilidad de poder rastrear la evolución a través de las estructuras
conservadas y su relación entre ellas, lo que ha sido planteado años
atrás por Fitch (1970) quien planteo que la discriminación entre
analogía y homologìa entre dos grupos de secuencias puede ser
llevada a cabo sin un registro fósil, utilizando el principio de
descendencia común y el supuesto de parsimonia (Patterson,
1988), y así construir conformaciones estructurales ancestrales y
analizar si son mas o menos similares con los descendientes
observados.
Otro desafío será evaluar estadísticamente caracteres de este tipo;
es decir determinar si la estructuración es debida al azar, o es
resultado de algún tipo de selección.
Puedo deducir de todo esto es que el criterio usado para definir
Homologia (criterio de ancestria común) es un concepto teórico, por
lo que para reconocer empíricamente
caracteres derivados
compartidos estructurales debo evaluar la congruencia con otras
topologías que usan otros caracteres.
ANEXOS
Tabal 1. Matriz generada a partir de los dominios encontrados en cada familia
(Pfam).
Figura 2. Bucle tipo Alfa-Alfa. Clasificación de proteínas LOOPS
Figura 1. Árbol consenso estricto, para los caracteres “dominio” propuestos.
Dominio A
β1
β2
Bacillus subtilis
Aquifex aeolicum
T. erythraeum
T. thermophilus
G. sulfurreducens
β3
3
3
3
0
1
4
0
4
4
3
β4
5
4
4
0
2
β5
β6
1
1
1
1
1
α2
5
2
3
3
4
4
3
1
1
3
β7
3
1
2
0
2
3
2
2
2
3
4
3
4
2
3
Dominio B
β10
Bacillus subtilis
Aquifex
aeolicum
T. erythraeum
T. thermophilus
β11
β13
β14
β15
β16
β19α6
β17
β20
α3β9
β8
β21
3
5
3
4
2
3
3
5
3
2
3
3
3
3
1
4
3
1
1
4
4
4
2
2
2
3
3
3
2
2
3
4
3
4
2
2
2
2
1
1
9
7
6
7
5
G.
sulfurreducens
3
3
2
4
2
3
3
5
2
Dominio C
β25α8β29β22 β23 β24 β26
α9 β27 β28 α10
β30
Bacillus subtilis
2
2
3
0
2
1
1
1
3
Aquifex
aeolicum
2
2
3
1
0
1
3
1
2
T. erythraeum
2
2
2
2
0
1
3
2
0
T. thermophilus
1
1
1
1
1
1
2
2
1
G.
sulfurreducens
2
2
3
1
2
2
1
1
2
Tabla 2. Matriz de caracteres obtenidos a partir de HCA. La codificación de los
estados se realizo de acuerdo al numero de tipos morfológicos diferentes
encontrados en la posición.
Figura 3. Topología para Lacasas obtenida con caracteres de agregados
hidrofóbicos.
Figura 4. Topología para Lacasas obtenida con secuencias de aminoácidos.
2
Figura 5. Topología con secuencias a.a. para los miembros de tres familias
LOOPS, diferenciadas con colores.