manual de medios y reactivos del laboratorio de micologia

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MANUAL DE MEDIOS Y
REACTIVOS DEL
LABORATORIO DE MICOLOGIA
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Elaborado por: RNegroni, L.Guelfand, M.C.Perrone
Fecha: 6 de mayo 2008
Version original
Revisado por: A. Romeo, L. Guelfand
Fecha: Julio 2011
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: Agosto 2011
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INDICE
1.- REACTIVOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA
1.1 HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) al 40% ..................................................................... pág. 6
1.2 .a HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER.................................................... pág. 6
1.2 .b HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER modificada……………………..
1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFÓXIDO ............................................... pág. 7
1.4 BLANCO CALCOFLUOR............................................................................................... pág. 7
1.5 TINTA CHINA.................................................................................................................. pág. 8
1.6 COLORACIÓN DE GIEMSA........................................................................................... pág. 9
1.7 GRAM............................................................................................................................ pág. 10
1.8 AZUL DE METILENO ................................................................................................... pág. 12
1.9 KINYOUN ..................................................................................................................... pág. 13
1.10 GRAM-WEIGERT ....................................................................................................... pág. 14
1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA ......................................................................... pág.15
1.11.b COLORACIÓN ABREVIADA DE GROCOTT .......................................................... pág.18
1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado ......................................................................... pág.19
1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp) ........................................... pág.20
1.14 PAS (Acido periódico Schiff) .................................................................................... pág.21
1.15 MUCICARMIN DE MAYER.......................................................................................... pág.23
1.16 ALCIAN BLUE DE LISON ........................................................................................... pág.24
2.- LÍQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS
2.1 AZUL DE LACTOFENOL .............................................................................................. pág.25
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2.2 COLORANTE DE GUEGUEN ....................................................................................... pág.26
3.- SOLUCIONES DE TRABAJO
3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBIÓTICOS ..................................................................... pág.26
3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS .................................................................... pág.27
3.3 SOLUCIÓN MADRE DE CICLOHEXIMIDA .................................................................. pág.27
4.- MEDIOS DE CULTIVO
4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD...................................................................... pág.28
4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA ............................................................................... pág.28
4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD..................................................................................... pág.29
4.4 LACTRIMEL................................................................................................................... pág.29
4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE ................................................................................. pág.30
4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO ......................................................................................... pág.30
4.7 AGAR CEREBRO CORAZÓN....................................................................................... pág.30
4.8 AGAR V8........................................................................................................................ pág.31
4.9 MEDIO DE GORODKOWA............................................................................................ pág.31
4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN..................................................................................... pág.32
4.11 AGAR AGUA ............................................................................................................... pág.32
4.12 AGAR CZAPEK ........................................................................................................... pág.32
4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL........................ pág.33
4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA ........................................................................................ pág.33
4.15 AGAR DIXON Modificado .......................................................................................... pág.33
4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM) .............................................................. pág.34
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5.- MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE CULTIVOS
5.1 MÉTODO DE SABOURAUD ......................................................................................... pág.35
5.2 MÉTODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA ............................................ pág.36
5.3 PRESERVACIÓN DE CEPAS POR CONGELACIO..................................................... pág.36
6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES FÚNGICAS
6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG).................................................................. pág.37
6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80.................................................................. pág.37
6.3.a AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS .......................................................... pág.38
6.3.b AGAR CROMOGÉNICO MODIFICADO (CMA)………………………………………..pág.38
6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL SLANT)………………………………………………… pág.39
6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE SLANT)……………………………………………… pág.39
6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80.................................................................................... pág.39
6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL..................................................................................... pág.40
6.6. a AGAR TABACO ....................................................................................................... pág.41
6.6. b AGAR TABACO Modificado .................................................................................... pág42
6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssínica) ................................................................... pág.42
6.8 MEDIO DE SALKIN ...................................................................................................... pág.43
6.9 MEDIO CGB................................................................................................................... pág.44
6.10 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE UREASA...................................................... pág.44
6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN ....................................................................................... pág.45
6.10.2 TEST DE UREA RAPIDO ......................................................................................... pág.45
6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco) .............................................................................. pág.45
6.11 ASIMILACION DE TREHALOSA RAPIDA ................................................................. pág.46
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7.- HEMOCULTIVOS
7.1 TUBOS PARA LA RECOLECCIÓN DE HEMOCULTIVOS.......................................... pág.46
8.- REACTIVOS PARA INMUNODIAGNÓSTICO
8.1 MEDIO PARA INMUNODIFUSIÓN (ID) ........................................................................ pág.46
8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE) ................................ pág.47
9.- MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA
9.1 MEDIO DE SHADOMY Modificado .............................................................................. pág.48
9.2 MUELLER HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO ................................... pág.48
9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM ........................................................................... pág.49
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1.- REACTIVOS UTILIZADOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA
1.1 HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) al 40%
Principio
El KOH disuelve la queratina y aclara la preparación sin afectar la morfología de
los elementos fúngicos, permitiendo una mejor visualización de los mismos.
Preparación del reactivo
Hidróxido de potasio (lentejas) ------------------------------ 40 g *
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente. Para la obtención de preparaciones más
duraderas, agregar glicerina al 10% que reduce la evaporación.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripción de la técnica
Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la
muestra en el KOH y cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto
aclarante se acelera calentando la preparación suavemente a la llama hasta el
desprendimiento de las primeras burbujas.
Resultado
Los dermatofitos se observan como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas de 4 a 6
µm de diámetro. Las levaduras se visualizan como elementos esféricos u ovalados
(blastosporos) que pueden presentar brote y/o seudohifas. Los hongos miceliales
se ven como hifas hialinas o pigmentadas, tabicadas o no, de diámetro irregular
según el hongo al que corresponde.
Nota: Se puede utilizar concentraciones de OHK de 10 al 40%, para ello solo
se debe pesar 10, 20 o 30 gr y asi obtener una solucion de OHK al 10%, 20%
o 30%.
1.2.a HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de
PARKER (azul negro permanente)
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Principio
Ídem 1.1. La tinta azul negra pigmenta la pared de los hongos y permite una mejor
visualización de los mismos.
Preparación del reactivo
Hidróxido de potasio al 40% ----------------------------------10 ml
Tinta azul negra permanente* (Quink de Parker)--------10 ml
Conservar a temperatura ambiente
(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como “Permanente” y QuinkParker
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripción de la técnica
Ídem 1.1
Resultado
Los filamentos y levaduras toman la tinta y aparecen color azul. Es particularmente
útil para la detección de Malassezia spp en escamas cutáneas.
1.2.b HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de
PARKER modificado
Principio
Ídem 1.2.a. Para mantener los preparados por varios dias, se debe incluir glicerina
Preparación del reactivo
Solución I:
Hidróxido de potasio al 20% ------------------------------- 100 ml
Glicerina--------------------------------------------------------- 10 ml
Mantener a temperatura ambiente por 1 año.
Solución de trabajo:
Solución I------------------------------------------------------------ 1,5 ml
Cartucho de Tinta negra permanente(Quink Parker)---- 1,0 ml
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Conservar a temperatura ambiente
(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como “Permanente” y QuinkParker
Control de Calidad
Ídem 1.2.a
Descripción de la técnica
Ídem 1.2.a
Resultado
Ídem 1.2.a
1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFÓXIDO (DMS)
Principio
Ídem 1.1. El agregado de DMS reduce o elimina la necesidad de calentar el
preparado
Preparación del reactivo
Hidróxido de potasio --------------------------------------------- 20 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Dimetilsulfóxido al 40% -------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripción de la técnica
Ídem 1.1 realizando la primera observación, sin calentar el preparado a la llama.
Resultado
Ídem 1.1
1.4 BLANCO CALCOFLUOR (Calcofluor white) (CFW)
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Principio
El CFW es un colorante fluorocrómico no específico, que se une a la quitina y
celulosa de la pared de los hongos. Tiene el inconveniente de exigir para la
observación del preparado, la utilización de un microscopio de fluorescencia. Ha
sido recomendado para el estudio de las muestras poco parasitadas. De los
diversos fluorocromos usados, el Blankophor tiene la ventaja de disolverse con
facilidad en el KOH.
Preparación del reactivo
Solución A:
Calcofluor white MR2 ---------------------------------------- 100 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Calentar suavemente. Conservar en frasco color caramelo
Solución B:
Hidróxido de potasio 10%-40%
Control de Calidad
Seguir el procedimiento utilizando una Candida albicans ATCC. Se debe observar
una fluorescencia brillante de las células de levaduras.
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripción de la técnica
Mezclar una gota de solución A con una gota de solución B sobre un portaobjetos,
ubicar la muestra y colocar un cubreobjetos. Calentar suavemente sobre la llama,
incubar de 5 a 10 min y observar el preparado con microscopio de fluorescencia,
bajo luz UV, rango 300 a 440nm (según la marca del microscopio empleado).
Resultado
Las formas fúngicas exhiben en su perímetro fluorescencia azul brillante
1.5 TINTA CHINA (TCH)
Principio
La TCH es útil para observar la presencia de la cápsula de Cryptococcus spp (Cn),
basada en la coloración negativa. La cápsula repele las partículas de carbón de la
TCH dando un halo claro, bien demarcado alrededor de cada célula capsulada.
Eliminado: ¶
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Preparación del reactivo
Puede prepararse con o sin el agregado de Tween 80 y solución de mertiolate
comercial o preparada, que se utiliza para inhibir el desarrollo de
microorganismos.
Tinta china---------------------------------------------------------- 5 ml
Solución fisiológica ----------------------------------------------- 5 ml
Tween 80 --------------------------------------------------------- 0.1 ml
Solución de mertiolato-borato de sodio -------------- 0.1 ml (*)
(*) Solución de mertiolato-borato de sodio:
Mertiolato de sodio ------------------------------------------------- 1 g
Borato de sodio -------------------------------------------------- 1.4 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver primero el borato de sodio y luego el mertiolato. Conservar a temperatura
ambiente.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripción de la técnica
Colocar una gota de TCH y luego una gota del sedimento (fluido corporal, orina,
LCR) en un portaobjetos limpio, mezclar y cubrir con cubreobjetos. Examinar al
microscopio con objetivo de 10x, 20x y confirmar con 40x.
Resultados
La presencia de levaduras con o sin brote, con halo claro alrededor de la célula
fúngica que indica presencia de cápsula. Se debe tener en cuenta que los glóbulos
blancos pueden repeler las partículas de carbón de la TCH, pero presentan un
halo irregular con granulaciones internas y membrana nuclear, y la imagen no se
observa tan nítida como la pared del Cn.
1.6 COLORACIÓN DE GIEMSA (GI)
Principio
Esta coloración es útil para búsqueda de levaduras intracelulares, como la fase
tisular del Histoplasma capsulatum (Hc) y Penicillium marneffei (Pm); observar los
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cuerpos intraquísticos (CI) (ascosporos) de Pneumocystis jirovecii (Pj), describir la
citología de las muestras clínicas y para descartar infecciones virales producidas
por Herpes, Citomegalovirus (CMV) y Molluscum contagiosum.
Preparación del reactivo
Metanol 100%, Giemsa diluído 1/10 con agua destilada o agua de la canilla. La
preparación debe realizarse en el momento de usar.
Control de Calidad
No está estandarizado, sin embargo puede utilizarse un frotis de sangre y
observar la coloración de los glóbulos blancos que tendrán un citoplasma celeste
claro (mononucleares) y violeta rosado (polimorfonucleares) con sus
granulaciones características
Descripción de la técnica
Fijar la muestra con metanol por 1 min., luego inundar el extendido con la dilución
de Giemsa por 20 min. Lavar el preparado con abundante agua de la canilla y
dejar secar al aire.
Resultado
Permite observar levaduras pequeñas y ovales en el interior de los macrófagos.
En el caso de Hc las levaduras se tiñen en casquete de color azul, con un halo
claro debido a que la pared del hongo no se colorea con este colorante. En Pm las
células fúngicas presentan en su interior un tabicamiento transversal. En los
pacientes inmunosuprimidos graves, se pueden observar estos elementos fuera
de los macrófagos. Para Pj esta coloración tiñe solamente los cuerpos
intraquísticos (CI) (ascosporos) o formas tróficas, observándose el citoplasma de
color celeste y pequeños núcleos de color rojo-púrpura. La pared del quiste (asco)
no se tiñe y se ve un halo claro alrededor de los CI, observándose generalmente
en grupos o “clusters” y ocasionalmente en macrófagos. El porcentaje de
sensibilidad de esta técnica para detectar Pj varía del 70 al 92% según diferentes
autores y dependiendo del material respiratorio analizado.
1.7 GRAM (Modificado por Hucker)
Principio
Esta coloración es utilizada para clasificar microorganismos en base a su tamaño,
forma, morfología celular y reacción de Gram.
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Preparación del reactivo
Solución A-1 (Cristal violeta)
Cristal violeta ---------------------------------------------------------2g
Alcohol etílico (95%) --------------------------------------------10 ml
Disolver el colorante en el alcohol
Agua destilada--------------------------------------------------- 100ml
Filtrar por papel
Solución A-2 (Oxalato de amonio)
Oxalato de amonio --------------------------------------------------4g
Agua destilada--------------------------------------------------- 400ml
Mezclar Solución A-1 con A-2
Solución B (Lugol)
Yodo --------------------------------------------------------------------1g
Yoduro de potasio ---------------------------------------------------2g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p ----------------------------------------- 240 ml
Bicarbonato de sodio 5% --------------------------------------60 ml
Conservar en botella de vidrio color caramelo
Solución C (Decolorante)
Etanol 95% --------------------------------------------------------70 ml
Acetona ------------------------------------------------------------30 ml
Solución D (Contracolor)
Safranina O (*) -------------------------------------------------------1g
Etanol 95% --------------------------------------------------------40 ml
Disolver el colorante en el alcohol
Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml
(*) se puede reemplazar por fucsina fenicada diluída 1/50
Como alternativas de las soluciones A-1 y A-2 puede emplearse la siguiente
solución:
Cristal violeta -------------------------------------------------------- 5 g
Fenol ----------------------------------------------------------------- 20 g
Etanol Absoluto --------------------------------------------------10 ml
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
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Control de calidad
Gram Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
Gram Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Descripción de la técnica
Preparar extendidos delgados. Fijar el material con calor ó metanol. Colorear con
la Solución A por 30 segundos, lavar con agua corriente. Inundar con la Solución
B, dejar 30 segundos y lavar con agua corriente. Decolorar 10 segundos con
Solución C, dependiendo del grosor del preparado, lavar con agua corriente. Teñir
con Solución D durante 30 segundos, lavar con agua corriente. Secar el extendido
al aire.
Resultado
Gram positivo: Azul violeta
Gram negativo: Fucsia (de rosa a rojo)
Los hongos son Gram positivos (Ej. Candida spp) pero algunos se colorean
parcialmente (Ej. Cryptococcus neoformans), otros se observan como Gram
variable (Ej. Blastomyces dermatitidis) ó Gram negativo (Ej. Pneumocystis spp y
Zygomycetes).
1.8 AZUL DE METILENO (AM)
Principio
El AM tiñe la pared del hongo permitiendo una fácil visualización. Se utiliza para la
búsqueda de Malassezia spp.
Preparación del reactivo
Azul de Metileno ---------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente
Control de Calidad
Colorear una preparación con células siguiendo el procedimiento y observar con
400x. Se observan células teñidas de azul (núcleos y citoplasma) con un fondo
celeste claro
Descripción de la técnica
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Preparar el extendido con el producto del raspado de la lesión y suero para pegar
las escamas. Dejar secar al aire. Inundar el preparado lentamente (para no
despegar el material) con el colorante AM, dejar durante 1 minuto. Lavar el
extendido suavemente por inmersión en agua, dejar secar al aire y observar con
objetivo de 40x y de inmersión.
Se observan filamentos flexuosos, tabicados y cúmulos de blastosporos esféricos
de 3 a 8 µm de diámetro de color azul.
1.9 KINYOUN (Modificado para Nocardia)
Principio
Se utiliza para la detección de los microorganismos ácido-resistentes (Ej. Nocardia
spp) y permite diferenciarlos de otros Actinomycetes.
Preparación del reactivo
Solución A: Fucsina fenicada
Fucsina básica ------------------------------------------------------ 4 g
Fenol cristalizado ------------------------------------------------- 8 ml
Alcohol etílico 95% ----------------------------------------------20 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver el colorante en el alcohol y luego agregar el agua y el fenol
Solución B: Decolorante
Acido sulfúrico concentrado------------------------------------ 1 ml
Agua destilada----------------------------------------------------99 ml
Agregar el ácido al agua, no viceversa
Solución C: Contracolor
Azul de metileno ------------------------------------------------- 2.5 g
Etanol 95% ------------------------------------------------------ 100 ml
Descripción de la técnica
Preparar el extendido y fijarlo a la llama, cubrir luego con papel de filtro. Inundar el
portaobjeto con la solución A durante 5 minutos. Volcar el exceso de colorante y
lavar con agua corriente. Decolorar con la solución B y lavar con agua. Colocar la
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solución C por 1 minuto, lavar con agua corriente y dejar secar al aire. Observar
con objetivo de inmersión (100x).
Resultado
Los microorganismos ácido resistentes se tiñen de color rosa a rojo. Sirve también
para detectar esporas sexuadas en los cultivos de levaduras.
1.10 GRAM-WEIGERT (GW)
Principio
Tiñe las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y de otros hongos.
Esta coloración es muy útil en la detección de Actinomycetes anaerobios
(Actinomyces spp) y aerobios (Nocardia, Actinomadura, Streptomyces,
Nocardiopsis, Rhodococcus, Arachnia y Dermatophylus)
Preparación del reactivo
Solución A: Eosina
Eosina Y -------------------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Solución B: Cristal Violeta
B1
Anilina --------------------------------------------------------------- 2 ml
Agua destilada----------------------------------------------------88 ml
B2
Cristal Violeta -------------------------------------------------------- 5 g
Etanol 95% --------------------------------------------------------10 ml
Mezclar solución B1 y B2. Filtrar antes de utilizar. Estable por 3 meses.
Solución C: Yodo
Yodo ----------------------------------------------------------------- 1 g
Yoduro de potasio ------------------------------------------------ 2 g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p. ------------------------------------------------- 300 ml
Solución D: Anilina
Aceite de anilina -------------------------------------------------- 5 ml
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Xileno ---------------------------------------------------------------- 5 ml
Descripción de la técnica
Fijar los frotis y secar al aire. Colorear con Solución A por 5 minutos y lavar con
agua corriente. Teñir con Solución B 5 minutos y lavar con la Solución C, dejar el
yodo 5 minutos. Lavar con agua y absorber el extendido con papel secante, secar
al aire. Decolorar con Solución D, moviendo el portaobjeto suavemente hasta que
no salga color púrpura. La utilización de una segunda decoloración ayuda a la
evaluación de la coloración. Enjuagar con xileno, secar al aire y examinar el
preparado con objetivo de inmersión (100x).
Resultados
Las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y el resto de los hongos,
se tiñen de color azul-violeta irregular. Los quistes se observan como estructuras
circulares o en forma de taza, de 5µm de tamaño. Las estructuras internas no se
colorean. El fondo aparece de color rosado y los núcleos celulares se tiñen de
rosa, pero algunos pueden retener el cristal violeta y confundirlos con quistes
(ascos) de (Pj). En nuestra experiencia, el porcentaje de sensibilidad con esta
técnica es semejante a la coloración de Giemsa.
1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA (GMP)
Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacáridos. Tiene la ventaja
de teñir a los hongos muertos, situación que no ocurre con el PAS y otras
coloraciones histológicas.
Preparación del reactivo
A) Soluciones de stock
Pueden conservarse por tiempo indefinido
Solución I:
Metenamina (Hexametilentetramina ó Urotropina) ---------3g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solución II:
Nitrato de plata ------------------------------------------------------ 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
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Solución IIl:
Acido crómico-------------------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solución IV:
Bórax ( uso fotográfico) ------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solución V:
Bisulfito de sodio---------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
B) Solución madre de metenamina-plata
Solución I (Metenamina 3%) -------------------------------- 100 ml
Solución II (Nitrato de plata 5%) ------------------------------ 5 ml
Se forma un precipitado blanco que desaparece por agitación. Es conveniente
prepararla cada vez que se realice la coloración
C) Solución de trabajo de metenamina-plata
Solución madre de metenamina - plata --------------------50 ml
Solución IV (Bórax 5%) ----------------------------------------- 6 ml
Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------50 ml
Esta solución de trabajo debe prepararse siempre en el momento de realizar la
coloración
D) Soluciones para los pasos optativos:
Solución VI:
Cloruro de oro ---------------------------------------------------- 0.1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solución VII:
Tiosulfato de sodio (Hipo) ------------------------------------- 2.5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solución VIII:
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Verde luz S.F. (amarillo) --------------------------------------- 0.2 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Ácido acético glacial ------------------------------------------- 0.2 ml
En el momento de usar diluir 10 ml de la solución VIII en 50 ml de agua destilada.
Solución IX
Alumbre de hierro1 g
Agua destilada c.s.p.100 ml
Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.
Descripción de la técnica
Si se utilizan cortes histológicos, se deben desparafinar. Oxidar con el ácido
crómico (Solución III) por 1 hora, este paso se realiza colocando los portaobjetos
sobre varillas y la droga no debe recuperarse luego de su uso. Lavar durante 10
minutos con agua corriente, cuidadosamente para evitar el desprendimiento del
material (utilizar un vaso de Coplin y que el agua caiga sobre la parte trasera del
portaobjetos). Enjuagar con agua destilada.
Colocar las preparaciones sobre varillas y agar agar bisulfito de sodio (Solución
IV) durante 1 minuto, lavar con agua corriente (en vaso de Coplin) por 10 minutos,
enjuagar varias veces con agua destilada. Colorear con la solución de trabajo de
metenamina plata durante 1 hora aproximadamente en estufa a 50 º C hasta que
los cortes tomen un color pardo dorado. Este paso es clave para el resultado de la
técnica, por lo tanto es necesario controlar cada 15 minutos para evitar la
sobrecoloración. Enjuagar repetidas veces con agua destilada, deshidratar
pasando por xilol y montar.
Pasos optativos
1) Virado: se puede efectuar el virado con colururo de sodio (Solución VI)
durante 3 minutos y luego Hiposufito de sodio (Solución VII) por 2 minutos.
Deshidratar, pasar por xilol y montar.
2) Coloración de fondo: Se puede teñir con cualquier coloración que se desee,
incluso con colorantes azules ó violáceos, ya que producen buen contraste con el
negro. Pero para diagnósticos difíciles, es preferible no realizar coloración de
fondo ó utilizar una coloración monocromática como el verde luz (Solución VIII)
durante 30-45 minutos, deshidratar pasando por xilol y montar
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3) Sobreimpregnación: En caso de sobrecoloración argéntica, se puede decolorar
con un baño de alumbre de hierro (Solución IX) y controlar visualmente; cuando se
obtenga el tono deseado, lavar con agua destilada, deshidratar, pasar por xilol y
realizar el montaje o la coloración de fondo.
Resultados
Los hongos se colorean de pardo dorado u oscuro debido a la impregnación
argéntica. Esta técnica ha sido tradicionalmente considerada “Gold Standard” para
la visualización de los quistes (ascos) de Pj, los cuales se colorean de marrón
oscuro a negro y se observan con un pliegue interno (doble coma) de color negro.
Las bacterias y algunos elementos tisulares (especialmente fibras elásticas)
pueden teñirse de negro o gris. Los cuerpos amiláceos, frecuentemente en los
materiales respiratorios, también son argentófilos y pueden confundirse con
Cryptococcus y Paracoccidioides. En caso de utilizar “virado”, todos los hongos se
tiñen de negro y el resto de los tejido se decoloran ligeramente.
1.11.b COLORACIÓN ABREVIADA DE GROCOTT
Principio
Idem 1.11.a
Preparación del reactivo
Solución I:
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Bórax al 5% (p/v) ------------------------------------------------- 6 ml
Solución II: Madre de Metenamina-plata
Metenamina al 3% (p/v) ----------------------------------------50 ml
Nitrato de plata al 10% (p/v) ------------------------------- 1.25 ml
Solución de trabajo: Mezclar partes iguales de solución I y solución II
Solución de verde luz: Contracolor
Verde luz-------------------------------------------------------------- 2 g
Ácido acético----------------------------------------------------- 0.2 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
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Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.
Descripción de la técnica
Fijar el preparado con metanol hasta secado al aire (no lavar). Colocar ácido
crómico al 10% sobre la muestra durante 15 minutos, luego lavar con agua
corriente. Si se utilizan cortes histológicos parafinados, oxidar con ácido crómico al
5% (p/v) durante 1 hora, posteriormente lavar 10 minutos con agua corriente y
enjuagar con agua destilada. Si se observa la muestra de color amarillo, agregar
bisulfito de sodio al 1% (p/v) durante 1 minuto, esto es para eliminar el exceso de
ácido crómico. Lavar con agua destilada 4 ó 5 veces. Sumergir en la solución
colorante de metenamina-plata y calentar en microondas a una potencia de 60%
durante 20 segundos, 5 ó 6 veces hasta que la muestra tome color pardo. Si no se
dispone de microondas agregar solución colorante sobre la muestra y calentar con
hisopo hasta color pardo- dorado. Lavar con agua corriente, agregar tiosulfato de
sodio al 2% durante 2 a 5 minutos, para eliminar el exceso de plata, finalmente
lavar con agua corriente y contracolorear con solución de verde luz diluído 1/20
durante 5 minutos. Se puede elegir otros contrastes como los azules ó rojos, pero
este es el recomendado, deshidratar, pasar por xilol 10 segundos secar y montar.
Luego observar con objetivo de 40x ó 100x.
1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado (OT)
Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacáridos.
Preparación del reactivo
Solución A ( reactivo de sulfatación)
Ácido acético glacial --------------------------------------------90 ml
Ácido sulfúrico concentrado-----------------------------------30 ml
En un erlenmeyer sumergido en agua fría (no más de 10ºC), colocar el ácido
acético glacial y agregar lentamente el ácido sulfúrico. Conservar esta solución a
temperatura ambiente al abrigo de la luz. Cuando toma color deberá descartarse.
Solución B:
Azul de O-toluidina ---------------------------------------------0.64 g
Agua destilada----------------------------------------------------30 ml
Ácido clorhídrico fumante--------------------------------------- 1 ml
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Etanol absoluto---------------------------------------------------70 ml
Colocar en un frasco color caramelo y bajo campano el azul de O- toluidina y el
agua, agitar vigorosamente hasta disolver el colorante y agregar en este orden: 1
ml de ácido clorhídrico y 70 ml de etanol absoluto. Esta solución se mantiene
estable durante 1 año a temperatura ambiente.
Control de Calidad
Colorear un preparado con suspensión de Candida albicans, observar a 40x las
células de levaduras se observan de color violeta-púrpura
Descripción de la técnica
Fijar los extendidos con alcohol etílico absoluto durante 1 minuto, secar 5 minutos.
Sumergir los vidrios en la Solución A durante 10 minuto homogeneizar cada 5
minutos para mezclar) y lavar suavemente con agua fría durante 5 minutos. Cubrir
los extendidos con la Solución B durante 12 minutos y luego lavar con metanol
95% por 10 segundos, pasar los extendidos por etanol absoluto otros 10
segundos, aclarar con xilol 10 segundos, secar al aire y examinar con objetivo de
inmersión (100x).
Resultados
La pared quística (asco) del Pneumocystis se colorea de violeta-púrpura y se
observa un pliegue interno (doble coma) teñido de violeta oscuro.
1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp)
Principio
Utiliza anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato de fluoresceína:
técnica de IFD (inmunofluorescencia directa). Estos anticuerpos están dirigidos
contra la pared celular y antígenos del microorganismo. Se debe utilizar un
microscopio de Inmunofluorescencia para su observación.
Preparación del reactivo
Según instrucciones del fabricante del reactivo comercial
Control de Calidad
Según instrucciones del fabricante del reactivo comercial
Descripción de la técnica
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Colocar el material sobre un portaobjeto y secar al aire, luego sumergir en acetona
fría durante 15 minutos, finalmente dejar secar al aire y realizar la coloración
según instrucciones del fabricante.
Resultado
Se observa la morfología característica del Pneumocystis en color verde manzana
fluorescente y el fondo del preparado se observa rojizo. La sensibilidad de la
técnica para esputos inducidos es del 90% aproximadamente.
1.14 PAS (Ácido periódico Schiff)
Principio
Colorea la pared del hongo por afinidad a las mucoproteínas y mucopolisacáridos.
Preparación del reactivo
Solución A: Ácido periódico
Ácido periódico --------------------------------------------------- 0.4 g
Alcohol 95%-------------------------------------------------------35 ml
Disolver y agregar
Acetato de sodio 0.2 M ------------------------------------------ 5 ml
(27.2 g en 1000 ml de agua destilada)
Conservar y usar a temperatura ambiente (22-25ºC), si toma color pardo
desechar.
Solución B: Baño reductor
Ioduro de potasio --------------------------------------------------- 1 g
Tiosulfato sódico ---------------------------------------------------- 1 g
Alcohol 96%-------------------------------------------------------30 ml
Agua destilada----------------------------------------------------20 ml
Se forma un depósito de azufre que puede despreciarse. Conservar a temperatura
ambiente (22-25ºC). No dura más de 14 días.
Solución C: Reactivo de Schiff
Fucsina básica ------------------------------------------------------ 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml
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En un erlenmeyer colocar el agua y se calienta hasta ebullición. Se disminuye la
llama y cuando desaparece el burbujeo, se añade la fucsina. Enfriar a 50ºC y
filtrar.
Agregar:
Cloruro de tionilo-------------------------------------------------- 1 ml
Mantener en la oscuridad por 12 horas
Aclarar mediante agitación durante 1 minuto con:
Carbón activado----------------------------------------------------- 2 g
Filtrar, guardar en la oscuridad a 0-4 º C. Utilizar a temperatura ambiente y en la
oscuridad.
Solución D: Azul de celestino
Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente, luego agregar:
Azul de celestino R ---------------------------------------------0.25 g
Hervir durante 3 minutos, filtrar una vez frío y agregar 7 ml de glicerol
Solución E: Anaranjado G
Anaranjado G -------------------------------------------------------- 2 g
Ácido fosfotúngstico sol. acuosa 5%---------------------- 100 ml
Dejar en reposo y utilizar el sobrenadante.
Descripción de la técnica
Lavar los cortes en alcohol 70%, sumergirlos en Solución A 5 minutos y lavar con
alcohol 70%. Llevarlos al baño reductor con la Solución B 1 minuto y lavar con
alcohol 70%. Sumergir en Solución C durante 20 minutos y lavar con agua
corriente durante 10 minutos. Teñir con Solución D de 5 a 6 minutos. Diferenciar
en alcohol ácido al 1%, lavar con agua corriente 30 minutos. Colorear el fondo con
la Solución E durante 10 segundos. Lavar en agua hasta que los cortes queden de
color amarillo pálido (30 segundos). Deshidratar, pasar por xilol, agregando líquido
de montar y cubrir con un cubreobjetos.
Resultados
Las mucoproteínas y mucopolisacáridos neutros se tiñen de color rojo púrpura
intenso. Permite visualizar con mayor detalle la pared de Coccidioides spp y
contrastarlo con los esporos. En la histoplasmosis es la técnica por elección para
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cortes histológicos, debido a que se observa con nitidez la pared del hongo “en
negativo”, en contraste con la membrana plasmática bien teñida. Colorea bien la
cápsula gelatinosa de Cryptococcus neoformans. En paracoccidioidomicosis,
aspergilosis, candidiasis y maduromicetomas los resultados son muy buenos pero
no alcanzan a superar los obtenidos con la coloración de metenamina-plata.
1.15 MUCICARMIN DE MAYER
Principio
Colorea los mucopolisacáridos de la cápsula de Cryptococcus spp en los cortes
histológicos.
Preparación del reactivo
Solución A: hematoxilina férrica de Weigert
A-1
Hematoxilina --------------------------------------------------------- 1 g
Alcohol 95%----------------------------------------------------- 100 ml
A-2
Cloruro férrico (sol. Acuosa 29%)4 ml
Agua destilada----------------------------------------------------95 ml
Ácido clorhídrico concentrado1 ml
En el momento de usar mezclar partes iguales de A-1 y A-2
Solución B: Colorante Mucicarmín
Carmín----------------------------------------------------------------- 1 g
Cloruro de aluminio anhidro ---------------------------------- 0.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------20 ml
Para disolver los componentes agitar constantemente sobre un mechero con llama
pequeña.
Solución C: Amarillo-Metanil
Amarillo-metanil -------------------------------------------------25 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Ácido acético glacial ----------------------------------------- 0.25 ml
Preparar el colorante en un tubo de ensayo y calentar suavemente en la llama
hasta que se torne siruposo y negro. Agregar 100 ml de alcohol 50%, dejar
reposar 24 horas, filtrar y diluir con agua.
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Descripción de la técnica
Tener preparados cortes parafinados de 6 micrómetros. Pasar los cortes como es
habitual por xilol y la serie de alcoholes y finalmente por agua destilada. Colorear
durante 7 minutos con la Solución A, lavar en agua 5 a 10 minutos y teñir con
Solución B por 30 a 60 minutos o más si fuera necesario. Lavar rápidamente en
agua destilada y agregar durante 1 minuto la Solución C. Rápidamente enjuagar
con agua y pasar por alcohol 95%. Deshidratar, pasar por xilol y montar.
Resultados
La mucina se colorea en rosa intenso ó rojo, los núcleos en negro y otros
elementos en amarillo.
1.16 ALCIAN BLUE DE LISON
Principio
Colorea loa mucopolisacáridos de la cápsula de Cryptococcus spp en los cortes
histológicos.
Preparación del reactivo
Fijador
Bouin, Bouin-hollande, formol al 10%, formol neutro, buffer fosfatos, alcoholformol-acético.
Solución A:
Alcian blue BG al 1% (solución acuosa) -------------------50 ml
Ácido acético al 1% (solución acuosa) ---------------------50 ml
Filtrar
Timol ---------------------------------------------------------------15 mg
Solución B:
Fast red 5 B ------------------------------------------------------50 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Solución C:
Ácido fosfomolíbdico ----------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
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Hematoxilina de Mayer (Hemalumbre de Ehrlich)
Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente.
Descripción de la técnica
Tener preparados cortes parafinados. Pasar los cortes del agua al hemalumbre
dejándolos actuar 10 a 15 minutos, lavar hasta obtener un color azul, teñir con la
Solución A durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada. Agregar la Solución
C por 10 minutos, lavar rápidamente en agua destilada y teñir con la Solución B
durante 10 a 15 minutos, enjuagar y montar.
Resultados
Los núcleos teñidos en rojo púrpura, los gránulos de mastocitos, mucina,
sustancia basal de los cartílagos y ciertos tipos de fibras conjuntivas se observan
en verde azulado. Las fibras de colágeno y huesos se tiñen en rojo cereza y el
citoplasma y músculo en amarillo pálido.
2. LÍQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS
2.1 AZUL DE LACTOFENOL (LPCB)
Principio
Esta solución es muy útil para examinar el material fúngico tomado de los cultivos.
El fenol mata el hongo, el ácido láctico es un agente aclarante que preserva la
estructura del hongo, la glicerina previene la desecación y el azul de algodón o
cotton blue colorea la quitina y celulosa del hongo.
Preparación del reactivo
Solución A
Fenol en cristales ------------------------------------------------- 20 g
Ácido láctico-------------------------------------------------------20 ml
Glicerina------------------------------------------------------------40 ml
Mezclar bien
Solución B
Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.05 g
(o Azul de Anilina)
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Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------20 ml
Mezclar bien Solución A y Solución B, conservar a temperatura ambiente por más
de 6 meses.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias
2.2 COLORANTE DE GUEGUEN
Principio
Este líquido resulta útil para montar el material fúngico tomado de los medios de
cultivo
Preparación del reactivo
Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.10 g
Sudán III ----------------------------------------------------------0.10 g
Tintura de iodo fresca --------------------------------------20 gotas
Ácido láctico----------------------------------------------------- 100 ml
Disolver en un mortero el Sudán III con el ácido láctico, pasarlo a un erlenmeyer y
calentar hasta obtención de un líquido límpido de color cereza. Dejar reposar 24
horas, disolver en un mortero el azul cotton de Poirrier con el Sudán III-láctico,
agregar el iodo y filtrar por lana de vidrio. Conservar en frasco color caramelo.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias
3.- SOLUCIONES DE TRABAJO
3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBIÓTICOS (SMA)
Cloranfenicol --------------------------------------------------------- 1 g
Estreptomicina* -------------------------------------------------- 0.5 g
Agua destilada estéril----------------------------------------- 100 ml
Se mantiene en heladera. Se adiciona a los medios de cultivo en concentración
final de 100 µg / ml
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*Puede utilizarse otro aminoglucósido
3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS
Se utiliza el Agar Trichophyton (Difco), disponible comercialmente
A) Tiamina (Clorhidrato) --------------------------------------10 mg
Agua destilada pH: 4-5 --------------------------------------- 100 ml
B) I-Inositol ----------------------------------------------------- 250 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120º C durante 10 minutos y conservar a 4ºC (heladera)
C) Ácido nicotínico ---------------------------------------------10 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120ºC durante 10 minutos y conservar a 4-5ºC
(heladera)
D) I-Histidina --------------------------------------------------- 150 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120ºC durante 10 minutos y conservar a 4-5ºC
(heladera)
3.3 SOLUCIÓN MADRE DE CICLOHEXIMIDA
Cicloheximida----------------------------------------------------- 1 mg
Acetona pura------------------------------------------------------- 3 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver la cicloheximida en acetona pura y luego agregar agua destilada.
Tener mucho cuidado por la toxicidad de la cicloheximida
4.- MEDIOS DE CULTIVO
Consideraciones generales
Los medios de aislamiento primario deben tener un pH: entre 6.5 y 7.2. Las
condiciones ácidas que se utilizan en algunos medios de cultivo, son para inhibir el
crecimiento bacteriano, pero también disminuye el desarrollo de algunos hongos.
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Por lo tanto, es preferible agregar agentes antibacterianos (100 µg / ml de
cloranfenicol/estreptomicina) al medio de cultivo, para reducir la contaminación
bacteriana.
4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD (SDA)
Principio
Medio poco utilizado ya que normalmente se usa la modificación de Emmons.
Puede no crecer Blastomyces dermatitidis. Disponible comercialmente
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 40 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml
Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a
121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado
Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml)
Control de calidad
Aspecto: medio sólido, ámbar, transparente
pH final a 25ºC: 5.6± 0.2
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Staphylococcus epidermidis: Inhibición parcial o total en el medio con cloranfenicol
4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA modificado por Emmons (SABE)
Principio
Es el medio estándar para la recuperación y mantenimiento de una gran variedad
de hongos aislados de materiales clínicos. Tiene como ventaja su simple
preparación y la obtención de colonias con caracteres macroscópicos típicos, su
desventaja radica en que al tener una fuente de carbohidratos fácilmente utilizable
por los hongos, estos desarrollan vegetativamente en forma exuberante pero con
escasa fructificación, lo cual limita la identificación de la especie fúngica.
Preparación del medio
Dextrosa ------------------------------------------------------------ 20 g
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Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
pHfinal: 6.8-7.0
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 120 ºC, 15 minutos, enfriar los tubos en posición inclinada
(pico de flauta, sin fondo).
Modificación: Añadir SMA (50 mg/l)
Control de Calidad
Aspecto: medio sólido, ámbar, transparente
PH final a 25ºC: 7.0± 0.2
Aspergillus spp. : Crece
Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o total en el medio con cloranfenicol
4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD (SAB+M)
Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Extracto de levaduras --------------------------------------------- 5 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p…………………………………….1000 ml
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición
Enfriar y tomar el pH: 6.8-7.0
Agregar Carbonato de Calcio……………………………….5 gr
Mezclar y distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 º C 15 minutos.
Enfriar los tubos en posición inclinada.
Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml)
4.4 LACTRIMEL (LAC)
Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml
Harina de trigo----------------------------------------------------- 10 g
Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml
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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 121 º C 15 minutos. Enfriar los tubos en posición inclinada.
Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml)
4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE (ABAL)
Una banana licuada---------------------------------------------200 g
Harina de avena -------------------------------------------------- 10 g
Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p ---------------------------------------- 1000 ml
Licuar la banana con leche, disolver los restantes ingredientes calentando hasta
su ebullición, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 º C, 15 minutos.
Enfriar los tubos en posición inclinada.
4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO (APA)
Papa pelada-------------------------------------------------------- 20 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Pelar y rallar la papa, disolver la glucosa en el agua y agregar los demás
ingredientes. Hervir 20 minutos y filtrar por gasa y rectificar volumen a 1000 ml.
Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121º C durante 15 min, enfriar los tubos en
posición inclinada.
4.7 AGAR CEREBRO CORAZÓN (BHI Agar)
Este medio se recomienda para la recuperación de hongos patógenos exigentes
como Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis, especialmente para
sus formas levaduriformes. Con este propósito puede agregarse 5% de sangre
ovina estéril cuando el medio está fundido y enfriado a 45-50 º C. Se encuentra
disponible comercialmente. Seguir indicaciones del fabricante para su preparación.
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Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml)
Control de Calidad
Aspecto: Ámbar claro a semitransparente, sin precipitado (cuando no está
adicionado de sangre)
PH final a 25ºC: 7.4± 0.2
Candida albicans: crece bien
Neisseria meningitidis ATCC 13090: crecimiento aceptable a bueno
Sporothrix schenckii: conversión a levadura a 37ºC
4.8 AGAR V8 (V8)
Se utiliza para la formación de ascosporos de levaduras.
Jugo vegetal V8 ------------------------------------------------ 150 ml
Agua de levadura*--------------------------------------------- 850 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Ajustar a pH: 7.0
* Agua de levadura: hervir 1 litro de agua durante 30 minutos con 40 g de levadura
prensada. Enfriar y llevar a 1 litro.Dejar reposar en heladera 48 horas, utilizar el
sobrenadante (850 ml).
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición. Fraccionar 7 ml por tubo y
autoclavar a 121 º C durante 15 min, enfriar los tubos en posición inclinada. Los
ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fácilmente identificados
en extendidos teñidos con la técnica de KY, ya que son ácido resistente.
4.9 MEDIO DE GORODKOWA (GOR)
Se utiliza para la formación de ascosporos de levaduras
Glucosa -----------------------------------------------------------1.25 g
Peptona --------------------------------------------------------------- 5 g
Cloruro de sodio ------------------------------------------------2.50 g
Extracto de carne --------------------------------------------------- 5 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 10 g
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Agua destilada-------------------------------------------------- 500 ml
Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121 º C durante 15 minutos, enfriar los
tubos en posición inclinada.
Los ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fácilmente
identificados en extendidos teñidos con la técnica de KY, ya que son ácido
resistente
4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN (TM)
Este medio de cultivo disponible comercialmente, es usado para aislamiento de
especies de Neisseria spp, y también Nocardia spp.
4.11 AGAR AGUA (AA)
Estimula la formación de conidios. Recomendable para hifomicetes de
pigmentación oscura (dematiáceos) e incluso para dermatofitos poco o nada
esporulados. Favorece la esporulación de hongos saprofitos.
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Calentar hasta disolver los componentes, autoclavar a 121º C durante 15 min.,
distribuir en placas de petri
Control de Calidad
Microsporum canis: abundante producción de macroconidios.
4.12 AGAR CZAPEK (ACZ)
Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y
Penicillium spp. Es el medio de referencia para la identificación de Aspergillus spp.
También está disponible comercialmente.
Nitrato sódico -------------------------------------------------------- 3 g
Fosfato dipotásico -------------------------------------------------- 1 g
Sulfato magnésico----------------------------------------------- 0.5 g
Cloruro potásico-------------------------------------------------- 0.5 g
Sulfato ferroso ---------------------------------------------------0.01 g
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Sacarosa------------------------------------------------------------ 30 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada ---------------------------------------------1.000 ml
Calentar hasta disolver todos los componentes, esterilizar a 121ºC durante 15
min., distribuir en placas de Petri
Control de Calidad
Apariencia: ámbar pálido, sólido transparente.
pH final a 25 ºC: 7.3± 0.2
Aspergillus flavus: crece colonia amarilla-verde
4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL (SCC)
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patógenos a partir
de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza
fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimórficos. Inhibe
algunas especies de hongos de interés médico (Candida no albicans, Aspergillus,
Zygomycetes, Cryptococcus neoformans, etc).
Se utilizan preparados comerciales, se preparan de acuerdo con las instrucciones
del fabricante
Control de Calidad
Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente.
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Aspergillus flavus: Inhibición parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o total
4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA (APZ)
Idóneo para estimular la esporulación de hongos miceliales, muy indicado para la
identificación de hongos dematiáceos.
Papa rallada-------------------------------------------------------- 10 g
Zanahoria rallada ------------------------------------------------- 20 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Agua ------------------------------------------------------------ 1000 ml
4.15 AGAR DIXON Modificado (DXN)
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Utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse añadiendo
cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.
Extracto de malta ------------------------------------------------- 36 g
Peptona --------------------------------------------------------------- 6 g
Oxgall, desecada -------------------------------------------------- 20g
Tween 40 ---------------------------------------------------------10 ml
Glicerol -------------------------------------------------------------- 2 ml
Acido oleico -------------------------------------------------------- 2 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 12 g
Agua deionizada1000 ml
Calentar bien, disolver todos los componentes, esterilizar a 121 ºC durante 15
min., distribuir en placas de Petri
Control de Calidad
Aspecto: Blanco amarillento, no muy sólido
pH final: 6.0
Malassezia restricta: Crece
En el medio inhibidor
Malassezia restricta: Crece
Aspergillus flavus: Inhibición parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: Inhibición parcial o completa
4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM)
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Dextrose ------------------------------------------------------------ 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Rojo Fenol ---------------------------------------------------------40 ml
Cl 0.8 M ------------------------------------------------------------- 6 ml
Cicloheximida-----------------------------0.5 g (ó 500mg. disueltos en 2 ml de acetona)
Sulfato de gentamicina-----------------0.1g (ó 100 mg disueltos en 2ml de agua
destilada)
Cloramfenicol-----------------------------250 mg (disueltos en 10 ml de etanol)
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
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Disolver la peptona, la dextrosa y el agar en agua. Calentar a BM. Agregar el rojo
Fenol agitando. Ajustar el pH con HCl, agitándola agregar la Gentamicina (o
Streptomicina), agitando. Fraccionar en frascos de 200 ml. Autoclavar a 121º C
durante 10 minutos. Enfriar a 50 º C y agregar el cloramfenicol. (para 200 ml de
medio, 5ml de antibiótico). El pH final debe ser 5.5 ± 0.1.Distribuir a razón de 7 ml
por tubo, en tubos de ensayo estériles. Enfriar en bisel y guardar, listos para su
uso, en la heladera.
Solución Rojo Fenol
Rojo fenol ----------------------------------------------------------- 0.5g
HONa 0.1 N ------------------------------------------------------ 15 ml.
Agua destilada-------------------------------------------------- 100ml.
Solución HCl 0.8 M
HCl 1N---------------------------------------------------------------8 ml.
Agua destilada-----------------------------------------------------2 ml.
5.- MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE CULTIVOS
5.1 METODO DE SABOURAUD
Se utiliza para conservar algunas cepas de Zygomicetes y formas miceliares no
esporuladas, evita el pleomorfismo especialmente de los dermatofitos.
Medio de Cultivo
Peptona --------------------------------------------------------------- 3 g
Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Agua destilada c.s.p. ----------------------------------------- 100 ml
pH final: 6.8-7.0
Fraccionar en tubos y autoclavar a 121ºC, 15 minutos. Enfriar los tubos en
posición inclinada.
Solución de Aceite
Aceite neutro ó mineral estéril. Autoclavar por 2 horas a 121ºC y luego calentar en
una estufa de secado a 100 ºC por 1-2 horas para evaporar la humedad
remanente.
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Procedimiento
Sembrar el hongo previamente aislado, en el medio de cultivo para preservación.
Incubar hasta obtener el crecimiento deseado. Cubrir con aceite neutro ó mineral,
colocar tapón de goma estéril y sellar con parafina. Se conserva a temperatura
ambiente.
5.2 METODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA
El método descripto por Castellani es una técnica económica y sencilla de realizar.
Permite la conservación de varios hongos filamentosos y levaduras por más de 1
año.
Procedimiento para levaduras
Fraccionar 2-3 ml de agua destilada en viales con cierre hermético para prevenir la
evaporación y/ó la contaminación. Autoclavar a 121º C por 15 minutos. Tomar con
un ansa 2 ó 3 colonias de un cultivo de 24-48 horas y suspenderlas en el vial. Las
cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas.
Procedimiento para hongos filamentosos
En un cultivo activamente esporulado, agregar de 2-3 ml de agua estéril. Con un
ansa estéril remover las esporas de la colonia sin romper el agar. Se toma la
suspensión de esporas con una pipeta estéril y se la transfiere a un vial estéril de
cierre hermético. Las cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas.
5.3 PRESERVACIÓN DE CEPAS POR CONGELACIÓN
Es un método sencillo que permite la conservación de varios hongos filamentosos
y levaduras por varios años. Este medio preserva bien Candida spp y
Saccharomyces spp pero no es recomendado para Cryptococcus neoformans por
su baja recuperación.
Procedimiento para hongos filamentosos
Preparar cultivos activamente esporulados en criotubos a rosca, con agar en pico
de flauta. Luego conservar los viales en freezer a -70º C.
Procedimiento para levaduras
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Glicerol -------------------------------------------------------------30 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Fraccionar 1 ml en crioviales, esterilizar a 12 ºC por 15 min y mantenerlos a 5ºC.
Suspender 2-3 colonias de un SAB de 24-48 horas de incubación. Luego
conservar los viales en freezer a – 70º C.
6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES FÚNGICAS
6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG)
Es el método rápido para la identificación presuntiva de Candida albicans.
Procedimiento
Se utiliza 0.3 a 0.5 ml de un pool de suero fresco, suero bovino ó equino en tubo
de hemólisis. Tocar una colonia de levadura de la placa de 24 horas y suspenderla
en el suero. Incubar a 35 ºC por 2 a 3 horas. Ubicar una gota de la suspensión en
un portaobjeto, colocar cubreobjeto y observar en microscopio a 400x
Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. parapsilosis ATCC 66029
6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80 (CORN-MEAL AGAR)
Se utiliza para observar la producción de clamidosporos de Candida albicans y la
micromorfología y distribución de las blastoconidias y artroconidias y pseudohifas
para diferenciar las distintas especies de Candida. También puede ser usado para
la producción de pigmento para identificar Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes para este fin se le agrega al medio 10 g de dextrosa.
Procedimiento
Se encuentra comercialmente disponible, pero puede prepararse con harina de
maíz (polenta)
Harina de maíz ---------------------------------------------------- 40 g
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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Tween 80 (polisorbato) ------------------------------------------10ml
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Si se utiliza harina de maíz, se calienta con agua a 60º C durante 1 hora. Filtrar y
completar a 1 litro con agua. Agregar el agar, el Tween 80 hervir y autoclavar.
6.3.a AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS
Es útil para la detección de infecciones mixtas de distintos materiales como orina,
sangre, heridas, flujos vaginales, esputos, etc. Este medio permite la identificación
presuntiva de algunas levaduras. El medio contiene sustratos enzimáticos unidos
a compuestos cromógenos que producen un color determinado en presencia de la
enzima específica. Algunas especies de levaduras desarrollan un color
característico. Existen diferentes medios comerciales en nuestro mercado, los
cuales desarrollan distintos colores según las especies que pueden detectar.
6.3.a.1 CHROMagar (CHROMagarTM )
Verde:
C. albicans
Azul:
C. tropicalis
Rosa (aspecto seco):
C. krusei
6.3.a.2 Brilliance Candida Agar (Oxoid)
Azul:
C. albicans
Verde:
C. tropicalis
Rosadas (aspecto seco):
C. krusei
6.3.a.3 Agar Candida ID II (BioMerieux)
Azul:
C. albicans
Rosa:C. tropicalis,C. lusitaniae y C. kefyr
Procedimiento
Los medios 6.3.a.1 y 6.3.a.2 se preparan según instrucciones del fabricante. El
medio 6.3.a.3 se comercializa directamente en placas. Todos pueden mantenerse
varios días en heladera al abrigo de la luz. Las placas sembradas se incuban a 28
º C - 35 º C durante 48 a 72 horas.
6.3.b AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS LIPOFÍLICAS (CMA)
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Procedimiento
Preparar según las instrucciones del fabricante con el agregado de 10 ml de
Tween 40 por litro.
6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL Slant)
Procedimiento
SDA ………………………………………………………………..65g
Cremophor EL (sigma)………………………………………….10 ml
Agua destilada……………………………………………c.s.p.1000ml
Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a
121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado.
6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE Slant)
Procedimiento
Peptona …………………………………………………………….10g
Glucosa …………………………………………………………….10g
Extracto de levadura………………………………………………..2g
Tween 60…………………………………………………………..5 ml
Citrato férrico amónico…………………………………………..0.5g
Esculina ……………………………………………………………..1g
Agar ………………………………………………………………...15g
Agua destilada ……………………………………… ...c.s.p.1000ml
Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a
121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado.
6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80
Se utiliza para observar la producción de clamidosporos y tubo germinativo de
Candida albicans y C. dubliniensis del resto de las especies de Candidas. Esta
técnica tiene la ventaja que realiza dos métodos diagnósticos en una misma
prueba. También permite ver producción o ausencia de seudohifas y la disposición
del micelio y blastosporas.
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Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Tween 80 ----------------------------------------------------------- 1 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Autoclavar a 121 º C por 20 minutos. Agregar a 56 º C 1 ml de leche descremada
en polvo estéril.
Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. tropicalis ATCC 66029
Procedimiento
Fraccionar en tubos. En el momento de usar, fundir el medio y preparar un
portaobjetos con tres mililitros del agar, como para inmunodifusión. Sembrar con
una estría en la superficie y cubrir con un cubreobjeto previamente flameado a la
llama. Se incuba en una placa de Petri con un dispositivo similar al empleado para
microcultivos (Ver AMID)
6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL
El medio contiene ácido cafeico (extracto semilla de girasol) que permite la
detección de la enzima fenol-oxidasa producida únicamente por Cryptococcus
neoformans / C. gatti. Esta reacción enzimática da como producto final melanina,
la cual es absorbida por la pared del hongo dando un color marrón claro.
Glucosa --------------------------------------------------------------- 1 g
Creatina -----------------------------------------------------------0.78 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Extracto de semilla de girasol* ----------------------------- 350 ml
Calentar hasta disolución. Distribuir en frascos con tapa a rosca entre 50 a 100 ml.
Autoclavar a 121º C durante 15 min.
*Preparación del extracto: Pulverizar las semillas de girasol, pesar 70g del
mismo y suspenderlo en 350ml de agua destilada, hervir y filtrar con gasa.
Autoclavar a 121º C durante 15 min. Mantener en heladera en frasco con cierre
hermético.
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Control de calidad
C. neoformans ATCC 66031
C. albicans ATCC 60193
Procedimiento
En el momento de utilizar, fundir el medio y plaquear.
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28ºC durante 96 horas.
6.6. a AGAR TABACO
Permite la detección de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus
neoformans. Esta reacción tiene como producto final la melanina, la cual le da al
hongo una coloración marrón característica.
Tabaco -------------------------------------------------------------- 50gr
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Hervir durante 30 minutos en baño de María. Filtrar a través de gasa, corregir
volumen a 1000 ml,
Agar ----------------------------------------------------------------- 20 gr
pH: 5.4. Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos. Plaquear 20 ml de medio en
cajas de Petri de 90 mm de diámetro.
Control de calidad
Candida albicans: color blanco
Cryptococcus neoformans: Color marrón
Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 ºC durante 96 horas.
6.6. b AGAR TABACO Modificado
Permite la detección de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus
neoformans. Esta reacción tiene como producto final la melanina, la cual le da al
hongo una coloración marrón característica.
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Es utilizado como una prueba más para diferenciar C. albicans de C. dubliniensis.
Se rompen 2 atados de cigarrillos (Malboro) y se vuelca el tabaco en un
erlenmeyer con 1l de agua destilada.
Hervir durante 30’a Baño de María. Filtrar a través de gasa y corregir volumen a 1l
Agregar 20 g de agar, mezclar bien. Ajustar el pH a 5.4
Autoclavar a 121°C durante 15 min. Plaquear a razón de 20 ml por placa.
Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 ºC durante 96 horas.
Interpretación
Candida albicans: colonia color blanco o crema, lisa, borde liso.
Observación microscópica del borde a las 48 h: Clamidosporas (-)
Candida dubliniensis: colonia color pardo amarillenta, rugosa, borde festoneado.
Observación microscópica del borde a las 48 hs: Clamidosporas (+)
Cryptococcus neoformans: colonia color marrón
6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssínica). Agar semillas de alpiste
Utilizado para aislar Cryptococcus spp. y Cryptococcus neoformans. Este último es
el único que al metabolizar la guizotia abyssinica (alpiste), produce melanina
originando un color marrón oscuro. El cloranfenicol lo convierte en medio selectivo.
También puede ser útil en la diferenciación de Candida dubliniensis
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Creatinina---------------------------------------------------------0.78 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Difenilo (disuelto en 10 ml de etanol 95%) ------------- 100 mg
Guizotia abyssinica----------------------------------------------- 70 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml
Moler las semillas y añadir 350 ml de agua, esterilizar en autoclave y filtrar. Añadir
agua hasta 1000 ml, agregar el resto de los componentes excepto el difenilo.
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Esterilizar a 121ºC 15 min. Enfriar a 45ºC. Añadir el difenilo antes de dispensar el
medio en las placas
Control de Calidad
C. neoformans: colonias color marrón oscuro
Cryptococcus spp: colonias claras
6.8 MEDIO DE SALKIN
Solución de Cicloheximida: 1.6 mg en 10 ml de agua destilada
Solución de Rojo de Fenol: 500 mg en 100 ml de agua destilada.
Base
Agar-agar ----------------------------------------------------------- 20 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 700 ml
Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.
Suplemento
Medio Base de Nitrógeno(YNB) ----------------------------- 6.7 g
Solución cicloheximida -----------------------------------------10 ml
Solución Rojo de fenol -----------------------------------------30 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 260 ml
Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g
Esterilizar por filtración
Para preparar el medio mezclar 70:30 Base fundida y enfriada a 45ºC y
Suplemento. Fraccionar en tubos de hemólisis estériles en pico de flauta.
Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color rojo en 1-5 días
6.9 MEDIO CGB
Solución A (Suplemento)
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Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g
PO H K---------------------------------------------------------------- 1 g
4
2
SO Mg----------------------------------------------------------------- 1 g
4
Tiamina.ClH ------------------------------------------------------- 1 mg
L-canavanina ----------------------------------------------------30 mg
Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml
Ajustar el pH a 5.6 .Esterilizar por filtración
Solución B
Azul de bromotimol sódico ------------------------------------ 0.2 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Base
Mezclar 440 ml de agua destilada, 20 ml de Solución B y 10 g de agar. Autoclavar
15 minutos a 1 atm.
Para preparar el medio mezclar una parte del Suplemento con 9 partes de la Base
fundida y enfriada a 45ºC. Envasar en tubos de hemólisis estériles en pico de
flauta.
Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color azul en 1-5 días.
6.10 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE UREASA
Se basan en la capacidad de algunos microorganismos en producir la enzima
ureasa, la cual puede ser detectada por diferentes métodos. Los medios utilizados
contienen urea, que en presencia de la enzima se desdobla en
dióxido de carbono y amonio, elevando el pH y produciendo un cambio de color en
el indicador rojo de fenol del amarillo al fucsia
6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN
Procedimiento
El medio base se prepara de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Autoclavar
a 120ºC durante 15 minutos. Adicionar la solución de urea estéril al 40%, al medio
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base fundido y enfriado a 45°C. Fraccionar 3 ml por tubo, enfriar los tubos en
posición inclinada.
Sembrar el agar, incubar a 28ºC 72 horas.
Control de Calidad
T. mentagrophytes: positivo (rojo)
T. rubrum: negativo (amarillo)
6.10.2 TEST DE UREA RÁPIDO
Tiene la ventaja que su lectura se realiza entre 3 a 5 minutos.
Solución A
Solución madre de rojo de fenol al 0.01%
Mantener en heladera
Solución B
Solución de urea al 10%
Mantener en heladera
Procedimiento
En el momento de usar, colocar en un tubo de hemólisis 0.5 ml de la Solución A y
agregar 1 gota de Solución B. Tomar algunas colonias de levaduras con un hisopo
estéril e introducirlo en el tubo, dejar de 3 a 5 min y realizar la lectura final.
Control de Calidad
T. mentagrophytes: positivo (rojo)
T. rubrum: negativo (amarillo)
6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco)
Procedimiento
Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial
6.11 ASIMILACIÓN DE TREHALOSA (Tabletas Rosco)
Procedimiento
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Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial
7. HEMOCULTIVOS (por Lisis Centrifugación)
TUBOS PARA RECOLECCIÓN DE HEMOCULTIVOS
Saponina-------------------------------------------------------------- 5 g
Polianetol sulfonato de sodio --------------------------------- 0.5 g
Solución fisiológica -------------------------------------------- 100 ml
Fraccionar en tubos con tapa a rosca esterilizables en autoclave, 1 ml por tubo.
Autoclavar 15 minutos a 1 atm.
8. REACTIVOS PARA INMUNODIAGNÓSTICO
8.1REACTIVOS PARA INMUNODIFUSIÓN
Solución buffer fosfatos pH 7.4
M/15 Na2HPO4---------------------------------------------------------------------- 80,8 ml
M/15 NaH2PO4---------------------------------------------------------------------- 19,2 ml
Gel de Agar
Agua destilada------------------------------------------------ 99.0 ml
Solución buffer de fosfatos-------------------------------- 1.0 ml
NaCl------------------------------------------------------------ 0.85 g
Fenol ----------------------------------------------------------- 0.3 ml
Agar purificado----------------------------------------------- 1.0 g
PEG 6000------------------------------------------------------ 1.0 g
Se prepara la solución fisiológica fenolada al 3‰: Al agua destilada se le agregan
el NaCl y el fenol. Luego se agrega el agar y el PEG y se mezclan durante 5
minutos. Se lleva a baño de agua a 100 °C hasta su disolución completa y se
distribuye en tubos con tapa a rosca con 5 y 15 ml por tubo y se conserva a 4 °C
hasta su utilización.
Solución buffer de citrato-cloruro de sodio pH 8,2
Citrato trisódico --------------------------------------------------------
5g
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Solución salina isotónica ------------------------------------------- 100 ml
Mezclar bien hasta disolución total del citrato, envasar en un frasco con tapa a
rosca. Mantener a temperatura ambiente.
Solución de Azul de Coomasie
Azul brillante de Coomasie R-250--------------------------------1g
Etanol--------------------------------------------------------------------- 90 ml
Acido acético glacial-------------------------------------------------- 20 ml
Agua destilada---------------------------------------------------------- 90 ml
Disolver el azul en etanol y luego agregar el ácido acético y el agua destilada.
Esta solución puede reutilizarse muchas veces.
PREPARACIÓN DE LAS LÁMINAS O PLACAS
Se funde el agar en baño de agua a ebullición y se deja enfriar hasta 55-60 °C
Se vierte un tubo de 15 ml, si se realiza la ID en placa
Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua
destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar hasta
formar una película seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin diluir.
Se deja solidificar y se puede mantener a 4 °C hasta una semana. Los
portaobjetos así preparados deben conservarse en cámara húmeda.
8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS
Agarosa --------------------------------------------------------------- 1 g
PEG 6000------------------------------------------------------------- 1 g
Buffer veronal pH 8.2 ----------------------------------------- 100 ml
Merthiolate® 1/100 ----------------------------------------------- 1 ml
Mezclar. Disolver por calentamiento. Envasar en tubos de ensayo (10 ml)
Se utiliza 3 ml por portaobjeto.
Recubrir uno o varios portaobjetos con 3 ml de agarosa al 1 % en solución acuosa
caliente y dejar enfriar 10 minutos. Se pueden conservar en cámara húmeda a 4
ºC durante una semana.
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9. MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS
9.1 MEDIO DE SHADOMY MODIFICADO
Solución 1
YNB ----------------------------------------------------------------- 6.7 g
l-asparagina ------------------------------------------------------- 4.5 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Cloranfenicol --------------------------------------------------- 100 mg
Alcohol 99º --------------------------------------------------------- 2 ml
Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml
Disolver el cloranfenicol en el alcohol y agregar 50 ml de agua. Calentar la
solución a 35-40ºC, agregar el YNB, l-asparagina y la glucosa mientras se
revuelve. Luego se completa a 100 ml con agua destilada. Se esteriliza por
filtración con membrana de 0.45 μm o filtro Seitz
.
Solución 2
PO H Na.H2O ---------------------------------------------------0.37 g
4
2
PO HK2 ------------------------------------------------------------0.96 g
4
Agar (Oxoid Nº1)-------------------------------------------------- 10 g
Agua destilada csp -------------------------------------------- 900 ml
Se disuelve el agar en 900 ml de agua destilada calentando hasta ebullición y se
agregan los fosfatos, enfriar lentamente hasta 60ºC y se mide pH(6.8-7.2) Llevar a
volumen final de 900 ml y esterilizar en autoclave 20 minutos a 1 atm. Después de
autoclavar enfriar a 55-60ºC y agregar asépticamente la Solución 1 mientras se
agita. Mantener a 45-55ºC mientras se fracciona en frascos estériles (100 ml).
9.2 MUELLER-HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO
Agar Mueller-Hinton ---------------------------------------------- 37 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 20 g
Azul de metileno 1% ------------------------------------------- 0.1 ml
Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml
Disolver el agar y la glucosa en el agua y calentar. Agregar el azul de metileno.
Fraccionar en frascos (100 ml) y autoclavar 15 minutos a 1 atm.
9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM
Medio RPMI ---------------------------------------------------- 1 sobre
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MOPS------------------------------------------------------------ 34.53 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 18 g
Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml
Disolver 1 sobre de RPMI en 600-700 ml de agua destilada en un matraz aforado
de 1000 ml.
Disolver el MOPS en 50 ml de agua destilada en un Erlenmeyer.
Agregar la solución de MOPS al RPMI
Añadir la glucosa y mezclar hasta disolución completa.
Ajustar el pH a 7 con NaOH 40%.
Agregar agua destilada hasta volumen de 1000 ml.
Esterilizar por filtración y envasar en frascos de vidrio estériles de 100-200 ml cada
uno. Conservar en heladera.