biología molecular

biología molecular
aplicada
emplea principios de la estructura y la
función del DNA y de las proteínas para
estudiar las bases de fenotipos producidos
por genotipos bajo condiciones normales y
patológicas
mediante herramientas y técnicas que explotan
la información contenida en las moleculas de
un organismo (sobre todo DNA)
La información química
contenida en un polimero
simple (ácido nucleíco)
controla el desarrollo y
mantenimiento de un
organismo vivo complejo
4 bases: Guanina (G), Adenina (A), Citosina (C), Timina (T)
En un oligonucleótido de 10 nucleótidos puede haber 410 posiciones
distintas de las cuatro bases (1.048.576)
En nucleo de una célula humana hay más de 109 nucleótidos, es
decir más de 41000.000.000 de combinaciones de secuencias
Procesamiento de la información genética
en la célula (eucariotas)
Procesamiento de la información genética
en la célula (eucariotas)
TRES DIMENSIONES EN UNA PROTEÍNA
INTERACCIONES CON:
Otros aminoácidos y con
elementos de estructura
secundaria en la misma
subunidad
Otras subunidades
Ligandos específicos
Estructuras celulares
Perspectiva
El emparejamiento de las bases conduce a la
doble hélice y a la hibridación
Heteroduplex DNA-RNA formado durante la síntesis de RNA
Doble hélice
Emparejamiento
A-T
≈ 2°C
C-G
≈ 4°C
La cantidad de DNA en solución
puede ser determinada mediante
espectrofotometria ultravioleta.
Las bases del
DNA son menos
accesibles a la
luz ultravioleta
en doble
cadena que en
cadena sencilla
La desnaturalización de la doble hélice de DNA es
un proceso cooperativo
Tm es la temperatura a la que el 50% del DNA se
denaturaliza
La Tm de un duplex de un ácido nucleíco se
modifica por tres factores principales:
1. Composición de bases
2. Longitud del duplex
3. Fuerza iónica de la solución
Los desapareamientos en un heteroduplex producen una
disminución de 1ºC por cada 1% de secuencia desapareada
Factores que afectan la desnaturalización y
renaturalización de la doble hélice
Parametro
Efecto
sobre Tm
Efecto sobre
renaturalización
Sin efecto
Composición
↑ Tm ↑ % GC
Longitud
↑ Tm ↑ longitud
↑ vel. ↑ longitud
Fuerza iónica
↑ Tm ↑ % Na
Optimo a 1,5 M Na
% error
↓ Tm ↑ % error
↓ vel. ↑ % error
Concentración
Sin efecto
↑ vel. ↑ conc.
Denaturalizantes
↓ urea, formamida
Optimo a 50% form.
Temperatura
Optimo a 20ºC ↓ Tm
El apareamiento de
bases tiene lugar en la
doble hélice del DNA
y tambien en las
interacciones intra e
inter-moleculares del
RNA y del DNA de
cadena sencilla
Las hebras sencillas de
DNA desnaturalizaddo
pueden ser
renaturalizadas y
adoptar formas de
doble hebra
La hibridación sobre un
DNA inmovilizado (en
filtro) permite saber si
una solución de DNA o
RNA desnaturalizado
contiene secuencias
complementarias de las
cadenas inmovilizadas
El DNA y el RNA pueden ser separados del
resto de componentes celulares por métodos
físico-químicos
La electroforesis
horizontal en geles de
agarosa permite
separar las moleculas
de DNA por su tamaño
(0,2 - 10 kb).
La electroforesis vertical
en geles de
poliacrilamida permite
separar las moleculas
de DNA con diferencias
en una sola base
La transferencia (blot) e
hibridación usando la
tecnica de Southern
permite identificar
secuencias específicas
de DNA
Cortar y Pegar
Los enzimas de restricción son endonucleasas que
reconocen y cortan secuencias específicas en la doble
hélice de DNA.
Los enzimas de restricción son endonucleasas que
reconocen y cortan secuencias específicas en la doble
hélice de DNA.
ER y sus metilasas protegen
en bacterias a infecciones
por fagos.
Las ER de Tipo II son
homodimeros que se unen a
secuencias específicas de
DNA y rompen enlaces
fosfodiester
Se requieren estirpes de
bacterias modificadas para
realizar DNA recombinante
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción de Tipo I
Enzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones
simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa
Cofactores: ATP, Mg2+ y S-Adenosilmetionina
3 Subunidades: Reconocimiento, Actv. Endonucleasa y Actv.
Metilasa se localizan en diferentes subunidades del
complejo
Sitio de reconocimiento: 15 pares de bases
Sitio de metilación o rotura: a aprox. 1000 pb del 5’ de la
secuencia TCA en sitio de reconocimiento
5’ AACNNNNNNGTGC 3’
5’ TGANNNNNNTGCT 3’
3’ TTGnnnnnnCACG 3’
3’ ACTnnnnnnACGA 3’
Eco K
Eco B
Enzimas de Restricción de Tipo II
Reconocen TETRA-, PENTA-, o HEXANUCLEOTIDOS
Secuencias poseen un eje de simetria rotacional:
PALINDROMO:
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Eco RI
Enzimas de Restricción de Tipo II reconocen
palindromos y producen 3 tipos de cortes
Enzimas de Restricción de Tipo III
Enzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones
simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa
Cofactores: ATP, Mg2+ y S-Adenosilmetionina
2 subunidades: Actividad endonucleasa en una subunidad y
Reconocimiento + Metilación en otra subunidad diferente
Sitio de reconocimiento: no palindromo
Sitio de rotura: separado del reconocimiento y diferente en
cada hebra
5’ CATGACGCAGAAG/TTAAC AC 3’
3’ GTACTGCGTCTTC AATTG/TG 3’
Hga I
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
COHESIVIDAD
Capacidad de complementariedad entre extremos digeridos
por enzimas de restricción
El orden y simetría de los sitios de corte de las ER tipo II
tiene las siguientes consecuencias:
a) La generación de extremos protuberantes con
terminación de cadena sencilla que son complementarios
en configuración antiparalela pero identicos en paralelo
5’G AATTCNNNNNNNNNG
3’CTTAA GnnnnnnnnnCTTAA
AATTC 3’
G 5’
COHESIVIDAD (2)
b) Los extremos de una molécula de DNA generados por
un ER puede tener complementariedad con otra molécula
con el mismo extremo:
MseI: T/TAA
AseI:
AT/TAAT
BamHI:
Bgl II:
Bcl I:
Sau 3AI:
G/GATCC
A/GATCT
T/GATCA
/GATC
COHESIVIDAD (3)
c) Recombinantes producto de dos ER con extremos
compatibles pueden perder secuencia original:
BamHI:
Bgl II:
G/GATCC
A/GATCT
Producen:
GGATCT
AGATCC
Y en consecuencia adquirir una nueva diana:
Mbo I o Sau3AI (/GATC)
COHESIVIDAD (4)
d) Endonucleasas con sitios múltiples de reconocimiento
que producen extremos heterogéneos:
/CCAGG
/CCTGG
Eco RII
GT/AGAC
GT/ATAC
GT/CGAC
GT/CTAC
Acc I
C/CCGAG
C/CCGGG
C/TCGAG
C/TCGGG
Ava I
COHESIVIDAD (5)
e) Isosquizomería: Endonucleasas con identico sitio de
reconocimiento
Hind III y Hsu I:
A/AGCTT
Pero que pueden tener diferente punto de corte:
Sma I
CCC/GGG
Xma I
C/CCGGG
DNA ligasa
Cataliza la formación de enlaces
fosfodiester en moleculas de DNA de
doble cadena entre extremos próximos
cohesivos 3’-hidroxilo y 5’-fosfato
USO EN TECNOLOGÍA
RECOMBINANTE:
- de E.coli (NAD como cofactor)
- de fago T4 (ATP como energía)
DNA ligasa:
condiciones de ligación
Una reacción de ligación rquiere de 3 ingredientes (además de agua):
1.
Dos o mas fragmentos de DNA con extremos compatibles.
2.
Un tampon conteniendo ATP. El tampon se prepara concentrado
(10x) y tras la dilución proporciona una concentración de 0.25 a 1 mM.
3.
T4 DNA ligase. Una reacción tipica para insertar un fragmento en un
plamiso puede necesitar entre 0.01 (protuberantes solapantes) a 1
(romos) unidades de ligasa
La temperatura optima de incubación es de 16 ºC y cuando se desea una
eficiencia alta se requiere esta temperatura. Sin embargo la ligasa es
activa en un amplio rango de temperaturas y para reaccciones rutinarias
se efectuan entre 4ºC y temperatura ambiente, dependiendo de de los
tipos de secuencias a ligar
DNA ligasa:
condiciones de ligación
DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA
In vivo, la temperatura de la ligación óptima es de
aproximadamente 37 ºC, aunque a esta temperatura el
emparejamiento de bases es inestable
En el laboratorio se ha de determinar una temperatura de
compromiso entre la óptima y aquella que garantiza el
emparejameinto de las bases: dependencia en el contenido
en G+C
Extremo protuberante AATT: 5-6ºC
Para clonación de vectores: 5-15ºC
DNA ligasa:
condiciones de ligación
DEPENDENCIA DE LAS CONCENTRACIONES
A una fuerza iónica (concentración salina) constante la
preferencia entre reacción intra o intermolecular depende de:
1. Longitud del fragmento de DNA
2. Concentración de DNA
A concentracion constante: Cuanto menor sea el fragmento se
favorecen reacciones intramoleculares (circularización).
A longitud constante: Según disminuye la concentración de
DNA se incrementa la probabilidad de circularización.
Las reacciones bimoleculares son las preferidas entre un
vector y DNA lineal.
DNA ligasa:
condiciones de ligación
Teória de la reacción de policondensación intramolecular
j (en g/l) = 51.1 x Mr -1/2
Permite calcular la concentración “j” de un fragmento de DNA
a la cual se igualan las velocidades iniciales de las reacciones
bi- y monomolecular de circularizacción.
CIRCULARIZACIÓN
DNA < j
OLIGOMERIZACIÓN
DNA > j
DNA ligasa:
condiciones de ligación
Las reacciones bimoleculares entre monomeros de diferente
longitud funcionan mejor cuando los dos substratos de la
reacción estan en cantidades equimoleculares
La longitud del fragmento más corto va a
concentración de extremos del vector que se
competir con la circularización monomolecular
menor de la siguiente forma:
determinar la
necesita para
del fragmento
[inserto] = (Mr inserto / Mr vector) x [vector]
DNA ligasa:
condiciones de ligación
Tamaño inserto
kb
0.5
1
2
3
4
5
10
15
20
30
[vector] µg/ml
Lambda
pBR322
31x106 Da
2.6x106 Da
9750
3447
1218
663
430
308
109
59
38
21
813
286
102
55
36
26
9
5
3.2
1.8
DNA ligasa:
condiciones de ligación
Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal
Nucleasas: Dnasa y Rnasa
Fosfatasa alcalina
Polinucleótido quinasa
Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal (TT)
Añade colas homopolimericas
Substrato: extremos 3’ -OH con al menos 3 bases
protuberantes
Condiciones de reacción: diferente para añadir dA / dT (Co2+)
o dC / dC (Mn2+)
Longitud de la cola: entre 10 y 30 bases y puede ser
monitorizada (electroforesis o marcaje)
Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal (TT)
---------------------------------CTGCAG------------------------------------------------------------------GACGTC---------------------------------Pst I
--------------------------CTGCA3’
---------------------------G
G--------------------------3’ACGTC-------------------------TT
------------CTGCAGGGGGG3’
---------------G
--
G---3’GGGGGGACGTC-----
Desoxyribonucleasa I (DNasa I)
Endonucleasa de páncreas que hidróliza cadena doble o sencilla
de DNA.
No hidroliza RNA
Preferencialmente corta en enlaces adyacentes a residuos de C o
T (es por tanto una endonucleasa).
Con Mg hidroliza cada cadena independientemente al azar
Con Mn hidroliza ambas cadenas en el mismo sitio y proporciona
extremos romos o protuberantes de 1 o 2 bases.
Productos: di, tri y tetranucleótidos 5’-fosforilados.
Aplicaciones de la Dnasa I:
Elimina DNA de preparaciones de RNA
Analiza interacciones DNA-proteina mediante “Footprinting” de
Dnasa
Incision de DNA para marcaje de DNA
λ-Exonucleasa
5’-GpApApTpTOH-3’
3’-CpTpTpApAp-5’
5’-GpApApTpTOH-3’
3’-Cp
+ Np-5’
Exonucleasa III (E. coli)
5’-GpApApTpTOH-3’
3’-CpTpTpApAp-5’
5’-GOH-3’
+ Np-5’
3’-CpTpTpApAp-5’
Exonucleasa Bal 31 (Alteromonas)
5’-pApAOH-3’
5’-GpApApTpTOH-3’
3’- TpTp-5’
3’-CpTpTpApAp-5’
+ Oligo y mono
nucleótidos
S1- Nucleasa (Aspergillus)
5’-GOH-3’
3’-CpTpTpApAp-5’
5’-GOH-3’
5’-Cp-5’
Nucleasa de alubia china
5’-GpApApTpTOH-3’
3’-CpTp-5’
5’-GpAOH-3’
5’-CpTp-5’
Ribonucleasa A (RNasa A)
Endoribonucleasa de páncreas que hidróliza cadena sencilla de
RNA al extremo 3’ de residuos de pirimidinas (C y T).
Productos: mono y oligonucleótidos 3’-fosforilados.
Aplicaciones de la RNasa A:
Elimina RNA de preparaciones de DNA
Mapeo de mutaciones en DNA o RNA mediante escisión de
desapareamiento: La RNAsa hidroliza el RNA en los híbridos
de RNA:DNA en lugares de desapareamiento de una base y el
producto puede ser analizado
Fosfatasa alcalína:
Hidroliza grupos fosfato 5’ de DNA, de RNA de nucleótidos y de
proteínas.
5’-GOH-3’
3’-CpTpTpApAp-5’
5’-GOH-3’
3’-CpTpTpApAOH-5’
3 ORIGENES:
Bacteriano: Es el enzima mas activo pero el mas dificil de destruir al
final de la reacción.
Intestino de ternera. Es la mas utilizada en biología molecular porque
aunque es menos activa que la bacteriana se inactiva por proteasas o
mediante calor (75ºC 10 min).
Gamba: Se obtiene de una gamba de agua fría que permite que se
destruya facilmente por calor (65ºC 15 min).
Fosfatasa alcalína:
APLICACIONES:
Antes de una reacción de ligación permite eliminar los grupos 5’fosfato de vectores que han sido digeridos con enzimas de
restricción. Previene la auto-ligación del vector y facilita la ligación
de otros fragmentos dentro del vector.
Eliminar los grupos 5’-fosfato de fragmentos de DNA antes de
marcarlos con fosfato radioactivo mediante la polinucleótido
quinasa
T4 Polinucleótido quinasa + λ-32P-ATP
Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’
de DNA o de RNA.
Se utiliza en dos tipos de reacciones:
La reacción directa: Transferencia del fosfato gamma del ATP al extremo 5’ de
un polinucleotido (DNA o RNA).
En la reacción de intercambio: El ADN o RNA diana con un 5’fosfato se incuba
con exceso de ADP y el fosfato se desfosforila y se tranfiere al ADP para formar
ATP. Despues se realiza la reacción directa con ATP con fosfato marcado que se
transfiere al acido nucleíco.
T4 Polinucleótido quinasa + λ-32P-ATP
Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’
de DNA o de RNA.
APLICACIONES:
1) Fosforilación de linkers y adaptadores, o fragmentos de
DNA como paso previo a la ligación que requiere un extremo
5’fosfato. Los productos de PCR que se van a ligar
normalmente se generan con cebadores no fosforilados.
2) Marcaje de oligonucleótidos (con 32P) que se utiliza como
sondas de hibridación.
DNA polimerasas
DNA polimerasa I de E. coli
Fragmento Klenow
DNA polimerasa T4
DNA polimerasa T7
DNA polimerasas termoestables
Poseen actividad polimerasa 5’-3’
y tambien actividades exonucleasas 5’-3’ y 3’-5’.
DNA polimerasas
DNA polimerasa I de E. coli
Fragmento Klenow
DNA polimerasa T4
DNA polimerasa T7
DNA polimerasas termoestables
Poseen actividad polimerasa 5’-3’
y tambien actividades exonucleasas 5’-3’ y 3’-5’.
Trancriptasa reversa
DOS ACTIVIDADES:
1) 3’5’ DNA polimerasa
2) Actividad RNasa H
Proceden de los retrovirus
Son DNA polimerasas que usa RNA como cadena molde: fluye la
información genética en sentido reverso
Dos orígenes:
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV)
Avian Myeloblastosis Virus (AMV)
Trancriptasas reversas
5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’
RT + dATP + dCTP + dGTP + dTTP
3’-TTTTTTTTTTTTTT-5’
5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’
3’-GCACGGATTCCGATCTGGCTAAGCGTTTTTTTTTTTTT-5’
Con Oligo dt(18)
[RNA]
Hexameros al azar
[RNA]
Genoteca de cDNA:
DNA genomico vs DNA complementario
Genoteca de cDNA:
Expresión diferencial de genes en tejidos
Genoteca de cDNA:
Clonación de diferentes transcritos
Genoteca de cDNA:
Identificación de diferentes transcritos
Genoteca de cDNA:
Identificando función de diferentes transcritos