s2-fmct20 efectividad de la terapia fotodinámica utilizando nuevos

EFECTIVIDAD DE LA TERAPIA FOTODINÁMICA UTILIZANDO NUEVOS
FOTOSENSIBILIZADORES SINTETIZADOS Y AISLADOS EN MÉXICO
Eva Ramón-Gallegosa, Alicia R. Reyes-Arellanob, Roxana Olvera-Ramírezc y
Alfredo Cruz-Oread
a
Departamento de Morfología. bDepto. Orgánica, cDepto de Botánica. Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas-IPN. Carpio y Plan de Ayala S/N, col. Sto Tomás. Deleg. Miguel Hidalgo. CP 11340.
[email protected], tel: +52 55 57296300 ext. 62466.
d
Departamento de Física, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados. Av. IPN 2508, 07360,
Zacatenco, México DF, México.
RESUMEN
El costo de los fotosensibilizadores (Ps) limita la aplicación de la Terapia Fotodinámica (PDT), por lo que es
importante desarrollar nuevos Ps más eficientes y baratos. Se estudiaron dos Ps: uno, derivado éster de la
protoporfirina IX (DEPpIX), obtenido por síntesis orgánica, y otro, de ficobiliproteínas (PBs), extraído de una
cianobacteria que crece como contaminante en Valle de Bravo, Edo. de México. Para determinar la efectividad
de la PDT se utilizaron 2 líneas celulares aisladas de cáncer cervicouterino (HeLa y CaLo), las cuales se
expusieron a diferentes dosis de DEPpIX y PBs y posteriormente se irradiaron a 80 J/cm2 con un láser de argón.
La muerte celular se determinó por medio de la técnica del rojo neutro. El DEPpIX se acumuló en mayor
cantidad, en las 2 líneas de células cancerosas, que la sal disódica de PpIX que le dio origen, esto puede
atribuirse a que demostró ser más liposoluble y estable a la fotooxidación. La PDT fue más efectiva utilizando la
DEPpIX, y de las dos líneas, las células CaLo fueron más sensibles ya que presentaron un 85.7% de muerte
celular en comparación con HeLa en las que se encontró un 47.3%. Por otro lado, se observó que el extracto de
PBs al utilizarse como Ps tuvo actividad tóxica en las células HeLa y CaLo, debido a que al aplicar la PDT se
logró eliminar 88% de las células CaLo y 57% de HeLa. Así, podemos concluir que tanto el DEPpIX y como la
PBs, ambos estudiados por primera vez en México, tienen actividad fotosensibilizante.
1
INTRODUCCIÓN
La Terapia Fotodinámica (PDT) es una tratamiento contra el cáncer que aprovecha las ventajas que ofrece la
interacción entre la luz, el oxigeno y un agente fotosensibilizador para inducir muerte en las células cancerosas,
específicamente por la formación de especies reactivas de oxigeno (ROS) [1]. En la actualidad la PDT es
aplicada en muchos países para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, obteniéndose en algunos casos,
como con el carcinoma basocelular, la erradicación total del mismo, pero en otros, se obtienen efectividades
mucho menores [2], además, estudios realizados en el laboratorio de Citopatología Ambiental del Instituto
Politécnico Nacional, muestran que constantemente existe un grupo de células resistentes a la PDT (3%), esto
se debe, en parte, a la capacidad de las células de incorporar los fotosensibilizadores o de sintetizarlos [3 ]. Por
lo anterior, con la finalidad de hacer más efectiva la PDT, se sintetizó un éster de Protoporfirina IX, con el
objeto de evaluar su actividad como fotosensibilizador y determinar la eficiencia de la PDT utilizando este
nuevo compuesto.
Por otro lado se determinó la capacidad de las ficobiliproteinas (PBs) como fotosensibilizadores. Las PBs son los
principales pigmentos accesorios de las algas rojas y de algunas cianobacterias. Son ampliamente utilizadas como
reactivos químicos fluorescentes, colorantes en alimentos y cosméticos [4]. Tienen un valor terapéutico como
inmunomodulador y recientemente se ha incrementado el interés por su habilidad de revertir el fenotipo de
multirresistencia a fármacos de varios tipos de células tumorales [5]. Las PBs son proteínas que tienen unidos a
sus residuos de cisteína grupos prostéticos tetrapirroles lineales. Éstos absorben energía en la región visible del
1
espectro (400-700nm) [6] y sus dobles enlaces conjugados les permiten la transferencia de electrones. De tal
manera que se cumpliría uno de los requisitos que deben satisfacer los fotosensibilizadores para ser utilizados en
la Terapia Fotodinámica (PDT): la capacidad de alta transferencia de energía.
El uso de la PDT en nuestro país está limitado al tratamiento de la degeneración macular y los tratamientos
suelen ser caros, de ahí la importancia de encontrar nuevos fotosensibilizadores con alta eficiencia y más baratos
para facilitar su uso en México. Por lo anterior nuestro grupo de trabajo ha contribuido en el estudio de dos
fotosensibilizadores: un derivado éster de la protoporfirina IX (DEPpIX), obtenido por síntesis orgánica, y otro
de ficobiliproteínas (PBs), obtenido de una cianobacteria que crece como contaminante en Valle de Bravo, Edo.
de México.
2
2.1
METODOLOGÍA
Material biológico.
Se utilizaron dos líneas de cáncer cervicouterino (CaCU), HeLa y CaLo, ambas se mantuvieron en medio
DMEM complementado con suero fetal de bovino al 7% y en una incubadora a 37°C con una mezcla de 5% de
CO2/95% de aire.
2.2
Preparación de los fotosensibilizadores
Se sintetizó, purificó e identificó mediante espectroscopia de infrarrojo, espectrofluorometría y resonancia
magnética nuclear de carbono 13 una molécula de PpIX esterificada (DEPpIX) a partir de la sal disódica de
PpIX (SD-PpIX). Por otro lado se realizó una extracción de PBs a partir de un gramo de biomasa de
Pseudoanabaena tenuis en solución amortiguadora de fosfatos. La cuantificación se realizó mediante la lectura
de la densidad óptica de la muestra a 565, 620 y 650 nm para determinar las concentraciones de ficocianinas
(PC), ficoeritrinas (PE) y aloficocianinas (AP).
2.3
PC (mg/ml) = A620 - 0.7(A650)/7.38
(1)
AC (mg/ml) = A650 - 0.19(A620)/15.65
(2)
PC (mg/ml) = A565 - 2.8(PC) - 1.34(AP)/12.7
(3)
Aplicación de la PDT y determinación de su efectividad.
Para determinar la efectividad de los fotosensibilizadores en la PDT, se sembraron 5x10 4 células por pozo en
microplacas de 96 pozos, 24 horas después, las células se expusieron a las dosis de 10, 20, 40, y 80 g/mL de
ambas porfirinas, SD-PpIX y a la DEPpIX, otra placa bajo las mismas condiciones se expuso a las dosis de PBs
de 2.17x10-3 a 6.96x10-2 μg/ml para las células HeLa y de 6.78x10-5 a 0.24 μg/ml para las células CaLo,
posteriormente se irradiaron a 80 J/cm2 con un láser de argón. La muerte celular se determinó por medio de la
técnica espectrofotométrica del rojo neutro [7].
3. RESULTADOS
Al analizar la SD-PpIX y la DEPpIX por espectrofluorometria se encontró que los espectros eran idénticos a
excepción que aparece un pico a 630nm en la DEPpIX, así que el proceso de esterificación no modificó el grupo
prostético de la PpIX que pudo observarse alrededor de 400 nm.
Al determinar la mortalidad celular con y sin aplicar la PDT utilizando la SD-PpIX podemos decir que ésta no
tiene efecto citotóxico sobre las células CaLo pero si sobre las Células HeLa y sólo cuando se aplica la PDT, así
con la SD-PpIX la máxima mortalidad que se produce es de 54.6% en células HeLa (tabla 1).
Al utilizar la DEPpIX (nuevo fotosensibilizador sintetizado), se encontró que sin aplicar la PDT tiene efecto
citotóxico por si solo en las células CaLo, en dosis a partir de 40 g/mL, no así para las células HeLa, en las que
no se encontró muerte celular en ninguna dosis. Al aplicar la PDT, se encontró muerte en ambas líneas celulares.
Las células CaLo fueron más sensibles ya que presentaron un 82.9% de muerte celular en comparación con las
células HeLa en las que se encontró un 68.5 % (tabla 1).
2
Por otro lado, se observó que el extracto de PBs al utilizarse como fotosensibilizador tuvo actividad tóxica en las
células HeLa y CaLo, debido a que al aplicar la PDT se logró eliminar 88% de las células CaLo y 57% de las
células HeLa (Tabla 2). Es importante hacer notar que el extracto de PBs tiene actividad citotóxica por si solo y
ésta es mucho mayor en las células CaLo que en las HeLa.
Tabla 1. Porcentajes de mortalidad de las líneas celulares HeLa y CaLo para ambas PpIX.
Tipo de PpIX
Mortalidad de células HeLa
Mortalidad de células CaLo
(%)
(%)
Grupo
Sin PDT
SD-PpIX
DEPpIX
Con PDT
Sin PDT
Con PDT
Testigo
0
0
0
0
Testigo de irradiación
0
0
0
0
10 g/mL
18.0
43.7
0
0
20 g/mL
0
45.5
0
0
40 g/mL
0
54.6
0
0
80 g/mL
47.7
47.3
0
7.7
Testigo
0
0
0
0
Testigo de irradiación
0
0
0
0
10 g/mL
0
52.7
0
82.9
20 g/mL
0
68.5
0
82.9
40 g/mL
0
65.8
80.0
82.9
80 g/mL
0
57.9
82.9
85.7
Tabla 2. Mortalidad de las células HeLa y CaLo expuestas a diferentes dosis de PBs, Con PDT sin PDT.
*Diferencia significativa entre grupos (p<0.05).
Ficobiliproteína [mg/ml]
PE
2.1e-3
4.3e-3
8.7e-3
0.0174
0.0696
PC
1.46 e-3
2.92 e-3
5.84e-3
2.34e-2
4.68e-2
% de mortalidad de células HeLa
Sin PDT
AP
% de mortalidad de células CaLo
Con PDT
Sin PDT
Con PDT
9.61e-3
0.00
45.69*
69.58
59.79
1.92e-3
6.47
46.51*
72.74
62.55
3.84e-3
17.41
48.18*
77.63
84.94*
1.54e-2
6.47
46.51*
87.50
88.08
3.08e-2
23.38
57.10*
84.96
85.31
4. Discusión
Los fotosensibilizadores se probaron en dos líneas de carcinoma cervicouterino, las células HeLa que fueron
aisladas de un carcinoma en estadio IVb, y las células CaLo aisladas de un tumor del mimo tipo pero en estadio
IIB, ambas son positivas al HPV 18 [8 ], y en los resultados podemos observar que las células CaLo resultaron ser
mas sensibles que las HeLa, esto en parte puede ser explicado a que las células HeLa tienen características de
malignidad superiores a las de las células CaLo, como son más tumorogenicas, metastasicas y tienen una
velocidad de crecimiento superior, por lo que podemos suponer que son mucho más ricas en lípidos de membrana
y por lo mismo permitieron la incorporación de mayor cantidad de PpIX-EST o PBs, por otro lado estas células
quizás han desarrollado . Posiblemente, las células HeLa tengan una capacidad antioxidante superior al de las
3
células CaLo, lo que podría suponer que las hace más resistente, considerando que la PDT mata a las células
cancerosas por la generación de radicales libres [2 ].
El efecto citotóxico del extracto de ficobiliproteínas obtenidas de la cepa Pseudoanabaena (cianobacteria), puede
ser atribuido principalmente a la ficoeritrina, debido a que de las 3 ficobiliproteínas, es la única que absorbe a las
longitudes de onda en la que emite el láser de argón utilizado. Éste tiene 3 líneas, emite a 488, 496 y 514 nm.
MacColl y Guard-Friar en 1987 y Rowan en 1989 demostraron que las ficobiliproteínas tienen varios máximos de
absorción, así encontraron que las PE absorben a 498, 545-546 y 565-568, las APC 598, 629 y 650 nm y las PC
absorben a 615 y 617 [9,10]. También se ha demostrado que al excitarse son capaces de transferir altas cantidades
de energía, por lo que podemos sugerir que la citotoxicidad es debida al efecto fotodinámico que se lleva a cabo al
excitar a las PE.
En estudios anteriores relacionados con productos de cianobacterias y el tratamiento del cáncer, se ha encontrado
que la ficocianina-C es capaz de inducir apoptosis [11], por lo que no se descarta la idea de que la presencia de
esta molécula en el extracto crudo ensayado en este trabajo, esté provocando parte de la muerte celular, por lo
menos en las dosis mayores a 5.84x10-3 mg/ml de ficocianina y 8.70x10-3 mg/mL de ficoeritrina. Es importante
señalar que se requieren más estudios al respecto, sin embargo, el presente trabajo demuestra que la ficoeritrina es
en gran parte responsable del efecto citotóxico.
5. CONCLUSIONES
Tanto el DEPpIX como las PBs, ambos estudiados por primera vez en México, tienen actividad fotosensibilizante
por los altos porcentajes de células eliminadas, y al parecer la eficiencia de la PDT depende del estadio del tumor.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Biol. Celia Flores Granados del Departamento de Botánica por la identificación de la
cepa de cianobacteria. A los estudiantes: Mario Alberto García Flores y Ana Lidia Vargas Rodríguez que con
parte de su trabajo de tesis llegamos a los resultados mostrados. A la Biol. Ma. Luisa Vega Barrita por asesorar a
los estudiantes en algunas técnicas de laboratorio. Agradecen también al personal de la Central de Espectroscopia
de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN y a la IBQ Esther Ayala Maycotte del Depto de Física del
CINVESTAN-IPN, por las facilidades prestadas para la lectura de las muestras e irradiación de las células
respectivamente.
Proyectos apoyados por CONACYT-México, Clave:I39313-M y CGPI-IPN: CGPI: 20030463 y 20040129.
ERG, RAA y ACO son becarios SNI. ROR y ERG son becarias de COFAA. RAA y ERG son becarias EDI.
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