Variantes polimórficas del Citocromo P450 2D6 en la población

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
“VARIANTES POLIMÓRFICAS DEL CITOCROMO P450
2D6 Y SU INFLUENCIA SOBRE SU ACTIVIDAD
CATALÍTICA DEBRISOQUINA 4-HIDROXILASA IN VIVO”
Tesis para optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica
Área de Especialización: Toxicología y Diagnóstico Molecular
y
Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímica
JOSELYN IVONNE GARAY CORTESI
Directores de Tesis
Dr. Luis Quiñones Sepúlveda, B.Q.
Dr. Iván Saavedra Saavedra, Q.F.
Santiago de Chile
2012
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Dedicatoria
A mis padres y hermanas…
I
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Agradecimientos
Nadie dijo que sería fácil…
La universidad nos pone a prueba, no tan sólo en el ámbito educacional, sino también familiar y
emocional. El paso por la carrera de bioquímica me enseñó que no existen diferencias económicas
que se traduzcan en diferencias intelectuales, sino que todos tenemos las mismas posibilidades y sólo
depende de cada uno.
Mami, siempre me has apoyado aunque muchas veces no estemos de acuerdo. Tu amor es
incondicional y sin tí, no habría llegado hasta donde estoy. Te admiro infinitamente como madre,
mujer y persona.
Papi, gracias por tus consejos, tus charlas, siempre eternas pero llenas de experiencia. Gracias por
apoyarme en mis peores momentos y ayudarme a levantarme cada vez que lo he necesitado. Me
enseñaste lo que es la responsabilidad y la organización, creo que esta tesis es el mejor ejemplo de
tus enseñanzas.
Janita y Conita, mis hermanas. No existió un día en que no me preocupara o hablara de ustedes.
Me apoyaron en cada prueba y en cada locura que se me ocurría. Son incondicionales conmigo y mi
cariño es incondicional hacia ustedes. Recién están comenzando a vivir y quiero ser estar ahí día a
día. Gracias por tan sólo por existir, son mi vida entera. Las adoro.
A mis amigos de bioquímica, Anita, Panchi, Dani, Pablo, Xime, a mis compañeros y tantos amigos
más que hice durante la carrera. Gracias por transformarse en mi familia cada vez estudiamos y
compartimos juntos.
A mis compañeros del colegio, Carla, Anita, Cristina y especialmente a Jesús, jamás entendieron lo
que estudiaba, pero siempre estuvieron presentes y me apoyaron. Hemos vividos muchas etapas
juntos y les agradezco por seguir a mi lado.
A mis tutores de tesis, Dr. Iván Saavedra y Dr. Luis Quiñones, gracias por creer en mí y ayudarme a
realizar mi tesis.
Gracias a la comisión evaluadora, por su apoyo y críticas constructivas. Gracias a la Dr. Daniela
Seelenfreund por sus consejos e infinita disposición hacia mi persona, siempre sentí en sus palabras
una muestra de cariño. Gracias especialmente a la Dr. Amalia Sapag, esta tesis no sería lo que es sino
es gracias a su preocupación y dedicación, nunca esperé que un docente me dedicaría tanto tiempo y
me enseñaría de la forma que Usted lo hizo. Gracias.
Al laboratorio IFT y a todos los integrantes que alguna vez pasaron por el laboratorio, me vieron
reír, llorar, caerme, enojarme, pelear, siempre me apoyaron y se rieron conmigo ,y de mí. Los quiero.
Gracias a mi pololo, hemos vivido un largo proceso, pero hemos vencido todas las adversidades y
seguimos juntos, esta es una etapa cumplida para mí y para nosotros. Espero tener tu apoyo y amor
en todas las etapas que me quedan por cumplir. Te amo
Este logro no es solo mío, sino de todas las personas que me apoyaron y me animaron a seguir
cuando me sentí derrotada, infinitamente gracias.
II
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Índice
Pág.
Índice de figuras...……………………………………………………………………………………………………...v
Índice de tablas…………………………………………………………………………………………..……………vii
Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………….……viii
Resumen…………………………………………………………………………………………...……………………...ix
Summary…………………………………………………………………………………………………………………...x
1.
Introducción……………………………………………………………………………………….………………….…1
2.
Hipótesis……………………………………………………………………………………………….………………. 20
3.
Objetivos………………………………………………………………………………………………………………..21
3.1.
3.2.
Objetivo general……………………………………………………………………………………………………...21
Objetivos específicos…………………………………………………………………………………….………..21
4.
Materiales y Metodología…………………………………………………………………………………....22
4.1.
4.2.
Materiales…………………………………………………………………………………………….………………….22
Metodología………………………………………………………………………………………………….…………24
4.2.1
Determinación del tamaño muestral ………………………………………….………… 24
4.2.2.
Reclutamiento de voluntarios sanos………………………………………………….….24
4.2.3.
Análisis de las muestras según grupo sanguíneo (ABO) ……………………..24
.
.
4.2.4.
Extracción y purificación de DNA………………………………………………….……… 25
Análisis genotípico……………………………………………………………………………………………........25
4.3.1.
Identificación del alelo CYP2D6*2 (C2850T) mediante una
PCR-RFLP…………………………………………………………………………………………..... 24
4.3.2.
Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una PCR
.
4.3.
.
alelo específica semianidada.………………………………………………………….…... 27
Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una
PCR-RFLP…………………………………………………………………………………………..…30
Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCR
.
4.3.3.
4.3.4.
4.3.5.
4.3.6.
4.4.
alelo específica semianidada ……………………………………………………..………....32
Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una
PCR-RFLP……………………………………………………………………………………….….…35
Identificación de la duplicación y multiplicación génica del gen
CYP2D6 mediante una PCRL………….………………………………………….….…..…37
4.3.7.
Estimación del porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)…...39
Análisis farmacocinético: CYP2D6 in vivo………….………….………..….………….………….……41
4.4.1.
4.4.2.
Análisis de control de calidad del comprimido Declinax………….….………...41
Reclutamiento de voluntarios………….………….………….………….…………...………41
III
III
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.4.3.
Recolección de muestras de orina ………….………….………….………….….……….42
4.4.4.
4.4.5.
Determinación de debrisoquina y 4-hidroxidebrisoquina en orina …….….43
Equipamiento/ Instrumentación ………….………….………….………….…………...…...43
4.4.6.
4.4.7.
4.4.8.
4.4.9.
Preparación de soluciones madres de debrisoquina ………….……….….…….43
Curvas de calibración………….………….………….………….………….…………..……….45
Procesamiento de muestras de voluntarios sanos.………….……….….….…… 45
Determinación de la razón metabólica………….………….………….…………..…… 46
.
.
4.5.
Análisis estadístico………….………….………….………….………….………….………….………..…….…..46
5.
5.1.
Resultados………….………….………….………….………….………….………….………….………….……...48
5.2.
Análisis genotípico………….………….………….………….………….………….………….…………..……… 48
.
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.1.4.
Voluntarios sanos………….………….………….………….………….………….…………..….48
Frecuencias alélica y genotípica de C2850T (CYP2D6*2)…….……..…….. 48
Frecuencias alélica y genotípica de A2549del (CYP2D6*3)……..…….……48
Frecuencias alélica y genotípica de G1846A (CYP2D6*4)…….……...……. 48
5.1.6.
Frecuencia genotípica de la duplicación o multiplicación
génica de CYP2D6*1xN………….……………………………………….….…………...…….58
5.1.7.
5.1.8.
Resumen de las frecuencias alélica y genotípica de CYP2D6.….......…….58
Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)………….…………...……58
Análisis farmacocinético………….………….………….………….………….………….………….……..….. 63
5.2.1.
Prueba de identidad y uniformidad de contenido del comprimido
Declinax………….………….………….………….………….………….………….………….….…..63
5.2.2.
Genotipos de los voluntarios sanos………….………….………….………….…….…..63
5.2.3.
Determinación de la razón metabólica de debrisoquina
4-hidroxilasa……………………………………………………………………………………….….64
5.2.4.
Análisis estadístico………….………….………….………….………….………….……...….... 65
.
..
6.
Discusión………….………….………….………….………….………….………….………….………….…………79
7.
Conclusiones………….………….………….………….………….………….………….………….…………….. 86
8.
Bibliografía………….………….………….………….………….………….………….………….…………….……87
9.
Anexos
.
Anexo 1: Consentimiento informado para análisis genético ………….…….…….95
Anexo 2: Consentimiento informado para estudio farmacocinético de
debrisoquina………….………….………….………….………….………….…….…….96
Anexo 3: Acta de aprobación del Comité de Ética………….………….…………..….99
Anexo 4: Criterios de inclusión y exclusión de voluntarios para estudio
farmacocinético………….………….………….…….….………….………….………101
Anexo 5: Instructivo para el estudio farmacocinético de debrisoquina…...102
IV
IV
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Índice de figuras
Pág.
Figura 1:
Farmacogenética………….………….………….………….………….…………………….....2
Figura 2:
Medicina personalizada: del genotipo al fenotipo ………….…………..…........8
Figura 3:
Ubicación génica del gen CYP2D6……………….…………………………….……...9
Figura 4:
Metabolismo del tamoxifeno….……….………….…………………..……….…………14
Figura 5:
Estructura alélica funcional y no funcional de CYP2D6…………………..18
Figura 6:
Ruta de transformación de la debrisoquina mediada por
la enzima CY2PD6………….………….………….……………………………………….....19
Figura 7:
Esquema de corte del producto de la PCR con la enzima
HhaI para la detección de C2850T
(asociada al alelo CYP2D6*2)..……….………….………….…………………………26
Figura 8:
Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada
para la detección del polimorfismo A2549del
(asociado al alelo CYP2D6*3).………….………………………….….……………….29
Figura 9:
Digestión con la enzima MspI del producto de la PCR para la
detección del polimorfismo A2549del.………….…………..………….……………31
Figura 10:
Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada
para la detección del polimorfismo G1846A
(asociado al alelo CYP2D6*4)………….………….………….……….….……………33
Figura 11:
Digestión con la enzima MvaI del producto de la PCR para la
detección del polimorfismo G1846A…………….………………….…...………….36
Figura 12:
Duplicación génica o multiplicación génica del gen CYP2D6*1
y su detección mediante la PCRL ………………………………………….………...38
Figura 13:
Estructura molecular del sulfato de debrisoquina………….…………………40
Figura 14:
Patrones electroforéticos de C2850T (CYP2D6*2)………….…………..….. 50
.
V
V
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Figura 15:
Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través
de la PCR alelo específica semianidada…………………….….………...............52
Figura 16:
Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través
de la PCR RFLP…………………………………………………………………..…………….53
Figura 17:
Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través
de la PCR alelo específica semianidada………….………..................................55
Figura 18:
Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través
de la PCR RFLP………….……………………………………………………………..….......56
Figura 19:
Patrones electroforéticos de CYP2D6*1xN………….…………………...………60
Figura 20:
Espectro característico de sulfato de debrisoquina ……………………........63
Figura 21:
Cromatogramas representativos de los fenotipos ME, MI y MP………69
Figura 22:
Relación entre genotipos y razones metabólicas………….………………….76
Figura 23:
Comparación de los promedios de la razones metabólicas según
genotipo….……….……….……….……….……….……….……….……….……….……...........77
Figura 24:
Fenotipos esperados y fenotipos observados ……….………….………………79
VI
VI
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Índice de tablas
Pág.
Tabla 1:
Sustratos, inhibidores e inductores de CYP2D6………….………….…..…….11
Tabla 2:
.
Tabla 3:
Variables alélicas de CYP2D6………….………….………….……..…….……..……..15
Tabla 4:
Concentraciones de las soluciones madres de debrisoquina ….…..…...44
Tabla 5:
Razones metabólicas de debrisoquina………….………….…………………...…..47
Tabla 6:
Características de la población del estudio………….……................................49
Tabla 7:
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo
CY2D6*2 (C2850T)………………………………………………………………..…….…….51
Tabla 8:
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo
CYP2D6*3 (A2549del)………….………………………………………………...…….......54
Tabla 9:
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo
CYP2D6*4 (A1846A)………….………………………………………………….……......…57
Tabla 10:
Frecuencia genotípica de CYP2D6*1xN………….……………………….............60
Tabla 11:
Resumen de frecuencias genotípica y alélica de
CYP2D6*2, *3 y *4………….………………………………………………………………....61
Tabla 12:
Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica de la población del
estudio………….………….………….………….………….………….………….………...……...62
Tabla 13:
Test de uniformidad……………………………………………………………….…..………64
Tabla 14:
Características de los voluntarios sanos …………………………………......……66
Tabla 15:
Número de voluntarios por cada polimorfismo estudiado
de CYP2D6………….………………………………………………………………………..…...67
Tabla 16:
Genotipos teóricos y genotipos posibles.……..……….………….……………….67
Tabla 17:
Genotipos posibles y sus fenotipos metabolizadores
esperados………….………….……………………………………………….………..………....71
Tabla 18:
Razones metabólicas obtenidas según genotipo y
su clasificación metabólica………….………….………….…..….………….…………..72
Tabla 19:
Estadísticas descriptivas de los datos………….………….……………………..…75
Tabla 20:
Frecuencias alélicas de CYP2D6………….……………………………...….….……. 80
Oligonucleótidos………………………………………………………….…..…….……..….…23
.
VII
VII
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Abreviaturas
%MA-C
Porcentaje de mezcla amerindio-caucásica
A
Adenina
ACN
Acetonitrilo
AS
Alelo específica
BPC
Buenas prácticas clínicas
C
Citosina
CYP
Citocromo P450
DEPC
Dietilpirocarbonato
DE
Desviación estándar
dNTPs
Desoxinucleótidos
EDTA
Ácido etilendiamino tetra acético
G
Guanina
HPLC
Cromatografía líquida de alta resolución
IFT
Laboratorio de Investigaciones Farmacológicas y
Toxicológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile
IMC
Índice de masa corporal
ME
Metabolizador extensivo
MI
Metabolizador Intermedio
MP
Metabolizador pobre
MR
Razón metabólica
MU
Metabolizador ultrarrápido
P450
Citocromo P450
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PCRL
PCR larga
RFLP
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
SNC
Sistema nervioso central
SNP
Polimorfismo de nucleótido único
T
Timina
TBE
Tris Borato EDTA
wt o *1
Alelo silvestre
wt/wt
Genotipo silvestre
VIII
VIII
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Resumen
Los médicos prescriben fármacos sobre la base de
sus características
farmacológicas y sobre la posibilidad de obtener resultados clínicamente reproducibles.
Sin embargo, muchos de los fármacos son eficaces en sólo 25% a 60% de los
pacientes, por lo tanto, muchos pacientes no responden a los tratamientos e incluso
experimentan reacciones adversas e intoxicaciones. Existen variaciones individuales
en las respuestas a fármacos que pueden deberse a diversos efectos, pero en la
actualidad se sabe que muchas de estas variaciones se encuentran predeterminadas
genéticamente; éste es el blanco de estudio de la farmacogenética.
La debrisoquina-4-hidroxilasa (CYP2D6) es una de las enzimas más importante del
metabolismo de fármacos que actúan tanto a nivel del sistema nervioso central (SNC)
como del sistema circulatorio. Los polimorfismos de CYP2D6 presentan grandes
diferencias en las frecuencias alélicas según la población y etnia. En este estudio se
analizaron a través de PCR-AS semianidada, PCR RFLP y PCRL las variables
CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4 y la duplicación del gen CYP2D6 en 321
voluntarios sanos. Las frecuencias alélicas encontradas son muy similares a las
registradas para la población española: para *2 un 40,5%, para *3 un 1,09%, para *4
un 11,8%. No se encontraron duplicaciones del gen CYP2D6 en un subgrupo de 20
voluntarios analizados.
Para determinar con exactitud la influencia de los polimorfismos del gen CYP2D6 en
su actividad debrisoquina hidroxilasa, se seleccionaron 23 voluntarios del grupo en
estudio que presentaban genotipos relevantes, los cuales debieron ingerir el marcador
metabólico debrisoquina. Se recolectaron las muestras de orina de 0-8 horas y se
analizaron a través de HPLC. Presentaron el fenotipo esperado 18 voluntarios, de los
cuales el más relevante es el genotipo *4/*4 que presentó una actividad catalítica muy
disminuida en comparación al grupo wt/wt. Se obtuvo una correlación genotipo-fenotipo
para algunos voluntarios logrando el objetivo fundamental que busca un estudio
farmacogenético, es decir, la determinación de la respuesta individual.
IX
IX
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Summary
“Polymorphic variants of cytochrome P450 2D6 and its influence on in
vivo catalytic activity debrisoquine 4-hydroxylase”
Physicians prescribe drugs based on their pharmacological characteristics and the
possibility of clinically reproducible results. However, many drugs are effective only in
25% to 60% of patients, therefore, many patients do not respond to treatments and
even suffer adverse reactions and intoxications. There are individual variations in drug
response which may be due to various effects; many of these variations are genetically
predetermined, and are the target of a pharmacogenetic study.
Debrisoquine-4-hydroxylase (CYP2D6) is one of the most important enzymes in the
metabolism of drugs which have effects in the central nervous system (CNS) and the
circulatory system. CYP2D6 polymorphisms present large differences in allele
frequencies based on population and ethnicity. In this study we analyzed the variants of
CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4 and CYP2D6 gene duplication by PCR-AS nested,
RFLP and PCRL in 321 healthy subjects. The allelic frequencies found were very
similar to those reported for the Spanish population (40,5% for *2, 1,09% for *3 and
11,8% for *4). There were no CYP2D6 gene duplications in the 20 volunteers tested.
To determine the influence of CYP2D6 polymorphisms on the debrisoquine
hydroxylase activity, 23 volunteers having relevant genotypes were chosen from the
study group to determine their capacity to metabolize debrisoquine, a metabolic marker
for CYP2D6. Urine samples of 0-8 hours were collected and analyzed by HPLC. Only
18 volunteers presented the expected phenotype, of which the most relevant genotype
is *4/*4, with a reduced catalytic activity compared to the wt/wt group. A genotypephenotype correlation was observed for some volunteers, thus echieving the
fundamental aim of a pharmacogenetic study, that is, the determination of the individual
response.
X
X
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
1.
Introducción
El éxito de la medicina moderna es, en parte, el resultado de un tratamiento
farmacológico eficaz. Un hecho bien conocido es que los individuos responden en
forma diferente a una terapia de fármacos y que ningún medicamento es 100% eficaz
en todos los pacientes. En consecuencia, el margen de respuesta a un tratamiento
farmacológico es diverso, ya que algunos individuos pueden obtener los efectos
esperados, mientras otros no obtienen un resultado terapéutico e incluso pueden
experimentar efectos adversos (Figura 1) (Zhou y cols., 2008).
Los médicos prescriben fármacos sobre la
base de
las características
farmacológicas del medicamento y sobre la probabilidad de obtener resultados
clínicamente reproducibles. Sin embargo, muchos de los fármacos son eficaces en sólo
25 a 60 % de los pacientes. En los países desarrollados al menos el 6% de las nuevas
admisiones en los hospitales se deben a eventos de reacciones adversas. En Estados
Unidos más de dos millones de personas son hospitalizadas debido a reacciones
adversas, con un número de muertes que excede los 100.000 casos anualmente,
representando la quinta causa de muerte (Wilkinson, 2005; Xie y cols., 2005). Además,
cerca del 3% de las hospitalizaciones al año ocurridas en Estados Unidos se deben a
interacciones entre medicamentos. Los costos hospitalarios relacionados con
medicamentos exceden los 177 billones de dólares anualmente en Estados Unidos.
Muchos de estos medicamentos han sido retirados del mercado porque causan una
toxicidad severa a un número pequeño de personas (Xie y cols., 2005), por lo que se
considera necesario conocer el metabolismo de un medicamento como prerrequisito
para prevenir los efectos adversos de su administración (Wijnen y cols., 2007).
La variabilidad en la respuesta a los medicamentos en los pacientes es
multifactorial. Esta respuesta incluye factores extrínsecos como el medio ambiente, y
factores intrínsecos entre los que se incluyen aspectos genéticos que influyen en la
respuesta a cierto medicamento. La variabilidad en el metabolismo de los fármacos
contribuye a la variabilidad individual en la respuesta a los medicamentos por
alteración de la concentración plasmática en estado estacionario (Evans & McLeod,
2003; Wijnen y cols., 2007).
1
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Pacientes que
reciben el mismo
tratamiento
Responden al tratamiento
No responden al tratamiento
Sufren efectos adversos
Figura 1
Farmacogenética
Los tratamientos farmacológicos provocan variabilidad de respuesta en pacientes
tratados con la misma dosis. Algunos responden de la manera deseada al tratamiento,
mientras otros no responden y algunos incluso llegan a desarrollar reacciones
adversas.
2
2
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
La amplia diferencia de respuesta entre poblaciones, aparejada de una menor
variabilidad interpaciente, es coherente con la herencia como el principal factor
determinante de la respuesta a fármacos. Se estima que entre 20 y 95% de la
variabilidad en la disposición y efectos de fármacos corresponden a la herencia
genética, aunque muchos factores no genéticos influyen en la eficacia de los
medicamentos, incluyendo la edad, función del órgano, terapia concomitante,
interacción de medicamentos y la naturaleza de la enfermedad. Existen numerosos
ejemplos en los cuales la diferencia interindividual en respuesta a medicamentos se
debe a las variables genéticas de los genes que codifican enzimas metabolizadoras,
transportadores o receptores de medicamentos (Evans & McLeod, 2003). Estas
variaciones genéticas pueden corresponder a repeticiones nucleotídicas, inserciones,
deleciones o polimorfismos de un nucleótido (SNP), lo cual modifica la secuencia
aminoacídica de las proteínas codificadas y la expresión génica (Zhou & cols., 2008).
Farmacogenética
La relación entre las reacciones adversas de fármacos y las variaciones
determinadas genéticamente fue demostrada por primera vez en los años 50. Friedrich
Vogel fue el primero en usar el término farmacogenética en 1959, pero no fue hasta
1962 cuando la farmacogenética fue definida como el estudio de las variaciones
genéticas que causan la variabilidad en la respuesta a los fármacos. Los estudios de
farmacogenética se basan en la investigación de genes candidatos seleccionados por
su importancia biológica, ya sea en la cinética o por su relación en la acción
farmacológica; el objetivo final es identificar individuos con riesgo de experimentar
efectos adversos o con probabilidad de ser resistentes al tratamiento (Figura 1)
(Vesell, 2000).
El campo de la farmacogenética comenzó con un enfoque basado en el
metabolismo de fármacos, pero con los años ha logrado abarcar un amplio espectro de
factores que afectan la biodisponibilidad de fármacos, incluyendo los transportadores
que influyen en su absorción, distribución y excreción. Existen más de 30 familias de
enzimas metabolizadoras de fármacos en humanos, como son las enzimas del sistema
citocromo P450, la glutatión S-transferasa y la tiopurina metil-transferasa. La gran
mayoría de ellas presentan variantes genéticas que se traducen en cambios
3
3
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
funcionales de las proteínas codificadas (Evans & McLeod, 2003; Weinshilboum, 2003;
Gutiérrez, 2004).
El ser humano está constantemente expuesto a moléculas extrañas o compuestos
xenobióticos, los cuales están presentes en la naturaleza como alcaloides o toxinas
producidas por hongos, o bien como sustancias químicas sintetizadas por el hombre,
como compuestos químicos industriales y fármacos. La gran mayoría de estas
moléculas son lipofílicas, es decir, son absorbidas fácilmente a través de la piel,
mucosas intestinales y respiratorias, alcanzando de esta manera la circulación
sistémica. Los organismos vivos han desarrollado sistemas enzimáticos que les
permiten metabolizar sustancias lipofílicas en compuestos hidrofílicos facilitando su
excreción. Además, pueden convertir los profármacos en compuestos activos con
efecto terapéutico e incluso podría resultar la formación de compuestos tóxicos
(Weinshilboum, 2003).
Las enzimas involucradas en el metabolismo de fármacos se encuentran
principalmente en el hígado, pero también se pueden expresar en otros tejidos como el
riñón, el cerebro, la piel, la sangre, los pulmones y la mucosa gastrointestinal
(Wilkinson, 2005; Wolf & Smith, 1999). El gran número de compuestos químicos
encontrados en el medio ambiente que son metabolizados puede explicar por qué
estas enzimas pertenecen a familias multigénicas de proteínas (Wolf & Smith, 1999).
Los farmacólogos clasifican las rutas de metabolización de fármacos en Fase I y
Fase II. La primera corresponde a las reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis,
convirtiendo el fármaco en un compuesto soluble en agua o en un metabolito más
reactivo adecuado para las reacciones de Fase II, que son principalmente
conjugaciones con sustancias endógenas como el ácido glucurónico, aminoácidos,
ácidos grasos, glutatión, grupos metilo, sulfato o acetato, provocando la inactivación de
los metabolitos y facilitando de esta manera su excreción. Estas transformaciones
químicas que permiten convertir sustancias lipofílicas en compuestos hidrofílicos se
han denominado rutas de biotransformación asociadas usualmente a una pérdida de
actividad y a un aumento del carácter polar de las moléculas, lo que favorece su
excreción renal (Ioannides, 2002).
4
4
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Las reacciones de Fase I son catalizadas por proteínas de naturaleza diversa, entre
las que se incluyen las enzimas con actividad monooxigenasa como el sistema
citocromo P450 o la flavín monooxigenasa, diversas oxidasas (alcohol deshidrogenasa,
aldehído deshidrogenasa, aminooxidasas, aromatasas), la epóxido hidrolasa o
esterasas y amidasas hepáticas y plasmáticas. El sistema citocromo P450 es sin duda
el integrante más destacado de este grupo de enzimas y el que ha sido más
ampliamente estudiado. Corresponde a una superfamilia de monooxigenasas
responsables del metabolismo oxidativo de un gran número de compuestos endógenos
y xenobióticos, incluyendo más del 60% de los medicamentos; por lo tanto, se ha
convertido en un foco de estudio para elucidar los factores que contribuyen a la
variabilidad de la respuesta a fármacos (Weinshilboum, 2003; Zhou y cols., 2008).
Sistema citocromo P450
Precisar la fecha exacta en que fue descubierto el sistema citocromo P450 es difícil;
los primeros conocimientos se remontan a estudios desarrollados por diversos grupos
de investigación durante los años 50 en tejidos hepáticos de mamíferos. Transcurrieron
varios años hasta que en 1964 se identificó la naturaleza hemo-proteica de un
pigmento presente en los microsomas hepáticos de diferentes especies, el cual era
capaz de unirse a CO (monóxido de carbono) tras ser reducido por NADPH
(nicotinamida adenina dinucleótido fosfato ) o por ditionito. El complejo exhibía una
absorbancia máxima a 450 nm y por eso recibió el nombre de sistema citocromo P450
(Omura & Sato, 1964).
Las oxidaciones catalizadas por el sistema citocromo P450 son reacciones de
monooxigenación dependientes de NADPH y para las cuales se utiliza oxígeno
molecular; también es capaz de catalizar reducciones, hidrataciones o hidrólisis. Las
oxidaciones catalizadas por el sistema citocromo P450 incluyen hidroxilaciones
aromáticas y alifáticas, N- y S-oxidaciones, epoxidaciones, O- y S-desalquilaciones,
desaminaciones, desulfuraciones, deshalogenaciones y deshidrogenaciones. Se trata
de monooxigenaciones en las que sólo uno de los átomos de oxígeno es incorporado
en la molécula de sustrato, mientras que el otro es reducido a agua.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
La diversidad de la superfamilia citocromo P450 surgió de un extenso proceso de
duplicación génica y, probablemente, aunque no tan bien documentado, de situaciones
de amplificación génica, conversiones génicas, duplicaciones génicas, pérdida de
genes y transferencias laterales (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).
La nomenclatura estándar de las enzimas del citocromo P450 utiliza la raíz CYP
seguida de un número arábigo que designa la familia de enzimas sobre la base de una
identidad aminoacídica de más del 40%, una letra para designar la subfamilia con una
identidad de más del 55% y otro número que denota la enzima individual, por ejemplo:
CYP2D6*4. Para cada enzima el alelo silvestre se designa con *1 y las variaciones
alélicas se enumeran de manera secuencial según han sido identificadas (es decir, *2,
*3, etc.).
Las enzimas del sistema citocromo P450 son importantes tanto en la biosíntesis
como en la degradación de compuestos endógenos (esteroides, lípidos y vitaminas,
etc.); además, metabolizan muchas sustancias químicas presentes en la dieta, en el
ambiente y también los fármacos.
La secuenciación del genoma humano reveló la existencia de 115 genes CYP
humanos (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html), de los cuales 57 son
activos y 58 son seudogenes, pero sólo un pequeño número codifica proteínas,
principalmente las familias CYP1, CYP2 y CYP3 (Frye, 2004; Weijnen y cols., 2007;
Zhou y cols., 2008). Colectivamente, las enzimas de las familias 1-3 son responsables
del 70-80% de la oxidación de fármacos y, en cerca de un 50%, de la eliminación de
los medicamentos utilizados usualmente. Casi todos los miembros de las subfamilias
de CYP son polimórficos (ver: http://www.imm.ki.se/CYPalleles), lo cual afecta el
metabolismo de fármacos que son sustratos particulares para cada enzima,
determinando diferencias en la respuesta a medicamentos y, por ende, un alto riesgo
de experimentar efectos adversos e intoxicaciones (Meijerman y cols., 2007; Wijnen y
cols., 2007; Wilkinson, 2005; Zhou y cols., 2008).
Existen inhibidores de algunas enzimas del sistema citocromo P450, como por
ejemplo la naringina, que es un compuesto flavonoide extraído de las cáscaras del
pomelo que inhibe al CYP3A4. En cambio, otras sustancias son inductoras y pueden
aumentar la actividad de una enzima específica del citocromo P450, como por ejemplo
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
el benzo[a]pireno del humo del cigarrillo, que induce la acción del CYP1A2 (Wijnen y
cols., 2002). Sin embargo, son varios los factores que afectan la actividad enzimática
de los CYP, incluyendo polimorfismos genéticos, edad, género, enfermedades y
exposición a compuestos químicos contaminantes ambientales (Quiñones y cols.,
2006).
Los polimorfismos del sistema citocromo P450 pueden incluir variantes que
conducen a ausencia de la enzima, disminución o aumento de sus niveles o una
especificidad alterada. En base a la composición de los alelos, los individuos pueden
dividirse en cuatro grandes grupos: metabolizadores pobres (MP) que presentan dos
alelos no funcionales o un alelo no funcional y otro delecionado; metabolizadores
intermedios (MI), que son individuos con dos alelos con actividad catalítica deficiente o
un alelo funcional y otro nulo; metabolizadores silvestres o extensivos (ME), que
presentan dos copias del alelo silvestre o un alelo deficiente y otro funcional; y
metabolizadores ultrarrápidos (MU), que tienen tres o más copias de alelos activos
(Figura 2) (Higgins y cols., 2010; Rodriguez-Antona & Ingelman-Sundberg, 2006; Xie y
cols., 2005).
CYP2D6
Entre los años 1997 y 1979, Mahgoub y Eichelbaum descubrieron de manera
independiente que el metabolismo de la debrisoquina y la esparteína tenía naturaleza
polimórfica; después se demostró que ambos fármacos eran metabolizados por la
misma enzima, CYP2D6. El gen CYP2D6 se ubica en el cromosoma 22q13.1 y abarca
nueve exones y ocho intrones, con un marco de lectura abierto de 1383 pares de
bases que codifica 461 aminoácidos. En la Figura 3 se muestra que CYP2D6
pertenece a una agrupación génica que abarca cerca de 45 kb junto a los seudogenes
CYP2D7 y CYP2D8, con una identidad del 97% y 92%, respectivamente.
El gen CYP2D8 contiene varias inserciones que interrumpen el gen, deleciones y
codones de término dentro de exones, por lo cual es considerado un seudogen. Sin
embargo, el gen CYP2D7 (ubicado entre CYP2D8 y CYP2D6) tiene una estructura
similar al gen funcional CYP2D6, excepto por una inserción nucleotídica en el primer
exón (T138) que provoca un cambio en el marco de lectura y término prematuro de la
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Genotipo
Fenotipo
MU
o
o
o
ME
MI
MP
65-68%
10-15%
5-10%
Nortriptilina
Frecuencia
en la
población
Caucásica
5-10%
Figura 2
Medicina personalizada: del genotipo al fenotipo
Se muestran las diferentes dosis de nortriptilina que se deben administrar a pacientes
luego de realizar la determinación de su genotipo, la relación genotipo-fenotipo, su
farmacocinética y las consecuencias clínicas. Los alelos funcionales de CYP2D6 son
ilustrados en barras de color burdeo, los alelos deficientes (*9, *10, *17, *41) de color
naranja, los alelos no funcionales (*3, *4, *6) de color amarillo y la deleción del gen
completo (*5) con una línea segmentada. Adaptado de Frueh y colaboradores (2005);
Zanger y colaboradores (2003). MU: Metabolizador ultrarrápido; ME: Metabolizador
extensivo; MI: Metabolizador intermedio y MP: Metabolizador pobre.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A)
CYP2D8
CYP2D7
CYP2D6
B)
G31A
C100T
C1023T
C1039T
G1659A G1846A
C2850T
G1661C 1863bp rpt
A2953C
1707del
G1758A
2549del
G1758T
2613AGA del
G4042A
G4180C
Figura 3
Ubicación génica del gen CYP2D6
A) CYP2D6 (rectángulo amarillo) y sus polimorfismos más comunes se ubican en una
agrupación génica (rectángulo amarillo) junto a los seudogenes CYP2D8 y CYP2D7
(rectángulos burdeo y verde, respectivamente). B) Representación de los 9 exones
de CYP2D6 (cuadrados amarillos) y sus polimorfismos más comunes. Adaptado de
Koch y colaboradores (2004).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
traducción. Se cree que las conversiones génicas y entrecruzamientos desiguales
dentro de esta familia de genes repetidos en tándem podrían explicar el alto grado de
polimorfismos del sistema citocromo P450 en humanos (Cascorbi, 2005; Panserat y
cols., 1995; Zanger y cols., 2004).
Desde que se descubrieron los polimorfismos de CYP2D6, se ha demostrado que
cerca de 100 medicamentos son sustratos de esta enzima (Pirmohamed y cols., 2003).
La enzima CYP2D6 metaboliza principalmente fármacos antidepresivos, neurolépticos,
β-bloqueadores y antiarrítmicos (Linder y cols., 1997), los que actúan tanto a nivel del
sistema nervioso central como a nivel circulatorio (Tabla 1). Además, presentan una
gran variabilidad en su actividad catalítica entre individuos, principalmente debido a los
polimorfismos genéticos. Hasta la fecha se han encontrado más de 82 variantes
alélicas de CYP2D6 y cerca de 20 SNPs sin haplotipos determinados a la fecha
(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).
En relación al alelo silvestre de CYP2D6, los perfiles catalíticos de las variantes
polimórficas pueden resultar en una ausencia completa de la actividad enzimática,
actividad reducida, actividad normal o incluso un incremento de la actividad (Zhou y
cols., 2008). Los cocientes metabólicos para CYP2D6 están distribuidos de manera
bimodal en las poblaciones caucásicas, existiendo individuos con una actividad
deficiente (MP) y otros con una elevada actividad enzimática (MU) (IngelmanSundberg, 2005). Fenotípicamente, existe una gran variabilidad en la capacidad de
metabolización de CYP2D6 que se puede explicar por los polimorfismos del gen, ya
que los cocientes metabólicos de un individuo son estables en el tiempo, indicando una
influencia limitada de los factores medioambientales o fisiológicos en la actividad de
esta enzima, a diferencia de CYP3A4 que presenta una importante influencia de los
factores ambientales (Baker y cols., 2004; Eichelbaum y cols., 2001).
El CYP2D6 es una de las isoenzimas CYP más estudiadas, aunque se expresa a
niveles más bajos comparados con otras enzimas citocromo P450 humanas. Es una de
las enzimas más importantes considerando el número de rutas metabólicas de
medicamentos y xenobióticos que cataliza. Se estima que entre 20 y 25% de los
medicamentos usados clínicamente por humanos, entre los cuales algunos poseen un
rango terapéutico muy estrecho lo cual dificulta el tratamiento, son metabolizados por
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 1
Sustratos, inhibidores e inductores de CYP2D6
Se indican los sustratos más comunes de CYP2D6, principalmente de uso siquiátrico,
además de los inhibidores más potentes. Aún no se han encontrado inductores de la
enzima. Adaptado de Linder y colaboradores (1997); Lynch y colaboradores (2007).
Sustratos
Antiarrítmicos Antidepresivos Beta-bloqueadores Neurolépticos Misceláneos
Amiodarona
Encainida
Flecainida
Mexiletina
Propafenona
Esparteína
Imipramina
Desipramina
Amitriptilina
Nortriptilina
Clomipramina
Propranolol
Timolol
Bufuralol
Metroprolol
Perfenazina
Tioridazina
Codeína
Debrisoquina
Anfetamina
Indoramina
Fenformina
Inhibidores potentes
Inductores potentes
Amiodarona
Cimetidina
Difenhidramina
Fluoxetina
Paroxetina
Quidina
Ritonavir
Terbinafina
No existen inductores
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
esta enzima (Mejerman y cols., 2007; Zanger y cols., 2004; Zhou y cols., 2008). Para
muchos fármacos, especialmente los sicotrópicos, se considera que el CYP2D6 tiene
una capacidad enzimática de alta afinidad/ baja concentración, lo cual implica que
metaboliza fármacos preferentemente a bajas concentraciones (Wijnen y cols., 2007).
Muchos casos médicos y estudios clínicos han demostrado que algunas de estas
oxidaciones polimórficas tienen consecuencias terapéuticas, haciendo que ciertos
individuos sean muy propensos a desarrollar efectos adversos a dosis convencionales
y a presentar efectos terapéuticos disminuidos de ciertos medicamentos.
Implicancias clínicas de polimorfismos en CYP2D6
Los medicamentos más afectados por los polimorfismos de CYP2D6 son
comúnmente aquellos en los cuales esta enzima representa una ruta metabólica
fundamental, ya sea en la activación o eliminación del medicamento (Zhou y cols.,
2008).
Los polimorfismos están usualmente relacionados con una variación en la actividad
enzimática: cuando se encuentra reducida puede producir un aumento de la
concentración plasmática del medicamento administrado que no ha sido observado
previamente en la población con genotipo silvestre (codifica una enzima con función
normal) y, por el contrario, aquellos pacientes con polimorfismos asociados a un
aumento de la actividad enzimática podrían tener una respuesta menor si son tratados
con un fármaco que es sustrato de esta enzima, es decir, tendrían una concentración
plasmática menor comparada con la de individuos que tienen la enzima silvestre.
Se estima que entre 15 y 20% de las fallas en los tratamientos farmacológicos se
deben a polimorfismos de las enzimas del sistema citocromo P450 (Ingelman y cols.,
2005). Un ejemplo de la importancia clínica de estos polimorfismos lo constituye el uso
del antidepresivo tricíclico nortriptilina cuya degradación depende del CYP2D6: los
metabolizadores pobres (MP) necesitan 30 a 50 mg comparados con los
metabolizadores ultrarrápidos (MU) que requieren 500 mg para obtener los mismos
niveles plasmáticos; por lo tanto la dosis estándar de 150 mg no es apropiada para los
grupos de MP y MU (Ingelman-Sundberg, 2007).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Otro ejemplo relevante es el fármaco tamoxifeno, el cual es activado por el sistema
CYP a metabolitos antiestrogénicos que son más potentes que el compuesto original.
Los metabolitos claves del tamoxifeno son el 4-hidroxitamoxifeno y el endoxifeno,
formados principalmente por el CYP2D6, y el N-desmetiltamoxifeno, formado
principalmente por el CYP3A4 (Figura 4).
En pacientes tratados con tamoxifeno, los compuestos más abundantes en el
plasma son el N-desmetiltamoxifeno y el endoxifeno. Se ha demostrado que el
endoxifeno presenta una afinidad aproximadamente 100 veces mayor por el receptor
de estrógeno que el tamoxifeno y el N-desmetiltamoxifeno. Debido a que el endoxifeno
es formado principalmente por el CYP2D6, pacientes con alelos deficientes de
CYP2D6 podrían obtener menores beneficios de una terapia de tamoxifeno que
aquellos que tienen alelos funcionales. Los MP podrían desarrollar los efectos
adversos a la exposición a tamoxifeno que incluye trombosis y cáncer endometrial
(Rodriguez-Antona & Ingelman-Sundberg, 2006; Scripture & Figg, 2006; Zhou y cols.,
2008).
Variantes polimórficas del CYP2D6
Los polimorfismos del CYP2D6 identificados en el genoma humano presentan
grandes diferencias en sus frecuencias alélicas según la población (IngelmanSundberg, 2007). En la población caucásica los metabolizadores ultrarrápidos pueden
presentar duplicaciones y multiplicaciones del gen y sus variantes y están presentes en
un 7% de la población. En cambio, los metabolizadores pobres presentan mutaciones
en una sola base (*4,*6 y *10), deleciones parciales (*3) o deleciones totales (*5) y
tienen gran importancia clínica, puesto que 7-10% de esta población presenta alelos no
funcionales (Ingelman-Sundberg, 2007; Steijns y cols., 1998). En Hispanoamérica, la
frecuencia de la población MP es de 6,6% en colombianos, 3,2% en mexicanos, entre
2,2% y 4,4% en panameños y 3,6% en nicaragüenses. Según la literatura encontrada,
el fenotipo de la población chilena debería ser similar a la población caucásica, debido
a la migración española a estas tierras (Tabla 2) (Bernard y cols., 2006).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Figura 4
Metabolismo del tamoxifeno
Se indican las reacciones que conforman las rutas de biotranformación del tamoxifeno y
las principales enzimas del sistema citocromo P450 involucradas. Adaptado de Higgins
y colaboradores (2010). TAM: Tamoxifeno.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 2
Variables alélicas de CYP2D6
Alelos más comunes de CYP2D6 encontrados en la población española, alteración
génica más relevante, función enzimática, frecuencia alélica y número rs. Secuencia de
referencia
(rs)
y
función*
enzimática
(http://www.snpedia.com/index.php/CYP2D6).
designada
Actividad
medida
en
en
SNPedia
relación
a
debrisoquina, esparteína y dextrometorfán.
Alelo
Mayor alteración génica
Función*
Frecuencia (%) Número rs
*1
Silvestre
Actividad normal
31,00
rs16947
*2
C2850T
Actividad normal
40,50
rs1135840
*3
A2549del
Enzima inactiva
0,95
rs35742686
*4
G1846A
Enzima inactiva
13,80
rs3892097
*5
Deleción génica
No hay enzima
3,33
-----------
*6
T1707del
Enzima inactiva
0,95
rs5030655
*10
C100T
Actividad disminuida
1,90
rs1065852
*1xN
Duplicación génica
Actividad elevada
1,90
-----------
*2xN
Duplicación génica
Actividad elevada
1,90
-----------
*4xN
Duplicación génica
Enzima inactiva
0,47
-----------
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Uno de los polimorfismos más ampliamente estudiados es el del CYP2D6*2
(G2850T) (rs1135840), que es considerado un alelo funcional cuya actividad
enzimática es 20% menor con respecto a individuos que poseen el genotipo silvestre
CYP2D6*1 (Figura 5A) (Sachse y cols., 1997). Se ha visto que tiene una alta
incidencia en nuestro país, con una frecuencia alélica de 37,7% (Pinto, 2009). El
CYP2D6*2 representa un fenotipo ME en el caso de encontrarse en ambos alelos, sin
embargo, podría presentar un fenotipo MI si se encuentra como heterocigoto junto con
alelos no funcionales (*3, *4 y *5). En 1993, se descubrió una familia suiza en la cual
tanto el padre como sus hijos presentaban 12 copias adicionales del alelo CYP2D6*2;
estos sujetos eran MU con una razón metabólica de 0,01-0,02, por ende, la duplicación
del gen CYP2D6*2 está asociada a una actividad enzimática extremadamente alta al
igual que la duplicación o multiplicación del gen CYP2D6*1 (rs16947) (Neafsey y cols.,
2009; Pirmohamed y cols., 2003).
La duplicación o multiplicación del gen CYP2D6*1 (rs16947) también ha sido
detectada en la población caucásica con una frecuencia de 7% en individuos que
tienen una capacidad metabólica elevada (Lovlie y cols., 1996). Los individuos que
portan esta variante tanto en su forma homocigota como heterocigota son
considerados MU, ya que en ellos se observan bajas concentraciones plasmáticas de
ciertos medicamentos (Figura 5C) (Meijerman y cols., 2007).
Se postula que el análisis de tres polimorfismos de CYP2D6 (que definen los alelos
*3, *4 y *5) puede predecir entre el 93 y 97 % de los fenotipos metabolizadores pobres
en la población caucásica, donde la frecuencia de éstos fluctúa entre 5 y 10% (Zhou y
cols., 2008; Hersberger y cols., 2000; Steiner y cols., 1988). Los alelos *3 y *4 son los
más comunes (Meijerman y cols., 2007), pero CYP2D6*4 (G1846A) (rs3892097) fue el
primer alelo defectuoso descubierto en el locus CYP2D en 1990 (Cascorbi, 2003) y es
la variante polimórfica más común. Se encuentra con una frecuencia de 20-25% en
estas poblaciones y es responsable del 70-90% de todos los MP (Figura 5B). Se debe
a una transición G1846A que genera un cambio en el lugar de corte y empalme entre el
intrón 3 y el exón 4, generando una proteína inactiva. CYP2D6*4 es un alelo no
funcional de CYP2D6, al encontrarse en su forma homocigota determina un fenotipo
MP; lo mismo ocurre si se encuentra de manera heterocigota junto con otros alelos no
funcionales, como por ejemplo CYP2D6*3.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
El segundo alelo más común entre los MP es CYP2D6*3 (rs35742686). Se
caracteriza por la deleción de un nucleótido (A2549del) en el exón 5 del gen, que lleva
a un cambio en el marco de lectura y a obtener una enzima inactiva (Figura 5B)
(Nagata y cols., 2002). En su forma homocigota determina un fenotipo MP, al igual que
CYP2D6*4.
Las primeras frecuencias alélicas de CYP2D6 descritas en la población chilena
fueron determinadas por Pinto y colaboradores (2009), quienes realizaron una
comparación entre poblaciones de diferente estrato socioeconómico, estudiando las
frecuencias alélicas de las variantes polimórficas CYP2D6*1, *2, *4, *5, *9, *10 y *1xN
en 120 individuos de la Clínica Las Condes (estrato socioeconómico alto) y 120
individuos del Hospital San José (estrato socioeconómico bajo). Entre los resultados de
esta investigación solamente se encontraron diferencias significativas entre las
frecuencias alélicas para la variante CYP2D6*2 (C2850T) (CLC: 43,3%; HSJ: 32,1%).
Sin perjuicio de lo anterior, los resultados globales de las frecuencias encontradas para
las variantes alélicas CYP2D6*4 (G1846A) (CLC: 12,5%; HSJ: 10%) y CYP2D6*1xN
(CLC: 2,08%; HSJ: 2,08%) se utilizaron como referencia para este trabajo de tesis.
Actividad debrisoquina 4-hidroxilasa
El genotipo CYP2D6 ha sido asociado a la variabilidad interindividual en la actividad
de su enzima in vivo, la cual ha sido evaluada sobre la base de la razón metabólica
urinaria (RM: compuesto original/ metabolito en orina) de marcadores metabólicos. Se
han utilizado la esparteína, la debrisoquina, el metroprolol y el dextrometorfán para
determinar la actividad catalítica del CYP2D6 in vivo, sin embargo, la debrisoquina ha
sido el compuesto más utilizado, debido a que es capaz de discriminar los fenotipos
ME de los MI y los MU (Eiermann y cols., 1998; Frank y cols., 2007; Neafsey y cols.,
2009; Zhen y cols., 2006).
La debrisoquina es un agente antihipertensivo metabolizado principalmente por el
CYP2D6 a 4-hidroxidebrisoquina; también se generan los metabolitos 3-OH
debrisoquina y 1-OH debrisoquina, aunque en una baja proporción (Figura 6). La razón
metabólica (RM) de debrisoquina/4-hidroxidebrisoquina en muestras de orinas de 0-8
horas permite obtener los fenotipos metabólicos de los individuos (ME, MI, MP y MU).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Cromosoma 22q13.3
CYP2D8
CYP2D6
CYP2D7
A) Alelos con función normal:
*1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7
8
9
C2850T
*2
1
2
3
4
B) Alelos no funcionales:
5
6
A2549del
*3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5
6
7
8
9
G1846A
*4
1
2
3
4
C) Alelos con incremento de función:
*1xN
CYP2D8
CYP2D7
CYP2D6
CYP2D6
N-1
Figura 5
Estructura alélica funcional y no funcional de CYP2D6
Se indican los 9 exones de CYP2D6 y la denominación de los polimorfismos más
comunes al inicio de cada diagrama. A) Alelos con función normal (extensiva):
corresponden al alelo silvestre CYP2D6*1 y al alelo CYP2D6*2, para el cual se indica
la mutación C2850T. B) Alelos no funcionales: CYP2D6*3 y *4, y sus respectivas
mutaciones, A2549del y G1846A. C) Alelos con actividad incrementada: corresponden
a la duplicación y multiplicación génicas del alelo silvestre CYP2D6*1. Adaptado de
Zanger y colaboradores (2004).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
El fármaco antihipertensivo debrisoquina ya no es de uso clínico debido a su bajo
potencial terapéutico, pero es comercializada para su utilización en investigación como
marcador metabólico de la actividad del CYP2D6. La debrisoquina es metabolizada
también por el CYP1A1, enzima metabólica que se expresa en el hígado, aunque se ha
demostrado que sus niveles hepáticos son menores a los del CYP2D6. El CYP1A1
puede contribuir a la metabolización de la debrisoquina in vivo, pero su rol es limitado y
se estima una contribución relativa no mayor al 2% (Zanger y cols., 2004).
Figura 6
Ruta de transformación de la debrisoquina mediada por la enzima CYP2D6
La 4-OH debrisoquina es el metabolito más abundante de la hidroxilación de la
debrisoquina mediada por la enzima CYP2D6, mientras que los metabolitos 3-OH
debrisoquina y 1-OH debrisoquina se producen en una baja proporción. Adaptado de
Eiermann y colaboradores (1998).
19
19
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
2.
Hipótesis
―Los polimorfismos genéticos del citocromo P450 2D6 (CYP2D6) afectan su
actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa, por lo que constituyen la base de un
estudio molecular para determinar perfiles genéticos en la población chilena que
sirven como herramienta diagnóstica de individuos metabolizadores extensivos (ME),
metabolizadores intermedios (MI), metabolizadores pobres (MP) y metabolizadores
ultrarrápidos (MU) de la debrisoquina.‖
20
20
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
3.
Objetivos
3.1.
Objetivo general
Estudiar la presencia de las variantes genéticas *2 (C2850T), *3 (A2549del), *4
(G1846A) y *1xN (duplicación del gen CYP2D6), en voluntarios sanos de la población
chilena, para identificar los perfiles genéticos más relevantes en relación a la
actividad catalítica del citocromo CYP2D6, y validar la genotipificación de estas
variantes como descriptores del metabolismo de los fármacos metabolizados por la
enzima.
3.2.
Objetivos específicos
1. Implementar métodos de detección de las variantes de CYP2D6*2, *3, *4 y *1xN
basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
2. Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos de CYP2D6
en un grupo de 156 individuos sanos (mujeres y hombres) de la población chilena.
3. Implementar la determinación de la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa
del CYP2D6, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con
detector de fluorescencia.
4. Determinar la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo, en subgrupos
de individuos con diferentes genotipos y comparar la de individuos de genotipo
silvestre con la de portadores de los polimorfismos estudiados (*2, *3, *4 y *1xN).
5. Relacionar mediante métodos estadísticos apropiados, las diferentes variantes
polimórficas del CYP2D6 y su actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa.
21
21
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.
Materiales y metodología
4.1. Materiales
Para la extracción de sangre periférica se utilizaron tubos con EDTA como
anticoagulante (BD vacutainer, EE.UU.). La determinación de grupos sanguíneos se
realizó con un sistema comercial (BioClone, ABO Pharmaceuticals, Mission Viejo, CA,
EE.UU.). Para la purificación del DNA se utilizó un sistema comercial de purificación de
DNA genómico de sangre periférica (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania).
Para las PCRs se utilizaron partidores específicos indicados en la Tabla 3
(sintetizados por Invitrogen, Brasil), H2O DPC (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), dNTPs
(mezcla de dATP, dTTP, dGTP y dCTP) (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), DNA
polimerasa Taq recombinante (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil) con tampón de reacción
10X (Tris-HCl 200 mM (pH 8), KCl 500 mM), MgCl2 500 mM y BIO-X-ACT Long DNA
Polymerase (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) con su tampón de reacción 10X OptiBuffer
(Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM, glicerol 50%) y
MgCl2 1 mM.
En el estudio de la PCR-RFLP se utilizaron las enzimas de restricción HhaI, MvaI y
MspI (Genesys, Chile). Para la visualización de los fragmentos de restricción se
utilizaron los marcadores de peso molecular de 100-1000 pb Hyperladder IV y de 100010000 pb MassRuler High Range (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) en geles de agarosa
y poliacrilamida (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) con bromuro de etidio (Invitrogen, Sao
Paulo, Brasil). Para la electroforesis en geles de agarosa se utilizó el tampón Trisborato (TBE) 1X (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 0,5 M pH 8 y para la
electroforesis vertical se utilizó gel de poliacrilamida (30%), Tris 1,5 M pH 8, persulfato
de amonio (Winkler, Santiago, Chile) y TEMED (Merck, Darmstadt, Alemania). Como
tampón se usó Tris 25 mM (Winkler, Santiago, Chile) – glicina 192 mM pH 8 (Winkler,
Santiago, Chile).
Para los análisis cromatográficos se utilizaron tubos con heparina (BD vacutainer,
EE.UU.). El marcador metabólico Declinax (Hoffman-La Roche, Basel, Suiza) fue
gentilmente donado por el Dr. José García-Agúndez (Universidad de Extremadura,
España). Se usaron los reactivos diclorometano, cloruro de sodio, hidróxido de sodio
(grado p.a.) y acetonitrilo (grado HPLC) de Merck (Darmstadt, Alemania).
22
22
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 3
Oligonucleótidos
Se indican las secuencias (5’-3’) de los oligonucleótidos utilizados en las técnicas
moleculares para la identificación de los polimorfismos C2850T, A2549del, G1846A y la
duplicación o multiplicación génica de CYP2D6*1.
Polimorfismo
Directo
Inverso
C2850T
(RFLP)
GCT GGG GCC TGA GAC TT
GGC TAT CAC CAG GTG CTG GTG CT
A2549del
(RFLP)
GAT GAG CTG CTA ACT GAG CCC CCG AGA GCA TAC TCG GGA C
A2549del
(PCR-AS)
CGG GAG CGA GAG ACC GAG GA CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT
GCT AAC TGA GCA CA
GCT AAC TGA GCA CG
G1846A
(RFLP)
GCC TTC GCC AAC CAC TCC G
AAA TCC TGC TCT TCC GAG GC
ATT TCC CAG CTG GAA TCC
GAG ACT CCT CGG TCT CTC
G1846A
(PCR-AS)
CGA AAG GGG CGT CC
CGA AAG GGG CGT CT
CYP2D6*1xN
(PCRL)
TCC CCC ACT GAC CCA ACT CT
CAC GTG CAG GGC ACC TAG AT
23
23
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.2.
Metodología
4.2.1. Determinación del tamaño muestral
La determinación del tamaño muestral para obtener resultados estadísticamente
significativos, de modo que permita realizar una comparación entre los fenotipos
metabólicos, se realizó considerando un tamaño que permitiera a lo menos encontrar
individuos con la variable CYP2D6*4 (G1846A), teniendo en cuenta que las otras
variables, al ser más escasas, serían difíciles de encontrar. El cálculo se realizó a
través del programa estadístico n Query Advisor 4.0, para lo cual se consideró un α de
5%, una potencia de 80%, frecuencia del gen de 11% (Pinto, 2009) y la razón de
tamaño de muestra de 1:3. El tamaño de muestra obtenido fue de un total de 156
voluntarios.
4.2.2. Reclutamiento de voluntarios sanos
Los voluntarios sanos se reclutaron a través del sitio web del Centro de
Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas (IFT), se les informó sobre el estudio y
firmaron un documento de consentimiento informado (Anexos 1 y 2). Este estudio
contó con la aprobación del ―Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la
Facultad de Medicina de la Universidad de Chile‖ (Anexo 3) y los procedimientos se
realizaron bajo la ―Guía de Buenas Prácticas Clínicas‖ (BPC).
4.2.3. Análisis de las muestras según grupo sanguíneo (ABO)
Las muestras se obtuvieron en la sala de toma de muestras del Laboratorio IFT por
un Tecnólogo Médico del laboratorio, se tipificaron para el sistema de grupo sanguíneo
ABO y los datos se utilizaron para la determinación del porcentaje de mezcla
amerindio-caucásico según el método de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). La
elección se fundamenta en que el sistema de grupo sanguíneo ABO presenta
frecuencias contrastantes entre las poblaciones que dieron origen a la población
chilena. Se ha descrito en la literatura que las poblaciones amerindias carecían de los
alelos ABO*A y ABO*B antes del contacto con los conquistadores, los cuales
ingresaron desde Europa al territorio americano, mezclándose con la población
amerindia que principalmente tenía el alelo ABO*O (Valenzuela y cols., 1987; CavalliSforza, 1981).
24
24
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.2.4. Extracción y purificación de DNA
Se extrajo de cada voluntario sano una muestra de sangre venosa periférica de 10
mL
en
tubos
vaccutainer
con EDTA
(ácido
etilendiaminotetraacético ) como
anticoagulante y se aislaron los leucocitos mediante el método adaptado de Miller y
colaboradores (1988) o utilizando un sistema comercial de purificación de DNA
genómico de sangre periférica High Pure PCR Template Preparation Kit, en una
campana de extracción ESCO BSC – II (ESCO, Hatboro, PA, EE.UU.). El DNA
obtenido se almacenó a -20°C y se cuantificó midiendo su concentración por densidad
óptica a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1603 (Shimadzu,
Columbia,
MD,
EE.UU.).
La
concentración final
ideal
de
DNA
debía
ser
aproximadamente de 0,3 µg/µL para el análisis genotípico de los polimorfismos
propuestos en el estudio.
4.3.
Análisis genotípico
4.3.1. Identificación del alelo CYP2D6*2 (C2850T) mediante una PCRRFLP
Se utilizó el método descrito por Naveen y colaboradores (2006), con
modificaciones, el que se basa en amplificar la región que contiene la transición
2850C>T responsable del cambio aminoacídico de una treonina a una serina, y luego
digerir con la enzima de restricción HhaI el amplicón obtenido, pues contiene un sitio
de corte polimórfico y tres sitios de corte constitutivo para ellas (Figura 7A).
La PCR se llevó a cabo en un termociclador Corbett CG1-96 (Corbett Research,
Cambridge, UK) utilizando el partidor directo 2F (5’-GCTGGGGCCTGAGACTT-3’) y el
partidor inverso 2R (5’-GGCTATCACCAGGTGCTGGTGCT-3’). La reacción se realizó
en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,8 µM de cada partidor, 0,2 mM de dNTPs, 2 U de DNA
polimerasa Taq en Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM y MgCl2 2 mM.
El protocolo del termociclador constó de un paso inicial a 94ºC durante 90 segundos
seguido por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC
durante 60 segundos, apareamiento a 63ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC
25
25
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
CYP2D6
1
2
3
4
6
5
A)
7
8
9
2F
PCR
2R
1029 pb
B)
wt/wt
*2/*2
C2850T
Enzima de
restricción HhaI
414
372
111
41
5'...G C G^C...3'
3'...C^G C G...5'
91
111
41
41
786
41
wt/*2
111
786
Exón
91
Intrón
414
DNA amplificado
91
41
372
Partidor
Figura 7
Esquema de corte del producto de la PCR con la enzima HhaI para la detección
de C2850T (asociada al alelo CYP2D6*2)
A) Amplificación mediante la PCR de un segmento nucleotídico del exón 6 del gen
CYP2D6. B) Digestión del amplicón de 1029 pb utilizando la enzima de digestión HhaI.
Las líneas gruesas indican los fragmentos en los sitios de corte específicos para
detectar la mutación que determina CYP2D6*2 (C2850T) y las líneas delgadas indican
fragmentos generados en los sitios de corte constitutivos.
26
26
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
durante 40 segundos. Por último se completó la reacción con 72ºC durante 5 minutos.
Se observó el producto de la PCR mediante una electroforesis horizontal en un gel de
agarosa al 1,2 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso
molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó
utilizando una fuente de poder Bio-Rad Power PacTM HC (Bio-Rad, Hercules, CA,
EE.UU.) a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV
un amplicón de 1029 pb.
Posteriormente, el amplicón se sometió a digestión en una placa termorreguladora
Major Science MD – 01N (Major Science, Saratoga, CA, EE.UU.) durante 2 horas con
la enzima HhaI a 37°C y el tampón Tango 1X (Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de
magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a
cabo en 18 μL, usando 10 μL de producto de la PCR, 10 U de enzima HhaI, en 1 μL de
tampón Tango y 6 μL de agua. Los productos de la digestión se separaron mediante
una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1,5 % con bromuro de etidio.
Los patrones de corte, visualizados en un transluminador UV (Vilbert-Loumart,
Deutschland, Alemania), son: para el genotipo homocigoto wild type (wt/wt) se obtiene
un patrón de restricción bandas de 414, 372, 111, 91 y 41 pb; para el genotipo
heterocigoto (wt/*2), bandas de 786, 414, 372, 111, 91 y 41 pb, y para el genotipo
homocigoto mutado (*2/*2), bandas de 786, 111, 91 y 41 pb (Figura 7B). Los tres sitios
de corte constitutivos funcionan como controles internos de corte de la enzima HhaI,
asegurando la identificación correcta del genotipo (111, 91 y 41 pb).
4.3.2. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una PCR
alelo específica semianidada
La mutación puntual que define al alelo CYP2D6*3 es la deleción de un nucleótido
(A2549del) en el exón 5 que genera un cambio en el marco de lectura y, por lo tanto,
una enzima inactiva. Para la detección de este polimorfismo se utilizó la PCR alelo
específica semianidada según la técnica propuesta por Heim y colaboradores (1991)
modificada.
27
27
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Se realizó una primera reacción de la PCR denominada reacción A, en la que se
utilizó el partidor DB3 (5’-GCGGAGCGAGAGACCGAGGA-3’) que se ancla en el intrón
4,
desde
la
posición
2098
a
la
2117,
y
el
partidor
DB4
(5’-
CCGGCCCTGACACTCCTTCT-3’) que se ancla en el intrón 6, desde la posición 3200
a la 3181. El amplicón A es de 1123 pb y contiene al exón 5, en el que se encuentra el
polimorfismo en estudio (Figura 8A).
La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 5µL de DNA, 2 U de DNA
polimerasa Taq, Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 3 mM; MgCl2 2 mM; dNTPs 0,2 mM y 1
µM de cada partidor. Para el control negativo se reemplazó el molde por agua tratada
con dietil-pirocarbonato (DEPC).
Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C
durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60 segundos,
apareamiento a 69°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 90 segundos.
La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El resultado de la
amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2 % teñido
con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb
Hyperladder IV. La electroforesis se realizó a 300 volts durante 45 minutos en tampón
Tris-borato TBE 1X, observándose a la luz UV un amplicón de 739 pb.
La mutación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) se detectó llevando a cabo dos PCRs
semianidadas independientes a partir del amplicón A (Figura 8B). En una primera
reacción el producto A se amplificó usando DB4 y el partidor específico silvestre DB5
(5’-GCTAACTGAGCACA-3’). La segunda reacción se desarrolló en paralelo para
detectar la mutación en la posición 2549, amplificando el producto A con el partidor
DB4 junto con el partidor específico de la mutación DB6 (5’-GCTAACTGAGCACG-3’).
El partidor DB4 es constante, mientras que DB5 y DB6 son los partidores específicos.
Las PCRs se llevaron a cabo en un volumen de 25 µL usando: 1 µL del amplicón A,
Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM, 1 µM de cada
partidor y 2 U de DNA polimerasa Taq. Para el control negativo se reemplazó el molde
por agua.
28
28
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5’
CYP2D8
CYP2D7
1
2
3
4
Reacción A
A)
3’
CYP2D6
5
6
DB3
Fragmento A
1123 pb
7
8
9
DB4
5
6
DB5
DB4
DB6
B)
WT
*3
(DB4 +DB5)
(DB4 +DB6)
563 pb
Exón
Intrón
DNA amplificado
Partidor
Figura 8
Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada para la detección del
polimorfismo A2549del (asociado al alelo CYP2D6*3)
A) Representación de la amplificación de fragmentos específicos de CYP2D6 a través
de la PCR semianidada (Fragmentos A). B) Reacciones de la PCR alelo específica
utilizada para detectar la mutación A2549del.
29
29
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C
durante 90 segundos, seguido de 15 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60
segundos, apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 60
segundos. La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 5 minutos. El
resultado de la amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,2 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 1001000 pb Hyperladder IV y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a
300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un
amplicón de 563 pb.
De acuerdo al resultado de las amplificaciones se pueden obtener las siguientes
conclusiones: en el caso de que solo amplifique DB4-DB5 corresponde a un individuo
con genotipo homocigoto silvestre (*1/*1); si amplifican ambos juegos de partidores
(DB4-DB5 y DB4-DB6) se trata de un genotipo heterocigoto (*1/*3), mientras que si
solo amplifica el par de partidores específicos para la mutación (DB4-DB6)
corresponde a un homocigoto del polimorfismo (*3/*3) (Figura 8B).
4.3.3. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una
PCR-RFLP
Para confirmar los genotipos de CYP2D6*3 (A2549del) obtenidos a través de la
PCR alelo específica semianidada, se utilizó el método descrito por Schur y
colaboradores (2001). La amplificación mediante una PCR convencional de una
secuencia nucleotídica del exón 5 del gen CYP2D6, permite detectar la deleción de
una adenina en la posición 2549 del exón 5, cortando el amplicón con la enzima de
restricción MspI (Figura 9A).
La
PCR
se
llevó
a
cabo
utilizando
el
partidor
directo
3F
(5’-
GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3’) inverso 3R (5’-CCGAGAGCATACTCGGGAC-3’).
La reacción se realizó en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,6 µM de cada partidor, 0,2 mM de
dNTPs, 2 U de DNA polimerasa Taq en Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM y MgCl2 2
mM.
30
30
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5’
1
3’
CYP2D6
2
3
5
4
6
7
8
9
A)
3F
PCR
3R
270 pb
wt/wt
*3/*3
B)
2549del
A
188
82
168
20
82
Enzima de
restricción MspI
wt/*3
5'...C^CG G...3'
3'...G GC^C...5'
188
Exón
Intrón
168
20
DNA amplificado
82
Partidor
Figura 9
Digestión con la enzima MspI del producto de la PCR para la detección del
polimorfismo A2549del
A) Amplificación por la PCR de un segmento nucleotídico del exón 5 del gen CYP2D6.
B) Digestión del amplicón de 270 pb utilizando la enzima de digestión MspI, para la
detección de A2549del. Las líneas gruesas indican los fragmentos en los sitios de corte
específicos para detectar la mutación de CYP2D6*3 (A2549del) y las líneas delgadas
indican fragmentos generados en los sitios de corte constitutivos.
31
31
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
El protocolo del termociclador constó de un paso inicial a 94ºC durante 5 minutos
seguido por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC
durante 60 segundos, apareamiento a 60ºC durante 30 segundos y de extensión a
72ºC durante 90 segundos. Por último, se completó la reacción con una etapa de
extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Se observó el producto de la PCR mediante
una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio,
utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la
reacción. La electroforesis se realizó a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE
1X, observándose a la luz UV un amplicón de 270 pb.
Posteriormente, el amplicón se sometió a digestión durante 2 horas con la enzima
MspI a 37°C y su tampón Tango 1X (Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de magnesio
10 mM, acetato de potasio 66 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a cabo en
18 µL, usando 5 µL del producto de la PCR, 10 U de enzima MspI, en 1 µL de tampón
Tango y 6 µL de agua. El patrón de bandeo se observó mediante una electroforesis
vertical en un gel de poliacrilamida al 16 %.
Para los individuos homocigotos para el genotipo silvestre (wt/wt) se obtuvieron dos
segmentos de 188 y 82 pb; para los homocigotos del polimorfismo (*3/*3), tres
fragmentos de 168, 82 y 20 pb; para el genotipo heterocigoto (wt/*3) se obtuvieron 4
fragmentos de 188, 168, 82 y 20 pb (Figura 9B). El corte realizado por la enzima de
restricción en el sitio de corte constitutivo (82 pb) funcionó como un control interno de
la digestión en todos los genotipos, en cambio, el corte del fragmento de 188 pb que da
bandas de 168 y 20 pb, se origina debido a la deleción de una adenina.
4.3.4. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCR
semianidada alelo específica
En la primera reacción de la PCR denominada B se utilizaron el partidor DB1 (5’ATTTCCCAGCTGGAATCC-3’) que se ancla en el intrón 2, desde la posición 1385 a la
1402, y el partidor DB2 (5’-GAGACTCCTCGGTCTCTC-3’) que se ancla en el intrón 4,
desde la posición 2122 a la 2105. El amplicón B es de 739 pb y contiene la unión del
intrón 3 con el exón 4, donde está la transición G1846A (Hanioka y cols., 1999) de la
secuencia de consenso del sitio de corte y empalme, que lleva a obtener una proteína
no funcional (Figura 10A).
32
32
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5’
CYP2D8
1
CYP2D7
2
3
4
DB1
A)
3
3’
CYP2D6
5
6
7
DB2
Reacción B
DB7
Fragmento B
739 pb
8
9
4
DB1
DB8
B)
WT
*4
(DB1 +DB7)
(DB1 +DB8)
577 pb
Exón
Intrón
DNA amplificado
Partidor
Figura 10
Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada para la detección del
polimorfismo G1846A (asociado al alelo CYP2D6*4)
A) Representación de la amplificación de fragmentos específicos del gen CYP2D6
(Fragmentos B). B) Reacciones de la PCR alelo específica para detectar la mutación
G1846A.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 5 µl de DNA, 2 U de DNA
polimerasa Taq, Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 3 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM y 1
µM de cada partidor. Para el control negativo se reemplazó el molde por agua.
Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C
durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60 segundos,
apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 90 segundos.
La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El resultado de la
amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2 %, teñido
con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb. La
electroforesis se efectuó a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X,
observándose a la luz UV un amplicón de 739 pb.
Para detectar la mutación CYP2D6*4 (G1846A) se llevaron a cabo dos reacciones
simultáneas a partir del amplicón B. El fragmento se reamplificó usando el partidor DB1
y el partidor específico silvestre DB7 (5’-CGAAAGGGGCGTCC-3’). En una segunda
reacción separada y en paralelo, se utilizó el partidor DB1 junto con el partidor
específico de la mutación DB8 (5’-CGAAAGGGGCGTCT-3’) para amplificar el producto
B. El partidor DB1 es constante, mientras que DB7 y DB8 son los partidores
específicos.
La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 1 µL del producto de PCR,
Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM, 1 µM de cada
partidor y 2 U de DNA polimerasa Taq. Para el control negativo se reemplazó el molde
por agua.
Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C
durante 90 segundos, seguida de 15 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60
segundos, apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 60
segundos. La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El
resultado de la amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,2 %, teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 1001000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a 300 volts durante
45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un amplicón de 577 pb.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
De acuerdo al resultado de las amplificaciones se puede concluir lo siguiente: en el
caso de obtener el amplicón dado por DB1-DB7, corresponde a un individuo con
genotipo homocigoto silvestre (*1/*1); si ambos juegos de partidores (DB1-DB7 y DB1DB8) dan amplicones, se trata de un genotipo heterocigoto (*1/*4), mientras que si sólo
el par de partidores específico para la mutación (DB1-DB8) da el amplicón esperado,
corresponde a *4/*4 (Figura 10B).
4.3.5. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCRRFLP
Para la detección de este polimorfismo se utilizó el método de Schur y
colaboradores (2006), amplificando una región que abarca la unión entre el intrón 3 y el
exón 4, la cual contiene un cambio de guanina a adenina en la posición 1846,
realizando luego una digestión del amplicón resultante utilizando la enzima de
restricción MvaI. Esta técnica (Figura 11A) se implementó como metodología de
confirmación para los genotipos obtenidos a través de la PCR anidada-AS.
La
PCR
se
llevó
a
cabo
utilizando
los
partidores
directo
(5’-
GCCTTCGCCAACCACTCCG -3’) e inverso (5’-AAATCCTGCTCTTCCGAGGC-3’), la
reacción se realizó en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,8 µM de cada partidor, 0,2 mM de
dNTPs, 2 U de DNA polimerasa Taq, en Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM y MgCl2 2
mM.
El protocolo de la PCR consta de un paso inicial a 94ºC durante 5 minutos seguido
por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC durante 60
segundos, apareamiento a 67ºC durante 30 segundos y de extensión a 72ºC durante
90 segundos. Por último se completó la reacción con 72ºC durante 5 minutos. Se
observó el producto de la PCR mediante una electroforesis horizontal en un gel de
agarosa al 2,0 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso
molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a
300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un
amplicón de 355 pb.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5’
3’
CYP2D6
1
2
3
5
4
6
7
8
9
A)
PCR
B)
Enzima de
restricción MvaI
355 pb
*4/*4
wt/wt
5'...CC^W GG...3'
3'...GG W^CC...5'
G1846A
W: A o T
355
Exón
250
Intrón
105
DNA amplificado
Partidor
Figura 11
Digestión con la enzima MvaI del producto de la PCR para la detección del
polimorfismo G1846A
A) Amplificación mediante la PCR de un segmento que abarca la unión del intrón 3 con
el exón 4 del gen CYP2D6. B) Digestión del amplicón de 355 pb utilizando la enzima
de restricción MvaI para la detección de la mutación G1846A.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A continuación, el amplicón se sometió a digestión con la enzima MvaI durante 2
horas a 37°C en su tampón su tampón R 1X (Tris-HCl 10 mM (pH 8,5), cloruro de
magnesio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a
cabo en 16 µL, de los cuales 8 µL del producto de PCR, 10 U de enzima MvaI, en 1 µL
de tampón Tango y 6 µL de agua. La digestión se sometió a una electroforesis
horizontal en un gel de agarosa al 2,5 % con bromuro de etidio y los productos se
visualizaron bajo luz UV.
Los individuos homocigotos para el genotipo silvestre (wt/wt) dieron dos segmentos
de 250 y 105 pb; los homocigotos del polimorfismo (*4/*4), un segmento de 355 pb y el
genotipo heterocigoto (wt/*4), dio 3 fragmentos de 355, 250 y 105 pb (Figura 11B). El
amplicón de 355 pb no es cortado por la enzima en el alelo mutado ya que presenta
una adenina en la posición 1846, en cambio, el corte sí ocurre para el alelo silvestre
debido a la presencia de una guanina en la misma posición.
4.3.6. Identificación de la duplicación o multiplicación génica del gen
CYP2D6 mediante una PCRL
El método utilizado, adaptado de protocolos utilizados por otros investigadores
(Steijns y cols., 1998; Lovlie y cols., 1996; Pulczynska y cols., 2011), permite detectar
la duplicación o multiplicación génica basándose en la disposición de los segmentos
nucleotídicos ubicados río abajo de CYP2D7 y CYP2D6. Existe una secuencia
homóloga de 3,4 kb río debajo de ambos CYP2D6 y de CYP2D7. En el caso de éste
último, un elemento de 1,6 kb interrumpe el segmento de 3,4 kb en dos segmentos de
0,6 kb y 2,8 kb, mientras que en CYP2D6 no existe interrupción (Figura 12A). Además,
la secuencia ubicada entre el extremo 3’ del segmentos de 2,8 kb río abajo de CYP2D7
y el extremo 5’ del gen CYP2D6 es única; normalmente no se encuentra río abajo de
este gen y solamente en el caso de que exista duplicación o multiplicación génica, se
encuentra esta secuencia única en el segmento intergénico entre dos copias de
CYP2D6 (Figura 12A).
Según lo anterior, se puede utilizar una PCR especial, llamada PCR-long (PCRL)
empleando el partidor directo P17 (5’-TCCCCCACTGACCCAACTCT-3’) que se diseñó
para aparearse al segmento repetido de 0,6 kb río abajo de CYP2D6 y CYP2D7, y el
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A)
Banda de control de amplificación
5,2 kb
P17
5’
P32
CYP2D7
Banda de control de amplificación
2,8 kb
0,6 kb 2,8 kb
Banda específica de amplificación
5,2 kb
P17
5’
CYP2D7
3,6 kb
P32
P17
CYP2D6 DUP
Exón
3’
CYP2D6
0,6 kb
B)
P17
Intrón
DNA amplificado
P32
P17
3’
CYP2D6
Partidor
Figura 12
Duplicación y multiplicación génica del gen CYP2D6*1 y su detección mediante la
PRCL
A) Individuo silvestre. Los partidores P17 y P32 generan a través de la PCRL una
banda de 5,2 kb correspondiente a la región intergénica entre CYP2D6 y CYP2D7.
B) Duplicación del gen CYP2D6. Además de la banda de control de amplificación se
genera otra de 3,6 kb, correspondiente a la región intergénica entre dos copias del gen
CYP2D6.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
partidor inverso P32, que se ancla en la secuencia única presente en ambos genes.
Por lo tanto, al realizar la PCRL con esta combinación de partidores que genera una
única banda de control de amplificación de 5,2 kb, correspondiente a la región
intergénica de CYP2D7-CYP2D6. En el caso de la duplicación o multiplicación génica,
el mismo conjunto de partidores produce una banda específica de amplificación de 3,6
kb, debido a que el partidor P32 (5’-CACGTGCAGGGCACCTAGAT-3’) se ancla en la
región intergénica ubicada entre ambas copias del gen duplicado (Meijerman y cols.,
2007; Steijns y cols., 2007; Lovlie y cols., 1996).
La PCRL se realizó en 25 µL usando: 1 µL de DNA, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, (NaCl
100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM, glicerol 50%), MgCl2 1 mM, dNTPs 0,24 mM,
DMSO 5% v/v, cada partidor 0,3 µM y 0,8 U de BIO-X-ACT Long DNA polimerasa que
contiene una mezcla de dos polimerasas, una DNA polimerasa termoestable
convencional (polimerasa Taq) en mayor proporción y una DNA polimerasa con
actividad correctora 3’ --> 5’.
Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C
durante 2 minutos, luego 60 segundos a 67°C, seguido de 27 ciclos comenzando con
una desnaturación a 94°C durante 10 segundos, apareamiento a 67°C durante 30
segundos y luego extensión a 68°C durante 20 minutos, finalmente una extensión a
68°C durante 20 minutos. El resultado se visualizó mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% con bromuro de etidio, utilizando el estándar de peso molecular de
1500-10000 pb MassRuler High Range DNA Ladder.
En individuos con genotipo silvestre sólo se observa un amplicón de 5,2 kb,
mientras que en el caso de individuos que presentan la duplicación génica además se
observa la banda específica de duplicación de 3,6 kb (Figura 12B).
4.4.
Estimación del porcentaje de mezcla amerindia-caucásica
(%MA-C)
Suponiendo que las poblaciones españolas e indígenas actuales presentan las
mismas frecuencias genotípicas y alélicas para los loci ABO y Rh que las poblaciones
que dieron origen a la población chilena actual, se estimó el porcentaje de mezcla
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
amerindio-caucásica según el método de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). El cálculo
de la frecuencia alélica para el sistema ABO se determina a través el equilibrio de
Hardy-Weinberg, las frecuencias de los alelos sanguíneos A, B y O se definen p, q y r
respectivamente, siendo F la frecuencia alélica de cada grupo:
Si el valor de la ecuación 4 es diferente de 1, se realiza una corrección a través de
la desviación (D) de cálculo y se obtienen los valores específicos para cada frecuencia
alélica a partir de:
Siendo p’, q’ y r’ los valores corregidos de las frecuencias de los grupos sanguíneos.
El valor obtenido para D (ecuación 5) es reemplazado en las ecuaciones 6, 7 y 8. El
resultado obtenido para la ecuación 8, corresponde a la frecuencia de la población, el
cual es reemplazado en la ecuación 9 para obtener el % MA-C.
Donde las frecuencias génicas del alelo O (sistema sanguíneo ABO) aceptadas
para las poblaciones ancestrales tanto caucásica (española) como amerindia
(mapuche) son de 0,6465 y 1,000, respectivamente (Valenzuela y cols., 1987).
40
40
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.5.
Análisis farmacocinético: CYP2D6 in vivo
4.5.1. Análisis de control de calidad del comprimido Declinax
Se utilizaron comprimidos de Declinax que contienen 22,5 mg de sulfato de
debrisoquina, equivalentes a 20 mg de debrisoquina base.
Figura 13: Estructura molecular del sulfato de debrisoquina
Se comprobó la identidad del fármaco Declinax. Para esto se utilizó un método de
identificación a través de espectrofotometría-UV (Moffat y cols., 2004), el cual
establece que una solución acuosa ácida de Declinax a 270 nm determina una
absorbancia de 17,7, lo cual corresponde a 10 mg/mL de sulfato de debrisoquina.
Se molió un comprimido de 20 mg de Declinax y se transfirió a un matraz de 100
mL, se aforó con HCl 0,5 M, se sonicó durante 15 minutos y se centrifugó durante 15
minutos a 3000 rpm. El sobrenadante se utilizó para realizar la medición de
absorbancia a 270 nm en cubetas de cuarzo de 1 cm. La uniformidad del contenido de
los comprimidos de Declinax se determinó analizando 10 comprimidos de la manera
indicada, los cuales tuvieron un peso promedio de 147,37 mg.
4.5.2. Reclutamiento de voluntarios sanos
Para observar el comportamiento de las variantes polimórficas, se definió un diseño
experimental exploratorio con 5 individuos de cada variante. Éstos debían ser elegidos
al azar dentro de los individuos genotipificados. Sin embargo, no se logró encontrar el
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
número de voluntarios deseados, debido a la baja frecuencia de los polimorfismos de
CYP2D6 en la población en estudio; por lo tanto, se optó por la selección de
voluntarios que presentaran genotipos interesantes y relevantes para el estudio de
actividad catalítica in vivo.
Un médico del Hospital San Juan de Dios seleccionó a 25 voluntarios(as)
completamente sanos(as) a partir de los criterios de inclusión y exclusión (Anexo 4) y
los instruyó acerca del propósito del estudio explicando claramente los posibles riesgos
y beneficios. Cada voluntario debió firmar un consentimiento informado para participar
en el estudio (Anexo 2).
4.5.3. Recolección de muestras de orina
Los voluntarios fueron citados al Centro de Investigaciones Farmacológicas y
Toxicológicas (IFT) para la entrega de un instructivo (Anexo 5) con el procedimiento de
toma de muestra de orina a realizar en sus casas, junto con los recipientes adecuados
y una monodosis del comprimido de Declinax, el cual contiene 22,5 mg del sulfato de
debrisoquina.
A los voluntarios se les instruyó no ingerir alimentos desde las 19:00 horas hasta las
00:00 horas. También se les prohibió ingerir café, alcohol y realizar ejercicios violentos
durante esa noche, para no alterar los resultados del análisis. El instructivo indicaba
tomar una muestra de orina en un frasco a las 23:00 horas, la cual se designó como
―muestra blanco‖, luego se solicitaba vaciar completamente la vejiga e ingerir el
comprimido con 250 mL de agua. Luego de 8 horas o durante ellas el voluntario
recolectó toda la orina en un segundo frasco, designado como ―orina con
debrisoquina‖.
El voluntario mantuvo la orina recolectada refrigerada durante toda la noche y la
llevó al laboratorio IFT antes de las 2 horas de terminado el procedimiento de la
segunda toma de muestra de orina. De las muestras de orina se tomaron 10 mL que se
almacenaron a -20°C para su posterior utilización.
42
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.5.4. Determinación de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina en orina
Para determinar los niveles de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina en orina, se
utilizó un método de HPLC con detector de fluorescencia, luego de una extracción de
líquido/líquido, basados en lo descrito por Bozkurt y colaboradores en 1993.
4.5.5. Equipamiento/ Instrumentación
El sistema de cromatografía consistió en un equipo HPLC Shimadzu LC-20 AT,
desgasificador DGU – 20 As, unidad de toma de muestra automática SIL-20 A, módulo
de comunicación CBM – 20 A, detector de fluorescencia RF-10 A XL y horno de
columna CTO-20 A. Una columna ODS-3 C18 Inertsil; 250 x 4,6 mm, 5 µm (lote:
9JI86395) a 35°C. La fase móvil compuesta de amortiguador NaH2PO4 0,1 M:
acetonitrilo (87:13 v/v), se filtró antes de utilizar y se almacenó a temperatura ambiente
junto con la columna. La fase móvil se bombeó a un flujo de 1,0 mL/min a través de la
columna. El detector de fluorescencia se estableció para las longitudes de onda de 210
y 290 nm, para excitación y emisión, respectivamente. El volumen de inyección de la
muestra fue de 1µL/mL y el tiempo de corrida 30 minutos. Los tiempos de retención
bajo estas condiciones son 6 minutos para 4-hidroxidebrisoquina y 17,6 minutos para
debrisoquina.
4.5.6. Preparación de soluciones madres de debrisoquina
Se pesó un comprimido de Declinax obteniéndose 173,7 mg y se molió en un
mortero. El polvo se suspendió en HCl a 0,5 M y luego se transfirió a un matraz aforado
de 100 mL aforando con la misma solución. Se sonicó durante 15 minutos y se
centrifugó a 1509 x g durante 10 minutos a 4°C. Se midió la concentración del
sobrenadante de debrisoquina hemisulfato por espectrofotometría UV a 270 nm y se
obtuvo un resultado de 240 µg/mL.
A partir de la solución madre de debrisoquina de 240 µg/mL se preparó una solución
base de debrisoquina de 100 µg/mL y, a partir de ésta, varias soluciones con
concentraciones finales de 15-10-5-1-0,5 µg/mL (Tabla 4).
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 4
Concentraciones de las soluciones madres de debrisoquina
Se indican las soluciones madres y las alícuotas que se utilizaron para obtener las
concentraciones finales, las cuales se usaron para la estandarización de la
metodología de detección de 4-hidroxidebrisoquina y debrisoquina mediante HPLC con
detector de fluorescencia. (*)Todas las soluciones se mantuvieron refrigeradas a 7 °C.
Soluciones de
debrisoquina (µg/mL)
Alícuota (mL)
*Concentración final
(µg/mL)
240
2,08
100
100
0,75
15
100
1
10
10
5
5
5
1
1
5
0,5
0,5
44
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.5.7. Curvas de calibración
Para determinar la presencia de debrisoquina y su metabolito 4-hidroxidebrisoquina
en orina mediante cromatografía, los analitos deben extraerse de la matriz biológica.
Para ello se utilizó un método de extracción líquido-líquido adaptado de Pereira y
colaboradores (2000), que permite separar el analito utilizando la diferencia de
solubilidad de sus componentes entre dos líquidos no miscibles.
Se colocaron 180 µL de una muestra de orina blanco en un tubo de vidrio para
centrífuga, y se agregaron 20 µL de solución estándar de debrisoquina (5-10-15
µg/mL). La muestra biológica se purificó al agregar 80 mg de cloruro de sodio, luego la
orina se alcalinizó a pH 9,0 con la adición de 25 µL de hidróxido de sodio 0,4 M. La
extracción líquido/líquido se llevó a cabo agregando 1 mL de una mezcla de
diclorometano:isopropanol (6:4 v/v) y agitando durante 5 minutos a 110 x g. Luego de
la extracción y centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos a 4°C, se tomaron 0,5 mL
de la fase orgánica y se evaporó el solvente orgánico bajo una suave corriente de gas
nitrógeno a 37°C. El extracto seco se reconstituyó en 500 µL de una mezcla de
solución de NaH2PO4 0,1 M y acetonitrilo (87:13 v/v). Se mezcló en un vórtex durante
30 segundos y se puso en viales (Waters, MA, EE.UU.). Se inyectaron 10 µL en el
HPLC durante 30 minutos y se recolectaron los datos. La linealidad del método se
obtuvo en un rango de concentración de debrisoquina de 0,5 a 15 µg/mL. Para
establecer linealidad se realizaron curvas de calibración que incluían 5 puntos de
concentración (0,5 - 1 - 5 - 10 - 15 µg/mL). El valor obtenido para el coeficiente de
correlación entre la concentración de debrisoquina vs el área bajo la curva fue de
0,997.
4.5.8. Procesamiento de muestras de voluntarios sanos
Las muestras de orina obtenidas de los voluntarios correspondieron a muestras de
0 y 8 horas. Para la extracción líquido/líquido, se tomaron en duplicado 200 µL de cada
muestra y se procesaron de igual forma que las muestras de la curva de calibración.
Finalmente, se colocaron en viales y se analizaron por HPLC; se inyectó un volumen
de muestra de 10 µL.
45
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
4.5.9. Determinación de la razón metabólica
El fenotipo hidroxilador de la debrisoquina es asignado por la razón metabólica de
debrisoquina (RM) expresada en la ecuación 11, definida como la razón entre la
concentración molar de la molécula original y el metabolito 4-hidroxidebrisoquina en
muestras de orinas de 0 – 8 horas. Debido a que no se utilizó un estándar de
debrisoquina y tampoco de 4-hidroxidebrisoquina, en este estudio la razón metabólica
corresponde a la razón entre las áreas de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina.
La definición del fenotipo está establecida a modo de convención, donde se
instauran puntos de cortes que segregan la población en metabolizador ultrarrápido
(MU), metabolizador extensivo (ME), metabolizador intermedio (MI) y metabolizador
pobre (MP) (Tabla 5).
4.6. Análisis estadístico
Para relacionar las razones metabólicas con los genotipos estudiados, se realizó un
análisis descriptivo con respecto a la media, mediana y desviación estándar de los
resultados obtenidos utilizando el programa GraphPad Prism 5 (San Diego, EE.UU.
www.graphPad.com).
46
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 5
Razones metabólicas de debrisoquina
Las razones metabólicas se obtienen a través de los fenotipos de CYP2D6 según los
puntos de cortes establecidos en la literatura. Adaptado de Neafsey y colaboradores
(2009).
Fenotipo metabolizador
Metabolizador ultrarrápido (MU)
RM debrisoquina
< 0,2
Metabolizador extensivo (ME)
0,2 - 1,0
Metabolizador intermedio (MI)
1 - 12,6
Metabolizador pobre (MP)
> 12,6
47
47
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5.
Resultados
5.2.
Análisis genotípico
5.2.1. Voluntarios sanos
Se reclutaron 321 voluntarios sanos a los que se les informó sobre el estudio.
Firmaron el consentimiento informado (Anexo 1) y se les tomó la muestra de sangre
periférica.
La población del estudio incluyó hombres y mujeres mayores de 18 años y menores
de 73 años. El promedio de edad fue de 31 ± 12 años, con un índice de masa corporal
de 24,4 ± 3 kg/m2 (Tabla 6).
5.2.2. Frecuencias alélica y genotípica de C2850T (CYP2D6*2)
La detección de la variable alélica CYP2D6*2 (C2850T) se hizo a través de PCR
seguida de cortes específicos utilizando la enzima de restricción HhaI. En la Figura 14
se muestran ejemplos de los patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias
alélicas y genotípicas se presentan en la Tabla 7.
5.2.3. Frecuencias alélica y genotípica de A2549del (CYP2D6*3)
La detección de la variable alélica CYP2D6*3 (A2549del) se hizo a través de PCR
semianidada AS y PCR RFLP; en las Figuras 15 y 16 se muestran ejemplos de los
patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias alélicas y genotípicas se
presentan en la Tabla 8.
5.2.4. Frecuencias alélica y genotípica de G1846A (CYP2D6*4)
La detección de la variable alélica CYP2D6*4 (G1846A) se hizo a través de PCR
semianidada AS y PCR-RFLP; en las Figuras 17 y 18 se muestran ejemplos de los
patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias genotípicas y alélicas se
presentan en la Tabla 9.
48
48
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 6
Características de la población del estudio
Se presenta el número de voluntarios sanos que participaron en el estudio separados
según sexo, se indican los promedios de edad, peso, altura e IMC. Los datos están
expresados como promedios ± desviación estándar. IMC: Índice de masa corporal.
Mujeres
Hombres
Total
Número
188
133
321
Edad (años)
31 ± 12,3
30 ± 12,2
31 ± 12
Peso (kg)
61,8 ± 9,1
74,9 ± 10,1
66,8 ± 11,4
Altura (m2)
1,60 ± 0,1
1,73 ± 0,07
1,65 ± 0,09
IMC (kg m-2)
24,4 ± 3,2
25 ± 2,9
24,4 ± 3
49
49
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A
Estándar
PM
1029 pb
B
Estándar
PM
1
2
3
4
5
800 pb
786 pb
414 pb
400 pb
372 pb
*2/*2
wt/wt
wt/wt
wt/*2
*2/*2
Figura 14
Patrones electroforéticos de C2850T (CYP2D6*2)
A) Producto de la PCR de 1029 pb en gel de agarosa al 1,2 %. B) Productos de
digestión con la enzima de restricción HhaI, se observaron fragmentos de 786, 414 y
372 pb para el genotipo heterocigoto (carril 4), 414 y 372 pb para el genotipo silvestre
(carriles 2 y 3) y de 786 pb para el genotipo homocigoto (1 y 5). PM: Peso molecular
100 – 1000 pb.
50
50
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 7
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CY2D6*2 (C2850T)
A) Frecuencia genotípica del polimorfismo C2850T. B) Frecuencia alélica del
polimorfismo C2850T. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el
estudio. wt o *2: alelo silvestre o wild type , *2: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,
wt/*2: genotipo hetericogoto *2, *2/*2: genotipo homocigoto *2.
A)
Frecuencia genotípica de
CYP2D6*2
Genotipos
nt 2850
N
%
CYP2D6*1/*1
C/C
119
37
CYP2D6*1/*2
C/A
143
44,5
CYP2D6*2/*2
A/A
59
18,4
Alelos
nt 2850
N
%
*1
C
381
59,3
*2
A
261
40,6
B)
Frecuencia alélica de
CYP2D6*2
51
51
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A
Estándar
PM
1123 pb
1000 pb
1
2
3
4
B
Estándar
PM
1
2
3
4
700 pb
600 pb
563 pb
wt/wt
wt/wt
wt/wt
wt/*3
Figura 15
Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través de la PCR alelo
específica semianidada
A) Producto de la PCR, banda de 1123 pb en gel de agarosa al 1,2 %. B) Productos de
la PCR-AS de 563 pb. El primer carril corresponde a la reacción para determinar el
alelo silvestre, el segundo carril determina el alelo mutado. En la figura se muestran 4
voluntarios sanos genotipificados. Los voluntarios 1, 2 y 3 presentan un genotipo wt/wt,
el voluntario 4 presenta un genotipo heterocigoto para *3. Para CYP2D6*3 (A2549del)
no se encontraron individuos homocigotos. PM: Peso molecular 100 – 1000 pb.
52
52
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A
Estándar
PM
300 pb
200 pb
B
Estándar
PM
wt/wt
wt/wt
wt/wt
wt/wt
wt/wt
wt/*3
300 pb
250 pb
200 pb
150 pb
100 pb
Figura 16
Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través de la PCR RFLP
A) Producto de la PCR, banda de 270 pb en gel de agarosa al 2,0 %. B) Productos de
digestión del amplicón de 270 pb tratado con la enzima de restricción MspI. El patrón
de bandeo se observa en un gel de poliacrilamida al 16%, el genotipo silvestre produce
dos fragmentos de 188 y 82 pb, mientras que el genotipo heterocigoto para *3 produce
además fragmentos de 168 y 20 pb. PM: Peso molecular 50 – 1000 pb.
53
53
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 8
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CY2D6*3 (A2549del)
A) Frecuencia genotípica del polimorfismo A2549del. B) Frecuencia alélica del
polimorfismo A2549del. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el
estudio. wt o *3: alelo silvestre o wild type , *3: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,
wt/*3: genotipo heterocigoto *3, *3/*3: genotipo homocigoto *3.
A)
Frecuencia genotípica de
CYP2D6*3
Genotipos
nt 2549
N
%
CYP2D6*1/*1
A/A
259
97,8
CYP2D6*1/*3
A/del
6
2,18
CYP2D6*3/*3
del/del
0
0
Alelos
nt 2549
N
%
*1
A
635
98,9
*3
del
6
B)
Frecuencia alélica de
CYP2D6*3
1,09
54
54
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A
Estándar
PM
800 pb
700 pb
738 pb
B
Estándar
PM
1
2
3
4
570 pb
*4/*4
wt/*4
wt/wt
wt/wt
Figura 17
Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través de la PCR alelo
específica semianidada
A) Producto de la PCR, banda de 738 pb en gel de agarosa al 1,2 %. B) Productos de
la PCR-AS de 577 pb. El primer carril corresponde a la reacción para determinar el
alelo silvestre, el segundo carril determina el alelo mutado. En la figura se muestran 4
voluntarios sanos genotipificados. El voluntario 1 presenta un genotipo *4/*4, el
voluntario 2 presenta un genotipo wt/*4 y los voluntarios 3 y 4, corresponden a un
genotipo homocigoto wt/wt. PM: Peso molecular 100 – 1000 pb.
55
55
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A
Estándar
PM
Estándar
PM
355 pb
400 pb
300 pb
B
Estándar
PM
355 pb
400 pb
300 pb
250 pb
100 pb
105 pb
wt/wt
wt/wt
*4/*4
*4/*4
wt/*4
Figura 18
Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través de la PCR RFLP
A) Producto de la PCR, banda de 355 pb en gel de agarosa al 2,0 %. B) Productos de
la RFLP, digestión del producto de la PCR con la enzima de restricción MvaI en un gel
de agarosa al 2,2%. En el primer y segundo carriles se observó un fragmento de 250
pb para el genotipo homocigoto silvestre, en el tercer y cuarto se observó un fragmento
de 355 pb, que corresponde al genotipo homocigoto para el alelo *4, en el quinto carril
se observaron fragmentos de 355 y 250 pb, que definen al genotipo heterocigoto para
el alelo *4. El fragmento de 105 pb no se visualizó en todas las muestras. PM: Peso
molecular 100 – 1000 pb.
56
56
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 9
Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CYP2D6*4 (G1846A)
A) Frecuencia genotípica del polimorfismo G1846A. B) Frecuencia alélica del
polimorfismo G1846A. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el
estudio, wt o *4: alelo silvestre o wild type, *4: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,
wt/*4: genotipo heterocigoto *4, *4/*4: genotipo homocigoto *4.
A)
Frecuencia genotípica de
CYP2D6*4
Genotipos
nt 1846
N
%
CYP2D6*1/*1
G/G
249
77,6
CYP2D6*1/*4
G/A
68
21,2
CYP2D6*4/*4
A/A
4
1,3
Alelos
nt 1846
N
%
*1
G
566
88,2
*4
A
76
11,8
B)
Frecuencia alélica de
CYP2D6*4
57
57
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5.2.5. Frecuencia genotípica de la duplicación o multiplicación génica de
CYP2D6*1xN
La detección de la duplicación o multiplicación génica de CYP2D6 se hizo a través
de PCRL; en la Figura 19 se muestran ejemplos de los patrones electroforéticos
obtenidos. La frecuencia genotípica se presenta en la Tabla 10.
5.2.6. Resumen de las frecuencias alélica y genotípica de CYP2D6
En la Tabla 11 se reúnen las frecuencias alélicas y genotípicas determinadas en el
estudio para las variantes alélicas de CYP2D6 (*2, *3 y *4) para el total de individuos
analizados.
5.2.7. Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)
La estimación del nivel de mestizaje de la población de estudio se calculó a partir de
los grupos sanguíneos del conjunto de voluntarios reclutados, calculándose las
frecuencias alélicas para el sistema ABO utilizando el equilibrio de Hardy-Weinberg y la
ecuación de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). Las frecuencias obtenidas para la
población chilena del estudio fueron de A= 0,2093, B= 0,0797 y O= 0,7109 (Tabla 12).
Los resultados se compararon con las frecuencias alélicas de la población
caucásica y amerindia (Acuña y cols., 2000), calculándose el %MA-C (Ecuación 9) para
cada alelo. Se encontró que en la población estudiada existe aproximadamente un
18% de mezcla amerindia-caucásica.
58
58
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Estándar
PM
Control
positivo
5 kb
5,2 kb
3,6 kb
3 kb
Figura 19
Patrones electroforéticos de CYP2D6*1xN
En un gel de agarosa al 1,0% para voluntarios sin la duplicación se observó sólo la
banda de control de amplificación de 5,2 kb. Se utilizó un control positivo, para el cual
amplificaron la banda específica de duplicación de 3,6 kb y la banda de control de
amplificación de 5,2 kb. PM: 1000 – 10000 pb.
59
59
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 10
Frecuencia genotípica de CYP2D6*1xN
Se indica la frecuencia genotípica para un subgrupo de 20 voluntarios. N: Número de
voluntarios que participaron en el estudio.
Frecuencia genotípica
CYP2D6*1xN
N
%
Presencia
0
0
Ausencia
20
100
60
60
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 11
Resumen de las frecuencias genotípica y alélica de CYP2D6*2, *3 y *4
Se indican las frecuencias genotípicas de cada genotipo encontrado de CYP2D6 y las
frecuencias alélicas de los alelos de CYP2D6.
Frecuencia genotípica
Frecuencia alélica
Genotipos
nt 2850
N
%
Alelo
N
%
CYP2D6*1/*1
C/C
119
37
*1
281
59,3
CYP2D6*1/*2
C/T
143
44,5
*2
261
40,6
CYP2D6*2/*2
T/T
59
8,4
nt 2549
N
%
N
%
CYP2D6*1/*1
A/A
259
97,8
*1
635
98,9
CYP2D6*1/*3
A/del
6
2,18
*3
6
CYP2D6*3/*3
del/del
0
0
nt 1846
N
%
CYP2D6*1/*1
G/G
249
77,6
CYP2D6*1/*4
G/A
68
21,1
CYP2D6*4/*4
A/A
4
1,3
1,09
N
%
*1
566
88,2
*4
76
11,8
61
61
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 12
Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica en la población del estudio
A) Se indican la cantidad de cada grupo sanguíneo de los voluntarios. B) Se indican
frecuencias alélicas de cada grupo sanguíneo de la población de estudio y las
frecuencias alélicas de las poblaciones española e indígena (*Acuña y cols., 2000). Se
presenta el porcentaje de mezcla amerindia-caucásica de la población del estudio
equivalente a un 18%.
A)
Grupo sanguíneo
Chilenos
AB
8
A
112
B
41
O
160
Total
321
B)
Frecuencia alélicas
Chilenos
Españoles*
Indígenas*
A
0,2093
0,2864
0,0678
B
0,079
0,067
0
O
0,7109
0,6465
0,9322
%MA-C
18
62
62
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
5.3.
Análisis farmacocinético
5.3.1. Prueba de identidad y uniformidad de contenido del comprimido
Declinax
Se obtuvo el espectro ultravioleta (Figura 20) de los comprimidos de Declinax de 20
mg (sulfato de debrisoquina). El espectro ultravioleta se registró para una solución
ácida a 270 nm.
Figura 20: Espectro característico de sulfato de debrisoquina
El promedio de las absorbancias obtenidas a 270 nm fue 0,389, lo cual corresponde
a 22,02 mg en promedio para los 10 comprimidos. La United States Pharmacopeia
(USP) exige que el % RSD (desviación estándar/media) no debe exceder el 6%, lo cual
se cumplió en este ensayo (%RSD = 0,0389). Además exige que el contenido del
fármaco esté entre 85 y 115%, lo cual también se cumplió (Tabla 13).
5.3.2. Genotipos de los voluntarios sanos
Se seleccionaron 25 voluntarios sanos de la población del estudio, según los
polimorfismos que presentaron y a partir de los criterios establecidos, descritos en
la sección 4.2.3. de la metodología y en el Anexo 4. De estos voluntarios 15 fueron
63
63
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 13
Test de uniformidad
Se indican los gramos de cada comprimido y su absorbancia obtenida a 270 nm. Se
presenta la conversión de los gramos del comprimido Declinax a milígramos de sulfato
de debrisoquina, promedio y el cálculo de RSD.
Comprimido (gr)
Absorbancia
Sulfato de
debrisoquina (mg)
Contenido del
fármaco (%)
0,1746
0,365
20,62
93,64
0,1737
0,370
20,90
94,91
0,1766
0,376
21,24
96,46
0,1746
0,394
22,26
101,08
0,1762
0,402
22,71
103,13
0,1737
0,396
22,37
101,59
0,1728
0,390
22,03
100,04
0,1742
0,389
21,98
99,82
0,1731
0,407
23,00
104,45
0,1742
0,409
23,11
104,95
22,02
Promedio
0,86
Desviación
4,00
%RSD
64
64
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
mujeres y 10 fueron hombres, con un promedio de edad de 26 ± 9,2 años y un IMC
de 22,8 ± 2,4 kg m-2 (Tabla 14).
En la Tabla 15 se muestra el número de voluntarios elegidos para cada
polimorfismo de CYP2D6 separados en grupos según genotipo y sexo.
Los resultados de los análisis de los tres polimorfismos de nucleótido único (alelos
*2, *3 y *4) son compatibles con un total de 11 genotipos teóricos diferentes, de los
cuales 10 son genotipos posibles (Tabla 16).
5.3.3. Determinación de la razón metabólica de debrisoquina 4-hidroxilasa
Luego de administrar una monodosis de 20 mg de Declinax a cada voluntario, se
recolectaron las muestras de orina y se analizaron mediante HPLC. Los tiempos de
retención obtenidos para la 4-hidroxidebrisoquina y la debrisoquina fueron 6 y 17,6
minutos, respectivamente. En la Figura 21A se observa un cromatograma
representativo de un individuo con fenotipo ME, en la Figura 21B se observa un
cromatograma representativo de un individuo con fenotipo MI y en la Figura 21C se
observa un cromatograma representativo de un individuo con fenotipo MP.
Las razones metabólicas agrupadas según genotipo y su clasificación de acuerdo a
la capacidad metabólica, se encuentran plasmadas en la Tabla 17. Las razones
metabólicas de los individuos fueron segregadas en metabolizador pobre (MP),
metabolizador intermedio (MI), metabolizador extensivo (ME) y metabolizador
ultrarrápido (MU), según los valores establecidos en la Tabla 5. En base a estos datos
se analizó la relación genotipo-fenotipo en los 23 individuos a los que se les administró
Declinax. En la Tabla 18 se muestran los genotipos y una comparación entre los
fenotipos esperados y los fenotipos determinados.
5.3.4. Análisis estadístico
Los resultados de cada individuo del estudio se utilizaron para realizar un análisis
descriptivo. Para describir el conjunto de observaciones numéricas se calcularon
medidas de tendencia central (media y mediana) y medidas de dispersión (desviación
65
65
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 14
Características de los voluntarios sanos
Se detalla el número total de voluntarios participantes. Se clasifican según sexo y se
indica la edad promedio e IMC (Índice de masa corporal) del grupo completo. Los
valores están expresados como promedios ± DE.
Características grupo de estudio
Mujeres
15
Hombres
10
Total
25
Edad (años)
-2
IMC (kg m )
26 ± 9,2
22,8 ± 2,4
66
66
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 15
Número de voluntarios por cada polimorfismo estudiado de CYP2D6
Se detalla el polimorfismo de cada variable alélica y el número de voluntarios por cada
genotipo clasificados según sexo.
Polimorfismo C2850T
Genotipo
nt 2850
Mujeres
Hombres
Total
CYP2D6 *1/*1
C/C
8
6
14
CYP2D6*1/*2
C/T
3
0
3
CYP2D6*2/*2
T/T
4
4
8
Genotipo
nt 2549
Mujeres
Hombres
Total
CYP2D6 *1/*1
A/A
11
9
20
CYP2D6*1/*3
A/del
4
1
5
CYP2D6*3/*3
del/del
0
0
0
Genotipo
nt 1846
Mujeres
Hombres
Total
CYP2D6 *1/*1
G/G
7
8
15
CYP2D6*1/*4
G/A
5
2
7
CYP2D6*4/*4
A/A
3
0
3
Polimorfismo A2549del
Polimorfismo G1846A
67
67
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 16
Genotipos teóricos y genotipos posibles
Se indican los 11 genotipos teóricos, de los cuales 10 son posibles, para
combinaciones de los tres polimorfismos de CYP2D6, y el número de voluntarios para
cada combinación genotípica.
Polimorfismos de CYP2D6
nt 2850
nt 2549
nt 1846
Nº de
voluntarios
Genotipos
posibles
Genotipos
teóricos
wt/wt
wt/wt
wt/wt
4
wt/wt
wt/wt
wt/wt
wt/*3
wt/wt
3
wt/*3
wt/*3
wt/wt
wt/wt
wt/*4
5
wt/*4
wt/*4
wt/wt
wt/wt
*4/*4
1
*4/*4
*4/*4
wt/*2-3
wt/*2
wt/*3
wt/wt
2
*2/*3
*2/*3
wt/*2
wt/wt
wt/*4
wt/*2-4
wt/*2-4
*2/*4
*2/*4
1
*2/*2
wt/wt
wt/wt
4
*2/*2
*2/*2
*2/*2
wt/wt
wt/*4
2
*2/*2-4
*2/*2-4
*2/*2
wt/wt
*4/*4
1
*2-4/*2-4
*2-4/*2-4
68
68
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Figura 21
Cromatogramas representativos de los fenotipos ME, MI y MP
Se presentan ejemplos de cromatogramas de voluntarios sanos con tiempos de
retención de 6 minutos para 4-hidroxidebrisoquina y 17,6 minutos para debrisoquina. El
pico observado a los 24 minutos corresponde a una señal característica de la muestra
de orina. A) Cromatograma representativo de un voluntario con fenotipo metabolizador
extensivo.
B)
Cromatograma
representativo
de
un
voluntario
con
fenotipo
metabolizador intermedio. C) Cromatograma representativo de un voluntario con
fenotipo metabolizador pobre.
69
69
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
mV
Detector A:Ex:210nm,Em:290nm
A
1000
900
4-hidroxidebrisoquina/7636741
4-
800
700
600
500
400
300
200
debrisoquina/2173277
100
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
min
mV
Detector A:Ex:210nm,Em:290nm
B
1000
4-hidroxidebrisoquina/14018345
debrisoquina/18858885
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
min
mV
Detector A:Ex:210nm,Em:290nm
1000
C
debrisoquina/20746024
900
800
700
600
500
400
300
200
4-hidroxidebrisoquina/18444
100
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
min
70
70
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 17
Genotipos posibles y sus fenotipos metabolizadores esperados
Se indican los 10 genotipos posibles para las combinaciones de los tres polimorfismos
de CYP2D6, el número de voluntarios, el fenotipo esperado y el número de alelos
activos por cada combinación genotípica.
Polimorfismos de CYP2D6
nt 2850
nt 2549
nt 1846
Nº de
voluntarios
Fenotipo
esperado
Alelos
activos
Genotipos
posibles
wt/wt
wt/wt
wt/wt
4
ME
2
wt/wt
wt/wt
wt/*3
wt/wt
3
MI
1
wt/*3
wt/wt
wt/wt
wt/*4
5
MI
1
wt/*4
wt/wt
wt/wt
*4/*4
1
MP
0
*4/*4
wt/*2
wt/*3
wt/wt
2
MI
1
*2/*3
wt/*2-4
wt/*2
wt/wt
wt/*4
1
MI
1
*2/*4
*2/*2
wt/wt
wt/wt
4
ME
2
*2/*2
*2/*2
wt/wt
wt/*4
2
MI
1
*2/*2-4
*2/*2
wt/wt
*4/*4
1
MP
0
*2-4/*2-4
71
71
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 18
Razones metabólicas obtenidas según genotipo y su clasificación metabólica
Se indican las áreas observadas de 4-hidroxidebrisoquina y debrisoquina para cada
voluntario. Se presenta la razón metabólica correspondiente al cociente de las áreas de
debrisoquina y su metabolito. La RM de cada voluntario define su fenotipo
metabolizador observado, el cual se compara con el fenotipo metabolizador esperado.
72
72
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Genotipos 4-hidroxidebrisoquina debrisoquina
RM
Fenotipo Fenotipo
encontrado esperado
9.036.102
2.530.048
0,28
ME
ME
6.981.551
3.097.437
0,44
ME
ME
12.300.439
4.057.778
0,33
ME
ME
7.636.741
2.173.277
0,28
ME
ME
5.448.394
8.270.664
1,52
MI
MI
7.285.406
9.438.551
1,3
MI
MI
2.388.062
6.112.580
2,56
MI
MI
5.160.014
7.408.609
1,44
MI
MI
3.703.237
2.625.384
0,71
ME
MI
7.636.741
2.173.277
0,28
ME
MI
14.018.345
18.858.885
1,35
MI
MI
8.048.488
4.692.888
0,58
ME
MI
20.746.024 126,41
MP
MP
5.744.756
10.067.878
1,75
MI
MI
4.471.228
497.929
0,11
ME
MI
10.188.354
10.700.988
1,05
MI
MI
8.238.282
2.131.913
0,26
ME
ME
13.698.118
5.360.591
0,39
ME
ME
5.983.320
1.561.531
0,26
ME
ME
5.339.785
575.193
0,11
ME
ME
6.797.418
4.601.306
0,68
ME
MI
6.300.703
9.171.809
1,46
MI
MI
13.441.410 121,38
MP
MP
wt/wt
wt/*3
wt/*4
*4/*4
164.121
*2/*3
wt/*2-4
*2/*4
*2/*2
*2/*2-4
*2/*4
110.741
73
73
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
estándar) (Tabla 19). No se realizó un test estadístico comparativo debido a que el
número de individuos de cada subgrupo de estudio en algunos casos fue insuficiente.
Los siguientes gráficos incorporan los valores presentados en la Tabla 19. En la
Figura 22 se muestran las razones metabólicas separadas en grupos según el
genotipo. En la Figura 23 se observan las medias de las razones metabólicas de cada
genotipo, lo cual permite comparar las razones metabólicas entre genotipos.
En la Figura 24A se muestran los fenotipos metabolizadores esperados para cada
voluntario y en la Figura 24B se muestran los fenotipos metabolizadores observados
para cada voluntario según el genotipo determinado previamente.
74
74
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Tabla 19
Estadísticas descriptivas de los datos
Se presentan los genotipos junto a la media de las razones metabólicas, desviación
estándar, media del logaritmo de las razones metabólicas, desviación estándar y la
mediana. N: Número de voluntarios, RM: Razón metabólica, DE: Desviación estándar.
Genotipo
N
Media RM
DE
Mediana Media Log RM
DE
Mediana
wt/wt
4
0,33
0,08
0,38
-0,48
0,09
-0,51
wt/*3
3
1,79
0,67
1,52
0,23
0,15
0,18
wt/*4
5
0,87
0,50
0,71
-0,13
0,29
-0,15
*4/*4
1
126,41
0,00
126,41
2,10
0,00
2,10
*2/*3
2
0,93
1,16
0,93
-0,35
0,85
-0,35
1
1,05
0,00
1,05
0,02
0,00
0,02
*2/*2
4
0,25
0,12
0,26
-0,64
0,24
-0,59
*2/*2-4
2
1,07
0,55
1,07
0,00
0,24
0,00
*2/*4
1
121,38
0,00
121,38
2,08
0,00
2,08
wt/*2-4
*2/*4
75
75
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
wt/wt
*2/*2
*4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4
wt/*4
*2/*2-4
wt/*3
*2/*3
*2/*4
Genotipos
Metabolizador Intermedio
Metabolizador Normal
Metabolizador Pobre
Media de las razones
metabólicas del genotipo ± DE
Figura 22
Relación entre genotipos y razones metabólicas
Se observan los 23 voluntarios agrupados según su genotipo y sus razones
metabólicas respectivas. Además, se muestran los promedios de las razones
metabólicas para cada genotipo. Las líneas segmentadas corresponden a los
logaritmos de los puntos de corte que clasifican las razones metabólicas en ME, MI y
MP.
76
76
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
wt/wt
*2/*2
wt/*4
*2/*2-4
wt/*3
*2/*3
wt/*2-4
*4/*4 *2-4/*2-4 *4/*4
*2/*4
Genotipos
Metabolizador Intermedio
Metabolizador Pobre
Media de las razones
Metabólicas del genotipo ± DE
Figura 23
Comparación de los promedios de las razones metabólicas según genotipo.
Se observan los promedios de los genotipos que tienen un tamaño de muestra >1. La
razón metabólica para un voluntario único de genotipo wt/*2-4 o *2/*4 (fenotipo
metabolizador intermedio) se muestra en una barra rayada. Se muestran dos
voluntarios en barras de color negro, el primero presenta un genotipo *4/*4 y el
segundo *2-4/*2-4, con los cuales se obtuvo un promedio de las razones metabólicas
observadas (barra de color gris denominada *4/*4), ya que ambas presentan el
polimorfismo G1846A (asociado al alelo CYP2D6*4). Las líneas segmentadas
corresponden a los logaritmos de los puntos de corte para separar las razones
metabólicas en ME, MI y MP.
77
77
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
A)
wt/wt
*2/*2
*4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4
wt/*4
*2/*2-4
wt/*3
*2/*3
*2/*4
B)
wt/wt
*2/*2
*4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4
wt/*4
*2/*2-4
wt/*3
*2/*3
*2/*4
Genotipos
Metabolizador Normal
Metabolizador Intermedio
Metabolizador Pobre
Figura 24
Fenotipos esperados y fenotipos observados
A) Fenotipos esperados. Se observan 23 voluntarios agrupados según su genotipo y el
fenotipo metabolizador esperado encontrar a través de la determinación de la razón
metabólica. B) Fenotipos observados. Se observan 23 voluntarios agrupados según su
genotipo y el fenotipo metabolizador observado a través de la determinación de la
razón metabólica. MP: Metabolizador pobre; MI: Metabolizador intermedio y ME:
Metabolizador extensivo.
78
78
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
6.
Discusión
La farmacogenética trata de identificar aquellos polimorfismos genéticos que
influyen en la respuesta terapéutica de los fármacos, ofreciendo posibilidad de orientar
qué terapias farmacológicas pueden ser más eficaces y seguras para cada paciente,
en base a su perfil genético. Sin embargo, para que las pruebas farmacogenéticas
sean ampliamente aceptadas y utilizadas en el área clínica, se debe demostrar su
validez y utilidad clínica con tamaños muestrales suficientemente grandes e
independientes para cada población en estudio.
Un problema difícil de dilucidar es la correlación entre el perfil genético de un
individuo y su fenotipo metabólico, debido a que el factor genético no es el único factor
determinante del fenotipo metabolizador. Este trabajo aborda esta problemática,
esperando obtener información científica relevante que permita optimizar la toma de
decisiones frente a un tratamiento farmacológico, basándose en las características
genéticas y metabólicas de cada individuo.
Se caracterizaron tres de los polimorfismos más relevantes de la familia de
CYP2D6, correspondientes a aquellos que definen los alelos CYP2D6*2 (C2850T),
CYP2D6*3 (A2549del) y CYP2D6*4 (G1846A) en un grupo de la población chilena. El
primero corresponde a una transición 2850C>T que produce un cambio aminoacídico
de una treonina a serina, determinando una enzima con capacidad catalítica similar a
la enzima normal. El alelo CYP2D6*3 presenta la deleción de una adenina en la
posición 2549, lo cual genera una proteína no funcional, por lo tanto, no se observa
actividad catalítica de la enzima. Lo mismo ocurre con el alelo CYP2D6*4, en el cual
no se produce una enzima, producto de una transición G1846A que lleva a un codón
de término prematuro, que se traduce en una proteína no funcional.
Un aporte fundamental del presente trabajo fue determinar la frecuencia de las
variantes alélicas y genotípicas de estos polimorfismos (C2850T, A2549del y G1846A)
en un grupo de la población chilena, debido a que las frecuencias de las variantes
alélicas son diferentes en cada grupo étnico, aunque el efecto de cada variante alélica
sea idéntico en todas las poblaciones (Zanger y cols., 2004). El análisis genotípico
reunió 321 voluntarios sanos de la población general para determinar las frecuencias
79
79
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
alélicas del CYP2D6. Las frecuencias registradas para el CYP2D6 en la población
caucásica (España, Grecia, Portugal e Italia) se presentan en la Tabla 20. Los
resultados encontrados en este estudio son semejantes a los de la población española
caucásica, lo cual podría atribuirse a que el grupo étnico seleccionado de voluntarios
posee un porcentaje de mezcla amerindio-caucásico (%MA-C) de 18%, que es
representativo del estrato sociogenético S-II de acuerdo a lo establecido por
Valenzuela y colaboradores (1987), que corresponde al 23% de la población chilena.
Este cálculo se realizó con la finalidad de que las frecuencias genotípicas y alélicas de
los alelos CYP2D6*2 (C2850T), CYP2D6*3 (A2549del), CYP2D6*4 (G1846A) y de la
duplicación del gen CYP2D6 puedan ser comparadas con y extrapoladas a estudios
nacionales e internacionales.
Tabla 20: Frecuencias alélicas de CYP2D6
Frecuencias alélicas de CYP2D6 en países del sur de Europa y en la población
chilena (Meijerman y cols., 2007; Rodríguez Arcas & Ingelman-Sundberg, 2006). En
negrita se muestran los resultados obtenidos en el presente trabajo. Los valores que
no se muestran en la tabla no se encuentran determinados.
Grecia (%)
Caucásico
Italia (%)
Caucásico
Portugal (%)
Caucásico
31,00
-
75,00
-
40,60
40,50
-
-
-
*3
1,09
0,95
2,30
0,70
1,40
*4
11,80
13,80
17,80
15,30
13,30
*5
2,90
3,33
-
3,40
2,80
*1xN, *2xN
2,10
4,27
4,20
6,50
Gen
Alelo
Chile (%)
CYP2D6
*1
-
*2
España (%)
Caucásico
7,40
La frecuencia alélica encontrada para el polimorfismo G1846A (alelo 4) es 11,8%,
para A2549del (alelo *3) es 1,09% y para C2850T (alelo *2) es 40,6%, siendo las
frecuencias de G1846A (alelo *4) y A2549del (alelo *3) similares a las determinadas
80
80
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
por Pinto y colaboradores (2009) en dos grupos socioeconómicos de la población
chilena.
Una de las limitaciones del presente estudio fue que la genotipificación de la
duplicación del gen CYP2D6 en la población se realizó en un grupo pequeño de
voluntarios debido a limitaciones de tiempo. No obstante, la técnica fue implementada
y puede ser utilizada para este análisis de manera confiable y reproducible. La
frecuencia de CYP2D6*1xN reportada anteriormente en la población chilena es de
2,08% (Pinto, 2009), mientras que en el subgrupo de este estudio no se encontraron
individuos con la duplicación del gen. Para la variante polimórfica *3 (A2549del)
tampoco se encontraron individuos homocigotos mutados (genotipo *3/*3) sino tan
solo individuos heterocigotos (genotipo wt/*3). Para los polimorfismos *2 (C2850T) y
*4 (G1846A) se encontró que la frecuencia de el alelo *4 es tres veces menor que la
frecuencia de el alelo *2.
En este trabajo se postula que las variantes alélicas de CYP2D6 (*2, *3, *4 y *1xN)
podrían explicar en parte la gran variabilidad observada en pacientes tratados con
medicamentos metabolizados por CYP2D6, sin olvidar que las variaciones también se
podrían explicar por otros factores fisiológicos, patológicos, medio ambientales y por
interacciones entre medicamentos y otros xenobióticos. Para abordar esta
problemática se analizó la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo en un
subgrupo de 23 voluntarios previamente genotipificados. Estos voluntarios se
clasificaron según los fenotipos metabólicos de CYP2D6 en base a los puntos de
cortes establecidos en la literatura. Los voluntarios que exhibieron un genotipo
homocigoto para el alelo wt presentaron el fenotipo ME.
Los 23 voluntarios sanos seleccionados para la determinación in vivo de la
actividad catalítica del CYP2D6 reunió 11 genotipos teóricos diferentes (Tabla 16), de
los cuales 10 son considerados genotipos posibles. El grupo de genotipos wt/*2 para
CYP2D6*2, wt/*3 para CYP2D6*3 y wt/wt para CYP2D6*4, presenta los genotipos
teóricos wt/*2-3 y *2/*3, sin embargo dentro del estudio genotípico de los 321
voluntarios no se encontraron individuos que presentaran en uno solo de sus alelos
los polimorfismos C2850T y A2549 (*2/*2 y wt/*3; wt/*2 y *3/*3), por ende se considera
como genotipo posible solo a *2/*3. En cambio, el grupo de genotipos wt/*2 para
CYP2D6*2, wt/wt para CYP2D6*3 y wt/*4 para CYP2D6*4, ambos genotipos teóricos
81
81
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
(wt/*2-4 y *2/*4) fueron considerados genotipos posibles, ya que en la población de
estudio se encontraron individuos que presentan los polimorfismos C2850T y G1549G
en uno solo de sus alelos.
El polimorfismo A2549del (alelo *3) es un alelo no funcional que al estar junto a un
alelo funcional, debería resultar en un fenotipo MI, lo cual fue respaldado por los datos
obtenidos. El polimorfismo C2850T (alelo *2) es conocido por determinar un alelo
funcional al igual que CYP2D6*1, sin embargo, presenta una disminución de un 20%
de la actividad catalítica en comparación con CYP2D6*1, lo cual se demuestra en este
estudio, ya que los cuatro voluntarios presentaron un fenotipo ME. Las Figuras 22 y
23 presentan los datos obtenidos (Media Log MR) y se observa que existe una
disminución relativa de la actividad catalítica del genotipo homocigoto para el
polimorfismo C2850T (alelo *2) con respecto al grupo control (genotipo wt/wt). Un
voluntario con genotipo homocigoto para el alelo no funcional *4 exhibió un fenotipo
MP y, a su vez, otro voluntario con genotipo *2-4/*2-4 también presentó un fenotipo
MP. Ambos resultados corresponden a lo esperado debido a que presentan dos
copias del alelo no funcional *4.
Se eligieron cinco voluntarios que presentaban el genotipo heterocigoto para el
alelo *4 (G1846A), para los que, al igual que los heterocigotos para *3 (A2549del), se
esperaba un fenotipo MI. Sin embargo, se observó cierta discordancia en los datos
obtenidos, ya que tres voluntarios cumplieron con el fenotipo esperado, mientras los
otros dos voluntarios presentaron un fenotipo ME. De acuerdo a esto, no se puede
afirmar cuál de los dos fenotipos es el asociado al genotipo heterocigoto *4. Este
resultado se puede explicar debido a que el alelo funcional (CYP2D6*1) podría suplir
la actividad catalítica del alelo nulo transformando el fenotipo MI en ME, o debido a
que la gran variabilidad polimórfica presente en CYP2D6, representada por un gran
número de otras variantes alélicas de CYP2D6 no determinadas en este estudio,
podrían provocar una disminución de la actividad metabólica.
El trabajo también se dirigió a evaluar genotipos que presentaban más de un
polimorfismo, por lo que resultó interesante y relevante determinar la actividad
catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo. Se analizaron dos voluntarios que
presentaban el genotipo *2/*2-4. Debido a que la variante alélica *2 (C2850T) presenta
una actividad catalítica similar a la normal, no se esperaba que afectara el
82
82
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
metabolismo en los individuos, aún cuando la presencia del polimorfismo G1846A
(asociado al alelo *4) en su forma heterocigota, podría provocar una disminución de la
actividad clasificando a los voluntarios como MI. Un voluntario presentó el fenotipo
esperado MI, mientras el otro voluntario presentó un fenotipo ME, lo cual podría
explicarse por la presencia de otra variante polimórfica no determinada en este
estudio o incluso, por la presencia de duplicación-multiplicación del alelo *2 (C2850T),
lo que supliría la función enzimática del alelo defectuoso. Esto último no fue posible de
evaluar, ya que no se determinó la duplicación del alelo *2 en estos voluntarios. Se
analizaron dos voluntarios con un genotipo *2/*3 donde los fenotipos metabolizadores
observados no concordaron con lo esperado, ya que uno de los voluntarios es ME y el
otro MI.
En base a las razones metabólicas encontradas para el grupo heterocigoto
A2549del (alelo *3), se podría suponer que el voluntario que tiene un fenotipo ME
posee una duplicación del alelo *2 (C2850T), lo cual podría suplir la actividad nula del
alelo *3. Sin embargo, el número de voluntarios encontrados con este genotipo es
insuficiente para hacer un análisis estadísticamente significativo del fenotipo
esperado. Por otra parte, uno de los voluntarios con un genotipo heterocigoto para
C2850T (alelo *2) y para G1846A (alelo *4) presentó un fenotipo MI, lo cual concuerda
con el fenotipo esperado, según lo determinado para el alelo no funcional *4.
Los resultados obtenidos individualmente para las razones metabólicas muestran
claramente el efecto de las variantes genotípicas en la expresión fenotípica de la
enzima (Figura 22). Además, se demostró la influencia del polimorfismo G1846A
(alelo *4) en la RM de debrisoquina cuando se encuentra en ambos alelos.
La frecuencia alélica de CYP2D6*2 (C2850T) es trascendente, ya que se acerca al
50% de la población del estudio, lo cual no descarta que podría encontrarse en su
forma duplicada o incluso multiplicada, elevando sustancialmente la actividad
catalítica de la enzima determinando un fenotipo MU. Al respecto, la frecuencia de la
duplicación de CYP2D6*2 en la población española es de 0,9%, por lo que se podría
esperar que al igual que los polimorfismos estudiados, la frecuencia de *2xN también
sea similar en la población chilena. Aunque es una frecuencia relativamente baja, no
se debe descartar su estudio, puesto que son pacientes que no responderán a
tratamientos o pueden sufrir intoxicaciones con medicamentos (Menoyo y cols., 2006).
83
83
Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
En el presente trabajo de tesis no se pudo determinar la influencia del genotipo
homocigoto para CYP2D6*3 (A2549del), dado que no se encontraron individuos que
lo presentaran. A pesar de ello, los individuos heterocigotos analizados presentaron
un perfil de MI, lo cual significa una modificación de la dosis convencional de un
fármaco para obtener las respuestas farmacológicas deseadas.
Los polimorfismos de
CYP2D6
estudiados en
su genotipo homocigoto,
demostraron diferencias relevantes en comparación con aquellos genotipos
heterocigoto o combinación de variantes alélicas de CYP2D6. El hecho de
presentarse la mutación en ambos alelos (genotipo homocigoto), aumenta la
correlación genotipo-fenotipo al descartar la posibilidad de existencia de otras
mutaciones en igual posición que puedan afectar la caracterización in vivo. En cambio,
en aquellos que presentan distintas variables en su forma heterocigota es más difícil
estimar el fenotipo metabólico, ya que no se sabe cuan afectada puede estar la
actividad de la enzima.
No se realizaron análisis estadísticos de tipo comparativo entre los grupos con
diversos genotipos encontrados debido a que el número de voluntarios por genotipo
fue insuficiente para efectuar las comparaciones respectivas. A pesar de ello, ya que
este estudio plantea la implementación de una farmacoterapia personalizada, se
realizó un análisis descriptivo para evaluar a cada voluntario según su genotipo y
fenotipo. Se observaron diferencias en la metabolización de debrisoquina entre los
voluntarios, aunque en algunos casos no se correlacionan con el fenotipo esperado.
De los 23 voluntarios estudiados, 18 respondieron de la manera esperada, logrando
una correlación genotipo-fenotipo, lo cual se puede observar en las Figuras 23 y 24.
El solo hallazgo de voluntarios que no metabolizan debrisoquina de manera
convencional, significa que existe una base para pensar en una modificación de las
dosis convencionales de un fármaco, debido a que pueden sufrir reacciones adversas
o no obtener respuesta terapéutica al ser tratados de manera tradicional. El hecho de
que no todos los genotipos presentaran los fenotipos esperados, hace aún más
relevante estudiar otras variables alélicas de CYP2D6 no consideradas en este
estudio y sus respectivas combinaciones.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Los resultados de esta investigación sugieren que la genotipificación y/o
fenotipificación de CYP2D6 permite predecir la capacidad de oxidación de fármacos
en un individuo. Sin embargo, hay ciertas diferencias importantes entre los dos
enfoques. La fenotipificación depende de la toma de un fármaco utilizado como
marcador metabólico, por ende, se corre el riesgo de sufrir un efecto específico del
fármaco. Una desventaja adicional es la posibilidad de inhibición de la enzima por una
coadministración con otro fármaco o constituyentes de alimentos. Varios de los
sustratos de CYP2D6 y también no sustratos, son potentes inhibidores competitivos
de la enzima. Ocasionalmente pueden ocurrir interacciones de fármacos que bloquean
completamente el metabolismo de los sustratos coadministrados con consecuencias
graves. Esto podría explicar algunos de los fenotipos no esperados observados, que
pueden resultar en un cambio del fenotipo determinado in vivo de ME a IM, o incluso
MP. En contraste, el enfoque farmacogenético requiere del desarrollo de un test
apropiado de DNA. La ventaja de la genotipificación es que se requiere aplicar sólo
una vez en la vida y el resultado no se encuentra influenciado por factores
ambientales. Sin embargo, la genotipificación también tiene un bajo pero inevitable
grado de incertidumbre, hasta no disponer del análisis de todas las variantes
genéticas relevantes de la enzima.
No se encontraron estudios en la literatura que describan la caracterización de la
actividad debrisoquina hidroxilasa in vivo en grupos de la población chilena y la
correlación con su perfil genético. Por lo tanto, este es el primer trabajo realizado en
Chile que aborda este aspecto. El tamaño reducido de la muestra de individuos que
poseen ambos alelos mutados para cada polimorfismo ha sido el principal factor para
no lograr establecer una relación estadísticamente significativa entre ciertos grupos de
genotipos con la actividad catalítica de la enzima. Sin embargo, resulta importante
destacar que el objetivo fundamental que busca un estudio farmacogenético es la
determinación de la respuesta individual, por lo que los hallazgos de individuos cuyos
fenotipos metabolizadores determinan que no pueden ingerir las dosis convencionales
o deben cambiar de medicamento, ya que no son capaces de metabolizarlo, resultan
relevantes para fundamentar la farmacoterapia personalizada.
En definitiva, se requiere aumentar el número de individuos involucrados en el
análisis fenotípico, con diversas variantes alélicas y además, incluir la
caracterización de otras variantes genotípicas relevantes de la población chilena,
para una mejor caracterización genotípica-fenotípica.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
7.
Conclusiones
1. Se implementaron las técnicas de PCR alelo específica semianidada y PCR RFLP para
la detección de las variantes alélicas CYP2D6*3 (A2549del) y CYP2D6*4 (G1846A). La
frecuencia genotípica del polimorfismo CY2D6*3 obtenida en 321 chilenos sanos fue
97,8% para el genotipo silvestre (wt/wt), 2,18% para individuos homocigotos mutados
(*3/*3). La frecuencia alélica fue 98,9% para el alelo silvestre (*1) y 1,09% para el alelo
mutado (*3). La frecuencia genotípica encontrada para el polimorfismo CYP2D6*4 en
321 voluntarios sanos, fue 77,57% para el genotipo silvestre, 19,0% para el genotipo
heterocigoto (wt/*4) y 1,24% para individuos homocigotos mutados (*4/*4). La
frecuencia alélica para la variante alélica *4, fue 88,16% para el alelo silvestre (*1) y
11,8% para el alelo mutado (*4).
2. Se implementó la técnica de PCR RFLP para detectar el alelo CYP2D6*2 (C2850T) y
se caracterizó un grupo de 321 voluntarios sanos. La frecuencia genotípica para el
genotipo silvestre fue 37%, para el genotipo heterocigoto (wt/*2) fue 44,5% y para
individuos homocigotos mutados (*2/*2) fue 18,4%. La frecuencia alélica para la
variante *2 fue 40,6% y para el alelo silvestre (*1) fue 59,3%.
3. Se implementó la técnica de PCR larga para la determinación de la duplicación del gen
CYP2D6 (*1xN). Se analizaron 20 voluntarios sanos, de los cuales ninguno presentó la
duplicación.
4. Se desarrolló y validó la técnica para determinar debrisoquina y 4-hidroxidebrisoquina
mediante HPLC con detector de fluorescencia en muestras de orina de 0-8 horas. Se
determinó la razón metabólica (RM) de 23 voluntarios sanos quienes se clasificaron
según su capacidad metabólica en metabolizadores extensivos (ME), metabolizadores
intermedios (MI) y metabolizadores pobres (PM). Se obtuvieron resultados similares a
descrito en la literatura científica para una monodosis de 20 mg de Declinax.
5. Se realizaron análisis estadísticos descriptivos con los cuales se observó que, en 18 de
23 casos, existen diferencias en los fenotipos metabolizadores de cada voluntario por
la presencia de una variable polimórfica, existiendo una relación genotipo/ fenotipo en
la mayoría de los casos.
6. Si bien la descripción comparativa de los grupos aún no permite establecer de manera
enfática una relación genotipo-fenotipo de los polimorfismos estudiados, el
conocimiento del genotipo y del fenotipo metabólico de un individuo puede utilizarse
para establecer una farmacoterapia personalizada en cada individuo.
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
8.
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94
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
9.
Anexos
Anexo 1: Consentimiento informado para análisis genético
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Anexo 2: Consentimiento informado para estudio farmacocinético de debrisoquina
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debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
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debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
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Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica
debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Anexo 3: Acta de aprobación del comité de ética
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debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
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debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo
Anexo 4: Criterios de inclusión y exclusión de Voluntarios para estudio farmacocinético
Criterios de inclusión
1. Grupo de hombres y mujeres sanas de edades entre 18 y 55 años con apellidos
hispanoamericanos (as) y masa corporal (BMI) entre 19 y 30.
2. No fumadores, no consumidores de drogas de abuso ni de alcohol.
3. Sin alergias a medicamentos.
4. No estar sometidos a terapias concomitantes y no haber ingerido fármacos a lo
menos dos meses antes del estudio,
5. Con resultados de los exámenes de laboratorio en rangos normales y
declarados aptos (as) para el estudio por el médico después del examen físico.
Criterios de exclusión
1. Historia clínica de hipersensibilidad a cualquier medicamento.
2. Presencia en la historia clínica de problemas gastrointestinales, de hígado,
riñón,
pulmón,
hematológicos,
neurológicos,
psiquiátricos,
endocrinos,
inmunológicos o dermatológicos significativos.
3. Presencia en la historia clínica de enfermedades que hayan afectado la
absorción, distribución y eliminación de fármacos desde el organismo.
4. Mantención de una terapia para la adicción al alcohol, tabaco, marihuana u
otras drogas de abuso.
5. Haber tenido cualquier enfermedad de importancia en los 28 días previos al
estudio.
6. Haber usado en los 28 días previos al estudio fármacos que modifiquen el
sistema de biotransformación (todos los barbitúricos, corticoesteroides,
fenilhidantoinas, etcétera).
7. Haber usado cualquier medicamento en los 7 días previos del estudio,
incluyendo medicamentos de venta directa o sin receta médica.
8. Haber participado en otro estudio similar en los 28 días previos al estudio
actual.
9. Dar positivo el análisis de drogas o VIH.
10. Presencia de historia de desmayos o miedo a la extracción de sangre.
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Anexo 5: Instructivo estudio farmacocinético de debrisoquina
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