Caracterización de la actividad de la enzima Nitrato Reductasa en

Universidad de Los Lagos
Departamento de Acuicultura y Recursos Acuáticos
Caracterización de la actividad de la
enzima Nitrato Reductasa en
Macrocystis pyrifera de poblaciones
expuestas y protegidas del oleaje
Proyecto de seminario de título para
optar al título de Biólogo Marino
Pablo Patricio Leal Sandoval
2006
Macrocystis pyrifera
Importancia ecológica
•Base de cadenas tróficas
•Hábitat
•zonas asentamiento larval
•Refugio
Bahías abiertas al océano
Pacífico y canales y fiordos
protegidos de la acción de las
olas
Importancia económica
•Alginatos
•Alimento abalón
Sur de Chile
Áreas expuestas
al oleaje
Áreas protegidas
del oleaje
Abundancia poblacional
Sin variaciones
estacionales
•Población estable
•Reproducción continua
Con variaciones
estacionales
•Disminuyen en
primavera-verano;
desaparecen en otoño
•Reproducción verano
Patrones de estacionalidad
de poblaciones expuestas y
protegidas
Dentro de un contexto
ecológico, la actividad
enzimática de procesos
metabólicos relevantes.
•Tº
•Nutrientes
•Luz
•Movimiento del agua
Crecimiento
Nitrógeno (N)
NO3-
Reproducción
Urea
NH4+
La capacidad para captar y asimilar NO3-, puede determinar
las tasas de crecimiento macroalgal.
Removido el NO3- desde la columna de agua y almacenado
como NO3-, reducido a NH4+ o asimilado en los aminoácidos.
Nitrato
Reductasa
Regulación
Degradación de
proteína
Síntesis de
proteína
Presencia de NO3
-
Actividad de la enzima
Luz
Ausencia de NO3Presencia de NO2-
Concentración de NO3en la columna de agua
Fluctuaciones circadianas
o ultracircadiano
Actividad de la
enzima NR
Define
Actividad
mostrada por la
proteína
Cantidad de
proteína
Mide
Cantidad de NO2- producido en un
periodo de tiempo determinado
Métodos
Ensayo in situ
Ensayo in vitro
Muchos trabajos se han basado en los factores que
regulan la actividad de la NR en plantas superiores y
microalgas.
Pocos trabajos se han enfocado en macroalgas.
Los ensayos enzimáticos de la NR han sido realizados de
acuerdo a un método estándar sin la optimización para
un alga en particular.
Se ha observado que un método estándar no es igualmente
eficiente para medir la actividad NR en diferentes algas
marinas.
Preguntas de investigación
¿Cuáles son las condiciones óptimas para la evaluación de
la actividad de la NR in vitro en Macrocystis pyrifera?
¿Existen diferencias entre poblaciones de hábitat expuestos
y protegidos del oleaje, en cuanto a la actividad de la NR?
¿La enzima NR es útil como indicador fisiológico de
diferencias adaptativas entre distintas poblaciones de una
misma especie?.
Objetivo General
Determinar si existen diferencias significativas en la actividad
de la Nitrato Reductasa in vitro, entre poblaciones de M.
pyrifera de zonas expuestas y protegidas del oleaje.
Objetivos Específicos
Optimizar el ensayo in vitro para la extracción y medición de la
actividad de la enzima Nitrato Reductasa en M. pyrifera.
Evaluar la actividad de la enzima Nitrato Reductasa en frondas
juveniles de individuos provenientes de diferentes poblaciones de
M. pyrifera expuestas y protegidas del oleaje, utilizando un
ensayo in vitro optimizado.
Hipótesis
H1 Existen diferencias significativas, en la actividad de la enzima
Nitrato Reductasa, entre poblaciones de Macrocystis pyrifera de
zonas expuestas y protegidas del oleaje.
H1.1 La medición de la actividad de la NR, con un el ensayo in
vitro optimizado, en frondas juveniles de individuos de
Macrocystis pyrifera determina diferencias significativas en la
actividad de la NR entre poblaciones expuestas y protegidas del
oleaje.
Metodología
0,2 g peso fresco
Pulverizara en N líquido
Homogeneizara en 3 ml amortiguador extracción
750 x g por 5 min
NADH
KNO3
200 µl de
homogeneizado
600 x g por 5 min
Acetato de zinc
Fenazina metilsulfato
NNED
Sulfanilamida
Concentración de NO2- (λ = 540 nm)
Experimento 1: Optimización del ensayo in vitro para la
extracción y medición de la actividad de la NR en M. pyrifera
•Frondas juveniles de individuos adultos de M. pyrifera.
NO3Km
NADH
Estabilidad
de la enzima
Componentes del
amortiguador
Actividad
de la
enzima
0 - 20 mM
0 - 5 mM
Extractos de la enzima serán almacenados en
frío por 0 - 0,25 - 0,5 - 1 - 1,5 y 2 horas.
Prepararán, por separado,
amortiguadores sin
EDTA, PVP o BSA.
Experimento 2: Caracterización de la actividad NR in vitro de
poblaciones expuestas y protegidas del oleaje de M. pyrifera.
Osorno
Faro
Corona
Bahía Mansa
Puerto Montt
Dalcahue
Bahía Metri
Quellón
Análisis estadísticos
Los resultados obtenidos se someterán a una ANOVA simple
con una significancia de P < 0,05.
Experimento
1
2
Factor
Ausencia o presencia (EDTA, PVP o BSA)
Concentracion de KNO3 y NADH
Tiempo de almacenamiento
Grado de exposicion al oleaje
Variable Respuesta
Actividad de la NR
Actividad de la NR
Gracias...