evaluación de la integridad del acrosoma de - ovinos

EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL ACROSOMA DE ESPERMATOZOIDE OVINO
CRIOPRESERVADO UTILIZANDO DOS TEMPERATURAS DE ENFRIADO 5ºC Y -5ºC
ACROSOME INTEGRITY EVALUATION ON THE CRYOPRESERVED SHEEP SPERMATOZOA
USING TWO COOLING TEMPERATURES (5° C AND -5° C)
Jiménez MK1, Angulo MR2, Ortíz HA2, Gutiérrez PO1, Hernández EJ1, Juárez–Mosqueda ML.1
1Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM.
2Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Ovina (C.E.I.E.P.O.) de la FMVZ
RESUMEN.
La teca perinuclear (TP) es el principal citoesqueleto de la cabeza del espermatozoide de los
mamíferos y recientemente se ha señalado que esta sufre alteraciones durante la criopreservación
del semen de toro.
La TP cubre al núcleo espermático y ha sido involucrada en los procesos de espermiogénesis y
fertilización.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar si la integridad de la TP también se afecta en los
espermatozoides del ovino criopreservados pero bajo dos temperaturas de enfriamiento (5º C y -5º
C) y analizar la posible correlación entre el daño del citoesqueleto y el acrosoma.
El trabajo se realizó en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión de Producción Ovina y
en el Departamento de Morfología de la FMVZ de la UNAM. Se utilizaron 2 sementales de la raza
Suffolk y 2 de la raza Dorset, el semen se recolectó mediante la técnica de vagina artificial.
El acrosoma se evaluó mediante la técnica de triple tinción para microscopía fotónica y la
subestructura de la TP se evaluó mediante tinción negativa para microscopia electrónica de
transmisión.
Al análisis estadístico de las muestras mediante las pruebas de T-pareada, ANOVA y Pearson del
programa Minitab, mostraron diferencias significativas (P<0.05) entre la integridad de la TP del
semen fresco (%) y el descongelado (%), pero no existió diferencia significativa entre las muestras
descongeladas.
Tampoco se encontró correlación entre el daño del citoesqueleto y la pérdida de acrosoma.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
El acrosoma se localiza en la parte anterior de la cabeza del espermatozoide cubriendo dos tercios
del núcleo, contiene enzimas que son esenciales para la penetración de la zona pelucida del ovulo
dichas enzimas se liberan al exterior mediante un proceso de exocitosis denominado reacción
acrosomal, necesario para la fertilización del ovulo ( Fig 1). La congelación y descongelación
pueden afectar las membranas del espermatozoide debido a la transición de fases que sufren los
lípidos por efecto de la temperatura.
Algunos investigadores mencionan que el enfriado lento hasta -5º C puede mejorar la
estabilidad de las membranas espermáticas, disminuyendo el daño al acrosoma.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el mantenimiento del acrosoma por efecto de 2
temperaturas de enfriamiento previo a la congelación (5º C y -5º C).
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio se realizó en C.E.I.E.P.O de la UNAM, en el poblado de Tres Marías, Municipio
de Huitzilac, Estado de Morelos. Se utilizó el semen de 4 machos de las razas Suffolk y Dorset, con
una edad entre los 2 y 6 años.
La recolección del semen se realizó utilizando la técnica de vagina artificial y este se evaluó
macroscópica y microscópicamente.
El semen fue dividido en dos fracciones, una de ellas se empleó como semen fresco y la otra se
congeló.
El enfriado comenzó a temperatura ambiente (22º C) una parte del semen fue llevado hasta
alcanzar una temperatura de 5º C (en dos horas) y otra hasta llegar a -5º C (en una hora más)
utilizando para ello un refrigerador de uso doméstico.
Una vez alcanzadas las temperaturas se procedió al congelamiento de las muestras en vapores
de nitrógeno líquido.
Para la evaluación del semen criopreservado se descongelaron dos pajillas por temperatura en
un baño María a 37º C durante 30 segundos.
Se utilizó el método de la triple tinción (TT) que permite diferenciar entre células vivas y muertas
con y sin acrosoma.
Las observaciones se hicieron en un microscopio de luz.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las células se clasificaron y contabilizaron de acuerdo a los patrones de afinidad y reacción
tintorial de la TT y los resultados se muestran en el cuadro 1. Como se observa hubo una
diferencia estadística significativa entre los patrones observados en las muestras de semen fresco
y las muestras congeladas previo enfriamiento, lo cual coincide con en estudios anteriores en
semen de bovino.
Sin embargo no se encontró diferencia estadística entre las muestras enfriadas a 5° C y -5° C, lo
cual difiere con otras investigaciones.
En ambos tipos de muestras el porcentaje de espermatozoides fertilizantes (vivos con acrosoma)
fue muy bajo, lo cual posiblemente sea atribuido a que otras estructuras de la célula, más sensibles
a los cambios de temperatura, sean dañadas por el proceso de criopreservación.
Diversas investigaciones señalan que las proteínas del citoesqueleto son susceptibles a los
cambios de temperatura; en otro tipo de células se ha demostrado que el citoesqueleto interviene
en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática (cuadro 2, fig.2).
CUADRO 1.
RESULTADO DE LA COMPARACIÓN ENTRE PATRONES DE ESPERMATOZOIDES
FRESCOS Y DESCONGELADOS TEÑIDOS CON TRIPLE TINCIÓN.
Membrana acrosomal interna
Figura 1. Esquema de la cabeza del espermatozoide. (Gutiérrez 2006)
Membrana acrosomal externa
Membrana plasmática
Acrosoma
Capa postacrosomal
Capa subacrosomal
PATRONES FRESCO
% 5°C % - 5°C %
Muerto con acrosoma 27.83a 54.67b 48.58b
Muerto sin acrosoma 25.00a 41.67b 47.83b
Vivo con acrosoma 43.92a 3.33b 2.67b
Vivo sin acrosoma 3.25a 0.33b 0.92b
Literales diferentes indican diferencia significativa entre tratamientos (P < 0.05)
CUADRO 2.
EVALUACION DE LA INTEGRIDAD DE LA SUBESTRUCTURA DE LA TP ENTRE
TRATAMIENTOS. (T-PAREADA)
TP Fresco 5ºC -5ºC
Integra 86.33+/-4.48a 59.67+/-5.87b 73.50+/-4.06b
Alterada 12+/-4.11a 38+/-5.44b 24.67+/-2.80b
Literales diferentes indican diferencia estadística significativa P < 0.05
INTEGRIDAD DE LA SUBESTRUCTURA DE LA TECA PERINUCLEAR
Fig.2. Ultramicrofotografías de cabezas de espermatozoides de ovino contrastadas con tinción negativa,
donde se observa la integridad de la subestructura de la teca perinuclear (TP).
a) Subestructura normal mostrando las papilas (flecha) distribuidas a lo largo del borde apical de la PA y la
delimitación de las mismas por una línea continúa.
b) Subestructura alterada mostrando la pérdida de algunas papilas (flecha).
c) Cabeza espermática mostrando la ausencia de la subestructura (flechas) de la TP.
Barra 1 μm. SA: capa subacrosomal de la TP; PA: capa postacrosomal de la TP.
CONCLUSIÓN
Aunque después de la descongelación un alto porcentaje de espermatozoides conservaron el
acrosoma, el enfriado de las células hasta -5° C no permitió mantener la integridad de la
membrana plasmática ya que el porcentaje de células vivas fue muy bajo en ambos tipos de
enfriado.
La triple tinción es una valiosa herramienta que permite la identificación de los espermatozoides
con y sin acrosoma y de estos, diferenciar el porcentaje de vivos y muertos.
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