generación de plantas transgénicas de arroz con menor

GENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE ARROZ CON MENOR
REQUERIMIENTO HÍDRICO
Resumen ejecutivo
El arroz forma parte de la dieta básica del pueblo mexicano y ocupa el cuarto
lugar en producción de granos después del maíz, el trigo y el fríjol, por tal
motivo el objetivo de este estudio es explorar las formas de manipular la ruta
metabólica de la trehalosa en el arroz, con el fin de desarrollar variedades con
una mejor tolerancia al estrés abiótico y con un mejor comportamiento.
Los objetivos que guiaron el trabajo del investigador fueron los siguientes: a)
obtener el DNA complementario (cDNA) de la trehalasa de arroz; b) construir
un RNA de interferencia (RNAi) y un RNA antisentido (RNAas) para inhibir el
gen de la trehalasa; c) diseñar un hairpin RNA (hpRNA) para la secuencia
codificante de la trehalasa de arroz y un hpRNA para la región 3’ no traducible
3’UTR; d) construir vectores para la expresión constitutiva y regulada por
estrés del RNAi, el RNAas y los hpRNAs de la trehalasa de arroz en plantas; e)
introducir en plantas de arroz Oryza sativa var Índica de los cultivares
Temporalero A95 (secano) y Morelos A98 (riego) mediante biobalística los
vectores para la expresión constitutiva y regulada por estrés del RNAi, f) el
RNAas y los hpRNA de la trehalasa de arroz en plantas; y g) analizar los
fenotipos de las plantas seleccionadas y sus controles en cuanto a actividad
fotosintética, acumulación de azúcares, tolerancia a sequía y producción de
biomasa.
La metodología que siguió el investigador fue la siguiente:
Para la transformación genética de arroz (Oryza sativa) utilizó dos variedades
del genotipo Índica: una de temporal (secano) y una de riego, que
corresponden respectivamente a la Temporalero A95 y la Morelos A98.
Quitó la cáscara (cariópside) de las semillas y las desinfectó en etanol al 70%
por 3 minutos, y después en una solución de hipoclorito de sodio al 5 %
durante 40 minutos con 5 gotas de Tween 20 por cada 25 ml de solución;
después hizo cinco o seis lavados abundantes con agua destilada estéril, en
donde las mantuvo hasta su siembra. Trabajó en la inducción de callo
embriogénico y una vez que lo obtuvo preparó el tejido para la transformación
y selección de transformantes. Obtuvo plántulas a partir del callo embriogénico
y trabajó en el enraizamiento y aclimatación a condiciones de suelo de las
plántulas regeneradas.
A partir de ese momento procedió a las construcciones génicas. Inició con la
amplificación y clonación de la secuencia del cDNA de la trehalasa de arroz;
llevó a cabo la construcción de caset de expresión del RNAas de la secuencia
trehalasa.
Trabajó en la transformación de callo embriogénico de arroz por biobalística.
La preparación de DNA la realizó mediante la técnica de Acetato de Amonio.
Para la caracterización de las plantas transgénicas de arroz realizó: el análisis
molecular; el análisis de la actividad Trehalasa; la preparación de extracto
crudo de proteínas; la cuantificación de éstas, y el ensayo de actividad
Trehalasa.
Para determinar los niveles de tolerancia a estrés abiótico conferidos mediante
la inhibición por antisentido de la enzima trehalasa, realizó ensayos en
invernadero con el fin de determinar: el porcentaje de capacidad de campo, el
contenido relativo de agua, la actividad fotosíntetica; llevó a cabo el análisis
del contenido de carbohidratos de raíz, la colecta y almacenamiento de
material vegetal, la extracción de carbohidratos y, por último, la derivatización
de carbohidratos y su identificación por GC-MS.
Demanda o problemática que atiende
Generación y desarrollo de nuevo conocimiento y tecnología que ayuden a
incrementar el rendimiento de las cosechas de arroz, tanto en campo como en
invernadero.
Mejorar la resistencia de las plantas de arroz a la sequía, la salinidad y las
temperaturas extremas, y hacer que su tolerancia al estrés abiótico se
incremente, mediante una la expresión coordinada y diferencial de su red de
genes.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
El investigador clonó el cDNA de la trehalasa de arroz Oryza sativa variedad
Índica cultivar Temporalero A95 y se manipuló un fragmento interno de 550 pb
para su uso en la construcción de los plásmidos de inhibición por antisentido y
RNA de interferencia de la trehalasa endógena de plantas transgénicas de
arroz.
Obtuvo plantas transgénicas de arroz de la variedad Índica y cultivares Morelos
A92 (M92), Morelos A98 (M98) y Temporalero A95 (T95), a las que se les
introdujo el RNA antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa.
Obtuvo plantas transgénicas del cultivar M98 que presentan in vitro una
disminución de la actividad trehalasa del 19 al 67%, y plantas transgénicas del
cultivar T95 con disminución del 80 al 97%. Así mismo, las líneas transgénicas
M98 presentaron en promedio un incremento en la acumulación de trehalosa
que fluctúa del 54 al 100% con respecto al control bajo condiciones de sequía
en invernadero.
Logró plantas transgénicas del cultivar M98 que mantienen en invernadero
características de crecimiento (altura y biomasa) y desarrollo (estadios)
semejantes a los controles bajo condiciones normales, y que bajo condiciones
de estrés por sequía presentan del 27 al 36% más producción de biomasa y un
comportamiento fotosintético que va desde una menor inhibición con respecto
al control (26%), hasta un incremento en un rango del 200 al 300 por ciento.
Impactos
Mediante la tecnología desarrollada en esta investigación no sólo es posible
conferir tolerancia a estrés abiótico en un cultivo de gran importancia
agronómica, sino que aumenta la capacidad fotosintética de la planta, lo que
hace posible una mayor producción, lo que redunda en beneficio para los
agricultores que se dedican a esta siembra, y puede significar una aportación
para el logro de la suficiencia alimentaria.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
No es posible cuantificar el costo por la aplicación de este conocimiento, en
tanto que es experimental.
Ámbito de aplicación
Los Mochis, Sinaloa, y Noreste, en el distrito de riego de Las Ánimas, en
Tamaulipas, hasta el Sureste del país, en Chiapas.
Información adicional o comentario
La mayor parte del arroz cultivado en el Norte y el Centro de la república se
cultiva en condiciones de riego, bajo siembra directa o trasplante, mientras que
la mayoría del arroz que se cultiva en el Sur es de temporal y siembra directa.
Clave del proyecto: SAGARPA 2003-C01-235
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: genética vegetal y
fitomejoramiento
Investigador: doctor ROBERTO MONTES DE OCA LUNA
Institución: Universidad Autónoma de Nuevo León